本發(fā)明涉及一種表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于動物病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種重組火雞皰疹病毒rhvt-f株，其基因組中包含有cmv啟動子控制下的雞新城疫病毒(ndv)f基因。
背景技術(shù)：
：雞馬立克氏病(marek’sdisease，md)和雞新城疫病(newcastledisease,nd)給養(yǎng)禽業(yè)造成極大的危害。對于md、nd的防控主要是依靠疫苗的預(yù)防接種。hvt對雞及其它動物均無致病性，自1970年以來普遍用于mdv的防控。目前，絕大多數(shù)國家采用預(yù)防接種作為控制新城疫的主要措施。但由于常規(guī)疫苗的免疫保護(hù)期短，雖然商品雞群在整個飼養(yǎng)期內(nèi)多次進(jìn)行免疫接種，但是仍有可能感染ndv強(qiáng)毒，造成非典型新城疫病毒的流行。此外，常規(guī)弱毒疫苗和中等毒力疫苗還可在雞呼吸道復(fù)制，引起溫和的病變，增加了繼發(fā)細(xì)菌感染的易感性。為了彌補(bǔ)常規(guī)疫苗的不足，國內(nèi)外許多實驗室從20世紀(jì)80年代末開始利用重組技術(shù)研制新城疫病毒基因工程疫苗。其中基因工程活載體疫苗，是疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一?；痣u皰疹病毒(herpesvirusofturkey,hvt)作為載體疫苗對雞及其他動物均無致病性，接種后可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體并維持終生，接種一次即可獲得終生免疫，同時hvt是預(yù)防馬立克氏病(mdv)的常規(guī)疫苗。hvt作為載體具有以下優(yōu)勢：(1)hvt已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于1日齡雛雞的免疫，已近50年歷史，其疫苗生產(chǎn)、儲存和接種等都有十分成熟的方法；(2)hvt極為安全，對雞不具有任何副作用；(3)接種雞后終身帶毒，可以長時間刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，達(dá)到理想的免疫保護(hù)效果；(4)hvt在cef細(xì)胞上生長迅速，產(chǎn)生大量有囊膜的病毒，這樣制備的凍干疫苗在4℃可以長期保存，使用方便；(5)即使在密度很高的雞群，hvt也不易發(fā)生水平傳播，因而減少了重組疫苗散毒的風(fēng)險。本發(fā)明通過在細(xì)胞水平的同源重組，構(gòu)建成一株能夠穩(wěn)定表達(dá)ndvf基因的重組hvt毒株，并制備基因工程疫苗，用于雞群的免疫接種，同時產(chǎn)生對md、nd的免疫保護(hù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種采用生物技術(shù)構(gòu)建的重組火雞皰疹病毒(rhvt-f)，其基因組中包含有cmv啟動子控制下的雞新城疫病毒(ndv)f基因，，其實際上是將含ndv的f基因與火雞皰疹病毒hvt結(jié)合在一起，獲得了一種全新的重組火雞皰疹病毒rhvt-f，該病毒同時也是一種制備馬立克氏病和雞新城疫病二聯(lián)疫苗的生產(chǎn)毒種，是通過將由cmv啟動子控制下的ndvf基因插入到hvt基因組中，rhvt-f不僅可以對雞md起到良好的免疫保護(hù)作用，而且可以誘導(dǎo)抗ndv的持久保護(hù)性免疫。本發(fā)明的技術(shù)方案1.一株表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒，其特征在于該重組火雞皰疹病毒攜帶在cmv啟動子序列控制下的雞新城疫病毒的f基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒的基因序列如seqidno:1所示，該病毒被命名為重組火雞皰疹病毒(herpesvirusofturkey,hvt)rhvt-f株，并已于2017年01月11日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：cgmccno.13396。2.如本發(fā)明所述一種表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒的應(yīng)用，其特征在于，重組病毒株該在禽類宿主中誘導(dǎo)抗馬立克氏病病毒和雞新城疫病毒的保護(hù)性免疫并作為生產(chǎn)毒株用于制備相應(yīng)的疫苗。3.如本發(fā)明所述一種表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒的應(yīng)用，其特征在于該重組病毒rhvt-f株，作為病毒載體構(gòu)建新的重組病毒株中的應(yīng)用。本發(fā)明具體實施方式本發(fā)所述的明重組火雞皰疹病毒的dna序列模式圖如附圖1所示，其構(gòu)建的具體方法如下：在本發(fā)明中，發(fā)明人將含有雞新城疫病毒f基因的表達(dá)盒(序列見序列1)插入hvt基因組中，插入的區(qū)域為hvt基因組中病毒生長非必需的區(qū)域(us10和sorf3之間)，插入序列及位置見圖2。為了達(dá)到上述的目的，發(fā)明人首先：1.獲得了含ndvf基因的表達(dá)盒，具體如下：設(shè)計擴(kuò)增ndvf基因引物ndv-f-f/r(序列2/序列3)。以提取的ndvrna為模板，經(jīng)過rt-pcr擴(kuò)增ndvf基因片段，經(jīng)過nhei、xbai雙酶切后，克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcdna3.1(賽默飛世爾科技)，獲得的陽性質(zhì)粒，命名為pcdna3.1/ndv-f。按照lipofectamine2000(賽默飛世爾科技)轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒pcdna3.1/ndv-f轉(zhuǎn)染cef細(xì)胞，以ndvf蛋白的單克隆抗體作為一抗，鑒定重組質(zhì)粒f蛋白的表達(dá)。根據(jù)pcdna3.1載體bghpolya序列，設(shè)計引物bgh-f/r(序列4/序列5)擴(kuò)增bghpolya片段，經(jīng)xbai、sphi酶切后克隆進(jìn)puc18載體(寶生物工程有限公司)，陽性質(zhì)粒命名為puc18/bgh。根據(jù)genebank提供的hvtfc-126株(af291866)基因序列，設(shè)計引物tongyuan-down-f/r(序列6/序列7)、tongyuan-up-f/r(序列8/序列9)分別擴(kuò)增重組位點上下游同源臂。下游同源臂經(jīng)sphi、hindiii雙酶切，上游同源臂經(jīng)ecori、xbai雙酶切依次克隆進(jìn)puc18/bgh質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為puc18/bgh/tongyuan。利用引物pndv-f-f/r(序列10/序列11)擴(kuò)增cmv啟動子以及ndvf基因，經(jīng)clai、xbai雙酶切后克隆進(jìn)puc18/bgh/tongyuan質(zhì)粒，含有同源臂、ndvf基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒命名為puc18/ndv-f。2.重組病毒rhvt(rhvt-f)的構(gòu)建利用同源重組的方法構(gòu)建重組病毒rhvt-f，步驟如下：將長成單層的原代cef細(xì)胞用胰酶消化，以6～8×106細(xì)胞接種到35mm的平皿，待細(xì)胞長至80％～90％時用于dna轉(zhuǎn)染。取1μghvt感染的cefdna與2.5μgpuc18/ndv-f質(zhì)粒dna共同轉(zhuǎn)染原代cef。具體操作方法按lipofectamine2000(賽默飛世爾科技)使用說明書進(jìn)行。待培養(yǎng)至第4天，出現(xiàn)病毒蝕斑，用0.05％胰酶消化細(xì)胞，同時接種到新鮮制備2塊35mm的平皿上。取其中一塊以ndvf蛋白單克隆抗體作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光法鑒定，如果出現(xiàn)帶熒光的病毒蝕斑，另一塊經(jīng)超聲破碎后接種到新鮮制備96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4d，再孔對孔接種到兩塊新鮮制備96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，3～4d后取一塊固定進(jìn)行間接免疫熒光法鑒定，另一塊作為篩選陽性克隆的儲備板。在96孔板中挑選獨立的經(jīng)ifa檢測陽性的蝕斑繼續(xù)用96孔板篩選，如此重復(fù)下去直到篩選出表達(dá)f蛋白的純化的重組病毒，命名為hvt-f1。提取純化病毒的基因組dna，采用引物(序列12/序列13)進(jìn)行pcr鑒定。hvt-f:5'-cataggcacgctctgatg-3'；18(序列12)hvt-r:5'-tggcaaacagtaaaattatcc-3')21(序列13)。3.rhvt-f的體外的穩(wěn)定性試驗為了驗證所獲得的重組病毒rhvt-f體內(nèi)和體外的穩(wěn)定性，具體操作如下：將純化的重組病毒hvt-f1在cef細(xì)胞上連續(xù)傳代，分別選取第10、20、30代重組病毒進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，檢測ndvf基因的表達(dá)。提取不同代次病毒dna，利用pcr擴(kuò)增重組病毒外源基因的嵌合區(qū)，并進(jìn)行測序驗證，利用引物(序列14/序列15)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明所發(fā)明的rhvt-f在細(xì)胞中傳30代后仍保持穩(wěn)定。qianhe-f:5'-gcacatctgctctcattacc-3'20(序列14)qianhe-r:5'-gtttcaaattttcacgattcc-3')21(序列15)4.重組病毒rhvt-f應(yīng)用于spf雞中的免疫試驗具體步驟如下：60只1日齡spf雞，隨機(jī)分成3組,第一組接種rhvt-f，免疫劑量為4000pfu/只。第二組為非免疫攻毒組，第三組為空白對照(非免疫非攻毒)組。21日齡進(jìn)行ndv強(qiáng)毒北京株攻擊，觀察14d，rhvt-f保護(hù)率達(dá)到90％。5.重組病毒rhvt-f制備成疫苗疫苗的制備方法如下：rhvt-f接種雞胚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)瓶接種密度為每1cm2面積接種1000pfu的重組病毒，接種后50小時，有70％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(cpe)時，倒去培養(yǎng)液，加入適量胰酶消化液，在室溫下消化10min左右，細(xì)胞單層出現(xiàn)疏松拉網(wǎng)接近脫離瓶壁現(xiàn)象時，立即加入與消化液等量的含10％牛血清的營養(yǎng)液，停止消化。輕輕搖動轉(zhuǎn)瓶，使細(xì)胞全部脫離瓶壁，離心收集的細(xì)胞用超聲波裂解后加入適量spga穩(wěn)定劑，搖勻后分裝凍干。附圖說明圖1為rhvt-f重組病毒中的含有新城疫病毒f(ndv-f)基因的表達(dá)盒的序列示意圖；圖2：ndv-f表達(dá)盒插入hvt基因組中的序列及插入位點；大寫下劃線部分為hvtfc126(af291866.1)基因組中的us10序列，大寫斜體部分為sorf3序列，小寫部分為us10和sorf3基因之間的序列?！?”號為f表達(dá)盒插入位點；圖3為重組病毒hvt-f1的間接免疫熒光鑒定；a：hvt-f1感染cef細(xì)胞，在熒光顯微鏡下顯示亮綠色熒光；b：hvt感染cef細(xì)胞，熒光顯微鏡下視野為黑色；c：空白cef細(xì)胞，熒光顯微鏡下視野為黑色。本發(fā)明涉及生物材料資源信息本發(fā)明構(gòu)建的重組火雞皰疹病毒(herpesvirusofturkey)rhvt-f株，該株病毒是將含雞新城疫病毒的f基因與火雞皰疹病毒hvt結(jié)合在一起，獲得了一種全新的重組火雞皰疹病毒；該重組毒株被命名重組火雞皰疹病毒rhvt-f株，已于2017年01月11日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.13396；新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)北京株(cvccav1611)，為商品化疫苗效力檢驗用強(qiáng)毒株來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p142。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一株表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒被命名為重組火雞皰疹病毒rhvt-f株，該病毒株是將含雞新城疫病毒f基因的表達(dá)盒與火雞皰疹病毒(hvt)結(jié)合在一起，即通過將由cmv啟動子控制下的f基因插入到hvt基因組中，構(gòu)建而獲得了一種全新的重組火雞皰疹病毒rhvt-f株，該rhvt-f株病毒不僅可以對雞可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗md和nd的持久保護(hù)性免疫。該株病毒作為生產(chǎn)毒株用于制備馬立克氏病和雞新城疫病的二聯(lián)重組疫苗。實施例以下實施例是為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不對本發(fā)明構(gòu)成限制。實施例1——rhvt-f重組病毒的構(gòu)建1.含雞新城疫病毒的f基因的表達(dá)盒(序列見序列1)的制備設(shè)計擴(kuò)增ndvf基因引物ndv-f-f/r(序列2/序列3)。以提取的ndvrna為模板，經(jīng)過rt-pcr擴(kuò)增ndvf基因片段，經(jīng)過nhei、xbai雙酶切后，克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcdna3.1，獲得的陽性質(zhì)粒，命名為pcdna3.1/ndv-f。按照lipofectamine2000(賽默飛世爾科技)轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒pcdna3.1/ndv-f轉(zhuǎn)染cef細(xì)胞，以ndvf蛋白的單克隆抗體作為一抗，鑒定重組質(zhì)粒f蛋白的表達(dá)。表1構(gòu)建重組質(zhì)粒所使用引物。2.含有同源臂、表達(dá)盒重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)pcdna3.1載體bghpolya序列，設(shè)計引物bgh-f/r(序列4/序列5)擴(kuò)增bghpolya片段，經(jīng)xbai、sphi酶切后克隆進(jìn)puc18載體，陽性質(zhì)粒命名為puc18/bgh。根據(jù)genebank提供的hvtfc-126株(af291866)基因序列，設(shè)計引物tongyuan-down-f/r(序列6/序列7)、tongyuan-up-f/r(序列8/序列9)分別擴(kuò)增重組位點上下游同源臂。下游同源臂經(jīng)sphi、hindiii雙酶切，上游同源臂經(jīng)ecori、xbai雙酶切依次克隆進(jìn)puc18/bgh質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為puc18/bgh/tongyuan。利用引物pndv-f-f/r(序列10/序列11)擴(kuò)增cmv啟動子以及ndvf基因，經(jīng)clai、xbai雙酶切后克隆進(jìn)puc18/bgh/tongyuan質(zhì)粒，含有同源臂、ndvf基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒命名為puc18/ndv-f(圖3)。3.rhvt-f重組病毒的篩選與鑒定將長成單層的原代cef細(xì)胞用胰酶消化，以6～8×106細(xì)胞接種到35mm的平皿，待細(xì)胞長至80％～90％時用于dna轉(zhuǎn)染。取1μghvt感染的cefdna與2.5μgpuc18/ndv-f質(zhì)粒dna共同轉(zhuǎn)染原代cef。具體操作方法按lipofectamine2000(賽默飛世爾科技)使用說明書進(jìn)行。待培養(yǎng)至第4天，出現(xiàn)病毒蝕斑，用0.05％胰酶消化細(xì)胞，同時接種到新鮮制備2塊35mm的平皿上。取其中一塊以ndvf蛋白單克隆抗體作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光法鑒定，如果出現(xiàn)帶熒光的病毒蝕斑，另一塊接種到新鮮制備96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4d，再孔對孔稀釋到兩塊新鮮制備96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，3-4d后取一塊固定進(jìn)行間接免疫熒光法鑒定，另一塊作為篩選陽性克隆的儲備板。在96孔板中挑選獨立的經(jīng)ifa檢測陽性的蝕斑繼續(xù)用96孔板篩選，如此重復(fù)下去直到篩選出表達(dá)f蛋白的純化的重組病毒，命名為hvt-f1。提取純化病毒的基因組dna，進(jìn)行pcr鑒定(序列12/序列13)hvt-f:5'-cataggcacgctctgatg-3'；18(序列12)hvt-r:5'-tggcaaacagtaaaattatcc-3'21(序列13)。以重組病毒hvt-f1dna為模板，利用重組位點兩端的引物進(jìn)行pcr鑒定，僅能擴(kuò)增出約2813bp的ndvf基因表達(dá)盒的基因片段(包含兩端約200bp的hvt基因組片段)，而以hvtdna為模板僅能擴(kuò)增出約200bp的hvt基因組片段。實施例2——rhvt-f重組病毒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性的研究將純化的重組病毒hvt-f1在cef細(xì)胞上連續(xù)傳代，分別選取第10、20、30代重組病毒進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，檢測ndvf基因的表達(dá)。提取不同代次病毒dna，利用pcr擴(kuò)增重組病毒外源基因的嵌合區(qū)，并進(jìn)行測序驗證。以不同代次的dna為模板，均能擴(kuò)增出長約600bpndvf基因表達(dá)盒嵌合區(qū)的特異性片段。結(jié)果表明，ndvf基因能夠在重組病毒hvt-f1中穩(wěn)定存在并表達(dá)。所用引物為：qianhe-f:5'-gcacatctgctctcattacc-3'21(序列14)qianhe-r:5'-gtttcaaattttcacgattcc-3'21(序列15)實施例3——重組病毒rhvt-f在spf雞中的的免疫免疫效力評價60只1日齡spf雞，隨機(jī)分成3組,第一組接種rhvt-f，免疫劑量為4000pfu/只。第二組為非免疫攻毒組，第三組為空白對照(非免疫非攻毒)組。21日齡進(jìn)行ndv強(qiáng)毒北京株攻擊，觀察14d，rhvt-f保護(hù)率達(dá)到90％，(見表2)。表2rhvt-f對spf雞的免疫保護(hù)效果組別攻毒毒株死亡數(shù)(率)保護(hù)率(％)rhvt-f疫苗免疫組ndv(北京株)2/20(10％)90攻毒對照組-ndv(北京株)20/20(0％)0空白對照組--0/20(0％)-實施例4——重組病毒rhvt-f株疫苗的制備方法rhvt-f株病毒接種雞胚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)瓶接種密度為每1cm2面積接種1000pfu的重組病毒，接種后50小時，有70％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(cpe)時，倒去培養(yǎng)液，加入適量胰酶消化液，在室溫下消化10min左右，細(xì)胞單層出現(xiàn)疏松拉網(wǎng)接近脫離瓶壁現(xiàn)象時，立即加入與消化液等量的含10％牛血清的營養(yǎng)液，停止消化。輕輕搖動轉(zhuǎn)瓶，使細(xì)胞全部脫離瓶壁，離心收集的細(xì)胞用超聲波裂解后加入適量spga穩(wěn)定劑，搖勻后分裝凍干。附注：lipofectamine2000(賽默飛世爾科技)使用說明書轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞鋪板(6孔板)，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90％～95％。細(xì)胞鋪板在2ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。對于每孔細(xì)胞，使用250μl無血清培養(yǎng)基稀釋4.0ugdna，輕輕混勻。使用前將lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用250μl無血清培養(yǎng)基稀釋10ullipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。lipofectamine2000稀釋后，在5min內(nèi)同稀釋的dna混合，室溫放置20min。將6孔板中的舊營養(yǎng)液吸出，用無血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入2ml無血清配養(yǎng)基。直接將室溫放置20min的dna復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃，5％co2中保溫12小時，12小時后更換成含有血清的培養(yǎng)基。序列表　　<110>北京邦卓生物科技有限公司　　<120>表達(dá)雞新城疫病毒f基因的重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建及其應(yīng)用　　<130>　　<160>　　<170>patentinversion3.5　　<210>1　　<211>2613　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：構(gòu)建重組火雞皰疹病毒rhvt-f株的ndv-f基因的表達(dá)盒序列　　<400>1cctgcatcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaat060agtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataac120ttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataa180tgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagt240atttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcccc300ctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat360gggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgc420ggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtc480tccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaa540aatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggagg600tctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaa660ttaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcatgggctccagaccttctacc720aagaacccagcacctatgatgctgactatccgggttgcgctggtactgagttgcatctgt780ccggcaaactccattgatggcaggcctcttgcagctgcaggaattgtggttacaggagac840aaagccgtcaacatatacacctcatcccagacaggatcaatcatagttaagctcctcccg900aatctgcccaaggataaggaggcatgtgcgaaagcccccttggatgcatacaacaggaca960ttgaccactttgctcaccccccttggtgactctatccgtaggatacaagagtctgtgact1020acatctggaggggggagacaggggcgccttataggcgccattattggcggtgtggctctt1080ggggttgcaactgccgcacaaataacagcggccgcagctctgatacaagccaaacaaaat1140gctgccaacatcctccgacttaaagagagcattgccgcaaccaatgaggctgtgcatgag1200gtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagatgcagcagtttgttaat1260gaccaatttaataaaacagctcaggaattagactgcatcaaaattgcacagcaagttggt1320gtagagctcaacctgtacctaaccgaattgactacagtattcggaccacaaatcacttca1380cctgctttaaacaagctgactattcaggcactttacaatctagctggtggaaatatggat1440tacttattgactaagttaggtgtagggaacaatcaactcagctcattaatcggtagcggc1500ttaatcaccggtaaccctattctatacgactcacagactcaactcttgggtatacaggta1560actctaccttcagtcgggaacctaaataatatgcgtgccacctacttggaaaccttatcc1620gtaagcacaaccaggggatttgcctcggcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcggt1680tctgtgatagaagaacttgacacctcatactgtatagaaactgacttagatttatattgt1740acaagaatagtaacgttccctatgtcccctggtatttattcctgcttgagcggcaatacg1800tcggcctgtatgtactcaaagaccgaaggcgcacttactactccatacatgactatcaaa1860ggttcagtcattgccaactgcaagatgacaacatgtagatgtgtaaaccccccgggtatc1920atatcgcaaaattatggagaagccgtgtctttaagcgataatcaatcaggcattgtttta1980tctttgggcgggagtattgtacggttcagtggggaattcgatgtaacttatcagaagaat2040atctcaatacaagattctcaagtaatcataacatccaatcccgatatctcaactgagctt2100gggaatgtcaacaactcgatcagtaatgctttgaataagttagaggaaagcaacagaaaa2160ctagacaaagtcaatgtcaaactgactagcacatctgctctcattacctatatcgttttg2220actatcatatctcttgtttttggtatacttagcctgattctagcatgctacctaatgtac2280aagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttgggaataatactctcgatcagatg2340agagccactacaaaaatgtgatctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgact2400gtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctg2460gaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctg2520agtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgg2580gaagacaatagcaggcatgctggggaatgcagg2613　　<210>2　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物ndv-f-f序列　　<400>2atagctagcatgggctccagaccttct27　　<210>3　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物ndv-f-r序列　　<400>3gcgtctagatcacatttttgtagtggc27　　<210>4　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物bgh-f序列　　<400>4aattctagagggcccgtttaaacccgc27　　<210>5　　<211>29　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物bgh-r序列　　<400>5agggcatgcctgctattgtcttcccaatc29　　<210>6　　<211>29　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物tongyuan-down-f序列　　<400>6ggcgcatgctggggaatgcaggtacaatactttcgaca38　　<210>7　　<211>38　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物tongyuan-down-r序列　　<400>7ggggcaagcttatgcatttattgtgagactgctttaag38　　<210>8　　<211>35　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物tongyuan-up-f序列　　<400>8gcggaattcatgcatctgtcaccaacgcaaagtcg　　<210>9　　<211>29　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物tongyuan-down-r序列　　<400>9gcgtctagaatcgatgcagggtcttacatagaata35　　<210>10　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物pndv-f-f序列　　<400>10gcgatcgatgtacgggccagatatacg27　　<210>11　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物pndv-f-r序列　　<400>11gcgtctagatcacatttttgtagtggc27　　<210>12　　<211>27　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物hvt-f序列　　<400>12cataggcacgctctgatg18　　<210>13　　<211>21　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物hvt-r序列　　<400>13tggcaaacagtaaaattatcc21　　<210>14　　<211>20　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：上游引物qianhe-f序列　　<400>14gcacatctgctctcattacc20　　<210>15　　<211>21　　<212>dna　　<213>人工序列　　<223>對人工序列的描述：下游引物qianhe-r序列　　<400>15gtttcaaattttcacgattcc215當(dāng)前第1頁12