本發(fā)明屬于獸用疫苗領(lǐng)域，具體涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒株、其制備的疫苗組合物、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的北卡羅來(lái)納州(1987年)，此后相繼在加拿大(1998年)、德國(guó)(1990年)、英國(guó)(1991年)發(fā)現(xiàn)此病。1992年國(guó)際獸醫(yī)局(oie)將此病命名為豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)。我國(guó)于1996年也報(bào)道了此病的流行，2006年更是爆發(fā)了變異的prrsv引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近一年來(lái)，多地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有新的prrsv流行，與以往的流行株相比，其基因序列發(fā)生較大改變。而現(xiàn)有的減毒活疫苗在臨床上的預(yù)防效果不甚理想，滅活疫苗雖然也較早研制出來(lái)，其不存在散毒和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，但對(duì)于新的prrsv預(yù)防效果不是很理想，而且，prrsv經(jīng)常與其他病原混合感染，造成臨床上病情的復(fù)雜性，因此，需要研發(fā)出針對(duì)我國(guó)最新流行的毒株的疫苗組合物，以有效防止我國(guó)prrsv相關(guān)疾病的流行。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，該豬繁殖與呼吸綜合征病毒株制得的疫苗組合物可以對(duì)流行野毒 株提供有效的免疫保護(hù)，顯示出顯著的免疫特性。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述病毒株具有序列表seqno.2所示的gp5蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述病毒株具有序列表seqno.2所示的gp5蛋白，序列表seqno.3所示核苷酸序列編碼的gp2蛋白和序列表seqno.4所示核苷酸序列編碼的nsp2蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，保藏號(hào)為cctccno.v201540。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用目前新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株，制備混合疫苗或聯(lián)合疫苗，具有良好的免疫原性，接種豬只后，能夠刺激機(jī)體快速地產(chǎn)生免疫力，產(chǎn)生較高的中和抗體水平。本發(fā)明的混合疫苗或聯(lián)合疫苗能夠有效地保護(hù)流行毒株引起的單感染或混合感染的現(xiàn)象，可以有效地保護(hù)豬群抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株引起的相關(guān)疾病，提高豬群的生產(chǎn)力。序列表中：序列1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白核苷酸序列；序列2為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白氨基酸序列；序列3為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp2蛋白核苷酸序列；序列4為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株nsp2基因核苷酸序列。具體實(shí)施方式以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述病毒株具有序列表seqno.2所示的gp5蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述病毒株具有序列表seqno.2所示的gp5蛋白，序列表seqno.3所示核苷酸序列編碼的gp2蛋白和序列表seqno.4所示核苷酸序列編碼的nsp2蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，保藏號(hào)為cctccno.v201540。豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,strainhnjz15)，所述hnjz15株生物保藏號(hào)為：cctccno.v201540，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年9月21日。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原、減毒全病毒抗原、亞單位抗原或合成肽抗原以及藥學(xué)上可接受的載體?！芭囵B(yǎng)物”是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會(huì)發(fā)生微小的變異?！耙呙缃M合物”系指含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫原性的藥物組合物。該藥物組合物可誘發(fā)、刺激或增強(qiáng)豬只針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫反應(yīng)?！皽p毒全病毒抗原”指的是以毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細(xì)胞上復(fù)制的病毒。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“減毒”用于指以使病原喪失致病性、 但保持免疫原性的方式對(duì)基因進(jìn)行突變來(lái)人工降低病原體毒性。通常，通過(guò)uv輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力減弱?！皽缁钊《究乖保卜Q作滅活疫苗，失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過(guò)用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型疫苗可在用醚處理后由病毒包膜制備得到?！皝唵挝豢乖敝傅氖抢没蚬こ谭椒▽⒉≡w的保護(hù)性抗原基因克隆到原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中，使其高效表達(dá)而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反應(yīng)的可能性小?！昂铣呻目乖敝傅氖且环N僅含免疫決定簇組分的小肽,即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽,與載體連接后加佐劑所制成的抗原。本發(fā)明的組合物的成分或組分的量?jī)?yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學(xué)作用而不導(dǎo)致過(guò)度副作用所必需量。所用的成分和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動(dòng)物的類型和年齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原，所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前≥106.0tcid50/ml。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式；所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前106.0～108.0tcid50/ml。作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式，所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前107.0tcid50/ml。當(dāng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒以少于106.0tcid50的量使用時(shí)，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超過(guò)的量可能是不經(jīng)濟(jì)的。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活抗原的混合疫苗或組合疫苗。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物還包括免疫量的選自下列的抗原或其組合：豬瘟病毒抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬肺炎支原體抗原、豬流感抗原。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物還包括免疫量的選自下列的抗原中的一種抗原：豬瘟病毒抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬肺炎支原體抗原、豬流感抗原。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟兔化弱毒株。豬瘟兔化弱毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬偽狂犬病毒抗原選自豬偽狂犬病病毒js-2012株抗原、豬偽狂犬病病毒hen1株抗原、nvdc-prv-bj株抗原、nvdc-prv-heb株抗原、nvdc-prv-sd株抗原、prvtj株抗原、豬偽狂犬病病毒變異株prv-zj01抗原、豬偽狂犬病病毒變異株hn1201株抗原、豬偽狂犬病病毒變異株hn1201-r株抗原、豬偽狂犬病病毒變異株hn1202株抗原。豬偽狂犬病病毒株js-2012株公開(kāi)于免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定[j].童武，張青占，鄭浩等，中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)2013,21(3):1-7；豬偽狂犬病病毒hen1株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為cgmccno.6656，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102994458a；nvdc-prv-bj株、nvdcprv-heb株和nvdc-prv-sd株公開(kāi)于pathogenicpseudorabiesvirus,xiulingyu,zhizhou,dongmeihu,etal.china,2012emerginginfectiousdiseases，www.cdc.gov/eidol.20,no.1,january2014；prvtjstrain(prvtj株)，公開(kāi)于chun-huawang,jinyuan,hua-yangqin，etal，anovelge-deletedpseudorabiesvirus(prv)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththeprvvariantemerginginbartha-k61-vaccinatedswinepopulationinchina.vaccine32(2014):3379–3385中；豬偽狂犬病病毒變 異株prv-zj01，其保藏號(hào)為cgmccno.8170，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103627678a；豬偽狂犬病病毒hn1201株(pseudorabiesvirus,strainhn1201)保藏號(hào)為cctccno.v201311，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104004774a；豬偽狂犬病病毒hn1202株(pseudorabiesvirus,strainhn1202)保藏號(hào)為cctccno.v201335，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26日，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104328090a。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬圓環(huán)病毒抗原選自豬圓環(huán)病毒2型zj/h株抗原、豬圓環(huán)病毒ⅱ型dbn-sx07株抗原、豬圓環(huán)病毒2型sd株抗原、豬圓環(huán)病毒2型zj/c株抗原、豬圓環(huán)病毒2型毒株pcv2sd株抗原、豬圓環(huán)病毒2型sh株抗原、豬圓環(huán)病毒ⅱ型pcv2/hz09株抗原。豬圓環(huán)病毒2型zj/h株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.6391，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102787100a；豬圓環(huán)病毒ⅱ型dbn-sx07株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.3064，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn101549155a；豬圓環(huán)病毒2型sd株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.5774，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102732486a；豬圓環(huán)病毒2型zj/c株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201251，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103285385a；豬圓環(huán)病毒2型毒株pcv2sd株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.7707，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103421748a；豬圓環(huán)病毒2型sh株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.2389，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn101240264a；豬圓環(huán)病毒ⅱ型pcv2/hz09株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201312，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103436498a。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述副豬嗜血桿菌抗原選自血清13 型副豬嗜血桿菌gx0905株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌jx1002株抗原、血清4型副豬嗜血桿菌hn1009株抗原、血清4型副豬嗜血桿菌ybh04株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌ybh05株抗原、血清13型副豬嗜血桿菌ybh13株抗原、血清1型副豬嗜血桿菌lc株抗原、血清12型副豬嗜血桿菌shcm10株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌jsyz10株抗原、血清13型副豬嗜血桿菌fjmh10株抗原、血清4型副豬嗜血桿菌fs0307株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌xx0306株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌lz-20100109株抗原、血清5型副豬嗜血桿菌lx-5株抗原、副豬嗜血桿菌血清4型js株抗原、副豬嗜血桿菌血清5型zj株抗原、副豬嗜血桿菌血清12型heb株抗原或其組合。血清13型副豬嗜血桿菌gx0905株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014125，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104498384a；血清5型副豬嗜血桿菌jx1002株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014127，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104388340a；血清4型副豬嗜血桿菌hn1009株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014126，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104312964a；血清4型副豬嗜血桿菌ybh04株、血清5型副豬嗜血桿菌ybh05株、血清13型副豬嗜血桿菌ybh13株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)ybh04株為cgmccno.5479、ybh05株為cgmccno.5480、ybh13株為cgmccno.5501，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102499982a；血清1型副豬嗜血桿菌lc株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.5257，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102399724a；血清12型副豬嗜血桿菌shcm10株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014261，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104450556a；血清5型副豬嗜血桿菌jsyz10株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014260，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104450557a；血清13型副豬嗜血桿菌fjmh10株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2014262，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104450555a；血清4 型副豬嗜血桿菌fs0307株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2013094，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103194413a；血清5型副豬嗜血桿菌xx0306株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.m2013095，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103194412a；血清5型副豬嗜血桿菌lz-20100109株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.5802，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102851249a；血清5型副豬嗜血桿菌lx-5株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.10230，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn104611274a；副豬嗜血桿菌血清4型js株、副豬嗜血桿菌血清5型zj株、副豬嗜血桿菌血清12型heb株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)4型js株為cctccno.m2011172、5型zj株為cctccno.m2011173、12型heb株為cctccno.m2011174，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102908615a。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬肺炎支原體抗原選自勃林格殷格翰公司的m.hyo、哈藥集團(tuán)公司的瑞倍適respisure和respisureone、美國(guó)先靈葆雅的myco西班牙海博萊生物大藥廠的j株(喜可舒)、美國(guó)普泰克公司的mycogard、美國(guó)輝瑞公司的respifendmh、梅里亞動(dòng)物保健公司的豬克喘、南京天邦生物科技有限公司的168株活疫苗、豬肺炎支原體hn0613株抗原。豬肺炎支原體hn0613株(mycoplasmahyopneumoniaestrainhn0613)，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏號(hào)為cctccno.m2012230，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103031258a。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬流感抗原選自swhn/yil/10株抗原、a/swine/nanjing/50/2011(h1n1)株抗原、a/swine/shanxin/d5/2011(h1n1)株抗原、豬流感h1n1ln株抗原、豬流感h3n2hlj株抗原、h1n1亞型豬流感病毒tj株抗原、h3n2亞型豬流感病毒hun-1株抗原、豬流感病毒血清型h1n1亞型zjs株抗原、豬流感病毒血清型h3n2亞型wx株抗原或其組合。所述swhn/yil/10株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201223，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102766604a；所述a/swine/nanjing/50/2011(h1n1)株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201218，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102899294a；所述a/swine/shanxin/d5/2011(h1n1)株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.5323，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102586196a；所述豬流感h1n1ln株、豬流感h3n2hlj株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)豬流感h1n1ln株為cgmccno.4141、豬流感h3n2hlj株為cgmccno.4142，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102166352a；所述h1n1亞型豬流感病毒tj株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201107，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn102747045a；所述h3n2亞型豬流感病毒hun-1株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno.v201308，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103468647a；所述豬流感病毒血清型h1n1亞型zjs株、豬流感病毒血清型h3n2亞型wx株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)豬流感病毒血清型h1n1亞型zjs株為cctccno.v201233、豬流感病毒血清型h3n2亞型wx株為cctccno.v201234，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)cn103667196a。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟兔化弱毒株；所述豬偽狂犬病毒抗原為滅活抗原；所述豬圓環(huán)病毒抗原為滅活抗原；所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活抗原；所述豬肺炎支原體抗原為滅活抗原；所述豬流感抗原為滅活抗原。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬瘟病毒抗原含量為104.0～106.0tcid50/ml；所述豬偽狂犬病毒抗原含量為滅活前106.0～107.0tcid50/ml；所述豬圓環(huán)病毒抗原含量為滅活前105.0～107.0tcid50/ml；所述副豬嗜血桿菌抗原含量為滅活前108.0～1010.0tcid50/ml；所述豬肺炎支原體抗原含量為滅活前108.0～1010.0mhdce/ml；所述豬流感抗原含量為滅活前104.0～108.0eid50/ml。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬瘟病毒抗原含量為105.0 tcid50/ml；所述豬偽狂犬病毒抗原含量為滅活前106.0tcid50/ml；所述豬圓環(huán)病毒抗原含量為滅活前106.0tcid50/ml；所述副豬嗜血桿菌抗原含量為滅活前109.0tcid50/ml；所述豬肺炎支原體抗原含量為滅活前109.0mhdce/ml；所述豬流感抗原含量為滅活前106.0eid50/ml。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述疫苗組合物中的所述載體為佐劑，所述佐劑包括白油、德雷克油(drakeoil)，以及其他動(dòng)物油、植物油或礦物油；或氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽；或montanidetmgel、卡波姆、角鯊?fù)榛蚪酋徬?、isa206佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑。本發(fā)明的疫苗組合物可使用可用技術(shù)來(lái)調(diào)配，優(yōu)選為獸醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。例如，油可有助于穩(wěn)定調(diào)配物，且另外充當(dāng)疫苗佐劑。因此，本發(fā)明中，所述可藥用疫苗佐劑包括油佐劑，其選自白油、角鯊?fù)榛蚪酋徬⒌吕卓擞?drakeoil)，以及其他動(dòng)物油、植物油或礦物油。上述油佐劑既可以是來(lái)源，也可以是經(jīng)過(guò)人工合成獲得的。本發(fā)明中，所述疫苗組合物為水包油乳液、油包水乳液或雙重乳液，所述雙重乳液通常表現(xiàn)為水包油包水乳液?；谟妥魟?huì)對(duì)動(dòng)物體帶來(lái)一定的副反應(yīng)，還可以選擇本領(lǐng)域的其它佐劑，包括氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽，來(lái)制備混懸液，減少免疫刺激。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述疫苗組合物中的所述載體還包括助懸劑、表面活性劑、抗原滅活劑或防腐劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述疫苗組合物還包括助懸劑、表面活性劑、抗原滅活劑或防腐劑。所述助懸劑可包括，例如，硬脂酸鋁，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他助懸劑。所述表面活性劑可包括，例如，脫水山犁醇單油酸酯(tween系列)，司本(span)，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他表面活性劑。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻。具體地，所述方法為：(1)將豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株接種于各自的易感細(xì)胞，并培養(yǎng)所述接種后的易感細(xì)胞；收獲細(xì)胞培養(yǎng)物；(2)用甲醛溶液、bpl(β-丙內(nèi)酯)或bei(二乙烯亞胺)處理來(lái)自步驟(1)的病毒；所述易感細(xì)胞可以是傳代細(xì)胞系，也可以是原代細(xì)胞。適合于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的易感細(xì)胞包括但不限于，st細(xì)胞系(atcc編號(hào)：crl-1746)、pk-15細(xì)胞系(atcc編號(hào)：ccl-33)、非洲綠猴腎細(xì)胞marc-145細(xì)胞系(atcc編號(hào)：crl-12219)、牛腎細(xì)胞mdbk細(xì)胞系(atcc編號(hào)：ccl-22)、牛鼻甲骨細(xì)胞bt細(xì)胞系(atcc編號(hào)：crl-1390)、vero細(xì)胞系(atcc編號(hào)：ccl-81)、bhk-21細(xì)胞系(atcc編號(hào)：ccl-10)、豬腎傳代細(xì)胞系(如：ibrs-2，見(jiàn)例如，decastro，m.p.1964.behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture：susceptibilityoftheib-rs-2swinecellline.arquivosinstitutobiologica31：63-78)、兔腎傳代細(xì)胞系(rk，如：atcc編號(hào)：ccl-106)等傳代細(xì)胞系，或者雞胚成纖維細(xì)胞、pam細(xì)胞和豬腎細(xì)胞等原代細(xì)胞。原代細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，用動(dòng)物體內(nèi)的組織進(jìn)行分離和制備。所述抗原滅活劑包括(但不限于)，例如福爾馬林、β－丙內(nèi)酯等等。所述防腐劑包括，例如硫柳汞。上述物質(zhì)的使用方法及用量均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)的藥物中的應(yīng)用?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過(guò)皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型?！邦A(yù)防”指通過(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染或推遲疾病發(fā)作的所有行為。“治療”指通過(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的癥狀減輕或好轉(zhuǎn)的所有行為。“豬繁殖與呼吸綜合征”指天然的prrsv感染豬后引起的一系列生理和病理的癥狀。這些癥狀包括，但不限于，發(fā)熱、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困難、咳嗽、母豬繁殖障礙、仔豬生長(zhǎng)緩慢等。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量。本發(fā)明中所述的“tcid50”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。dmem液體培養(yǎng)基(液)用購(gòu)自美國(guó)lifetechnologies公司的dmem干粉培養(yǎng)基按照其說(shuō)明書配制。本發(fā)明的dmem培養(yǎng)基參照gb/t18641-2002附錄a配制方法配制。本發(fā)明中所述的“pbs”是指磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline)的英文縮寫，本發(fā)明中使用的是0.01mm的ph7.4的pbs，按《分子克隆》第三版所述配制。實(shí)施例1病毒的采集分離從來(lái)自河南的疑似豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的樣本中分離，無(wú)菌采集豬扁桃體淋巴組織，以1∶10(體積比)加入dmem培養(yǎng)液，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，12000r/min離心15min，收集上清液，再經(jīng)0.22μm濾膜濾器過(guò)濾，在pam細(xì)胞上傳代37℃培養(yǎng)1h，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)5日。收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液。采用豬繁 殖與呼吸綜合征病毒pcr檢測(cè)試劑盒(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒，結(jié)果為陽(yáng)性；對(duì)分離的病毒利用利用pcr試劑盒進(jìn)行外源病毒的檢測(cè)豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒(豬偽狂犬病病毒rt-pcr檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒pcr檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒rt-pcr檢測(cè)試劑盒均為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公產(chǎn)品)，pcr檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明毒種純凈。將分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為hnjz15株，提交保藏。實(shí)施例2分離病毒的遺傳特性通過(guò)基因分析來(lái)確定實(shí)施例1中分離的病毒的遺傳特性。利用在pam細(xì)胞上分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組做模板，反轉(zhuǎn)錄成cdna，使用表1所示的引物進(jìn)行pcr。分別使用primerpremier5.0來(lái)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增gp5、gp2、nsp2基因的引物序列。pcr擴(kuò)增體系如下：模板cdna1μl，primerstarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，5×primestartmbuffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dntpmix(2.5mmeach)4μl，并用ddh2o將體積補(bǔ)足50μl。進(jìn)行兩步pcr反應(yīng)：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通過(guò)在含有溴化乙錠的1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析所得的pcr產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5核苷酸序列如seqno.1所示，gp2核苷酸序列如seqno.3所示，nsp2核苷酸序列如seqno.4所示。表1pcr引物序列實(shí)施例3商品化疫苗對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的免疫保護(hù)試驗(yàn)將43日齡prrsv抗體陰性仔豬15頭隨機(jī)分成3組，5頭/組，按照表2注射疫苗，對(duì)照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。商品化活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合征病毒jxa1-r株制備，病毒含量為106.0tcid50/ml；商品化滅活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株制備，病毒含量為滅活前106.0tcid50/ml。表2商品化疫苗的免疫保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物分組組別注射疫苗免疫劑量1商品化活疫苗2ml/頭2商品化滅活疫苗2ml/頭3dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表3，攻毒后每日測(cè)定仔豬體溫。表3商品化疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表3結(jié)果顯示，用現(xiàn)有的商品化豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗及滅活疫苗免疫仔豬，均不能完全阻斷病毒感染，只能提供部分保護(hù)作用，而對(duì)照組仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀；進(jìn)一步通過(guò)剖檢發(fā)現(xiàn)，免疫商品化活疫苗和滅活疫苗組剖檢后依然存在不同程度的肺病變。實(shí)施例4豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的制備將實(shí)施例1中分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株培養(yǎng)物接種于pam細(xì)胞，按照病毒培養(yǎng)液量的1％(v/v)接入形成單層的pam細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37℃培養(yǎng)，當(dāng)病變達(dá)到80％時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，測(cè)定毒價(jià)。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的終濃度為0.2％(v/v)，37℃滅活18小時(shí)，每4小時(shí)攪拌1次，每次攪拌10min，滅活完全后備用。實(shí)施例5豬瘟病毒抗原的制備將長(zhǎng)成良好單層的對(duì)豬瘟病毒兔化弱毒株高敏感的st細(xì)胞(購(gòu)自atcc)用含0.125％胰酶和0.03％edta的消化液,進(jìn)行消化分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入3％犢牛血清的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)按照m.o.i.＝0.1接毒劑量加入種毒,置于37℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后進(jìn)行第一次收毒，收毒后補(bǔ)加含1.5％犢牛血清的細(xì)胞維持液，以后每隔2天收毒一次，可連續(xù)收毒5次。最后收毒后將各批收毒的抗原混合置于-20℃儲(chǔ)藏。實(shí)施例6豬偽狂犬病毒抗原的制備將豬偽狂犬病病毒hn1201株培養(yǎng)物接種于pk-15細(xì)胞培養(yǎng)物先形成種子批，然后按病毒培養(yǎng)液量的1％(v/v)接入形成單層的pk細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，當(dāng)病變達(dá)到80％時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，測(cè)定毒價(jià)。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的終濃度為0.2％(v/v)，37℃滅活18小時(shí)，每4小時(shí)攪拌1次，每次攪拌10min，滅活完全后備用。實(shí)施例7豬圓環(huán)病毒抗原的制備將長(zhǎng)滿單層的pk15細(xì)胞(購(gòu)自atcc)，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，將pcv2毒種按0.1～0.2tcid50的接種量接種于pk15細(xì)胞上，37℃吸附30分鐘，加入細(xì)胞維持液，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每日觀察1～2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，36～37℃培養(yǎng)4～7日后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融2-3次后，收毒，測(cè)毒價(jià)。將病毒液用中空纖維(0.5μm～2μm)濾柱過(guò)濾，除去細(xì)胞碎片，再加入0.1％～0.2％的甲醛溶液37℃滅活24h，滅活完全后備用。實(shí)施例8副豬嗜血桿菌抗原的制備一級(jí)種子的繁殖：副豬嗜血桿菌血清4型js株、5型zj株凍干菌種，分別劃線接種于tsa/nad(tsa為bd公司生產(chǎn)，nad為roche公司生產(chǎn))平板上，置37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，選取符合要求的菌落，接種于tsb/nad(tsb為bd公司生產(chǎn)，nad為roche公司生產(chǎn))液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，作為一級(jí)種子；二級(jí)種子的繁殖：取副豬嗜血桿菌血清4型js株、5型zj株一級(jí)種子的培養(yǎng)物，按1％的量加入tsb/nad液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二級(jí)種子；在tsb培養(yǎng)基中，加入0.01～0.05％nad、5～10％的小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、0.1～5％的葡萄糖，將副豬嗜血桿菌血清4型js株、5型zj株菌液(二級(jí)種子)按1％的量加進(jìn)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37℃培養(yǎng)16～18小時(shí)，當(dāng)菌液的濃度od600達(dá)到2.5以上、do值開(kāi)始上升、ph值降低到6.5以下時(shí)停止培養(yǎng)?；罹?jì)數(shù)后按總量的0.2％(v/v)加入37％的甲醛溶液(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)，放置于37℃滅活24h，期間攪拌3～5次，滅活完全后備用。實(shí)施例9豬肺炎支原體抗原的制備一級(jí)種子的繁殖凍干菌種(hn0613株，保藏編號(hào)為cctccno.m2012230)，用液體培養(yǎng)基稀釋，劃線接種于固體培養(yǎng)基平皿上，置37℃培養(yǎng)7d，選擇生長(zhǎng)良好的菌落，接種于固體培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)7d，作為一級(jí)種子。二級(jí)種子的繁殖取少量液體培養(yǎng)基洗一級(jí)種子的斜面培養(yǎng)物，接種于液體培養(yǎng)基大管中，置37℃培養(yǎng)7d，作為二級(jí)種子。液體培養(yǎng)基的配方(按1065ml計(jì))：牛心浸出液300ml，ddh2o(二次蒸餾水)360ml，校正ph值到7.4，121℃滅菌15分鐘。再加入下列過(guò)濾除菌的成份：hank’s平衡鹽溶液(10×)(10倍濃縮)40ml，0.25％酚紅10ml，馬血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000iu/ml青霉素10ml，1％醋酸鉈溶液25m1。固體培養(yǎng)基的配方：在液體培養(yǎng)基中加入15gnobleagar(純化瓊脂)即可。將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬肺炎支原體二級(jí)種子液以1:10(v/v)接種于液體培養(yǎng)基中。37℃下培養(yǎng)3～6日，培養(yǎng)物下降0.5個(gè)ph值以上，純粹檢驗(yàn)合格后，再以同樣的方式擴(kuò)大培養(yǎng)(繼代次不超過(guò)6代)。取檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體菌液，按菌液體積總量緩慢加入終濃度為0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃滅活，其間每隔3～4h攪拌一次，24h后取出，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果無(wú)菌生長(zhǎng)。實(shí)施例10豬流感抗原的制備將sivh1n1亞型zjs株和h3n2亞型wx株毒種分別按病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,m.o.i.)為0.001的接種量分別接種于長(zhǎng)滿單層的mdck(購(gòu)自atcc，型號(hào)為atccccl-34tm)細(xì)胞上，37℃吸附30分鐘，加入含有3％體積比的犢牛血清和2mmd-氨基葡萄糖鹽酸的dmem液體培養(yǎng)基(用購(gòu)自美國(guó)lifetechnologies公司的d-mem干粉培養(yǎng)基按照其說(shuō)明書配制)，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，72h收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，收獲病毒，用中空纖維(0.5μm～2μm)濾柱(購(gòu)自gehealthcarelifesciences)過(guò)濾，除去細(xì)胞碎片，再加入0.2％～0.3％的甲醛溶液37℃滅活18h，滅活完全后備用。實(shí)施例11豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗的制備實(shí)施例5制備的豬瘟病毒抗原加入耐熱保護(hù)劑(2wt％明膠水溶液與15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混勻，定量分裝，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，即為豬瘟病毒活疫苗。用實(shí)施例4制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活抗原緩緩加入到水溶性佐劑gel佐劑(法國(guó)賽比克公司)中，加的過(guò)程中不斷用轉(zhuǎn)速為800rpm乳化機(jī)攪拌12min，混勻，4℃保存，使用時(shí)用豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗稀釋豬瘟病毒活疫苗，兩種抗原比例如表4中所示。分別取實(shí)施例4制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、實(shí)施例6制備的豬偽狂犬病病毒抗原緩緩加入到水溶性佐劑gel佐劑(法國(guó)賽比克公司)中，加的過(guò)程中不斷用轉(zhuǎn)速為800rpm乳化機(jī)攪拌12min，混勻，4℃保存，即為豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬偽狂犬病病毒二聯(lián)滅活疫苗。疫苗具體配比見(jiàn)表4。表4豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗成分配比實(shí)施例12豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗的制備分別取實(shí)施例4制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、實(shí)施例7制備的豬圓環(huán)病毒抗原、實(shí)施例8制備的副豬嗜血桿菌抗原、實(shí)施例9制備的豬肺炎支原體抗原、實(shí)施例10制備的豬流感病毒抗原緩緩加入到水溶性佐劑gel佐劑(法國(guó)賽比克公司)中，加的過(guò)程中不斷用轉(zhuǎn)速為800rpm乳化機(jī)攪拌12min，混勻，4℃保存，即為豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬流感的聯(lián)合滅活疫苗。疫苗具體配比見(jiàn)表5。表5豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗成分配比組分疫苗3疫苗4疫苗5疫苗6prrsv抗原(tcid50/ml)107.0107.0107.0107.0pcv2抗原(tcid50/ml)106.0———4型hps抗原(cfu/ml)—109.0——5型hps抗原(cfu/ml)—109.0——m.hyo抗原(mhdce/ml)——109.0—h1n1亞型siv抗原(eid50/ml)———106.0h3n2亞型siv抗原(eid50/ml)———106.0gel佐劑(v/v％)10101010實(shí)施例13豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗的免疫原性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用健康仔豬40頭，分為八組，每組5頭。所用的健康仔豬中，豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟及豬偽狂犬病的抗原、抗體都呈雙陰性。第1組、第2組免疫實(shí)施例11制備的疫苗1；第3組、第4組免疫實(shí)施例11制備的疫苗2；第5組、第6組、第7組為攻毒對(duì)照組；第8組為陰 性對(duì)照組。疫苗免疫組每只豬頸部肌肉注射疫苗2ml，單次免疫。具體分組情況將表6。表6豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗的免疫原性試驗(yàn)分組組別注射疫苗免疫劑量1疫苗12ml/頭2疫苗12ml/頭3疫苗22ml/頭4疫苗22ml/頭5攻毒對(duì)照—6攻毒對(duì)照—7攻毒對(duì)照—8陰性對(duì)照—疫苗免疫后28天，第1組、第3組、第5組攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，第2組、第6組攻毒劑量為豬瘟石門系血毒1ml(105最小致死量)，第4組、第7組攻毒劑量為豬偽狂犬病病毒hn1201株豬偽狂犬病病毒2×108.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表7。表7豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，本發(fā)明制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合疫苗接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征流行株的攻擊、豬瘟強(qiáng)毒攻擊及豬偽狂犬流行株攻擊均可產(chǎn)生良好的保護(hù)作用，攻毒對(duì)照組均發(fā)病，表現(xiàn)明顯臨床癥狀。實(shí)施例14豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗的免疫原性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用健康仔豬70頭，分為14組，每組5頭。所用的健康仔豬中，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體及豬流感的抗原、抗體都呈雙陰性。第9組、第10組免疫實(shí)施例12制備的疫苗3；第11組、第12組免疫實(shí)施例12制備的疫苗4；第13組、第14組免疫實(shí)施例12制備的疫苗5；第15組、第16組免疫實(shí)施例12制備的疫苗6；第17組、第18組、第19組、第20組、第21組為攻毒對(duì)照組；第22組為陰性對(duì)照組。疫苗免疫組每只豬頸部肌肉注射疫苗2ml，單次免疫。具體分組情況將表8。表8豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗的免疫原性試驗(yàn)分組疫苗免疫后28天，第9組、第11組、第13組、第15組、第17組攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，第10組、第18組攻毒劑量為豬圓環(huán)病毒sh株2×106.0tcid50/頭，第12組、第19組攻毒劑量為副豬嗜血桿菌4型js株和5型zj株混合菌液6×109.0cfu/頭，第14組、第20組攻毒劑量為豬肺炎支原體cvcc354株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，該菌株為中國(guó)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏的豬支原體肺炎疫苗效力檢驗(yàn)用毒株)氣管注射5ml/頭(100mid)，第16組、第21組攻毒劑量為h1n1亞型豬流感病毒zjs株和h3n2亞型豬流感病毒wx株混合液2ml(106.0eid50/0.1ml),觀察臨床癥狀見(jiàn)表9。表9豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，本發(fā)明制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒聯(lián)合疫苗接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征流行株的攻擊、豬圓環(huán)病毒強(qiáng)毒攻擊、副豬嗜血桿菌攻擊、豬肺炎支原體攻擊及豬流感攻擊均可產(chǎn)生良好的保護(hù)作用，攻毒對(duì)照組均發(fā)病，表現(xiàn)明顯臨床癥狀及剖檢變化，與免疫保護(hù)組差異明顯。實(shí)施例15豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白的制備1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5基因克隆載體的構(gòu)建在生長(zhǎng)良好的pam細(xì)胞上接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其不同代次的培養(yǎng)物，收獲病毒后用takara公司minibestviralrna/dnaextractionkitver.3.0試劑盒提取prrsv基因組rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，取1μlcdna作為模板，利用gp5特異性引物(下劃線為酶切位點(diǎn))：gp5-f(5’-3’):cgcggatccttggggaaatgcttgaccg(bamhi)gp5-r(5’-3’):cccaagcttctatggacgaccccattgttc(hindш)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用takara的高保真酶hsdnapolymerase，擴(kuò)增條件為：98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。pcr產(chǎn)物命名為gp5。其核苷酸序列見(jiàn)seqno.1，推導(dǎo)其氨基酸序列為seqno.2。pcr擴(kuò)增gp5基因后，膠回收目的片段后，用bamhi和hindш 分別雙酶切膠回收產(chǎn)物和pfastbactmhta載體(購(gòu)自invitrogen公司，貨號(hào)10584-027)，37℃反應(yīng)2h，膠回收酶切片段，將回收的gp5連接到pfastbactmhta載體上。酶切體系：10×fdgreenbuffer5μl，dna/載體1-2μg，fdbamhi2μl，fdhindш2μl，補(bǔ)ddh2o至50μl，37℃反應(yīng)1h。于1％瓊脂糖凝膠電泳回收載體和目的片段。建立10μl連接體系：10×t4dnaligasebuffer1μl，t4dnaligase1μl，載體酶切膠回收產(chǎn)物2μl，目的片段酶切膠回收產(chǎn)物6μl，于22℃連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行pcr鑒定和測(cè)序鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒，命名為pfastbacht-gp5。2.重組bacmid的獲取及鑒定pfastbacht-gp5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen，貨號(hào)：10361-012)，pfastbacht-gp5和感受態(tài)細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒bacmid進(jìn)行轉(zhuǎn)座，用invitrogen的purelinktmhipureplasmiddnaminiprepkit提取獲得的重組質(zhì)粒，并用pucm13forward/pucm13reverse引物鑒定gp5的插入，陽(yáng)性重組穿梭質(zhì)粒bacmid命名為bacmid-gp5。3.轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒按照invitrogen公司bac-to-bachbmtoposecretedexpressionsystem的說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行。6孔板每孔鋪8×105個(gè)sf9細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后按照cellfectinⅱ轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別稀釋8μlcellfectinⅱ和1μgbacmid-gp5dna到100μlsf-900ⅱ培養(yǎng)基中，激烈振蕩混勻，混合稀釋后的dna與稀釋后的cellfectinⅱ(總體積～210μl),混合均勻室溫孵育15～30min，逐滴滴加到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后72h待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，記為p0代重組病毒vbac-gp5。p0代重組病毒vbac-gp5以0.1moi感染sf9細(xì)胞，經(jīng)3代擴(kuò)大培養(yǎng)后，獲得的p3代vbac-gp5用于重組蛋白表達(dá)。4.重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞獲得重組蛋白將p3代重組桿狀病毒vbac-gp5接種sf9細(xì)胞。在500ml三角瓶 中懸浮培養(yǎng)sf9細(xì)胞，至細(xì)胞密度達(dá)到7.0×105cell/ml后，按照5moi的量接種病毒，感染后72h-96h，5000g離心10min，收集細(xì)胞沉淀。按5-10ml/克菌體量加入bindbuffer(20mm磷酸鈉、500mm氯化鈉、20mm咪唑)重懸細(xì)胞沉淀，超聲裂解細(xì)胞，10000g，離心15min，上清按照ge公司his純化試劑盒(gehealthcare，貨號(hào)：28-4013-51)說(shuō)明書進(jìn)行。sds-page光密度法測(cè)定蛋白含量為200μg/ml。實(shí)施例16豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5亞單位疫苗的制備將實(shí)施例15制備的亞單位抗原，用pbs液(ph7.4)稀釋至表10的蛋白含量，與206佐劑(法國(guó)seppic公司產(chǎn)品)按照體積比50:50混合，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘。表10豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗的制備組別蛋白含量(μg/ml)206佐劑含量(v/v％)疫苗72550疫苗810050實(shí)施例17豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5亞單位疫苗的免疫原性試驗(yàn)將43日齡prrsv抗體陰性仔豬15頭隨機(jī)分成3組，5頭/組，按照表11的設(shè)定注射實(shí)施例16制備的疫苗，對(duì)照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。表11亞單位疫苗免疫原性試驗(yàn)動(dòng)物分組組別注射疫苗免疫劑量23疫苗72ml/頭24疫苗82ml/頭25dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表12，攻毒后每日測(cè)定仔豬體溫見(jiàn)表13。表12豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表13豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗免疫仔豬攻毒后體溫變化天數(shù)23組24組25組攻毒后1天39.439.539.5攻毒后2天39.439.741.4攻毒后3天39.639.641.2攻毒后4天39.739.641.5攻毒后5天39.639.541.4攻毒后6天39.539.341.3攻毒后7天39.539.641.3表12和表13的結(jié)果顯示，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株亞單位疫苗免疫仔豬，能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護(hù)，而對(duì)照仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀，因此，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株亞單位疫苗具有很好的保護(hù)力。以上全面描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但是可對(duì)它們進(jìn)行各種替代和修改。因此，不應(yīng)參照以上描述來(lái)決定本發(fā)明的范圍，而是應(yīng)參照所附權(quán)利要求書及其全部等同物來(lái)決定本發(fā)明的范圍。任何特征，(不論是否為優(yōu)選)均可與任何其他特征(不論是否為優(yōu)選)相結(jié)合。本發(fā)明的權(quán)利要求書不應(yīng)被理解為具有方法+功能的限制，除非在某一權(quán)利要求中通過(guò)術(shù)語(yǔ)“…的方法”明確地列舉出此類限制。當(dāng)前第1頁(yè)12