專利名稱：禽卡氏桿菌pcr診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
禽卡氏桿菌病是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋雞的一種傳染病，是由卡氏桿菌 (Gallibacterium anatis)引起蛋雞群的一種產(chǎn)蛋量下降的疾病，臨床上以輸卵管囊腫和卵巢炎等為主要特征。卡氏桿菌不僅是禽卡氏桿菌病的病原，而且還能夠引起其他多種禽類患病?？ㄊ蠗U菌常與雞減蛋綜合征病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、霉形體、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和復(fù)雜化，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。卡氏桿菌為兩端鈍圓的球桿菌，有時呈現(xiàn)多形性，無芽孢，不運(yùn)動。菌體單個散在或成對分布。革蘭氏染色陰性。 瑞氏和美蘭染色呈兩極著色，有明顯或微弱莢膜，需氧菌。目前已鑒定的卡氏桿菌有M個血清型。其中有3個致病性血清型，分別為1型、2型和4型。隨著研究的逐步深入，卡氏桿菌的血清型越來越趨于多樣化，在同一個雞場，血清型的分布也會有所不同；而且，各血清型之間沒有交叉免疫保護(hù)作用?，F(xiàn)在缺少一種能對臨床樣品中的禽卡氏桿菌進(jìn)行簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測病料中是否含有卡氏桿菌，并且簡便、靈敏、準(zhǔn)備。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1濃度為25 mg/ ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的 Marker DL2000，50 μ 1等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20 μ M，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。裂解液為由Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及占裂解液總體積5%的 triton X-100組成的混合溶液。PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。引物Ρ1，Ρ2的序列分別為 陰性對照為去離子水；
陽性對照為重組PMD18-T-16srRNA質(zhì)粒。PCR方法的建立
PCR體系在25 μ 1反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為，退火溫度60° C，Taq DNA polymerase 1 U，引物濃度ΙΟμΜ，用引物均有效擴(kuò)增出了其目的片段，片段大小為780bp。無非特異性片段產(chǎn)生(見圖1)。結(jié)果表明禽卡氏桿菌PCR檢測方法建立成功。敏感性試驗(yàn)
在PCR反應(yīng)中，10CFU/ml 1 X IO7 CFU/ml稀釋的卡氏桿菌進(jìn)行PCR，卡氏桿菌的最低檢測量為1000CFU (見圖2)。結(jié)果表明建立的PCR敏感性高。特異性試驗(yàn)
以禽卡氏桿菌血清型1型、2型、4型、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌進(jìn)行PCR反應(yīng)。禽卡氏桿菌為陽性，而豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、 大腸桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(見圖3)。應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測卡氏桿菌DNA樣品3次，結(jié)果均一致。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以知道禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒能夠?qū)εR床中禽卡氏桿菌進(jìn)行快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了檢測禽卡氏桿菌PCR試劑盒，通過PCR檢測結(jié)果與陰性對照及陽性對照比較，可以得到檢測結(jié)論， 從而起到快速檢測病料中是否含有禽卡氏桿菌。本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，檢測方式簡單，使用效果好。


附圖1為禽卡氏桿菌PCR試驗(yàn)圖；M:DL2000 ；1 禽卡氏桿菌PCR結(jié)果。附圖2為禽卡氏桿菌PCR敏感性試驗(yàn)圖；M :DL2000 ;1 7 :1X107 CFU/ml 10CFU/ml稀釋的禽卡氏桿菌PCR結(jié)果。附圖3為PCR特異性試驗(yàn)圖；M :DL2000 ； 1-3 禽卡氏桿菌1型、2型、4型PCR產(chǎn)物； 4 豬鏈球菌PCR產(chǎn)物；5 多殺性巴氏桿菌PCR產(chǎn)物；6 鼠傷寒沙門氏菌PCR產(chǎn)物；7 大腸桿菌PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500μ 1濃度為25 mg/ml 的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，TE緩沖液的具體組成成分為"Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0 ；50 μ IPCR酶，PCR酶為自配的PCR預(yù)混液，其具體成分為IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1 ；200 μ 1 超純水，30 μ 1 的 Marker DL2000,50y 1 等體積混合的引物 Pl， P2，引物PI、P2的濃度均為20 μ M，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
權(quán)利要求
1.一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的Marker DL2000, 50 μ 1等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于裂解液為由 Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及占裂解液總體積5%的triton X-100組成的混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于PCR酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 iTaq DNA polymerase/μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于引物Pl，Ρ2的序列分別為P1 TTGAAAGCTTGCTTTCAATGC ；P2 :TCGAGAGCCATACCTTTCGTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于陰性對照為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特征在于陽性對照為重組 PMD18-T-16srRNA 質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500μl濃度為25mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE緩沖液，50μlPCR酶，200μl超純水，30μl的MarkerDL2000，50μl等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，30μl的陰性對照以及30μl的陽性對照。本發(fā)明通過對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，通過PCR檢測結(jié)果與陽性對照和陰性對照比較，得出檢測結(jié)論，從而起到快速鑒定菌株中是否含有禽卡氏桿菌溶血素基因。本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，檢測方法簡單，使用效果確實(shí)。
文檔編號C12Q1/68GK102321742SQ201110222208
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者馮惠明, 孫志華, 徐安衡, 李武魁, 楊向東, 楊德明, 許玉清 申請人:云南瑞特農(nóng)牧發(fā)展有限公司