專利名稱：：過表達(dá)RimL的大腸桿菌及其在制備N-乙酰化胸腺素α中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種過表達(dá)RimL的大腸桿菌及其在制備N-乙?；叵偎卅林械膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛋白和多肽的N-末端乙?；揎検钦婧思?xì)胞中普遍存在的一種修飾，50%以上的真核細(xì)胞胞漿蛋白都有這種修飾。初步的功能研究表明N-末端乙酰化可通過改變N-端的電荷性，封閉N端等方式，對(duì)許多蛋白和多肽的空間結(jié)構(gòu)、配體識(shí)別、抗降解等特性產(chǎn)生重要影響。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙?；揎棿龠M(jìn)了其與膜受體Syslp/hSysl的識(shí)別，并使其定位到膜上。胎兒血紅蛋白的N-末端乙?；梢允蛊渌木垠w的解聚能力提高30倍。胸腺素α1(thymosinα1，Tα1)的Ν_末端乙?；瘜?duì)其在血漿中的穩(wěn)定性具有重要作用。除了Τα1外，還有如黑色素細(xì)胞刺激素(Melanocyte-MimulatingHormones,a-MSH)、胸腺素β4(Thymosinβ4，Tβ4)等一批在臨床上具有重要應(yīng)用的多肽也需要N-末端乙?；揎?。與真核生物中的普遍存在現(xiàn)象明顯不同的是，原核生物的N-末端乙?；揎椃浅：币?。在大腸桿菌內(nèi)源蛋白中已知發(fā)生N-末端乙?；揎椀闹挥泻颂求w亞基L7、S5、S18、延長(zhǎng)因子EF-Tu和伴侶蛋白kcB等為數(shù)不多的幾種蛋白。大腸桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的參與蛋白和多肽的N-末端乙酰化修飾的乙?；D(zhuǎn)移酶只有負(fù)責(zé)核糖體亞基S5乙酰化修飾的RimI，核糖體亞基S18乙?；揎椀腞imJ，和核糖體亞基L7乙?；揎椀腞imL。這些乙?；D(zhuǎn)移酶有很強(qiáng)的底物專一性。除上述每個(gè)酶對(duì)應(yīng)的特異性底物外，未知其能修飾大腸桿菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫調(diào)節(jié)多肽，它們包括胸腺素α原、胸腺素a1、胸腺素a11及其各種融合蛋白等。胸腺素a1和胸腺素a11是胸腺素α原在體內(nèi)降解的產(chǎn)物，它們分別包括了胸腺素α原的化端觀和35個(gè)氨基酸。不同物種的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的氨基酸序列上某些位點(diǎn)存在多態(tài)性，如其N-端第13位氨基酸殘基，有的是蘇氨酸，有的是異亮氨酸，它們具有相同或相似的功能。胸腺肽是一類動(dòng)物胸腺中提取的包含各種胸腺素α及其它胸腺來源肽類的免疫制劑，已廣泛用于病毒性肝炎、腫瘤等的治療。但動(dòng)物提取的胸腺肽存在成分復(fù)雜，純度低，其中混有動(dòng)物來源的污染物，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)等問題?；瘜W(xué)合成的N-乙酰化胸腺素al，是一種采用多肽化學(xué)合成方法制備的N-乙?；叵偎豠1，此種方法獲得的Ta1純度高、活性高、沒有明顯的副反應(yīng)，如kiClone公司的“日達(dá)仙”，已被包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于病毒性肝炎的治療獲作為免疫調(diào)節(jié)藥物；但化學(xué)合成N-乙?；叵偎豠1這樣一個(gè)觀個(gè)氨基酸的多肽，合成和純化工藝復(fù)雜，得率較低，因此制品價(jià)格高，限制了該藥的廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為如下1)或2)1)將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降闹亟M菌；所述宿主菌為基因組中含有RimL編碼基因的宿主菌；2)將胸腺素α的編碼基因?qū)肴缦滤龅闹亟M菌中得到的重組菌；所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個(gè)氨基酸相同或其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的28個(gè)氨基酸至少具有90%同源性。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。1)所示的重組菌中，所述將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因?qū)胨拗骶姆椒òㄈ缦虏襟Ea)將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導(dǎo)入所述宿主菌，得到重組菌A；b)將所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體1導(dǎo)入步驟a)得到的所述重組菌A，得到重組菌；所述重組載體1為所述胸腺素α編碼基因插入表達(dá)載體1中，得到表達(dá)胸腺素α的重組載體1；所述表達(dá)載體1優(yōu)選為PBV220；所述重組載體1具體為將所述胸腺素α編碼基因插入PBV220的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)間，得到表達(dá)胸腺素α的重組載體1；所述重組菌A為將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導(dǎo)入宿主菌中，得到的重組菌A；所述表達(dá)載體2優(yōu)選為pOKBV；所述重組載體2具體為將所述RimL的編碼基因插入pOKBV載體中的EcoRI和MlI酶切位點(diǎn)間中，得到表達(dá)RimL的重組載體2。1)所示的重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌；所述RimL編碼基因是如下1)或2)任一所示的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；所述胸腺素α編碼基因?yàn)橐环N多核苷酸，其核苷酸序列與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組菌Α。本發(fā)明提供的重組菌Α，為將所述RimL的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入宿主菌中，得到的重組菌A；所述重組載體為將所述RimL的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)RimL的重組載體，所述表達(dá)載體是通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制RimL的編碼基因表達(dá)的。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體T7、PL,Pe啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV所述表達(dá)載體優(yōu)選為P0KBV。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體T7、PL,Pe啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV所述宿主菌為大腸桿菌；所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體T7啟動(dòng)子，其核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述乙酰基轉(zhuǎn)移酶為RimL，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述重組菌按照如下方法制備1)將pKD46質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌中，得到重組菌1；2)將含有T7啟動(dòng)子的DNA分子導(dǎo)入步驟1)得到的重組菌1中，得到重組菌2；3)將步驟2、得到的重組菌2分別在含氯霉素的培養(yǎng)基和含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，若能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的即為重組菌；所述含有T7啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列5的1119-1135位核苷酸。所述的重組菌在制備N-乙?；叵偎卅林械膽?yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備N-乙酰化胸腺素α的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到N-乙?；叵偎卅?；所述發(fā)酵的溫度為42°C，所述發(fā)酵時(shí)間為12h。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶RimL和胸腺素α的編碼基因進(jìn)行共表達(dá)得到的重組菌，發(fā)酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙?；叵偎卅?，不僅可以提高N-乙?；叵偎卅恋漠a(chǎn)率，而且可以通過減少非乙?；叵偎卅恋谋壤?，方便N-乙?；叵偎卅恋姆蛛x，具有明顯的應(yīng)用前景。圖1為過表達(dá)RimL的SDS-PAGE分析圖2為大腸桿菌中過表達(dá)RimL對(duì)α乙酰化水平的影響(橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)代表紫外吸收值(mAU))圖3為red同源DNA分子結(jié)構(gòu)示意4為大腸桿菌中T7誘導(dǎo)表達(dá)基因組中RimL對(duì)α乙酰化水平的影響(橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)代表紫外吸收值(mAU))具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述的序列均可人工合成。實(shí)施例1、表達(dá)胸腺素α的RimL過表達(dá)的大腸桿菌的構(gòu)建一、N-乙?；D(zhuǎn)移酶RimL過表達(dá)的大腸桿菌的構(gòu)建1、pOKBV質(zhì)粒的構(gòu)建因要共表達(dá)RimL和胸腺素α，考慮到質(zhì)粒不相容性，遂將pBV220(購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司。)的復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因替換為質(zhì)粒P0K12(JeffreyVieiraandJoachimMessing.NewpUC-derivedcloningvectorswithdifferentselectablemarkersandDNAreplicationorigins·Gene，1991，100:189_194，可從該文獻(xiàn)提供的信息中構(gòu)建，載體的構(gòu)建方法已在許多文獻(xiàn)公開(如j.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995；p0K12載體Genbank號(hào)為AF223639，根據(jù)已經(jīng)公開的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫(kù)(Genbank)等中找到，因此可以利用基因全合成的方式獲得。)的P15A復(fù)制子和卡那霉素抗性基因，具體如下以質(zhì)粒pBV220為模板，用引物220-5’SphI(AAAAGCATGCAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTAT)及220-3，SacI(AAAAGAGCTCATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG)擴(kuò)增，得到1.8k的PCR產(chǎn)物，即為PBV220的溫敏操縱子。用SphI及Mel酶切上述得到的PBV220的溫敏操縱子，得到酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到質(zhì)粒P0K12載體片段連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將PBV220的溫敏操縱子插入質(zhì)粒Ρ0Κ12的SphI及Mel酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pOKBV，將含有該質(zhì)粒的菌命名為DH5α/pOKBVο2、RimL基因的克隆提取大腸桿菌DH5ci(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)⑶201)的基因組DNA為模板(方法見J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995)，用引物L(fēng)5’-EcoRI(AAAAGAATTCATGACTGAAACGATAAAAGTAAGCGAA)禾ΠL3，-SalI(AAAAGTCGACTTATTGTGAATCGATAATACGCGCGTA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到540bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸，其氨基酸序列為序列2，經(jīng)過比對(duì)為N-乙?；D(zhuǎn)移酶RimL。表1為RimL氨基酸序列的網(wǎng)上比對(duì)部分結(jié)果權(quán)利要求1.一種重組菌，為如下1)或2)1)將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降闹亟M菌；所述宿主菌為基因組中含有RimL編碼基因的宿主菌；2)將胸腺素α的編碼基因?qū)肴缦聶?quán)利要求6-8中任一所述的重組菌中得到的重組菌；所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個(gè)氨基酸相同或其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個(gè)氨基酸至少具有90%同源性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于1)所示的重組菌中，所述將RimL的編碼基因和所述胸腺素α的編碼基因?qū)胨拗骶姆椒òㄈ缦虏襟Ea)將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導(dǎo)入所述宿主菌，得到重組菌A；b)將所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體1導(dǎo)入步驟a)得到的所述重組菌A，得到重組菌；所述重組載體1為所述胸腺素α編碼基因插入表達(dá)載體1中，得到表達(dá)胸腺素α的重組載體1；所述表達(dá)載體1優(yōu)選為PBV220；所述重組載體2為將所述RimL的編碼基因插入表達(dá)載體2中，得到表達(dá)RimL的重組載體2，所述表達(dá)載體2優(yōu)選為pOKBV。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于1)所示的重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌；所述RimL編碼基因是如下1)或2)所示的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；所述胸腺素α編碼基因?yàn)橐环N多核苷酸，其核苷酸序列與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子。4.一種重組菌Α，為將所述RimL的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入宿主菌中，得到的重組菌A；所述重組載體為將所述RimL的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)RimL的重組載體，所述表達(dá)載體是通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制RimL的編碼基因表達(dá)的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體T7、h、PK啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV所述表達(dá)載體優(yōu)選為P0KBV。6.一種重組菌，為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體17、&、&啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的重組菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體T7啟動(dòng)子，其核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述乙?；D(zhuǎn)移酶為RimL，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。9.權(quán)利要求1-8中任一所述的重組菌在制備N-乙?；叵偎卅林械膽?yīng)用。10.一種制備N-乙酰化胸腺素的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到N-乙?；叵偎卅?；所述發(fā)酵的溫度為42°C，所述發(fā)酵時(shí)間為12h。全文摘要本發(fā)明公開了一種過表達(dá)RimL的大腸桿菌及其在制備N-乙?；叵偎卅林械膽?yīng)用。本發(fā)明提供了一種重組菌，為將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降闹亟M菌。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶RimL和胸腺素α的編碼基因進(jìn)行共表達(dá)得到的重組菌，發(fā)酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙?；叵偎卅?，具有明顯的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12R1/19GK102277327SQ20111022141公開日2011年12月14日申請(qǐng)日期2011年8月3日優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日發(fā)明者劉波,吳軍,唱韶紅,鞏新,馬清鈞申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所