專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ctl表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineR印roductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種豬高度接觸性傳染病。不同品種、年齡和性別的豬均可感染，以妊娠母豬和I月齡以內(nèi)的仔豬最易感。PRRS以母豬的流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬的呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。1987年美國(guó)首先報(bào)道了該病的發(fā)生，隨后短短幾年時(shí)間，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)。最初，由于人們不能確定其病因，故稱其為“豬神秘病”(swine Mystery disease, SMD)、“豬不育和呼吸道 綜合征”(Swine infertility and respiratory syndrome, SIRS)和“豬藍(lán)耳病”(Blue ear disease)等。1991年，荷蘭中央獸醫(yī)研究所研究人員用豬肺泡巨噬細(xì)胞首次分離到病原，并命名為L(zhǎng)elystadvirus (PRRSV歐洲型代表株)。1992年美國(guó)研究人員用CL2621細(xì)胞也分離到PRRSV美洲型代表株(VR2332)。1992年，國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)將其統(tǒng)一命名為“豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS) ”，并在同年5月將該病列為B類傳染病。目前，PRRS在幾乎所有養(yǎng)豬國(guó)家中存在，成為危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的疫病之一，嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)和世界公共衛(wèi)生。1996年，郭寶清等首次從北京豬流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到PRRSV，從而證實(shí)該病在我國(guó)存在。不久，我國(guó)其他地方也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)PRRS，該病的流行嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康有序發(fā)展。特別是2006年-2007年，在我國(guó)爆發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HighlyPahogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, HP-PRRS),此次疫情給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了前所未有的沖擊。由此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2008年12月11日公布的動(dòng)物疫病名錄中將HP-PRRS劃為一類動(dòng)物疫病。目前使用的疫苗(弱毒疫苗和滅活疫苗)雖然可一定程度地控制PRRS的流行與發(fā)生，但難以達(dá)到有效控制該病。我們認(rèn)為對(duì)于PRRS這類病毒性疫病，只有在研究清楚其發(fā)病機(jī)制與免疫機(jī)理的基礎(chǔ)上，才能更加有效地開展預(yù)防與治療。但是，迄今為止，對(duì)于PRRS的免疫機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的了解，特別是在豬細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)特異性細(xì)胞免疫研究領(lǐng)域。豬細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過(guò)識(shí)別主要組織相容性I (MHC I，豬稱為SLA-Ι)類分子與結(jié)合抗原表位多肽的復(fù)合物而殺傷靶細(xì)胞。CTL是機(jī)體是清除病毒、控制病毒復(fù)制和擴(kuò)散的主要機(jī)制之一。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞性免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答對(duì)于清除PRRSV都十分重要，近期的研究顯示PRRSV在淋巴結(jié)等的病毒量和CTL呈負(fù)相關(guān)，這表明在清除機(jī)體PRRSV感染方面，特異性CTL免疫應(yīng)答起著更重要的作用。PRRSV CTL表位是指PRRSV多肽經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)加工后結(jié)合于SLA-1類分子，再表達(dá)于APC細(xì)胞表面，被CTL細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)特異性識(shí)別，從而引起豬CTL免疫應(yīng)答的多肽(為8-10個(gè)氨基酸殘基的短肽)。因此，鑒定PRRSVCTL表位對(duì)于研究PRRSV感染的發(fā)病機(jī)制、免疫機(jī)理以及研制多肽疫苗等分子疫苗具有重要的意義。
目前，用于鑒定豬CTL表位的方法有4種以上，主要包括有限稀釋法(Limitingdilution analysis, LDA)、51Cr 釋放法、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(Intracellar CytokineStaining, ICS)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-1 ink immunospot assay, ELISP0T)等。但這些方法十分模糊，均未涉及豬種屬SLA-1等位基因的限制性。豬經(jīng)典SLA-1具有3個(gè)基因座，即SLA-1、SLA-2和SLA-3，因此，要鑒定某一 SLA-1等位基因的PRRSVCTL表位以及解析其在抗PRRSV免疫中的作用，目前還是世界范圍內(nèi)的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多肽及其應(yīng)用，該多肽能與豬SLA-1分子結(jié)合。本發(fā)明所提供的多肽，名稱為NSP9_tmp，來(lái)源于豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其氨基酸序列為序列表中序列I所示。編碼所述多肽NSP9_tmp的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式(例如mRNA、hnRNA、tRNA或任意其它形式)，也可以是DNA形式(包括但不限于通過(guò)克隆或合成產(chǎn)生，或其任意組合而產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA)。DNA可以是三鏈、雙鏈或單鏈，或其任意組合。DNA或RNA的至少一條鏈的任意部分可以是編碼鏈，也稱作有義鏈，或可以是非編碼鏈，也稱作反義鏈。編碼所述多肽NSP9_tmp的核酸分子具體可為序列表中序列2所示的DNA分子。含所述核酸分子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)如下物質(zhì)中的任一種在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用:I)所述多肽；2)所述核酸分子；3)所述重組表達(dá)載體；4)所述表達(dá)盒；5)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；6)所述重組菌；7)所述重組病毒載體。本發(fā)明還保護(hù)一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種:I)所述多肽；2)所述核酸分子； 3)所述重組表達(dá)載體；4)所述表達(dá)盒；5)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；6)所述重組菌；7)所述重組病毒載體。需要的時(shí)候，在上述疫苗中還可以加入一種或多種疫苗佐劑。本發(fā)明的疫苗可通過(guò)注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。本發(fā)明還保護(hù)如下物質(zhì)中的任一種在制備⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖劑中的應(yīng)用:I)所述多肽；2)所述核酸分子；3)所述重組表達(dá)載體；4)所述表達(dá)盒；5)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；6)所述重組菌；7)所述重組病毒載體。本發(fā)明還保護(hù)一種⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖劑，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種:I)所述多肽；2)所述核酸分子；3)所述重組表達(dá)載體；4)所述表達(dá)盒；

5)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；6)所述重組菌；7)所述重組病毒載體。所述⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖劑可促進(jìn)豬的⑶8+T淋巴細(xì)胞增殖。本發(fā)明以豬繁殖與呼吸綜合征病毒天然宿主豬為研究對(duì)象，鑒定出的豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的CTL表位多肽NSP9_tmp。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所鑒定的來(lái)源于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多肽NSP9_tmp能與豬SLA-1分子結(jié)合，可用于制備針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗，以及制備豬的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖劑。


圖1為SLA-1分子重鏈、s β 2m和多肽NSP9_tmp共復(fù)性的分子篩層析及SDS-PAGE鑒定結(jié)果。其中，A為SLA-1分子重鏈、si3 2m和多肽NSP9_tmp共復(fù)性的分子篩層析結(jié)果；B為分子篩層析后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。圖2為SLA-1分子重鏈/s β 2m/多肽NSP9_tmp復(fù)合物的離子交換層析及SDS-PAGE鑒定結(jié)果。其中，A為SLA-1分子重鏈、s β 2m和多肽NSP9_tmp復(fù)合物的離子交換層析結(jié)果；B為離子交換層析后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。圖3為SLA-1分子重鏈和s β 2m共復(fù)性的分子篩層析及SDS-PAGE鑒定結(jié)果。其中，A為SLA-1分子重鏈和s β 2m共復(fù)性的分子篩層析結(jié)果；B為分子篩層析后的SDS-PAGE
鑒定結(jié)果。圖4為SLA-1*1502-BSP、s β 2m與多肽NSP9_tmp共復(fù)性的分子篩層析及SDS-PAGE鑒定結(jié)果。其中，A為SLA-1*1502-BSP、s β 2m與多肽NSP9_tmp共復(fù)性的分子篩層析結(jié)果；B為分子篩層析后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。圖5為SLA-1*1502-BSP、s β 2m與多肽NSP9_TMP共復(fù)性的離子交換層析及SDS-PAGE鑒定結(jié)果。其中，A為SLA-l*15O2-BSP、s0 2m與多肽NSP9_tmp共復(fù)性的離子交換層析結(jié)果；B為離子交換析后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。圖6為SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp復(fù)合物分子四聚體的SDS-PAGE電泳分析。其中，泳道I為PE標(biāo)記的鏈酶親和素；泳道2為SLA-l*1502-BSP/s β 2m/NSP9_TMP肽的四聚體；泳道3為生物素化的SLA-l*15O2-BSP/s0 2m/NSP9_TMP肽單體。圖7為NSP9_tmp多肽特異性的CTL細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果。其中，A為對(duì)照組；B為免疫組。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位是通過(guò)以下方法鑒定得到的:(I)首先確定SLA-1等位基因類型，預(yù)測(cè)SLA-1限制性結(jié)合的PRRSV表位多肽；選擇親和性高的表位多肽NSP9_tmp合成，多肽純度> 90%。(2)4°C條件下，共復(fù)性SLA-1重鏈和輕鏈包涵體蛋白以及多肽NSP9_tmp，它們之間的摩爾比是1:1: 3。復(fù)性時(shí)間為24-48小時(shí)。(3)復(fù)性結(jié)束后，濃縮并去除沉淀，過(guò)分子篩層析鑒定它們是否結(jié)合。在分子篩層析圖上，確定復(fù)合物分子蛋白峰的位置。根據(jù)層析圖以及SDS-PAGE電泳分析判定多肽NSP9_tmp是否與SLA-1重鏈和輕鏈結(jié)合。(4)取上步的復(fù)合物分子蛋白峰樣品，過(guò)離子交換層析，根據(jù)層析圖和SDS-PAGE電泳分析判定多肽NSP9_tmp與SLA-1重鏈和輕鏈結(jié)合的穩(wěn)定性。(5)通過(guò)在SLA-1分子重鏈的羧基端引入BirA酶底物肽(BSP)序列的方法，制備SLA-l*1502-BSP/s β 2m/ 多肽 NSP9_tmp 四聚體。
·
(6)用PRRSV弱毒疫苗對(duì)SPF豬進(jìn)行首免，再用多肽NSP9_tmp加強(qiáng)免疫兩次，采外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。(7)用FITC標(biāo)記的抗豬CD8抗體及PE標(biāo)記的SLA-l*1502_BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp四聚體對(duì)PBMC進(jìn)行雙染，通過(guò)比較免疫組和對(duì)照組的流式檢測(cè)結(jié)果確定多肽NSP9_tmp的免疫學(xué)活性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所用到試驗(yàn)材料如物特殊說(shuō)明，均為在常規(guī)生化試劑商店可以購(gòu)買得到。Superdex 200 16/60 HiLoad 預(yù)裝柱和陰離子交換柱 Resource Q 購(gòu)自 GE (AmershamBiosciences)公司。L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arginine Hydrochloride, L-ArgHCl)、氧化型谷胱甘妝(Glutathione oxidized, GSSG)、還原型谷胱甘妝(Glutathione reduced, GSH)為Amresco公司產(chǎn)品。BirA酶和生物素化試劑購(gòu)自北京表源生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(CFA)、PE標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自Sigma公司；FITC標(biāo)記的抗豬⑶8的抗體購(gòu)自SouthernBiotech公司；豬淋巴細(xì)胞分離液為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品。濃縮杯購(gòu)自美國(guó)MilliPore公司。N2加壓裝置YQD-6型N2減壓器購(gòu)自上海長(zhǎng)城儀表廠。AKTA蛋白純化系統(tǒng)FPLCUPC-900購(gòu)自美國(guó)GE (Amersham Biosciences)公司。IOKD和100KD的超濾離心管購(gòu)于Millipore公司。流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司，型號(hào)BDFACSAria。SPF級(jí)長(zhǎng)白豬(2月齡)購(gòu)自北京SPF豬場(chǎng)。下述實(shí)施例中所用到的配制溶液有如下幾種:
包涵體提取純化試劑:(I)洗漆緩沖液(washing buffer, 500mL):Triton_1002.5ml, Tris-HCl (母液 1M，pH8.0) 25ml，NaCl (母液 5M) 30ml，EDTA (母液 0.5M) IOml，DTT (母液 1M,現(xiàn)用現(xiàn)加)5ml，雙蒸水 427.5ml。(2)重懸緩沖液(resuspension buffer, 500mL):Tris-HCl (母液 1Μ,ρΗ8.0) 25ml,NaCl (母液 5M) 10ml, EDTA (母液 0.5M) 10ml, DTT (母液 1M，現(xiàn)用現(xiàn)加)5ml，雙蒸水 450ml。(3)溶解緩沖液(dissolution buffer, 500mL):Gua_HCl (母液 8M) 375mL, 10 %甘油 50ml, Tris-HCl (母液 1M, ρΗ8.0) 25ml, NaCl (母液 5M) 10ml, EDTA (母液 0.5M) 10ml,DTT (母液1M，現(xiàn)用現(xiàn)加)5ml，雙蒸水25ml。包涵體復(fù)性試劑(refoldingbuffer, 500ml):Tris_HCl (母液 1M, pH8.0) 50ml ；L-ArgHCl (母液 2M) 100ml ；EDTA (母液 0.5M) 2ml ；GSH (復(fù)性液預(yù)冷后再加入)0.7653g ；GSSG (復(fù)性液預(yù)冷后再加入)0.1532g ;去離子水補(bǔ)足500ml。分子篩緩沖液=Tris-HCL (母液1M，pH8.0) 20mL ；NaCl (母液5M) IOmL ;超純水定容至1L,抽濾后4 C保存?zhèn)溆谩ｋx子交換A 液:Tris-HCL (母液 1M，pH8.0) IOmL ；NaCl (母液 5M) 2mL ;超純水定容至1L,抽濾后4 C保存?zhèn)溆谩ｋx子交換B 液:Tris-HCL (母液 1M，ρΗ8.0) IOmL ；NaCl (母液 5M) 200mL ;超純水定各至1L，抽濾后4 C保存?zhèn)溆?。Facs緩沖液的配制:PBS(pH 7.4) 490ml,犢牛血清10ml，疊氮鈉(母液30% ) 1.67ml，EDTA(母液 0.5M) 5.38ml。1 %的多聚甲醛:Img多聚甲醛溶于IOOml的PBS (pH 7.4)中。實(shí)施例1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽的選擇與合成經(jīng)NetMHCpan 2.0server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)網(wǎng)站，預(yù)測(cè)SLA-1限制性結(jié) 合的PRRSV來(lái)源CTL表位多肽，在PRRSV的NSP9蛋白上選擇了 I條氨基酸序列為序列表中序列I的CTL細(xì)胞表位多肽(其核苷酸序列為序列表中序列2，命名為NSP9_tmp)，多肽NSP9_tmp對(duì)SLA-1有較高的親和性預(yù)測(cè)分值(0.540)。將多肽NSP9_tmp送北京中科亞光生物科技有限公司進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC(高效液相色譜法)純化，純度> 90%。并經(jīng)過(guò)質(zhì)譜(MS)分析鑒定。實(shí)施例2、用蛋白的折疊復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽與SAL-1分子的結(jié)合能力一、豬SAL-1類分子輕鏈β 2m包涵體蛋白的制備β 2m包涵體蛋白重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如下:將編碼豬SAL-1類分子輕鏈β 2m成熟肽基因的1-98位氨基酸(氨基酸序列如序列表中序列3所示)的DNA (核苷酸序列如序列表中序列4所示)插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)的酶切位點(diǎn)EcoR I和HindIII之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-21a (+) /s β 2m。輕鏈β 2m包涵體蛋白的制備過(guò)程如下:(1)將pET_21a(+)/s β 2m質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。(2)挑取單克隆菌落，接種到IOOmL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，培養(yǎng)8-10小時(shí)，作為培養(yǎng)母菌。(3)將培養(yǎng)母菌分別按照1% -5%的接種量轉(zhuǎn)接到2升含Amp的LB液體培養(yǎng)基的大搖瓶中，37°C，200rpm，培養(yǎng)至0D600 = 0.4-0.6，加入 IPTG,使其終濃度為 ImM, 37 °C, 160rpm-170rpm,繼續(xù)培養(yǎng) 4-6 小時(shí)。(4)收菌(以下步驟都在低溫或冰水浴下進(jìn)行)，4°C, 12000rpm離心5min,棄上清,用40-60mL IXPBS懸浮，超聲裂解(超聲5s，間隔118，99次，300胃；接著超聲5s，間隔Hs,49次,300W)。(5)4°C, 12000rpm,離心10_30min,離心管下部呈白色致密塊即為包涵體。玻棒輕輕劃去上層的細(xì)胞碎片(沉淀上層密度較低的都是細(xì)胞碎片)，棄上清。洗滌緩沖液懸浮。
(6)離心后可看細(xì)菌有無(wú)完全裂解，若沒有完全裂解，可以再次超聲，條件為超聲5s，間隔Ils，40次，300W左右，超聲條件可以自行調(diào)整。(7) 40C，12000rpm, 10-20min,洗滌緩沖液洗滌，盡量去除細(xì)菌碎片。觀察細(xì)菌有無(wú)完全裂解，若沒有完全裂解，重復(fù)操作出)。(8)取一支新的離心管，對(duì)反復(fù)裂解所得的包涵體沉淀進(jìn)行稱重，預(yù)冷備用。(9) 40C，12000rpm,離心10-20min，用重懸緩沖液懸浮沉淀，將重懸后的液體更換至已稱重的新的離心管中(取出5μ1，按I: I比例加入2父303上樣緩沖液，煮沸5-101^11，12000印111，離心51^11，303^^ 電泳，鑒定包涵體是否有目的蛋白的表達(dá))。(10)4°C, 12000rpm,離心10_20min,按30mg/ml的用量，用鹽酸胍溶液(Dissolution Buffer)溶解包涵體，4°C攪拌至完全溶解。(11)4°C，12000rpm，離心10_20min，取出上清，即得到的豬SAL-1類分子輕鏈β 2m包涵體蛋白溶液，分裝成Iml/管，測(cè)其濃度為30mg/ml，于-20°C或_80°C保存?zhèn)溆?。二、豬SAL-1類分子重鏈包涵體蛋白的制備SAL-1類分子重鏈包涵體蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下:將編碼豬SAL-1類分子重鏈(SLA_1*1502, GenBank N0.HQ909439)胞外區(qū)氨基酸(氨基酸序列如序列表中序列5所示)的DNA分子(核苷酸序列如序列表中序列6所示)插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-2Ia(+)的酶切位點(diǎn)EcoR I和HindIII之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET_21a(+)/SLA-1*1502。SAL-1類分子重鏈(SLA_1*1502)包涵體蛋白具體的制備方法同步驟一中輕鏈β 2m包涵體蛋白的制備。所得的包含豬SLA-1類分子重鏈包涵體蛋白溶解于鹽酸胍溶液中，測(cè)其濃度為30mg/ml。三、SAL-1分子重鏈、s β 2m和多肽NSP9_tmp的折疊復(fù)性SLA-1分子重鏈和s β 2m的包涵體蛋白以及多肽NSP9_tmp按照摩爾比1:1: 3的比例加入復(fù)性液中。具體復(fù)性過(guò)程如下所述:(I)包涵體復(fù)性液(一般500ml體系，具體視復(fù)性效果而定)于4°C冰箱(或冷庫(kù)中)預(yù)冷。復(fù)性過(guò)程均在4°C條件下進(jìn)行(4°C冰箱或冷庫(kù))。(2)將盛有包涵體復(fù)性液的燒杯置于磁力攪拌器上，加入磁力轉(zhuǎn)子，設(shè)置合適的攪拌速度(60rpm為宜)。(3)取ImL鹽酸胍溶解后的s β 2m包涵體(30mg/ml)加入注射器內(nèi)，使之緩慢滴入包涵體復(fù)性液內(nèi)，慢慢攪拌6-10h。(4)將5mg多肽NSP9_tmp溶解在200 μ LDMSO中，然后用移液器直接加入到包涵體復(fù)性液中。(5)慢慢攪拌30min后，于注射器內(nèi)加Λ 3mL SLA-1分子重鏈的包涵體(30mg/ml),慢慢攪拌8_12h?？蛇m當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間。四、復(fù)合物蛋白的濃縮復(fù)性結(jié)束后，在4°C冰箱或冷庫(kù)中小心將包涵體復(fù)性液移至壓力攪拌式濃縮杯中，采用氮?dú)馓峁毫Γ贗OkDa超濾膜上的濃縮溶液至體積約為30mL時(shí)加入120mL預(yù)冷的分子篩緩沖液。最后濃縮至30mL左右時(shí)將溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4°C，12000rpm離心15min除去沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至IOKD蛋白濃縮管中，4°C，2400rpm離心進(jìn)一步濃縮至2_5ml。如果復(fù)性后復(fù)性液變 得渾濁，可低溫離心去除沉淀后，再用壓力攪拌式濃縮杯濃縮。五、復(fù)合物蛋白的分子篩和離子交換層析
用分子篩緩沖液平衡Superdex 200 16/60 HiLoad凝膠層析柱。平衡好后(一般lml/min，需2h)，將濃縮并換液完畢之后的復(fù)合物蛋白樣品離心除去沉淀(4°C，12000rpm，lOmin)，用分子篩緩沖液洗滌快速蛋白液相色譜儀(FPLC)的上樣泵后，取上清注入。在層析柱上以適當(dāng)?shù)牧魉龠\(yùn)行(一般lml/min)，根據(jù)分子篩層析的結(jié)果檢測(cè)復(fù)性效果，將相應(yīng)分子量的蛋白峰收集，并經(jīng)SDS-PAGE鑒定。將SDS-PAGE鑒定后為目的蛋白(復(fù)合物)的蛋白峰收集物用陰離子交換柱Resource Q進(jìn)一步分析。先用離子交換液B平衡柱子，再用離子交換液A平衡柱子后并上樣，樣品掛上柱子后，用由離子交換液A和離子交換液B組成的洗脫液進(jìn)行線性梯度洗脫60分鐘。在該60分鐘內(nèi)，洗脫液中離子交換液A的體積比由100%線性下降到50%，洗脫液中離子交換液B的體積比由50%線性上升到100%。收集洗脫峰，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。分子篩與SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖1所示，SLA-1能夠與PRRSV預(yù)測(cè)CTL表位多肽NSP9_tmp結(jié)合。它的分子篩色譜圖顯示:蛋白分子篩層析在280nm的紫外吸收條件下分布為2個(gè)主峰，分別在約85mL洗脫體積和IOlmL洗脫體積的位置。根據(jù)層析柱蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和SDS-PAGE電泳的結(jié)果判定:峰I是SLA-1分子重鏈/s β 2m/多肽NSP9_tmp形成的復(fù)合物分子單體，峰2是s β 2m(約IlKDa)。經(jīng)分子篩層析鑒定表明PRRSV來(lái)源的多肽NSP9_tmp能夠與SLA-1分子重鏈、s β 2m結(jié)合形成復(fù)合物蛋白。收集峰I的蛋白樣品進(jìn)行離子(ResourceQ)交換純化，在15% -20%鹽濃度條件下有一個(gè)均勻單一的吸收峰，SDS-PAGE證實(shí)為SLA-1分子重鏈/s β 2m/多肽NSP9_tmp的復(fù)合物蛋白，見圖2。這一結(jié)果說(shuō)明多肽NSP9_tmp與SLA-1分子重鏈、s β 2m能夠結(jié)合形成復(fù)合物，并且此復(fù)合物蛋白具有高度的穩(wěn)定性。而在多肽NSP9_tmp不存在的情況下，SLA-1分子重鏈與s β 2m不能形成復(fù)合物蛋白，見圖3。實(shí)施例3、用四聚體技術(shù)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位免疫學(xué)活性一、羧基端添加BirA底物肽(BSP)序列的豬SAL-1類分子重鏈包涵體蛋白的制備將編碼包含羧基端添加BirA底物肽(BSP)序列的豬SAL-1類分子重鏈SLA-1 (SLA-1*1502，G enBank N0.HQ909439)胞外區(qū)氨基酸(氨基酸序列如序列表中序列7所示)的DNA分子(核苷酸序列如序列表中序列8所示)插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-2Ia(+)的酶切位點(diǎn)EcoR I和Hind III之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET_21a(+)/SLA-1*1502-BSP。羧基端添加BirA底物肽(BSP)序列的豬SAL-1類分子重鏈包涵體蛋白(命名為SLA-1*1502-BSP)具體的制備過(guò)程同實(shí)施例1步驟一中輕鏈β 2m包涵體蛋白的制備。所得的SLA-1*1502-BSP包涵體蛋白溶解于鹽酸胍溶液中，其濃度為30mg/ml。二、SLA-l*1502_BSP/s β 2m/NSP9_TMP 肽復(fù)合物單體的制備將本實(shí)施例步驟一制備的SLA-1*1502_BSP和實(shí)施例2步驟一制備的s β 2m包涵體蛋白，以及NSP9_tmp肽一起經(jīng)過(guò)共復(fù)性折疊，復(fù)性后經(jīng)過(guò)濃縮、過(guò)分子篩和離子交換層析得到了 SLA-l*1502-BSP/si3 2m/NSP9_TMP肽復(fù)合物單體(具體過(guò)程同實(shí)施例2步驟三、四、五所述的SLA-1*1502、s β 2m與NSP9_tmp的折疊復(fù)性、濃縮以及分子篩和離子交換層析的過(guò)程)。分子篩與SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖4所示，SLA_1*1502_BSP和s β 2m能夠與PRRSV預(yù)測(cè)CTL表位多肽NSP9_tmp結(jié)合。它的分子篩色譜圖顯示:蛋白分子篩層析在280nm的紫外吸收條件下分布為3個(gè)主峰，分別在約47mL洗脫體積、85mL洗脫體積和IOlmL洗脫體積的位置。根據(jù)層析柱蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和SDS-PAGE電泳的結(jié)果判定:峰I是SLA-1*1502-BSP的多聚體(SLA-1*1502-BSP 約 33kD)，峰 2 是 SLA_l*1502_BSP/s β 2m/ 多肽 NSP9_tmp 形成的復(fù)合物分子，峰3是s β 2m(約IlkD)。經(jīng)分子篩層析鑒定PRRSV來(lái)源多肽NSP9_tmp能夠與SLA-1*1502-BSP、s β 2m結(jié)合形成復(fù)合物蛋白。收集峰2的復(fù)合物蛋白樣品進(jìn)行離子(Resource Q)交換純化，在30_35%鹽濃度條件下有一個(gè)均勻單一的吸收峰，SDS-PAGE證實(shí)為SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp的復(fù)合物蛋白，見圖5。這說(shuō)明多肽NSP9_tmp與SLA-1*1502-BSP、s β 2m能夠結(jié)合形成復(fù)合物，并且此復(fù)合物蛋白具有高度的穩(wěn)定性。三、SLA-l*1502_BSP/sβ 2m/ 多肽 NSP9_tmp 復(fù)合物的生物素化利用生物素化試劑盒對(duì)步驟二所得的SLA-l*1502-BSP/s β 2m/NSP9_TMP肽復(fù)合物單體蛋白進(jìn)行生物素化，具體操作如下:將上述經(jīng)過(guò)分子篩層析和離子交換層析純化后所得的SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp的復(fù)合物單體用分子篩緩沖液換液三次，濃縮至體積500 μ L左右，經(jīng)BCA法測(cè)定復(fù)合物蛋白含量。將總量為I 2mg的復(fù)合物蛋白用分子篩緩沖液稀釋至700 μ L，建立如下體系:復(fù)合物單體700 μ L，溶液A 100 μ L，溶液B100 μ L，d-生物素 100 μ L, BirA 酶(3mg/mL) 10 μ L，胃蛋白酶抑制劑(2mg/mL) 0.5 μ L，抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)0.5yL，混勻后于室溫(23°C )孵育過(guò)夜進(jìn)行生物化。生物素化的SLA-l*1502-BSP/s^ 2m/ 多肽 NSP9_tmp 的復(fù)合物單體，經(jīng) 4°C、12000rpm，離心 lOmin，去除沉淀。取上清過(guò)分子篩層析去除未結(jié)合的d-生物素，(若不除去d-生物素將干擾多聚化過(guò)程)，使用SuperdexTM 20016/60GL凝膠柱進(jìn)一步純化已生物素化的SLA_1*1502_BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp肽的復(fù)合物單體。所收集的生物素化后SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp肽的復(fù)合物單體蛋白采用IOkDa的蛋白濃縮管濃縮至500-1000 μ L(終濃度大約是l-3mg/ml), BCA試劑盒測(cè)定其蛋白濃度。四、SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp四聚體的生成、純化及鑒定對(duì)上述步驟三所得的SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp復(fù)合物單體進(jìn)行四聚體的生成、純化及鑒定，具體方法如下所述:(I)生物素化的復(fù)合物單體與PE標(biāo)記鏈霉親和素按5: I的摩爾比，計(jì)算生 成四聚體所需的PE標(biāo)記鏈霉親和素的總量。將其分成10等份，間隔20min，每次加入I份，4°C避光孵育，最后一次加完后，再置于4°C避光孵育過(guò)夜，期間不斷混勻。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將多聚化后的反應(yīng)產(chǎn)物加至IOOkDa的超濾離心管中，4°C、2400rpm離心濃縮至體積小于500 μ L。(3)用ρΗ8.0的PBS將樣品在IOOkD的超濾離心管中稀釋至4mL，然后再次離心濃縮至體積小于500 μ L ;重復(fù)此操作4次。(4)結(jié)束后加入ΡΗ8.0的PBS至4mL后，再加入8μ L的NaEDTA(母液0.5M)、2yL胃蛋白酶抑制劑(2mg/mL)、2 μ L抑亮蛋白酶肽(2mg/mL)和4 μ L疊氮鈉(母液30% )0 (5)再用IOOkDa的超濾離心管進(jìn)行濃縮，BCA法測(cè)定其濃度，濃縮至四聚體濃度為2-2.5mg/mL，于4°C避光保存。接著，用12%的SDS-PAGE分析和鑒定四聚體的生成。DS-PAGE分析和鑒定四聚體生成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，由于四聚體經(jīng)IOOkDa濃縮管濃縮后可以將小于IOOkDa的SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp復(fù)合物單體蛋白除去。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在與生物素化復(fù)合物單體的電泳條帶(約IlkD和約33kD)處，有相應(yīng)的電泳條帶出現(xiàn)，說(shuō)明生物素化后的SLA-l*1502-BSP/s β 2m/多肽NSP9_tmp復(fù)合物單體與鏈霉親合素發(fā)生了結(jié)合，生成了四聚體。五、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫及單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離設(shè)免疫組和對(duì)照組，每組5頭豬，免疫組首免用PRRSV弱毒疫苗進(jìn)行免疫，用量遵照使用說(shuō)明。二免和三免均使用本發(fā)明的多肽NSP9_tmp，免疫劑量為0.lmg/kg體重。二免疫采用弗氏完全佐劑(CFA)乳化的多肽，三免用弗氏不完全佐劑(IFA)乳化的多肽，每次免疫間隔期7-10天。多肽乳化的方法為:將多肽用去離子水溶解(3mg多肽溶于Iml水，可根據(jù)溶解度調(diào)整)，然后將配好的多肽溶液與CFA或IFA按1: 3比例混合后進(jìn)行乳化。免疫結(jié)束后十天采前腔靜脈血。分離豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。具體過(guò)程如下:(I)前腔靜脈采血法采集豬的新鮮血液，放入肝素抗凝的采血管中。(2)取IOml的新鮮血液，用PH7.4的PBS或0.9% NaCl水溶液按1:1比例稀釋后，加到已復(fù)溫至室溫(20°C左右)的IOml豬淋巴細(xì)胞分離液上,加樣時(shí)動(dòng)作要輕柔,沿管壁緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上。(3)20°C，2000rpm(700g)離心20min。(4)離心后最上層為血漿和稀釋液，管底為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，中層為淋巴細(xì)胞分離液(灰白色云霧層，該層主要為PBMC)，吸取灰白色層，至一個(gè)IOml的試管中。(5) 2500rpm離心IOmin,棄上清。(6)加入5ml的RPMI 1640稀釋,1500rpm離心IOmin ;重復(fù)此操作一次,盡量去除血小板和抗凝劑。(7)細(xì)胞計(jì)數(shù),用Facs緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個(gè)/mL待用。六、SLA-l*1502-BSP/sβ 2m/ 多肽 NSP9_tmp 四聚體檢測(cè) NSP9_tmp 肽特異性 CTL 細(xì)胞取2X IO6個(gè)PBMC于4°C，1500rpm離心5min，棄上清；加入20 μ I用流式反應(yīng)液稀釋的FITC標(biāo)記的豬⑶8單抗將細(xì)胞懸浮，4°C避光孵育30分鐘；IOOOrpm離心5min，棄上清；加入20 μ I用流式反應(yīng)液稀釋的PE標(biāo)記四聚體(2-2.5mg/ml的四聚體按10倍稀釋)將細(xì)胞懸浮，4°C避光孵育30分鐘；1000rpm，離心5min，棄上清，用流式反應(yīng)液洗滌細(xì)胞三次；1%多聚甲醛500μ1稀釋待檢。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。免疫組樣品中的FITC和PE雙陽(yáng)性區(qū)域 存在相對(duì)集中的細(xì)胞群，而所檢測(cè)對(duì)照組樣品的雙陽(yáng)性區(qū)域僅存在極少的細(xì)胞(< 0.05% )。由此可見，構(gòu)建的SLA-l*1502-BSP/sP 2m/多肽NSP9_tmp四聚體具有生物學(xué)活性。同時(shí)也說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)存在能夠識(shí)別PRRSV的CTL多肽NSP9_tmp的⑶8+T淋巴細(xì)胞，多肽NSP9_tmp可以促進(jìn)⑶8+T淋巴細(xì)胞的增殖。
權(quán)利要求
1.多肽，其氨基酸序列如序列表中序列I所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為DNA分子，所述DNA分子的編碼序列如序列表中序列2所示。
4.含權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒載體。
5.如下物質(zhì)中的任一種在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應(yīng)用: 1)權(quán)利要求1所述多肽； 2)權(quán)利要求2或3所述核酸分子； 3)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體； 4)權(quán)利要求4所述表達(dá)盒； 5)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 6)權(quán)利要求4所述重組菌； 7)權(quán)利要求4所述重組病毒載體。
6.豬繁殖與呼吸綜合 征病毒疫苗，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種: 1)權(quán)利要求1所述多肽； 2)權(quán)利要求2或3所述核酸分子； 3)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體； 4)權(quán)利要求4所述表達(dá)盒； 5)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 6)權(quán)利要求4所述重組菌； 7)權(quán)利要求4所述重組病毒載體。
7.如下物質(zhì)中的任一種在制備CD8+T淋巴細(xì)胞增殖劑中的應(yīng)用: 1)權(quán)利要求1所述多肽； 2)權(quán)利要求2或3所述核酸分子； 3)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體； 4)權(quán)利要求4所述表達(dá)盒； 5)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 6)權(quán)利要求4所述重組菌； 7)權(quán)利要求4所述重組病毒載體。
8.CD8+T淋巴細(xì)胞增殖劑，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種: 1)權(quán)利要求1所述多肽； 2)權(quán)利要求2或3所述核酸分子； 3)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體； 4)權(quán)利要求4所述表達(dá)盒； 5)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 6)權(quán)利要求4所述重組菌； 7)權(quán)利要求4所述重組病毒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或權(quán)利要求8所述的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖劑，其特征在于:所述CD8+T淋巴細(xì)胞 增殖劑促進(jìn)豬的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。本發(fā)明還保護(hù)編碼所述多肽的核酸分子。本發(fā)明所提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的CTL表位多肽能夠與豬SLA-I分子結(jié)合，可用于制備針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗，以及制備雞的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖劑。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103242427SQ201210030549
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者夏春, 潘孝成 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)