連翹苷對膿毒癥大鼠的治療作用
【專利摘要】本發(fā)明涉及膿毒癥的治療領(lǐng)域，具體是一種能降低大鼠的死亡率，并相對延長生存時間的藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)，連翹提取物有摧毀細(xì)菌內(nèi)毒素，對各種革蘭陽性及陰性細(xì)菌有抑制作用，但因作用機(jī)制尚未完全闡述清楚，影響了其向國際市場的推廣。本發(fā)明通過運用硅膠柱層析、Saphadex LH?20柱層析、重結(jié)晶等方法從50％連翹乙醇提取物中分離獲得物質(zhì)；采用化學(xué)鑒別、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、薄層色譜、高效液相色譜等方法對物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其結(jié)構(gòu)和名稱。通過復(fù)制大鼠盲腸結(jié)扎穿孔動物模型，模擬人類膿毒癥病理過程。尾靜脈注射給藥，觀察術(shù)后各大鼠術(shù)后存活率。本發(fā)明主要用于以連翹苷為主要成分，制備成注射劑用于膿毒癥的治療。
【專利說明】
連翹苷對膿毒癥大鼠的治療作用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及膿毒癥的治療領(lǐng)域，具體是一種能降低大鼠的死亡率，并相對延長生存時間的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]膿毒癥(Sepsis)是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中，是機(jī)體對感染的一種全身性炎癥反應(yīng)(SIRS)，是嚴(yán)重感染、重度創(chuàng)傷、大手術(shù)后、重型急性胰腺炎和休克等常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對機(jī)體組織器官損傷大、治療難，已經(jīng)成為世界性攻關(guān)難題。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示，膿毒癥的病死率已超過急性心肌梗死，每年歐洲和美國死于此病超過35萬人，每年全球有超過1800萬嚴(yán)重膿毒癥病例，且患者數(shù)目每年以
1.5 %速度遞增。每年膿毒癥病人超過300萬人，因此造成多臟衰的死亡人數(shù)高達(dá)50萬人以上。膿毒癥來勢兇猛，病情進(jìn)展迅速，病死率高，給臨床救治帶來極大困難，已成為現(xiàn)代創(chuàng)、燒傷外科及危重病醫(yī)學(xué)面臨的突出難題。
[0003]近年來，國內(nèi)關(guān)于膿毒癥的治療的有關(guān)研究報道主要有，四川醫(yī)學(xué)雜志2011年12月第12期和創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué)2014年I月第I期上分別刊載了 “膿毒癥及其治療研究進(jìn)展”和“膿毒癥和感染性休克治療進(jìn)展”的研究文章。文章中提出膿毒癥的主要治療方案為:1.擴(kuò)容療法，在頸靜脈或鎖骨下中央靜脈內(nèi)插管(CVC)，以便快速補液進(jìn)行液體恢復(fù)；
2.早期正確的抗生素應(yīng)用，要早期靜脈給予廣譜抗生素；3.激素的應(yīng)用，應(yīng)用氫化可的松扭轉(zhuǎn)休克癥狀，降低病死率；4.器官支持治療，如急性腎損傷時要適當(dāng)補液和保持適當(dāng)血管內(nèi)容量、維持適當(dāng)?shù)墓嘧?、避免使用腎毒性藥物。而急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥時應(yīng)用機(jī)械通氣進(jìn)行生命支持。
[0004]膿毒癥發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，確切機(jī)制仍不十分明確，并涉及局部和全身性反應(yīng)的復(fù)雜病理過程，以上療法可以對治療膿毒癥有一定的療效，但其有效特異性不強(qiáng)。我國臨床上使用中藥治療膿毒癥有著長期的用藥經(jīng)驗，如王今達(dá)教授就提出了膿毒癥治療的“三證三法”，即熱證用清熱解毒法，瘀證用活血化瘀法，虛證用扶正固本法；與“菌毒炎并治”細(xì)菌-內(nèi)毒素-炎性介質(zhì)同時治療的方法，將膿毒癥患者的死亡率降低了 50%，并開發(fā)出針對“瘀證”的中藥注射用劑“血必凈”；除活血化瘀法外，還有用清熱解毒方下調(diào)腸道水通道蛋白治療膿毒癥的研究，研究說明清熱解毒方可通過對結(jié)腸水通道蛋白的抑制作用而產(chǎn)生瀉下效應(yīng)治療膿毒癥。目前在大量的臨床觀察及前期動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，中藥連翹對膿毒癥的防治療效甚佳，同時連翹也是歷代溫病學(xué)家手中的利器，研究工作研究中也發(fā)現(xiàn)，連翹提取物對各種革蘭陽性及陰性細(xì)菌有抑制作用。同時體外實驗發(fā)現(xiàn)連翹提取物有很強(qiáng)的摧毀細(xì)菌內(nèi)毒素作用，但是因為中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚未完全闡述清楚，影響了其向國際市場的推廣。因此，從中醫(yī)中藥角度出發(fā)，應(yīng)用現(xiàn)代藥理研究方法對中藥進(jìn)行研究，闡明其對膿毒癥的作用機(jī)制，將會是膿毒癥治療進(jìn)展的新的突破點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于闡明連翹對膿毒癥治療的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理。
[0006]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]連翹通過50%乙醇大孔樹脂洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇，得到洗脫液浸膏354.39g，備用。
[0008]取少量50%乙醇洗脫部位浸膏，無水乙醇溶解，作為樣品，用于點樣。將樣品、對照藥材和連翹苷在硅膠G板上點樣，展開劑分別用氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、二氯甲烷-甲醇。每種展開劑按不同的比例配置展開，結(jié)果氯仿-甲醇系統(tǒng)分離間隔好，不拖尾，分離點最多且Rf值合適，是合適的溶劑系統(tǒng)。選擇氯仿-甲醇作為50%乙醇洗脫部位粗分洗脫劑，在該體系中展開，分別用5%香草醛濃硫酸、10%硫酸-乙醇、三氯化鋁試劑顯色，結(jié)果表明5%香草醛濃硫酸顯色明顯，選擇5%香草醛濃硫酸作為顯色劑。用氯仿-甲醇不同比例為展開劑時，可看出不同比例出斑點數(shù)量不同，在10: I左右出點較集中，故采用梯度洗脫時在10: I左右的梯度變換要緩和。
[0009]采用干法上樣，將得到的洗脫液浸膏350g加無水乙醇超聲溶解，用350g硅膠(60-100目)拌樣(I: I拌樣)，在通風(fēng)櫥中揮干溶劑，研磨均勻，即得。
[0010]取硅膠(160-200目)約3000g(l: 8左右)，預(yù)先用氯仿浸泡過夜，濕法裝柱(柱高78cm，柱徑Ilcm)。先用氯仿平衡柱體至液面不再下降，然后將上述樣品緩緩地裝入硅膠柱，邊裝邊敲打使樣品均勻平整的鋪在硅膠上。首先用氯仿洗脫，然后逐漸加入甲醇(0-50% )變換梯度進(jìn)行洗脫。當(dāng)溶劑色帶接近柱底時，開始接收洗脫液，每100ml收集濃縮，薄層色譜對流分實時檢測決定洗脫劑比例的更換。依次為氯仿(12500ml)、三氯甲烷:甲醇=50: I (15000ml),20: I (18000ml)、15: I (22000ml)、10: I (13000ml)、
8: I (17000ml)、6: I (21000ml)、5: I (15000ml)、2: I (12000ml)梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并相同流分，得到9個極性段，從以下3個部分1-1II，三氯甲烷:甲醇(I = 15: K II=10: UIII = 8: I)分離出4個化合物。分離過程見圖8。
[0011]從I部分氯仿:甲醇(15: I)洗脫得到組分Fr.1，將Fr.1濃縮，用熱乙醇溶解后放置，析出大量白色針狀結(jié)晶LQ-1 (2g);從II部分氯仿:甲醇(10: I)洗脫得到組分Fr.2，經(jīng)200-300目硅膠，氯仿:甲醇(4: 1-0: I)梯度洗脫，再經(jīng)反相柱色譜20%-50%甲醇逐級洗脫，得棕黃色粉末LQ-3(0.6g);從III部分氯仿:甲醇(8: I)洗脫得到組分Fr.3，經(jīng)200-300目硅膠，乙酸乙酯:甲醇(7: 1-5: I)梯度洗脫、S^hadex LH-20凝膠柱純化得化合物L(fēng)Q-2(0.1g)和LQ-4(0.1g)，均為黃色粉末。
[0012]在通過運用娃膠柱層析、Saphadex LH-20柱層析、重結(jié)晶等方法從50%連翅乙醇提取物中分離獲得的白色針狀結(jié)晶；采用化學(xué)鑒別、核磁共振氫譜(IH-NMR)、核磁共振碳譜(13C-NMR)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)等光譜色譜方法對所分離出的白色針狀結(jié)晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定化合物的結(jié)構(gòu)和名稱。首先采用化學(xué)方法對化合物進(jìn)行鑒別，確定基本骨架后結(jié)合氫譜、碳譜進(jìn)行數(shù)據(jù)比對歸屬，再用TLC、HPLC進(jìn)一步進(jìn)行驗證。由鑒定的化合物可得出，分離出的白色針狀結(jié)晶化合物為一個木脂素類(連翹苷)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖9:
[0013]通過復(fù)制大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)動物模型，來模擬人類感染引起一系列病理生理反應(yīng)的自然過程。大鼠購來后適應(yīng)性喂養(yǎng)I周，稱重，編號，將90只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:模型組(η = 30)、假手術(shù)組(η = 30)、給藥組(η = 30)，模型組采用CLP復(fù)制膿毒癥模型，假手術(shù)組除不進(jìn)行盲腸結(jié)扎及穿孔外其余同模型組，給藥組CLP復(fù)制膿毒癥模型，術(shù)后待大鼠清醒后，尾靜脈注射給藥，一天兩次，間隔約12小時，連續(xù)6天，模型組及假手術(shù)組給予等量的生理鹽水。觀察術(shù)后各組大鼠術(shù)后24h、48h及一周存活率。大鼠手術(shù)后，給藥后及處死后腹腔狀態(tài)見圖1-6，連翹苷提取物見圖7
[0014]使用結(jié)果:本發(fā)明所述的連翹苷具有顯著降低膿毒癥大鼠死亡率的效果。
【附圖說明】
[0015]圖1是發(fā)明實驗中假手組術(shù)大鼠:大鼠正常進(jìn)食飲水，自由活動，呼吸平穩(wěn)，體重增加，皮毛有光澤。
[0016]圖2是模型組:多數(shù)術(shù)后蘇醒延遲，蘇醒后進(jìn)食飲水減少，豎毛、寒戰(zhàn)、不活動、嗜睡、呼吸急促、眼角滲出物等，體重減輕明顯，多數(shù)出現(xiàn)腹瀉，部分甚至出現(xiàn)膿便、膿尿；隨著病程進(jìn)展，癥狀逐漸加重，瀕死前表現(xiàn)精神萎靡、對被動仰臥無反抗、四肢顫抖、皮毛無光澤。
[0017]圖3是給藥組大鼠:大鼠精神相對萎靡，眼瞼、鼻部分沁物增多，毛松散，弓背，懶動，部分大鼠腹大，腹部存在包塊，飲食減少，皮毛失去光澤，呼吸困難，皮下出血，對被動仰臥無反抗，感覺遲鈍，腹瀉，便稀，體溫偏低，體重下降，瀕死前部分動物出現(xiàn)輕度皮下出血，呼吸窘迫，四肢肌張力增高，頸項強(qiáng)直。
[0018]圖4為假術(shù)組處死時，尸解見腹腔內(nèi)無明顯滲液，盲腸無腫脹、粘連，肝腎無充血，肺粉紅色，質(zhì)地均勻，72h生存率為100%。
[0019]圖5為模型組處死時，尸解見大鼠腹內(nèi)腸體粗脹，色灰白或暗黃，輕度粘連與黃稠積液存在，或腹內(nèi)積液不顯，腹內(nèi)散在白色斑點，肝臟色暗紅，脾臟大，盲腸部粘連或包塊狀，與腹壁粘連，分離困難。
[0020]圖6為給藥組處死時，腹腔內(nèi)可散在白色斑塊狀物，腸體偏細(xì)或輕度粗大，色灰白，積液不顯，肝臟色紅，脾臟大，盲腸部包塊，分離因難。
[0021 ] 圖7是連翹提取物連翹苷。
[0022]圖8為連翹苷結(jié)構(gòu)分子式。
[0023]圖9為50 %乙醇大孔樹脂洗脫物分離流程圖。
【具體實施方式】
[0024]膿毒癥大鼠模型制備
[0025]采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型，術(shù)前12h禁食，不禁水，5%水合氯醛麻醉(350-400mg/kg)腹腔麻醉，前腹正中備皮，消毒腹部皮膚，于腹部正中做2.5cm切口，取出盲腸后，游離腸系膜和盲腸，距盲、回腸結(jié)合部約盲腸全長1/3處，4號手術(shù)縫線盡量回避血管結(jié)扎，于距結(jié)扎處遠(yuǎn)端約0.8-lcm處回避血管,三棱針(2.6 X 65mm)貫穿孔,3 X 30mm膠條貫穿盲腸留滯，放回腹腔，縫合切口。術(shù)后頸部皮下補液10mL，補充術(shù)中液體流失，抗休克。假手術(shù)組大鼠麻醉、開腹后只做盲腸翻動，不做結(jié)扎及穿孔，其余同模型組；對照組大鼠不予手術(shù)處理。給藥組同模型組。
[0026]動物的分組及給藥
[0027]大鼠購來后適應(yīng)性喂養(yǎng)I周，稱重，編號，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:模型組(η =30)、假手術(shù)組(η = 30)、給藥組(η = 30)，模型組采用CLP復(fù)制膿毒癥模型，假手術(shù)組除不進(jìn)行盲腸結(jié)扎及穿孔外其余同模型組，給藥組CLP復(fù)制膿毒癥模型，術(shù)后待大鼠清醒后，尾靜脈注射給藥，一天兩次，間隔約12小時，連續(xù)6天，模型組及假手術(shù)組給予等量的生理鹽水。觀察術(shù)后各組大鼠一般狀況，連翹提取物連翹苷對膿毒癥大鼠術(shù)后24h、48h及一周存活率的影響。
[0028]給藥劑量
[0029]連翹用藥量(生藥)為6_15g/d (中國藥典2010版)，取均值10g/d。實驗動物給藥劑量折算公式方法(見附錄一)，計算得大鼠用藥量為lg/kg.d，單體的給藥劑量定位3mg/kg。
[0030]觀察指標(biāo)及檢測方法
[0031]分別觀察各組大鼠造模前后體重、精神狀態(tài)、活動情況、肛溫、呼吸、剖腹時腹腔情況、臟器大體情況等。
【主權(quán)項】
1.連翹苷在制備抗膿毒癥藥物中的用途。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的連翹苷是指用各種方法從連翹屬科植物提取的，純度在90 %以上的單體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于，以連翹苷為有效成分配以輔料，按藥學(xué)上的規(guī)定制備方法制成注射劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述注射劑注射液。
【文檔編號】A61P31/04GK105878262SQ201410457545
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年9月10日
【發(fā)明人】李志軍
【申請人】李志軍