本發(fā)明涉及一株維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素b2，又名核黃素，為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分（黃酶在生物氧化還原中發(fā)揮遞氫作用）。當(dāng)缺乏維生素b2時，就影響機體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙。其病變多表現(xiàn)為口、眼和外生殖器部位的炎癥，如口角炎、唇炎、舌炎、眼結(jié)膜炎和陰囊炎等。維生素b2是水溶性維生素，容易消化和吸收，不能在體內(nèi)蓄積，因此只有通過日常膳食攝取維生素b2，維生素b2廣泛存在于酵母、肝、腎、蛋、奶、大豆等中。兒童生長發(fā)育期、婦女妊娠哺乳期、創(chuàng)傷期由于機體需求量大，日常飲食攝入可能無法滿足需要，因此需要補充維生素b2。
中國居民膳食維生素b2推薦攝入量男士1.5mg/天，女士1.2mg/天，妊娠期間需要1.6mg/天，哺乳6個月內(nèi)要攝取1.8mg/天，之后的6個月為1.7mg/天。食品營養(yǎng)強化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)gb14880-94規(guī)定了維生素b2的用量，維生素b2強化嬰兒食品配方中需要8～14mg/kg，妊娠食品配方4～22mg/kg。
目前維生素b2含量分析方法有微生物法、分光光度法、色譜法。色譜法應(yīng)用最為廣泛，包括氣相色譜法(gc)、高效液相色譜法(hplc)、氣質(zhì)聯(lián)用(gc-ms)、液質(zhì)聯(lián)用(lc-ms)、超臨界流體色譜(sfc)、毛細管電泳(ce)等的儀器方法，但這些方法需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員，且樣品前處理復(fù)雜，成本高，時間長，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，因此建立快速簡便的維生素b2檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。建立高效的免疫學(xué)檢測方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4，由該細胞株制備的抗體對維生素b2具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立維生素b2的免疫學(xué)檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一株維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號為cgmccno.13094。
維生素b2單克隆抗體，它由所述保藏編號為cgmccno.13094的維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4分泌產(chǎn)生。
所述維生素b2單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測中維生素b2的分析檢測。
本發(fā)明提供的維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4的制備基本步驟為：
1）完全抗原的合成：
稱取8.42mgvb2（維生素b2）于1ml無水dmf中，加入18.15mgcdi（羰基二咪唑），40℃水浴避光攪拌，活化1h；另取5mgbsa溶解于2ml、0.05m、ph9.6的cb溶液中，將上述活化后的vb2溶液緩慢逐滴加入bsa溶液中，室溫攪拌反應(yīng)過夜，即得vb2完全抗原混合液，4℃透析3天，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；
2）小鼠的免疫：維生素b2完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐劑，多次加強免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第二次加強免疫之間間隔一個月，多次加強免疫之間間隔21天。最后一次用維生素b2完全抗原（25μg/只，不含佐劑）沖擊免疫；通過間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測血清效價和抑制；
3）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（peg4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測陽性細胞孔，并進一步利用ic-elisa測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行3次亞克隆，最終篩選獲得維生素b2單克隆抗體雜交瘤細胞株gz-4；
4）雜交瘤細胞株性質(zhì)的鑒定：通過ic-elisa測定靈敏度和特異性。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的細胞株gz-4分泌的單克隆抗體，對維生素b2具有較好的特異性和檢測靈敏度（ic50值為11ng/ml），可以用于對牛奶、維生素飲料、嬰幼兒食品中維生素b2的檢測，具有實際應(yīng)用價值。
生物材料樣品保藏：一株單克隆細胞株gz-4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13094，保藏日期為2016年10月31日。
附圖說明
圖1gz-4所分泌單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施方式
本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明通過將維生素b2完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過ic-elisa篩選細胞上清，最終得到了對維生素b2有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
實施例1雜交瘤細胞株gz-4的制備
（1）完全抗原的合成：稱取8.42mgvb2（維生素b2）于1ml無水dmf中，加入18.15mgcdi（羰基二咪唑），40℃水浴避光攪拌，活化1h；另取5mgbsa溶解于2ml、0.05m、ph9.6的cb溶液中，將上述活化后的vb2溶液緩慢逐滴加入bsa溶液中，室溫攪拌反應(yīng)過夜，即得vb2完全抗原混合液，4℃透析3天，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。
（2）小鼠免疫：選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進行免疫。取維生素b2完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第1次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第2次加強免疫之間間隔一個月，多次加強免疫之間間隔21天。第3次免疫后7天采血，使用ic-elisa測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在第5次免疫后21天沖擊免疫，腹腔注射，要求沖免劑量減半且不含任何佐劑。
（3）細胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為4000）方法進行細胞融合，具體步驟如下：
a、摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，無菌操作取出小鼠的脾臟，用注射器的膠頭適度研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，收集，離心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌脾細胞3次，最后一次離心后，將脾細胞稀釋到一定體積，計數(shù)，備用；
b、收集sp2/0細胞：融合前7～10天，將sp2/0瘤細胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培養(yǎng)基在5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細胞數(shù)量達到1～4*107，保證融合前sp2/0瘤細胞處于對數(shù)生長期。融合時，收集瘤細胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；
c、融合過程7min。第1min，將1ml的peg4000由慢到快滴加到細胞中；第2min，靜置。第3min和第4min，在1min內(nèi)滴加1mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第5min和第6min，在1min內(nèi)滴加2mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。然后37℃溫浴5min。離心（800rpm，8min），棄上清，重懸入含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，按照200μl/孔加到96孔細胞板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（4）細胞篩選與細胞株建立：在細胞融合的第3天對融合細胞進行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用ic-elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用維生素b2為標(biāo)準(zhǔn)品，用ic-elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對維生素b2標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)3次，獲得細胞株gz-4。
（5）單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細胞，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化。在偏酸條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀；再用等量飽和度的硫酸銨溶液沉淀igg型的單克隆抗體，離心，棄上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體置于-20℃保存。
6.1包被：將包被原vb2-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從1μg/ml開始倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h；
6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
6.3封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
6.4加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h；
6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
6.6終止和測定：每孔加入50μl2m的h2so4終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔的od450值。
用ic-elisa測定單克隆抗體維生素b2的ic50為：11ng/ml，說明對維生素b2有很好的靈敏度，可用于維生素b2免疫分析檢測。
溶液的配置：碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐溫20的pbs；
tmb顯色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。