專利名稱：高免疫原性豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5和gp6基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E、 M蛋白的 GP5和GP6基因的核苷酸序列。
技術(shù)背景豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ， PRRSV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。目前用于 預(yù)防PRRSV的主要有滅活苗和弱毒苗，但存在免疫保護(hù)效果不好或散毒等危險，因 此迫切需要更安全、更有效的新型疫苗。PRRSV是有囊膜的單股線性正鏈RNA病毒，其基因組全長約15kb，包括9個 開放閱讀框(ORFla、 ORFlb、 ORF2-ORF7)(Deas et al，1996; Snijder et al，1998)其中由 ORF5編碼的E蛋白和由ORF6編碼的M蛋白為PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，E蛋白和M蛋白 可以二硫鍵相連的異源二聚體存在于PRRSV病毒粒子表面，是PRRSV病毒侵入耙 向組織和細(xì)胞的必要條件(deVriesetal，1995; Mardassi et a1，1996) ，E蛋白誘導(dǎo)的抗 體具有最強的中和病毒能力(Pirzadehetal,1997,1998; Zhang etal， 1998; Weiland et al,1999)， M可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。因此GP5、 GP6成為研制豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的主要候選基因。目前試驗研究表明，利用天然的豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、 GP6 基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠或豬均能產(chǎn)生一定水平的中和抗體和細(xì)胞免疫, 但普遍存在免疫水平較低，不能有效預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征之不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種經(jīng)人工改造的豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基 因，使其具有較高的免疫原性之特點，從而為制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗提供更好 的抗原基因。實現(xiàn)本發(fā)明的方案是對表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E、 M蛋白的GP5和GP6 基因的核苷酸序列進(jìn)行改造，以提高二者的免疫原性，達(dá)到更好的免疫效果。利用本 發(fā)明提供的抗原基因制備的疫苗將用于本體動物豬體內(nèi)，故本發(fā)明是在保證豬繁殖與 呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因所表達(dá)蛋白的氨基酸序列不變的前提下，用豬的偏愛 密碼子替代豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、 GP6基因的天然密碼子。具體技術(shù)方案是 在保證豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6蛋白氦基酸序列不變的前提下，采用豬偏愛 密碼子替代天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因的相應(yīng)密碼子，從而改造天然 豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因，并采用基因合成儀合成改造后的基因，以便 將其用于制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、 GP6的DNA疫苗。實施本發(fā)明的具體步驟是用豬偏愛密碼子替代天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒 GP5和GP6基因的相應(yīng)密碼子改造天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因，并 采用基因合成儀合成改造后的基因(命名為GP5A和GP6A)。將改造后的GP5A和GP6A基因分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1和JN-1中構(gòu) 建DNA疫苗，(JN-1質(zhì)粒的酶切圖譜見圖16， JN-1的構(gòu)建是在pCI-neo的基礎(chǔ)上改 造其多克隆位點和復(fù)制原點而成)。用構(gòu)建的pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，通過間接ELISA及病毒微量 中和試驗檢測其免疫效果。本發(fā)明將豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因和GP6基因改造為在豬體內(nèi)具有更強 免疫效果的優(yōu)化基因，并證實在BALB/c小鼠體內(nèi)其具有優(yōu)良的免疫原性，從而為制備 豬繁殖與呼吸綜合征疫苗提供了更好的抗原基因。
經(jīng)實驗證實與現(xiàn)有技術(shù)相比，改造后的GP5A和GP6A基因所誘導(dǎo)的ELISA抗體有 明顯提高；所產(chǎn)生的中和抗體的效價有顯著提高，表明本發(fā)明提供的改造后的GP5A 和GP6A基因具有高免疫原性。


圖1為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因序列；圖2為利用豬偏愛密碼子替代天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因相應(yīng)的密 碼子改造得到的GP5A序列；圖3為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP6基因序列；圖4為利用豬偏愛密碼子替代天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP6基因相應(yīng)密碼 子改造得到的GP6A序列；圖5為GP5A PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DL2000Marker， 1為GP5A 序列片斷；圖6為重組質(zhì)粒pcDNA3. 1—GP5A BamHI、 EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果，其中M為 DL2000Marker， 1和2分別為pcDNA3. 1—GP5A的兩個克隆的酶切結(jié)果；圖7為JN-1-GP5A的Nhel， Xbal雙酶切鑒定結(jié)果，其中M為DL2000Marker， 1、 2、 3和4分別為JN-1—GP5A的四個克隆的酶切結(jié)果；圖8為pcDNA3. 1—GP6AHindl11和EcoRI雙酶切鑒定，其中M為DL2000Marker， 1、 2和3分別為JN-1--GP6A的三個克隆的酶切結(jié)果；圖9為JN-1—GP6A Nhel和EcoRI雙酶切鑒定的結(jié)果，其中M為DL2000Marker， 1為JN-1—GP6A的雙酶切結(jié)果；圖10為GP5相關(guān)重組質(zhì)粒免疫小鼠的ELISA抗體；用GP5相關(guān)DNA疫苗免疫5 — 6周齡雌性BALB/c小鼠，分別于首免2、 4、 6周 尾靜脈采血用于ELISA檢測，Y軸表示各組小鼠產(chǎn)生的ELISA值(數(shù)值為各組小鼠的 算術(shù)平均值)，X軸表述免疫小鼠的組別。圖11為GP6相關(guān)重組質(zhì)粒免疫小鼠的ELISA抗體；用GP6相關(guān)DNA疫苗免疫5 — 6周齡雌性BALB/c小鼠，分別于首免2、 4、 6周 尾靜脈采血用于ELISA檢測，Y軸表示各組小鼠產(chǎn)生的ELISA值(數(shù)值為各組小鼠的
算術(shù)平均值)，x軸表述免疫小鼠的組別。圖12為GP5相關(guān)重組質(zhì)粒免疫小鼠的中和抗體；用GP5相關(guān)DNA疫苗免疫5 — 6周齡雌性BALB/c小鼠，分別于首免2、 4、 6周 尾靜脈采血用于微量中和試驗檢測中和效價，Y軸表示各組小鼠產(chǎn)生的中和效價(數(shù) 值為各組小鼠中和效價的算術(shù)平均值)，X軸表述免疫小鼠的組別。圖13為GP6相關(guān)重組質(zhì)粒免疫小鼠的中和抗體；用GP6相關(guān)DNA疫苗免疫5 — 6周齡雌性BALB/c小鼠，分別于首免2、 4、 6周 尾靜脈采血用于微量中和試驗檢測中和效價，Y軸表示各組小鼠產(chǎn)生的中和效價(數(shù) 值為各組小鼠中和效價的算術(shù)平均值)，X軸表述免疫小鼠的組別。圖14為pUC57質(zhì)粒的酶切圖譜；圖15為pcDNA3. 1質(zhì)粒的酶切圖譜；圖16為JN-1質(zhì)粒的酶切圖譜；具體實施方式
下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本說明是如何實現(xiàn)的，以下說明不用于 限制本發(fā)明的范圍。實施例l.改造的GP5A和GP6A序列的合成。在保證豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6蛋白氨基酸序列不變的前提下，采用 豬偏愛密碼子替代天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因中相應(yīng)密碼子而改造 天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因，改造后的基因分別相應(yīng)稱為GP5A和GP6A 基因，并采用基因合成儀合成改造后的基因，序列改造由本專利申請發(fā)明人完成，改造 后的優(yōu)化GP5A和GP6A基因序列的合成工作委托GenScript公司完成，合成的序列克隆 在pUC57中。(pUC57的酶切圖譜見圖14)。GP5和GP6基因改造前后的序列分別見圖1、圖2、圖3和圖4。
實施例2. pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A重組質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3. 1購自invitrogen公司，酶切圖譜見圖15。JN-1的構(gòu)建是在pCI-neo的基礎(chǔ)上改造其多克隆位點和復(fù)制原點而成，酶切圖 譜見圖161. pcDNA3. 1—GP5A的構(gòu)建 1) GP5A的PCR擴(kuò)增以優(yōu)化GP5A為基礎(chǔ)，分別設(shè)計兩對引物分別為GP5-AMN-f: 5'-CGGGATCCGCCACCATGGGCATGCTGGGCAAGTGCC-3'(劃線部分為BamHI 酶切位點)GP5-AMN-r: 5' -GGAATTCTCACAGGCGGCCCCACTG-3，(劃線部分為EcoRI酶切位點) 以GP5-AMN-f和GP5-AMN-r為引物，以pUC57-GP5A序列為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為1 Ox LA PCR Buffer (Mg2+ plus)LATaq (Takara)dNTP(2.5mM)GP5-AMN-f(10" M)GP5-A畫-r(10u M)pUC57-GP5AdH20反應(yīng)參數(shù)為940C 940C 600C 720C 720C 40C5min 20 s 25 s 40s 3min2.50.2510.25 0.25 0.5Up to 2530cyclesPCR產(chǎn)物的W瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明擴(kuò)增出約600bp的片段，與預(yù)期大小一致 (見圖5)。2) pc腿3. 1一GP5A的構(gòu)建將GP5A的PCR產(chǎn)物割膠回收后，連接到pMD-19T載體構(gòu)建為pMD-19T—GP5A， 轉(zhuǎn)化DH5a，挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定并測序,測序結(jié)果表明，GP5A序列完全正確。用BamHI和EcoRI將pMD-19T—GP5A及目的載體pcDNA3. 1 (+)兩步法雙酶切，然后進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為pMD-19T simple vector 0.5 u 1GP5A (PCR) 4.5 ulLigation solution I 5^1Total 10ul反應(yīng)條件16t ,過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明酶切片段與預(yù)期 大小一致(見圖6)，重:組質(zhì)粒pcDNA3. 1一GP5A構(gòu)建成功。2. JN-l-GP5A的構(gòu)建用Nhel和EcoRI將pcDNA3. 1-GP5A及目的載體JN-1兩步法雙酶切然后進(jìn)行連接， 連接反應(yīng)體系為，10x T4 DNA Ligase Buffer 1T4 DNA Ligase 1pcDNA3.) (B/E) 0.7TS-GP5A (B/E) 7.3Total 10ul反應(yīng)條件16°C ，過夜。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明酶切片段與預(yù)期大小 一致(見圖7)，重組質(zhì)粒JN-1—GP5A構(gòu)建成功。JN-1的構(gòu)建是在pCI-neo的基礎(chǔ)上 改造其多克隆位點和復(fù)制原點而成。3. pcDNA3. 1—GP6A的構(gòu)建用HindiII和EcoRI將pUC57-GP6及目的載體pcDNA3. 1 (+)兩步法雙酶切，然后 進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為- Reagent Volume( u I)1 Ox T4DNALigase Buffer 1T4 DNA Ligase 1pcDNA3.1 (H/E) 0.7pUC57-GP6 (H/E) 7.3Total 10ul反應(yīng)條件16t ，過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，挑取克隆進(jìn)行HindIII和EcoRI雙酶切鑒定，結(jié)果表 明酶切片段與預(yù)期大小一致(見圖8)，重組質(zhì)粒pcDNA3. 1—GP6A構(gòu)建成功。 4. JN-1-GP6A的構(gòu)建用Nhel和EcoRI將pcDNA3. 1-GP6及目的載體JN-1兩步法雙酶切，然后進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為Reagent Volume( u I)1 Ox T4 DNA Ligase Buffer 1T4 DNA Ligase 1JN-1 (廳) 0.7pcDNA3.!-GP6 (N/E) 7.3Total 10ul反應(yīng)條件16°C ，過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 a中，挑取克隆進(jìn)行Nhel和EcoRI 雙酶切鑒定，結(jié)果表明酶切片段與預(yù)期大小一致(見圖9)，重組質(zhì)粒JN-1—GP6A構(gòu) 建成功。實施例3. pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A重組質(zhì) 粒免疫BALB/c小鼠。分別將5 6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成pcDNA3. 1、 pcDNA3. 1—GP5、 pcDNA3. 1—GP5A及pcDNA3. 1—GP6、 pcDNA3. 1—GP6A 、 JN-1-GP5A， JN-1, JN-1-GP5 及JN-1-GP6A， JN-1-GP6十個免疫組，每組5只。以每只100ug (100 uL體積)的 量經(jīng)后腿肌肉注射免疫小鼠，共免疫2次，間隔2周。于首免后第2、 4、 6周尾部負(fù) 壓采血分離血清。實施例4.免疫小鼠血清抗體的檢測
用ELISA方法檢測血清中GP5及GP6特異性ELISA抗體。其中以pGEX-4T-2原核表達(dá) 的GST-GP5和GST-GP6融合蛋白作抗原包被酶標(biāo)板， 一抗為待檢血清，二抗為服P標(biāo)記的 羊抗鼠IgG。以PRRSV疫苗免疫的小鼠血清作為陽性對照，先用棋盤滴定法確定最佳的 抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。然后用建立的標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測免疫組小鼠的ELISA 抗體(結(jié)果見圖IO、圖ll)。
用微量中和試驗檢測血清中針對PRRSV的中和抗體。其中將被檢血清于56"C滅活 30min后，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將血清作連續(xù)2倍的倍比稀釋，從l : 2至l : 128 ， 每孔50uL ; PRRSV病毒液為100TCID50 ,于37"€，5%(:02培養(yǎng)箱中作用1小時，再于每 孔中滴加2X105個/mL的Marc—145細(xì)胞懸液100uL ，繼續(xù)培養(yǎng)4一5天，觀察細(xì)胞 病變情況并記錄中和效價，以能完全保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生病變的血清最高稀釋倍數(shù)為其中 和效價(結(jié)果見圖12、圖13)。
棋盤法確定的最佳抗原包被濃度為O. 1 u g/ml，血清稀釋倍數(shù)為l: 200， ELISA結(jié) 果表明改造的DNA疫苗pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A禾口JN-1-GP6A 的免疫組誘導(dǎo)的ELISA抗體要明顯高于未改造的DNA疫苗pcDNA3. 1 — GP5、 pcDNA3. 1 —GP6、 JN-1-GP5和JN-1-GP6免疫組(P 〈 0. 05) ; pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. l — GP6A與JN-1-GP5A和JN-1-GP6A抗體水平相差不大，空載體對照免疫組沒有檢測到抗 體，表明GP5A和GP6A具有更好的免疫原性。(見圖10、圖ll)。
微量中和試驗表明在二免后2周各組鼠血清在Marc—145細(xì)胞上檢測中和抗體 效價(結(jié)果見圖12和圖13)， pcDNA3.1—GP5免疫組可刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體(平均值 為l : 20 )， pcDNA3. 1—GP5A可將中和抗體效價提高到1 : 32與pcDNA3. 1—GP5免疫 組差異顯著；JN-l-GP5免疫組可刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體(平均值為l : 19.2 )， JN-l-GP5A免疫可將中和抗體效價提高到l : 32，與JN-1-GP5組差異顯著(P〈0.05); pcDNA3. 1—GP6免疫組可刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體(平均值為l : 9.4 )， pcDNA3. l —
GP6A可將中和抗體效價提高到1 : 16，與pcDNA3. 1—GP6免疫組差異顯著(P〈0.05); JN-1-GP6免疫組可刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體(平均值為1 : 10.6 )， JN-l-GP6A免疫組 可將中和抗體效價提高到l : 16，與JN-1-GP6組差異顯著(P〈0.05);空載體對照組 血清l : 2稀釋時沒有檢測到中和抗體。以下為本發(fā)明專利申請所涉及的核苷酸序列和氨基酸序列的序列表 序列1為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因序列；序列2為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因編碼的氨基酸序列；序列3為改造后的GP5A基因序列；序列4為改造后的GP5A基因編碼的氨基酸序列；序列5為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP6基因序列；序列6為天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP6基因編碼的氨基酸序列；序列7為改造后的GP6A基因序列；序列8為改造后的GP6A基因編碼的氨基酸序列。 序歹U表<110〉國營武昌造船廠<120>高免疫原性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和GP6基因 <130> 1 <160> 8〈170〉 Patentln version 3.1<210> 1<211〉 603<212> 腿<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220〉<221> CDS<222〉 (1).. (603) <223〉<400> 1atg ttg ggg , tgc ttg Met Leu Gly Lys Cys Leu 1 5ttg tgg tgt ate gtg ccg Leu Trp Cys lie Va] Pro 20aac aac age age tct cat Asn Asn Ser Ser Ser His 35gag ctg aat ggc aca gat Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50gag act ttt gtc ate ttc Glu Thr Phe Val lie Phe 65 70gca etc acc acc age cat Ala Leu Thr Thr Ser Hisacc gcg ggc tgt tgc teg cga ttg ctt tct 48 Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 10 15ttc tat ctt get gtg etc gtc aac gcc age 96 Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 25 30att cag ttg att tat aac ttg acg eta tgt 144 lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 40 45tgg ctg gca aaa aat ttt aac egg gca gtg 192 Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 55 60ccc gtg ttg act cac att gtt tec tat ggg 240 Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 75 80ttc ctt gac aca gtt ggt ctg gtc act gtg 288 Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95tcc acc gcc gga tat tat cac agg egg tat gtc ttg agt age att tac 336Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr100 105 110gca gtc tgt get ttg get gcg ctg att tgt Ut gtc att agg ctt gcg 384Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125aag aac tgc atg tcc tgg cgc tac tct tgc acc aga tat acc aac ttc 432Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140ctt ctg gac act aag ggc aaa etc tat cgt tgg egg teg ccc gtc att 480Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160gtg gag a幼ggg ggt aag gta gag gtc gaa ggt cac ctg ate gac etc 528Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Asp Leu 165 170 175aag aga gtt gtg ctt gat ggt tcc gtg gca acc cct tta acc aga gtt 576Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val180 185 190tea gcg gaa caa tgg ggt cgt ctt tag 603 Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200<210> 2 <211> 200 〈212〉 PRT<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 15 10 15Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 50 55 60Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95Ser Thr Als Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr 100 105 110Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Asp Leu 165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val 180 185 190Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200 <210> 3〈211〉 636<212> 腿 〈213〉人工序列<220〉〈221> CDS<222〉 (14).. (616)<223><400> 3gtttaaaccc acc atg ctg ggc卿tgc ctg acc gcc ggc tgc tgc tcc 49Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser 1 5 10egg ctg ctg tcc ctg tgg tgc ate gtg ccc ttc tac ctg gcc gtg ctg 97 Arg L>eu Leu Ser Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu 15 20 25gtg aac gcc age aac aac age tcc tcc cac ate cag ctg ate tac aac 145 Val Asn Ala Ser Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn 30 35 40ctg acc ctg tgc gag ctg aac ggc acc gac tgg ctg gcc aag aac ttc 193 Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe 45 50 55 60aac cgc gcc gtg gag acc ttc gtg ate ttc ccc gtg ctg acc cac ate 241 Asn Arg Ala Val Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie 65 70 75gtg age tac ggc gcc ctg acc acc tcc cac ttc ctg gac acc gtg ggc 289 Val Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly 80 85 90ctg gtg acc gtg age acc gcc ggc tac tac cac cgc cgc tac gtg ctg 337 Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu 95 100 105tcc tcc ate tac gcc gtg tgc gcc ctg gcc gcc ctg ate tgc ttc gtg 385 Ser Ser lie Tyr Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val 110 115 120ate cgc ctg gcc aag aac tgc atg tcc tgg cgc tac tcc tgc acc cgc 433 lie Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg 125130135140tac acc aac ttc ctg ctg gac acc aag ggc aag ctg tac egg tgg cgc Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg 145 150 155481tec ccc gtg ate gtg gag aag ggc ggc aag gtg gag gtg gag ggc cac Ser Pro Val lie Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His 160 165 170529ctg ate gac ctg aag cgc gtg gtg ctg gac ggc age gtg gcc acc ccc Leu lie Asp Leu l,ys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro 175 180 185577Ctg 3CC CgC gtg tCC gCC g3g C3g tgg ggC CgCLeu Thr Arg Val Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg 190 195ctg tga aaaaaaaaaaLeu200626aaggcgcgcc636<210> 4<211〉 200<212> PRT <213>人工序列<400> 4Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 15 10 15Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 50 55 60Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly65 70 75 80Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr 100 105 110Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie A印Leu 165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro !Leu Thr Arg Val 180 185 190Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200<210> <211〉 <212> <213><220> <221〉 <222> <223>5438 DNAPorcine reproductive and respiratory syndrome virusCDS(l).. (438)
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Gly Arg Lys Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala 130 135 140Lys 14權(quán)利要求
1. 一種經(jīng)改造的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E蛋白的GP5基因，具有序列表中序列3所述的核苷酸序列。
2. —種經(jīng)改造的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白的GP6 基因，具有序列表中序列7所述的核苷酸序列。
3. 含有權(quán)利要求1所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E蛋 白的GP5基因的表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋 白的GP6基因的表達(dá)載體。
5. 含有權(quán)利要求1所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E蛋 白的GP5基因的重組質(zhì)粒pcDNA3. 1—GP5A或JN-1-GP5A。
6. 含有權(quán)利要求2所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋 白的GP6基因的重組質(zhì)粒pcDNA3. 1—GP6A或JN-1-GP6A。
7. 獲取權(quán)利要求1所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒E蛋 白的GP5基因的方法，其特征在于，在保證豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因所表 達(dá)蛋白的氨基酸序列不變的前提下，用豬的偏愛密碼子替代豬繁殖與呼吸綜合征病毒 GP5基因的天然密碼子。
8. 獲取權(quán)利要求2所述的具有高免疫原性的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋 白的GP6基因的方法，其特征在于，在保證豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP6基因所表 達(dá)蛋白的氨基酸序列不變的前提下，用豬的偏愛密碼子替代豬繁殖與呼吸綜合征病毒 GP6基因的天然密碼子。
全文摘要
本發(fā)明在保證豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因或GP6基因所表達(dá)蛋白的氨基酸序列不變的前提下，用豬的偏愛密碼子替代豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5或GP6基因的天然密碼子，本發(fā)明將豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因和GP6基因改造為在豬體內(nèi)具有更強免疫效果的優(yōu)化基因，并證實在BALB/c小鼠體內(nèi)其具有優(yōu)良的免疫原性，從而為制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗提供了更好的抗原基因。
文檔編號C12N15/33GK101210249SQ20061016661
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月31日
發(fā)明者余銘恩, 孫永林, 封江南, 王忠德, 佳 魏 申請人:國營武昌造船廠