本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體地說，涉及一種銅綠假單胞菌噬菌體及其應用。

背景技術：

銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)也稱綠膿桿菌是一種在環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陰性致病菌，能夠引起人的囊腫性纖維癥、以及嚴重燒傷和某些癌癥患者危及生命的急性感染和免疫抑制患者的慢性感染。在動物，銅綠假單胞菌主要引起馬的子宮內膜炎，牛和其他反芻動物的乳腺炎，毛絲鼠的中耳炎、內耳炎，水貂的出血性肺炎等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。治療銅綠假單胞菌感染的傳統的方法是抗生素，然而由于多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的出現和新的治療制劑的短缺，使得該菌引起感染的治療變得越來越困難。

銅綠假單胞菌的耐藥機制很多，而生物被膜(biofilm，bf)的形成是一個很重要的耐藥機制，也是引起臨床治療失敗的很重要原因。細菌生物膜是細菌在生長過程中為適應生存環(huán)境而吸附于機體或物體表面形成的一種與浮游細菌相對應的生長方式，由細菌和它所分泌的細胞外基質組成，主要組成分為胞外多糖(exopolysaccharide,eps)。bf細菌有極強的耐藥性，且bf可以保護細菌逃避機體的免疫作用，導致病原菌難以徹底清除。現已證實約有90％的微生物生活在微生物被膜(bacterialbiofilm，bf)系統中，80％的細菌性疾病與細菌生物膜有關。近年來,臨床上細菌生物膜引起的頑固性感染日益增多，給臨床治療增加難度。

目前國際上對綠膿桿菌bf抑制作用主要致力于抗生素的研究，目前已發(fā)現十四、十五元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素(如紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素)、利福平等在體外能抑制綠膿桿菌形成bf，但效果一般。噬菌體作為特異性感染和裂解細菌的病毒，在20年代早期，噬菌體療法已被認為是一種用于細菌感染性疾病治療的有效藥物。近年來，全世界范圍內持續(xù)增加出現的耐藥性菌株，噬菌體療法可能會是常規(guī)抗生素治療的替代方法之一，許多實驗表明噬菌體療法是有效的，并且在某種程度上，噬菌體療法優(yōu)于抗生素治療方法：第一，噬菌體更具有特異性；第二，噬菌體可以在感染部位復制和大量聚集，從而提高了殺菌效率。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型銅綠假單胞菌噬菌體及其制劑，用于銅綠假單胞菌生物被膜抑制，高效降解銅綠假單胞菌生物被膜。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種銅綠假單胞菌噬菌體，該銅綠假單胞菌噬菌體菌株名為vb_paem_qkl1，保藏號cgmccno.13381，分類命名為銅綠假單胞菌噬菌體，于2016年12月08日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101。

本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌噬菌體以水貂來源的銅綠假單胞菌為宿主，分離得到銅綠假單胞菌強裂解性噬菌體，通過一步生長曲線表征，其潛伏期、裂解期分別約為20min、35min，裂解量為120pfu/感染細胞，裂解能力較強。本發(fā)明噬菌體屬于肌尾病毒科(myoviridae)，頭部為二十面體，直徑約為50nm，尾長約為65nm。

本發(fā)明還提供了上述銅綠假單胞菌噬菌體的應用，用于降解銅綠假單胞菌生物被膜。

優(yōu)選方式下，所述銅綠假單胞菌噬菌體用于以下方面：

(1)制備抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成的產品；

(2)制備裂解銅綠假單胞菌生物被膜的產品；

(3)制備降低銅綠假單胞菌生物被膜形成總量的產品；

(4)制備與抗生素共同作用提高對銅綠假單胞菌的殺傷效率的產品；

(5)制備用與化學清潔劑聯合應用的消毒的產品。

優(yōu)選方式下，上述銅綠假單胞菌噬菌體的應用還包括制備含有銅綠假單胞菌噬菌體的制劑，所述制劑活性成分包括銅綠假單胞菌噬菌體cgmccno.13381。

進一步優(yōu)化，所述含有銅綠假單胞菌噬菌體的制劑應用于以下方面：

(1)制備抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成的產品；

(2)制備裂解銅綠假單胞菌生物被膜的產品；

(3)制備降低銅綠假單胞菌生物被膜形成總量的產品；

(4)制備與抗生素共同作用提高對銅綠假單胞菌的殺傷效率的產品；

(5)制備用與化學清潔劑聯合應用的消毒的產品。

本發(fā)明相對于現有技術具有如下優(yōu)勢：

1、本發(fā)明銅綠假單胞菌噬菌體尾刺(tailspike)中有胞外聚合物(eps)的降解酶類，這些酶類具有裂解細胞被膜進而裂解生物被膜產生菌的潛力，從而徹底去除細菌生物被膜。

2、本發(fā)明銅綠假單胞菌噬菌體對銅綠假單胞菌生物被膜的抑制效果明顯，加入moi大于1的噬菌體即可達到很好抑制效果；本發(fā)明銅綠假單胞菌噬菌體能夠破壞銅綠假單胞菌生物被膜，對銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物被膜具有明顯的清除作用；本發(fā)明噬菌體和抗生素的聯合應用對生物被膜的清除作用增強；本發(fā)明噬菌體與常用化學清潔劑聯合應用對于生物被膜的降解具有良好效果。

附圖說明

圖1為不同培養(yǎng)時間下的噬菌斑形態(tài)；

圖2為所述噬菌體(cgmccno.13381)的透射電鏡圖；

圖3為噬菌體(cgmccno.13381)對銅綠假單胞桿菌生物被膜的抑制效果；

圖4為噬菌體(cgmccno.13381)對銅綠假單胞桿菌生物被膜的破壞效果；

圖5為噬菌體(cgmccno.13381)聯合抗生素對生物被膜的清除作用；

圖6為噬菌體(cgmccno.13381)聯合化學清潔劑對生物被膜的降解作用。

保藏信息

本發(fā)明所提供的銅綠假單胞菌噬菌體該菌株已于2016年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101)，保藏登記號為cgmccno.13381。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明銅綠假單胞菌噬菌體通過透射電鏡觀察，屬于肌尾病毒科(myoviridae)，頭部直徑約為50nm，尾長約為65nm，透射電鏡圖片見圖2。

實施例1噬菌體的分離和鑒定

一噬菌體的分離

取醫(yī)院處理前的污水1l，加入cacl2至1mmol/l，4℃，5000rpm離心10min，去除污水中的沉淀顆粒，取上清用0.22μm濾膜濾過除菌；取濾液20ml與20ml2×lb培養(yǎng)基混合，按1％的接種量，接種400μl的綠膿桿菌，37℃富集培養(yǎng)12h。取5ml的上述菌液4℃、5000rpm離心10min，取上清用0.22μm的濾膜濾過除菌，得噬菌體原液。把得到的噬菌體原液10倍梯度稀釋，分別取300μl的稀釋液與相應的對數生長期的綠膿桿菌1:1混合，37℃培養(yǎng)15min，與4ml55℃液體lb培養(yǎng)基混合，均勻傾入固體lb瓊脂平板上，冷卻15min倒置37℃過夜培養(yǎng)。次日，得到單個噬菌斑。

在噬菌斑形成的平板上用槍頭挑取較大的、獨立的噬菌斑放入1mlsm液的ep管中，室溫放置1h后4℃過夜，次日取0.1ml經過適當稀釋后(10-1-10-8)，與相應的培養(yǎng)至對數生長期的宿主菌1:1混合做雙層平板進行純化，次日得到大小均勻的噬菌斑。得到均勻大小的噬菌斑后，對此噬菌體再次做雙層平板實驗(步驟如上)，分別在37℃條件下培養(yǎng)24h，48h后觀察噬菌斑的形態(tài)，噬菌斑形態(tài)如圖1。發(fā)現在噬菌斑的透明區(qū)域外面有一圈半透明的暈環(huán)，說明該噬菌體尾刺中有胞外聚合物的降解酶，該酶類能降解生物被膜胞外聚合物。隨時間增加噬菌體擴散出噬菌斑的透明區(qū)而裂解周圍的細菌，所以暈環(huán)會隨著時間的增加而增大。

用滅菌槍頭挑取上述純化好的噬菌斑加入培養(yǎng)至對數生長期的宿主菌中，37℃，140rpm培養(yǎng)6h左右，培養(yǎng)液變的相對澄清，將培養(yǎng)液4℃、8000rpm離心5min，取上清用0.22μm的濾膜過濾，除去少量的細菌及細菌碎片，即得高效價的噬菌體原液。

二噬菌體的鑒定

從形態(tài)學和噬菌體裂解譜兩個方面對該噬菌體進行鑒定。

1形態(tài)學鑒定

具體方法為：將350目的銅網浸入噬菌體純化液中，10min后取出銅網，用濾紙吸取多余的液體；將銅網放在5％(w/v)的乙酸鈾酰液滴上，染色后取出放在濾紙上待測；待全部樣品處理好后，使用加速電壓為80kv的tem觀察噬菌體形態(tài)。電鏡圖顯示屬于肌尾病毒科(myoviridae)，頭部直徑約為50nm，尾長約為65nm。噬菌體形態(tài)如圖2.

2噬菌體裂解譜測定

分別向制備好的lb瓊脂培養(yǎng)基平板上加入2ml的待測菌株對數期菌液，搖動平板使菌液均勻分布在平板上，吸取多余的菌液，安全柜中靜置15min；每個平板上的不同區(qū)域分別滴加5μl不同的噬菌體粗制液，安全柜中再次靜置15min，待噬菌體液體被瓊脂平板完全吸收，37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日觀察是否有噬菌斑出現。選用的細菌包括本實驗室分離的貂源銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)pa-dlut-1、p.aeruginosa0212、p.aeruginosa0205、p.aeruginosa0206、p.aeruginosa10104、p.aeruginosaatcc27853、klebsiella6*-1(克雷伯氏)、p.mirabilisg1(變形桿菌)、eteco57：h7atcc35150(產腸毒素大腸桿菌)、s.areusatcc29213(金黃色葡萄球菌)、s.typhimurimcmcc20115(沙門氏菌)。

采用單層瓊脂平板法分析噬菌體的宿主譜。結果顯示該噬菌體能裂解6株綠膿桿菌中的5株，形成的噬菌斑比較大且較透亮，但噬菌體不能裂解克雷伯氏菌、變形桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的代表菌株，宿主譜如表一。

通過形態(tài)學和宿主譜鑒定該噬菌體為銅綠假單胞菌噬菌體，為肌尾噬菌體科，且宿主譜較寬。

表一銅綠假單胞菌噬菌體(cgmccno.13381)的宿主譜

實施例2銅綠假單胞菌噬菌體(cgmccno.13381)抑制銅綠假單胞菌生物被膜的檢測

1噬菌體(cgmccno.13381)的擴增和純化

挑取宿主菌單個菌落，接種于100ml液體lb培養(yǎng)基，37℃，140rpm培養(yǎng)6h至對數生長早期，然后用滅菌槍頭挑取上述純化好的噬菌斑加入培養(yǎng)至對數生長期的宿主菌中，37℃，140rpm培養(yǎng)6h左右，觀察到有白色絮狀物時；取出培養(yǎng)物8000rpm，離心5min，取上清液10ml加入50ml培養(yǎng)至對數生長期的宿主菌種，37℃，140rpm培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的狀態(tài)，待培養(yǎng)液變的相對澄清，并且有白色絮狀沉淀后(約5-7h)，將培養(yǎng)液4℃、8000rpm離心5min，取上清用0.22μm的濾膜過濾，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的活化

從-80℃的冰箱中取出保種的銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)，室溫解凍后加入20mllb液體培養(yǎng)基中37℃，140rpm過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)菌液100倍稀釋后取1ml稀釋后的菌液加入100mllb液體培養(yǎng)基中37℃，140rpm培養(yǎng)6h至對數生長期，4℃?zhèn)溆谩?/p>

3檢測該噬菌體(cgmccno.13381)對銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物被膜的抑制效果

(1)生物被膜的培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數生長期(約為10⁸pfu/ml)的銅綠假單胞菌接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔20μl菌液和2mltsb培養(yǎng)基，實驗組按照moi為0.1，1，10分別加入噬菌體，陽性對照組不加噬菌體記moi為0，每組做三個重復孔。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24小時后，更換一次培養(yǎng)基，加入2mltsb培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。只含tsb培養(yǎng)基的孔作為對照孔。培養(yǎng)72小時后取出細胞培養(yǎng)板，棄去游離培養(yǎng)基并用滅菌的pbs(ph7.2)輕輕洗滌兩次以去除游離菌。

(2)銅綠假單胞菌生物被膜的固定及染色。培養(yǎng)好的細菌生物被膜用甲醇(500μl)固定半小時。棄去固定液，37℃溫箱干燥，用1％的結晶紫染色(500μl)半小時后棄去染色液，蒸餾水清洗兩次。將24孔細胞培養(yǎng)板放置于70℃烘箱中烘干，取出后每孔加入33％乙酸溶液(500μl)，置于搖床30min以釋放生物被膜中的結晶紫。每孔取200μl釋放液加入96孔酶標板中，測定其在od600。吸光度越大，說明溶解產物的濃度越大，生物被膜的生物量也就越大。反之，則表明微生物被膜的生物量變小，生物被膜形成受到抑制。

(3)檢測結果如圖3所示，從圖中可以看出，與陽性對照組相比，加入了moi為1和10的噬菌體各組，對銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物被膜的形成均具有明顯的抑制作用(p<0.01，差異極顯著)。實驗結果表明，加入moi大于1的噬菌體即可達到很好抑制效果，且這種抑制作用隨著加入的噬菌體濃度的增大而增強。

實施例3銅綠假單胞菌噬菌體cgmccno.13381破壞銅綠假單胞菌生物被膜的檢測

1噬菌體(cgmccno.13381)的擴增和純化

如實施例2所述

2銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的活化

如實施例2所述

3生物被膜的培養(yǎng)和噬菌體對其的作用

將培養(yǎng)至對數生長期(約為10⁸pfu/ml)的銅綠假單胞菌接種到含有細胞爬片的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔20μl菌液和2mltsb培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24小時后，更換一次培養(yǎng)基，加入2mltsb培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)72小時后取出細胞爬片，用滅菌的pbs(ph7.2)輕輕洗滌兩次以去除游離菌，然后把細胞爬片置換到新的24孔板里加入噬菌體(moi＝0.1，1和10)，陽性對照組記為moi＝0，37℃溫箱培養(yǎng)12小時后固定、染色、觀察。

4結晶紫半定量測定細菌生物被膜的消除情況

24孔板中的細胞爬片用甲醇(500μl)固定半小時。棄去固定液，37℃溫箱干燥，用1％的結晶紫染色(500μl)半小時后棄去染色液，蒸餾水清洗兩次。將24孔細胞培養(yǎng)板放置于70℃烘箱中烘干，取出后每孔加入33％乙酸溶液(500μl)，置于搖床30min以釋放生物被膜中的結晶紫。每孔取200μl釋放液加入96孔酶標板中，測定其在od600。根據od值的大小確定生物被膜的殘留量。

生物被膜的降解效果如圖4。從圖中可以看出，與對照組(moi＝0)相比，加入了噬菌體(cgmccno.13381)的組，對銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物被膜的具有明顯的清除作用，且這種降解作用隨著加入的噬菌體濃度的增大而增強。

實施例4噬菌體(cgmccno.13381)聯合抗生素對生物被膜的清除作用

1噬菌體(cgmccno.13381)的擴增和純化

如實施例2所述

2銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的活化和生物被膜的培養(yǎng)

如實施例2所述

3噬菌體(cgmccno.13381)聯合抗生素對生物被膜的清除作用

培養(yǎng)到成熟的載有生物被膜的細胞爬片取出，用滅菌的pbs(ph7.2)輕輕洗滌兩次以去除游離菌，然后把細胞爬片置換到新的24孔板里分別加入噬菌體組(moi＝10)，噬菌體(moi＝0.1，1和10)+卡那霉素組(100μg/ml)，卡那霉素組(100μg/ml)，37℃溫箱培養(yǎng)12小時后，取出細胞培養(yǎng)板，棄去游離培養(yǎng)基并用滅菌的pbs(ph7.2)輕輕洗滌兩次以去除游離菌，取漂洗后的細胞爬片放入加入含有20ml0.9％生理鹽水離心管中，然后放入超聲波震蕩儀中震蕩22％功率10min，取超聲震蕩后的菌液經適當的稀釋后取0.1ml加入lb平板中，37℃培養(yǎng)20-24h后觀察菌落數量，根據存活的細菌數量判斷噬菌體和抗生素清除生物被膜的效果。

生物被膜的降解效果如圖5。從圖中可以看出與對照組相比，加入了噬菌體(cgmccno.13381)的組，噬菌體(cgmccno.13381)+卡那霉素組和卡那霉素組對銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物被膜都具有清除作用；而噬菌體(cgmccno.13381)后，特別是加入與對照組相同濃度的噬菌體時，噬菌體(cgmccno.13381)和抗生素的聯合應用對生物被膜的清除作用更加明顯，且這種清除作用隨著加入噬菌體濃度的增加增強。

實施例5制備用與常用化學清潔劑聯合應用的消毒的產品

1噬菌體(cgmccno.13381)的擴增和純化

如實施例2所述

2銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)的活化

如實施例2所述

3噬菌體(cgmccno.13381)和常用化學清潔劑主要成分聯合應用效果

噬菌體(cgmccno.13381)用sm緩沖液稀釋后得到效價為10⁸pfu/ml。將噬菌體(cgmccno.13381)、1％tritonx-100(非離子清潔劑)、及二者混合物(體積比1:1)加到生物被膜上，每孔各100μl。sm液作為對照。將處理后的生物被膜置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)4、8、12、24小時后，棄去廢液并用滅菌pbs(ph7.2)輕輕洗滌兩次以去除游離菌。按照常規(guī)方法固定、染色。測定在600nm波長處的吸光度。根據od值的大小確定生物被膜的殘留量。

生物被膜的降解效果如圖6。從圖中可以看出，噬菌體(cgmccno.13381)和1％tritonx-100聯合應用效果最好；12小時內生物被膜基本清除干凈，清除效果優(yōu)于單獨使用噬菌體(cgmccno.13381)；1％tritonx-100單獨處理24小時后，效果不明顯。從實例2，3，4，5的結果可以得出噬菌體(cgmccno.13381)可以制作降低銅綠假單胞菌生物被膜形成總量的產品。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內，根據本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。