專利名稱：重組火雞皰疹病毒及其衍生的活載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有引進(jìn)HVT染色體組插入?yún)^(qū)中的異種核酸序列的重組火雞(Turkey)皰疹病毒(HVT)，包括由所述HVT染色體組插入?yún)^(qū)衍生的DNA序列側(cè)接的異種基因的核酸序列。包含所述核酸序列的質(zhì)粒。制備重組HVT的方法，由重組HVT感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，含有重組HVT的疫苗，以及制備這種疫苗和含有針對重組HVT抗體的抗血清的方法。
馬瑞克(Marek′s)病(MD)是一種使小雞致癌的淋巴增生無序疾病，它導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴瘤和外周神經(jīng)的脫髓鞘作用，是造成家禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)主要原因。
馬瑞克病的病毒(MDV)已被鑒定為MD的病原。
原型MD疫苗由火雞皰疹病毒(HVT)，最初由火雞皰疹病毒中分離的血清型3MD病毒組成。它的不致病性、不致癌性、在體內(nèi)和試管內(nèi)的良好復(fù)制性、作為無細(xì)胞和聯(lián)合細(xì)胞制劑時(shí)的可用性，以及高防護(hù)效能均已證實(shí)HVT可作為對有效控制家禽的馬瑞克病十分成功和廣泛應(yīng)用的可靠疫苗。
現(xiàn)在，動物一般能夠使用活的或失活的疫苗，或通過由相應(yīng)病原體亞單位所衍生的疫苗來防止致病微生物的感染。
但是，這些類型的疫苗可能會有許多缺點(diǎn)。使用稀釋的活病毒疫苗總免不了要冒使用不適當(dāng)稀釋致病微生物來給動物接種的危險(xiǎn)。此外。稀釋的病毒可能回復(fù)成毒性狀態(tài)，導(dǎo)致被接種的動物患病，并可能蔓延使其它動物致病。
失活的疫苗通常只誘導(dǎo)低水平的免疫性，需要附加的免疫接種。進(jìn)而，誘導(dǎo)病毒抗原因子的平衡可能通過失活處理而改變，結(jié)果降低了疫苗的防護(hù)效力。
此外，聯(lián)合活體病毒疫苗的問題是各抗體組分的相互影響，這導(dǎo)致一種或多種構(gòu)成組分相效力降低。
重組或自然衍生的亞單位疫苗還顯示出許多缺點(diǎn)。首先，作為非復(fù)制構(gòu)成物存在于免疫系統(tǒng)的多肽亞單位通常不誘導(dǎo)長期持久的免疫性，還需要存在佐劑。其次，作為復(fù)制構(gòu)成物存在能比作為亞單位構(gòu)成物存在時(shí)更有效地誘導(dǎo)免疫性。
本發(fā)明的目的是提供一種重組HVT，它不僅能用于制備抗MD疫苗，而且還能用于制備抗其它家禽傳染病的疫苗，它排除了作為疫苗與活的稀釋病原體聯(lián)合使用的任何潛在危險(xiǎn)，它以有效的方式促進(jìn)體液的和細(xì)胞的免疫系統(tǒng)而不必明顯地需要佐劑，并且它提供了多價(jià)疫苗的可能性而不必冒各種抗原組分相互不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。
按照本發(fā)明，這種重組HVT的特征在于，它含有將多肽異種編碼成HVT的異種核酸序列，所述核酸序列被引進(jìn)HVT染色體組的插入?yún)^(qū)，所述區(qū)域如

圖1所示與由ORF-1的端部直至并包括ORF-5的染色體組區(qū)域相對應(yīng)，而且位于HVT染色體組的DNA片斷中，具有如圖1所基本限定的限制性內(nèi)切酶圖。
本發(fā)明的重組HVT可由任何HVT病毒株，例如PB-THV1(可由Intervet International購得)或病毒株FC126衍生而得到。
在此使用的術(shù)語“重組HVT”指的是這樣一種傳染性病毒，它已經(jīng)被摻入異種核酸序列，即對于與在HVT中自然存在的基因的核酸序列不同等的基因或其一部分編碼DNA在遺傳上改性。
當(dāng)細(xì)胞被重組HVT感染時(shí)，則重組HVT以異種多肽形式表達(dá)異種基因。
術(shù)語“多肽”指的是具有生物活性的氨基酸分子鏈，不是指產(chǎn)物的特定長度，并且如果需要可在體內(nèi)或試管內(nèi)改性。例如通過糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化;因此，特別是肽、寡肽和蛋白質(zhì)均包括在多肽的定義之內(nèi)。
對于有效的重組HVT而言，其前提是將異種核酸序列插入在染色體組HVT序列的容許位置或區(qū)域，例如可被用于摻入異種序列而不破壞HVT的基本功能如感染或復(fù)制所需這些功能的位置和區(qū)域。這種區(qū)域被稱為插入?yún)^(qū)。
本發(fā)明所涉及的插入?yún)^(qū)對于摻入異種DNA而不破壞HVT基本功能而言以前尚未公開過。此外，還沒有可得到的有關(guān)在此所述用于摻入異種DNA序列的HVT染色體組區(qū)域的限制性內(nèi)切酶圖的情報(bào)。
為制備本發(fā)明重組HVT而被用于摻入異種DNA序列的插入?yún)^(qū)，位于經(jīng)過用酶Sau3A部分消化染色體組HVT DNA而產(chǎn)生的17.5Kb限制性片斷之中。
所述片斷經(jīng)限制性內(nèi)切酶制圖詳細(xì)分析(圖1)，它基本上對應(yīng)于HVT染色體組的Us區(qū)域，也許包括IRs和TRs結(jié)構(gòu)的側(cè)接部分。在HVT染色體組中的該Us區(qū)域和該IRs和TRs結(jié)構(gòu)的相對位置由Igarashi等人示出(1987)。
此處所述的插入?yún)^(qū)分別位于大約1.2Kb、3.5Kb和2.8Kb的三個(gè)鄰接的XhoⅠ片斷之中，并且開始于在HVT染色體組中1.2KbXhoⅠ片斷左側(cè)位置起始的開放讀碼(ORF-1)的末端(圖1)。所述大約5Kb的插入?yún)^(qū)連續(xù)通過ORF′s2、3、4和5，包括位于其間的非編碼序列。相應(yīng)于上述插入?yún)^(qū)的DNA序列可被用于將基因插入HVT染色體組，而不會破壞病毒的基本功能。
特別是，ORF-2和ORF-3可被用于異種基因的綜合。
對于在ORF-2和ORF-3中的異種基因，較佳的插入位點(diǎn)是圖1所示的BglⅡ限制性位點(diǎn)。
β-半乳糖苷酶基因被插入在ORF-2或ORF-3中的單一BglⅡ限制性位點(diǎn)，產(chǎn)生重組病毒，它是活的和穩(wěn)定的，并且不僅在組織培養(yǎng)物中復(fù)制，而且還將雞感染到如同由其中衍生出的HVT病毒一樣可比較的程度。用特指的pMD07gal或pMD12gal質(zhì)粒(圖2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.Coli)被存放在C.N.C.M of the Institute Pasteur at Paris under accession number I-914和I-915，該質(zhì)粒是通過將β-gal基因插入攜帶如圖1所指出的相應(yīng)XhoⅠ片斷的pMD07和pMD12的單一BglⅡ位點(diǎn)而衍生出的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，ORF-4和ORF-5的顯著部分已由HVT染色體組中缺失，并由β-半乳糖苷酶標(biāo)記基因代替，導(dǎo)致重組病毒可與在ORF-2或ORF-3中含標(biāo)記基因插入的重組HVT病毒比較。
可以理解的是，對于HVT染色體組的DNA序列，在個(gè)別HVT病毒中間可能存在自然變化。這些變化可導(dǎo)致缺失、取代、插入、轉(zhuǎn)化或增加一種或多種核苷酸，它們可能影響一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)的位置，從而改變圖1所示的限制性內(nèi)切酶圖。
此外，為引起上述改變而使用基因工程技術(shù)存在著潛力，導(dǎo)致了具有與圖1所示圖相關(guān)的限制性內(nèi)切酶圖的DNA序列。很清楚，包括摻入位于HVT染色體組區(qū)域中的插入?yún)^(qū)內(nèi)的異種基因，并以這樣的相關(guān)限制性內(nèi)切酶圖為特征的重組HVT也包括在本發(fā)明的范圍之中。此外，由于本發(fā)明標(biāo)志出的插入?yún)^(qū)不表現(xiàn)出基本的功能，所以所述區(qū)域可部分或全部缺失，在此之后，異種基因可被摻入到所述缺失處?？梢岳斫?，包括摻入到與本發(fā)明插入?yún)^(qū)相應(yīng)的HVT染色體組區(qū)域中的并以此為特征的異種基因也構(gòu)成本發(fā)明的部分。
總之，以上所基本限定的插入?yún)^(qū)表征了能被用于摻入異種核酸序列區(qū)域定位。
本發(fā)明所提出的較佳目的是提供一種重組HVT，它包括被摻入到插入?yún)^(qū)的異種核酸序列，其主要特征是如SEQ ID NO1中所示的HVT DNA序列，它包括4個(gè)ORF。ORF-2，即一個(gè)209氨基酸的小開放讀碼位于核苷酸位置316和945之間，并包含來自pMD07用于將基因插入HVT染色體組(圖1，SEQ ID NO1)的BglⅡ限制性位點(diǎn)，從而表明，對于通過ORF-2編碼假設(shè)的多肽不具有將病毒保存在體內(nèi)或試管內(nèi)的基本功能。這也用于包含346氨基酸(SEQ ID NO3)的ORF-3，它在核苷酸位置1084和2124(互補(bǔ)的)之間以反向變換，并包含在pMD12中用于將基因插入HVT染色體組的BglⅡ限制性位點(diǎn)(圖1，SEQ ID NO1)。ORF-4朝著在核苷酸位置2322和3170(互補(bǔ)的，圖1，SEQ ID NO1)之間的IRs轉(zhuǎn)換并將282氨基酸(SEQ ID NO4)編碼，而ORF-5在核苷酸位置3320開始并連續(xù)直到核苷酸位置4504(圖1，SEQ ID NO1)，將394氨基酸(SEQ ID NO5)的多肽編碼。
按照本發(fā)明，在核苷酸位置82的ORF-1末端后面開始的，大約5Kb的HVT染色體組的，其主要特征在于如SEQ ID NO1所示DNA序列的，在中間包括四個(gè)開放讀碼和非編碼序列的連續(xù)DNA的伸長可用于將異種基因插入HVT染色體組，而不破壞病毒的基本功能。
特別是，在示于SEQ ID NO1的核苷酸位置316-945、1084-2124、2322-3170和3320-4504之間的DNA的伸長已被限定用于結(jié)合異種基因，單一的BglⅡ限制性位點(diǎn)對于插入是最有利的位點(diǎn)。
很清楚，對于示于SEQ ID NO1所示的，表征本發(fā)明插入?yún)^(qū)的DNA序列，自然的變化存在于各個(gè)HVT病毒中間，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、取代、插入、轉(zhuǎn)化等。這些變化也可通過基因工程所引起。包含摻入上述與具有以上特征的插入?yún)^(qū)相關(guān)但不相同這樣的HVT染色體組區(qū)域的異種基因的重組HVT也包括在本發(fā)明中。例如異種基因可被摻入SEQ ID NO1中所示HVT染色體組核酸序列中所引起的缺失部位。在此由SEQ ID NO1中所示DNA序列限定的HVT插入?yún)^(qū)的特征是在HVT染色體組中能被用于摻入異種核酸序列的區(qū)域的定位。
被摻入本發(fā)明HVT染色體組的異種核酸序列可由任何來源如病毒的、原核生物的、真核生物的或合成物的來源衍生。所述核酸序列可由病原體，較佳的是雞的病原體衍生，在插入HVT染色體組后，可用它誘導(dǎo)對疾病的免疫性。較佳的是，試圖將由傳染性支氣管炎病毒(IBV)、馬瑞克病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性Bursal病病毒(IBDV)、雞的Aneamia劑(CAA)、呼吸道腸道病毒、鳥的Retro病毒、Eimeria種類、Salmonella種類、大腸桿菌和支源體gallisepticum衍生的核酸序列用于插入HVT染色體組的插入?yún)^(qū)。
此外，對于藥用的或診斷的編碼多肽的核酸序列，特別是免疫抑揚(yáng)調(diào)節(jié)劑如淋巴激活素，干擾素或細(xì)胞分裂素(Cytokines)可被摻入上述插入?yún)^(qū)。
為表達(dá)重組HVT中異種核酸序列的基本要求是可行地連接到該異種核酸序列上的適宜的啟動子。對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的是，對啟動子的選擇延伸到在重組HVT感染的細(xì)胞中能引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的任何真核生物的、原核生物的或病毒的啟動子，例如反病毒的長的末端復(fù)制物SV40衍生的啟動子或存在于HVT中的啟動子。
在體內(nèi)的同系重組技術(shù)可被用于將異種核酸序列引進(jìn)到HVT染色體組中。這通過首先構(gòu)成用于與HVT重組的重組DNA分子來完成。這種分子可由任何適宜的質(zhì)粒、宇宙粒(Cosmid)或噬菌體衍生，質(zhì)粒為最佳，如果需要實(shí)際上可連接到啟動子上，該分子含有異種核酸序列。上述核酸序列和啟動子被引進(jìn)到基因組HVTDNA片斷中，該片斷包含在此限定的，在重組DNA分子中半無性系化的插入?yún)^(qū)序列。應(yīng)具有適當(dāng)長度，以便在體內(nèi)發(fā)生與病毒的HVT染色體組的同系重組。如果需要，可以做成這樣的結(jié)構(gòu)，它含有兩個(gè)或多個(gè)不同的異種核酸序列，它們是由例如相同或不同的病原體衍生的，所述的序列通過在此規(guī)定的HVT序列的插入?yún)^(qū)被側(cè)接。這種重組的DNA分子可被用于制備表達(dá)兩種或多種不同抗原多肽的重組HVT，以提供多價(jià)的疫苗。其次，細(xì)胞，例如雞胚胎或纖維細(xì)胞(CEF)可在含與適當(dāng)HVT序列側(cè)接的異種核酸序列的重組DNA分子存在時(shí)，用HVT DNA轉(zhuǎn)染，從而在重組DNA分子中的插入?yún)^(qū)序列和HVT中的插入?yún)^(qū)序列之間發(fā)生重組。在沒有重組DNA分子序列時(shí)，通過用含與適當(dāng)側(cè)接插入?yún)^(qū)序列側(cè)接的異種核酸序列的核酸序列轉(zhuǎn)染被感染的細(xì)胞也可引起重組。據(jù)此，重組病毒的后代在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生并可以例如遺傳型地或表型地通過雜交而被選擇，檢測被異種核酸序列結(jié)合的基因編碼的酶的活性，或檢測由免疫重組HVT表達(dá)的抗原異種多肽。所選擇的重組HVT可以細(xì)胞培養(yǎng)方式大規(guī)模地被培養(yǎng)，此后含有由上述HVT表達(dá)的物質(zhì)或異種多肽的重組HVT可由此被收集。
按照本發(fā)明，表達(dá)一種或多種不同的特定病原體的異種多肽的活重組HVT可被用于對感受這些病原體的動物，特別是鳥類如雞、火雞、鶉鴿和珍珠鳥接種。用這樣的活載體疫苗接種后，最好繼而在被接種的宿主復(fù)制重組HVT，從而在體內(nèi)與HVT多肽一起表達(dá)異種多肽。然后該異種免疫多肽將導(dǎo)出既對HVT本身，也對上述多肽的免疫反應(yīng)。如果由特定病原體衍生的異種多肽能刺激防護(hù)免疫反應(yīng)，那么用本發(fā)明的重組HVT接種的動物將既對被MDV感染的，也對被該病原體隨后的感染免疫。因而，按照本發(fā)明摻入HVT染色體組中的異種核酸序列可以在體內(nèi)連續(xù)地表達(dá)，從而提供了對一種固態(tài)的、安全的和對病原體的長時(shí)間的免疫。
含有并表達(dá)一種或多種不同異種多肽的本發(fā)明的重組HVT可用作單價(jià)或多價(jià)疫苗。
本發(fā)明的重組HVT也可用來制備失活的疫苗。
對于動物施藥，特別可通過氣溶膠、飲水、口服、卵內(nèi)接種、皮內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)的方式供給所推薦的重組HVT。
本發(fā)明的另一目的是制備含有由本發(fā)明重組HVT表達(dá)的異種多肽的亞單位疫苗、藥用和診斷用制劑。這可以在促進(jìn)異種多肽的表達(dá)的條件下，通過培養(yǎng)用上述重組HVT感染的細(xì)胞來達(dá)到。然后根據(jù)其所需用途可用常規(guī)技術(shù)將異種多肽提純到一定程度，再將其處理成具有免疫、治療或診斷作用的制劑。
上述對特定抗原體的活性免疫被用作健康動物的防護(hù)處理。不言而喻，已被特定抗原體感染的動物可以用包含本發(fā)明重組HVT誘發(fā)的，含有由編碼抗原多肽的特定病原體所衍生的異種基因的抗體的抗血清處理。針對本發(fā)明重組HVT的抗血清可以通過使用激發(fā)適當(dāng)免疫反應(yīng)的有效量的上述重組HVT使動物，例如家禽免疫來制備。然后將該動物抽血并可制備抗血清。
實(shí)施例11、亞片斷與HVT染色體組的Us區(qū)域分離將雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)用來自HVT疫苗病毒株P(guān)B-THV1(由Interver International購得)的病毒感染，并在滾動瓶內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，直到該培養(yǎng)物達(dá)到90%的細(xì)胞病理效果(CPE)。細(xì)胞被收獲，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，離心并以每毫升1-5×18個(gè)細(xì)胞的密度再懸浮于20mMTris-HCl，pH7.5，10mM EDTA中。加入SDS至最終濃度為0.5%，并加入蛋白酶K(Boehringer)至200μg/ml。在37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，再加入100μg/ml蛋白酶K并繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。將該溶液用酚/氯仿的混合物(1∶1)萃取兩次，并將核酸用乙醇沉淀。將取自被感染細(xì)胞的全部DNA以0.5mg/ml的濃度溶于TE(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)。按照酶廠商推薦的條件在100μl反應(yīng)體積中于37℃用0.5單位Sau3A(Promega)經(jīng)10秒鐘培養(yǎng)出10微克DNA。將反應(yīng)產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上分離，并分離出16和20Kb之間的粒級。用1μg消化λEMBL3 DNA的BamHⅠ/EcoRⅠ(Promega)在10μl 30mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10Mm DTT，0.1mMATP中，于+4℃加入1U T，DNA連接酶(Boehringer)將100毫微克這些DNA片斷連接過夜。連接之后，在10μl體積中用BamHⅠ消化十分之一的反應(yīng)混合物，并使用市售萃取物(Promega)在試管內(nèi)包裝DNA。重組噬菌體以大約100pfu/平皿的密度在適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主菌株如LE392或K802上平板培養(yǎng)。按照Benton & Davis(1978)使用硝化纖維濾器制備雙份該皿的復(fù)制物。第一份用取自未感染CEF的32P-示蹤DNA雜交(Maniatis等人，1982)，而第二份用取自HVT感染細(xì)胞的32P-示蹤DNA雜交。經(jīng)洗滌并曝光在X射線膠片上之后，復(fù)式濾器的圖象以正確取向疊加，并且用由感染細(xì)胞制成的探針給出特定信號的若干噬菌斑被分離，并來自它的噬菌體被放大。這些選擇物之一，即特指的λHVT04通過17.5Kb插入物(圖1)的限制性圖詳細(xì)分析。存在于這個(gè)片斷中的序列基本對應(yīng)于HVT染色體組的Us區(qū)域，包括該重復(fù)結(jié)構(gòu)(Igarashi等人，1987)的側(cè)接部分。
2、使用Us區(qū)域的亞片斷將β-半乳糖苷酶基因插入HVT染色體組為了在體內(nèi)使得用完整病毒染色體組DNA發(fā)生重組過程，存在于λHVT04插入物中的兩個(gè)XhoⅠ片斷在適當(dāng)位置包含單一的BglⅡ限制性位點(diǎn)。這兩個(gè)片斷由λHVT04通過XhoⅠ的消化并用SalⅠ消化的質(zhì)粒載體pGEM3Z(Promega)連接而半無性系化。所得的攜帶有圖1所指明的XhoⅠ片斷的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)pMD07和pMD12，借助于單一BglⅡ限制性位點(diǎn)被線性化，并且與由BamHⅠ側(cè)接的4.0Kb表達(dá)盒相連接，它們含有來自由早期啟動子控制的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶，該早期啟動子則來自SV40。這種表達(dá)盒已由pCH110，即由Pharmacia購得的質(zhì)粒通過在復(fù)制物的SV40起源附近取代72bp而衍生，它在pCH110中通過雙鏈合成低核苷酸存在，并具有如下結(jié)構(gòu)5′－G G A T C C G T C G A C C A T G －3′3′－G T A C C C T A G G C A G C T G －5′在pCH110的兩個(gè)SphⅠ限制性位點(diǎn)之間插入銜接物不在二者中任何一個(gè)位點(diǎn)上恢復(fù)對SphⅠ的識別序列，并產(chǎn)生SV40早期啟動子上游的BamHⅠ和SalⅠ位點(diǎn)。用BamHⅠ依次消化這種構(gòu)成物產(chǎn)生上述用于在pMD07和pMD12的BglⅡ位點(diǎn)插入的4.0Kb表達(dá)盒，從而導(dǎo)致質(zhì)粒pMD07gal和pMDgal它們的限制性圖示于圖2。質(zhì)粒pMD07gal和pMD12gal的線性化DNA與由HVT感染的細(xì)胞制備的總的DNA一起基于按照Graham和V.d.Eb(1973)所述的磷酸鈣沉淀的方法被引進(jìn)CEF。來自含由HVT同源序列側(cè)接的β-半乳糖苷酶構(gòu)成物的2微克質(zhì)粒DNA在最終體積為560μl H2O中與15μgHVT感染細(xì)胞的DNA混合，并加入750μl HBSP(20mMKCl，560mM NaCl，24mM葡萄糖，3mM Na2HPO4，100mMH EPES，PH7.0)中，通過逐漸加入190μl 1M CaCl2溶液形成沉淀，再將該混合物在室溫下培養(yǎng)30分鐘。在此期間，來自在介質(zhì)6/B8中10天久的胚胎的二次CEF的15ml懸浮液以每5×105個(gè)細(xì)胞的密度被接種在φ10Cm的皿中，該懸浮液組合物是以用2%牛犢胎兒血清補(bǔ)充的Eagle′s Minimal Essential Medium的Glasgow變體為基礎(chǔ)的。將磷酸鈣沉淀的DNA細(xì)心地加入到細(xì)胞懸浮液中，該玻璃皿在空氣中于含5%CO2的增濕培養(yǎng)器中在37℃下培養(yǎng)。5小時(shí)后，除去介質(zhì)，并將含等體積HBSP和30%甘油的溶液10ml在該細(xì)胞上分層。培養(yǎng)1-2分鐘后，分離該溶液，用介質(zhì)6/B8洗滌細(xì)胞，并將玻璃皿用新鮮介質(zhì)培養(yǎng)3-5天，直至病毒CPI發(fā)育。含有表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的重組HVT病毒的噬菌斑通過它們能將基質(zhì)Bluogal(Gibco-BRL)，即一種5-溴基-4-氯代-3-吲哚基-β-半乳糖苷酶的化學(xué)衍生物轉(zhuǎn)化成一種蘭色反應(yīng)產(chǎn)物的能力而被鑒別。用0.2mg/ml溶于二甲基亞砜的新鮮Bluogal將平皿染色，并培養(yǎng)直到蘭色噬菌斑被檢測出來。用來自pMD07和pMD12的半乳糖苷酶衍生物轉(zhuǎn)染，這一切導(dǎo)致顯著百分?jǐn)?shù)(＞5)的蘭色噬菌斑。來自用pMD07和pMD12的轉(zhuǎn)染系列的正噬菌斑被顯微檢出并與新鮮CEF混合以使得放大病毒。當(dāng)CPE可見時(shí)，收獲細(xì)胞，并且在含有1%牛血清蛋白的Calstab緩沖液(每升H2O含74.35克蔗糖，0.52克KH2PO4，2.58克Na2HPO4·2H2O和0.92克谷氨酸鈉)中通過在Vibracell 300 Cup born裝置內(nèi)于15℃聲學(xué)處理盛有該萃取物的塑料管制備溶菌產(chǎn)物。無細(xì)胞病毒在供滴定的新鮮CEF上平板培養(yǎng)，并檢測含有染成蘭色的重組HVT病毒的噬菌斑并如上所述予以放大。重復(fù)這一循環(huán)直到當(dāng)用Bluogal感染該培養(yǎng)物時(shí)大于95%的病毒噬菌斑被標(biāo)記為正。特別是如由pMD12衍生的A4-1/A10-4和由pMD12衍生的E1/E2所指明的四克隆被選擇用于制備供雞作接種試驗(yàn)的病毒原種。此外，部分原種被用于由被感染的CEF制備總DNA。用XhoⅠ消化的DNA被接續(xù)在瓊脂糖凝膠上并按照Maniatis等人(1982)所述被轉(zhuǎn)移到硝化纖維素片上。使用非破裂的XhoⅠ片斷作為探針與消化非重組HVT病毒DNA的XhoⅠ作作比較時(shí)，A4-1/A10-4和E1/E2的雜交試樣由于插入β-半乳糖苷酶盒顯示出在pMD07和pMD12中原始斷片尺寸的預(yù)期增長。
β-半乳糖苷酶標(biāo)記的基因用于顯示ORF-4和ORF-5也代表潛在的插入?yún)^(qū)。為此目的，用合成的16-基雙鏈低聚物取代在ORF-4中的核苷酸位置2311和ORF-5中的3428之間的pMD12中的1117bp SpeⅠ片斷，在pMD12中產(chǎn)生一個(gè)新的和單一的SalⅠ位點(diǎn)，從而缺失ORF-4和ORF-5二者的顯著部分。由pMD40指明的這種質(zhì)粒的限制性圖存在于圖3A中。用于插入的β-半乳糖苷酶標(biāo)記基因通過首先將單一的BamHⅠ位點(diǎn)與SalⅠ交換，并接著用含上述BamHⅠ和SalⅠ限制性位點(diǎn)的雙鏈合成銜接物取代72-bp SphⅠ片斷而由pCH110衍生出來。
β-半乳糖苷酶標(biāo)記的基因現(xiàn)被置在由SalⅠ位點(diǎn)側(cè)接的4.0Kb DNA片斷上，并可以照這樣被轉(zhuǎn)移到pMD40中新產(chǎn)生的SalⅠ位點(diǎn)，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pMD44(參見圖3B)。
線性化的pMD44 DNA與來自HVT感染細(xì)胞的DNA一起被共同轉(zhuǎn)染到上述次級CEF中。培養(yǎng)平皿直到CPE發(fā)育為止。用Bluogal對培養(yǎng)皿染色鑒別出有足夠百分?jǐn)?shù)的表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的HVT噬菌斑。
這些結(jié)果可與在ORF-2和ORF-3中插入標(biāo)記基因后所做的最初的觀察相比較。
實(shí)施例2用表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的重組HVT給雞接種用50或1000pfu病毒原種A4-1和E1對10天久的白色來克亨雞作肌肉接種。將等劑量的親本HVT疫苗病毒株P(guān)B-THVI注入供比較的動物。在8天和15天時(shí)，收集血液樣品并在Ficoll/Hypaque梯度分離器上分離白血細(xì)胞。將白血細(xì)胞在次級CEF上接種，并測定與被接種細(xì)胞數(shù)目相關(guān)的噬菌斑的數(shù)目。將這些滴定結(jié)果示于表1，它們證明，含有插入每個(gè)XhoⅠ亞片斷中(該XhoⅠ亞片斷分別存在于pMD07和pMD12中)的任何一個(gè)單一BglⅡ限制性位點(diǎn)中的β-半乳糖苷酶基因的重組HVT病毒，相對于非重組PBTHVT疫苗病毒株，在可比較的倍數(shù)和水平上能夠誘導(dǎo)雞的病毒血癥。用某些在CEF上的白血細(xì)胞滴定的Bluogal染色顯示出，由仍然表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的被感染的雞回收的病毒大于90%。此外，在個(gè)別接種35天后的動物的血清樣品中，證明了對β-半乳糖苷酶有效的ELTSA抗體效價(jià)。因此可得出結(jié)論，由存在于pMD07和pMD12中的鄰接序列所限定的，來自HVT染色體組的Us的特殊區(qū)域可被用于穩(wěn)定的綜合異種基因，而不會影響該HVT病毒的基本功能，例如為感染和復(fù)制而必須的功能。此外還表明，插入這個(gè)區(qū)域的異種基因正是表現(xiàn)能在被感染動物血清中誘導(dǎo)高水平抗體效價(jià)的功能性蛋白質(zhì)。
表1重組HVI誘導(dǎo)的白血細(xì)胞(WBC)病毒血癥
＊WBC在CEF平皿上接種5天后讀數(shù)其它是接種3天后讀數(shù)實(shí)施例3HVT的Us區(qū)域部分的序列分析按照Sanger等人(1977)所述，使用在二脫氧鏈終止反應(yīng)中的雙鏈DNA制劑，將相應(yīng)于如圖1所示來自HVT基因組的有關(guān)XhoⅠ限制性片斷的質(zhì)粒pMD07和pMD12的插入物進(jìn)行精細(xì)的核苷酸序列分析。反應(yīng)的第一階段由與有關(guān)HVT基因片斷側(cè)接的pGEM3Z質(zhì)粒載體中的SP6和T7啟動子位點(diǎn)內(nèi)部完成。該分析通過引入僅在一個(gè)取向上插入有關(guān)片斷的漸進(jìn)缺失完成。這些漸進(jìn)缺失是使用核酸外切酶-Ⅲ，即僅識別雙鏈DNA和在3′至5′取向上消化雙螺旋的一個(gè)鏈的單鏈核酸外切酶引入的。在待分析的片斷末端附近選擇造成5′-突出或鈍頭端的限制性位點(diǎn)，結(jié)合產(chǎn)生保護(hù)通過核酸外切酶-Ⅲ降解的質(zhì)粒載體中的引子起始位點(diǎn)SP6或T7的3′單鏈端的第二限制性內(nèi)切酶，迫使該酶分離例如在pMD07或pMD12中存在的插入DNA片斷的一個(gè)鏈。每隔30秒由反應(yīng)混合物中取樣，并按照Henikoff(1984)所述步驟處理，產(chǎn)生重復(fù)循環(huán)的DNA分子，這些分子轉(zhuǎn)化成合適的E.coli宿主病毒株。對分別引入pMD07和pMD12的原始1.2和3.5Kb片斷的缺失位點(diǎn)，通過限制性圖分析單獨(dú)菌落的質(zhì)粒DNA微制劑。使用鏈終止反應(yīng)中來自微制劑的雙鏈DNA，通過核苷酸定序分析含有在一個(gè)取向上插入片斷的漸進(jìn)缺失的一系列選擇物。在變性丙烯酰胺凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過自動射線照相在X線膠片上目測。用數(shù)字讀數(shù)器閱讀帶型并使用射槍處理機(jī)和來自Gene-Master工作站(Bio-Rad)的其它程序采集數(shù)據(jù)。
鄰近在pMD12中存在的XhoⅠ片斷的XhoⅠ限制性片斷由λHVT04(圖1)半無性系化進(jìn)入pMD36并按照上述相同步驟部分定序。
實(shí)施例4在HVT基因組內(nèi)的區(qū)域鑒定和精細(xì)分析之后，可進(jìn)行基因插入，可以與一種編碼β-半乳糖苷酶以外的任何基因構(gòu)成重組HVT病毒。然而，將來自相關(guān)和非相關(guān)的禽類病原體的相關(guān)抗原編碼的這些基因是特別有意義的。在下述段落中將描述這一用途的一個(gè)實(shí)例。該有意義的基因使傳染性支氣管炎病毒(IBV)，即一種雞的高度接觸傳染冠形病毒的膜粒蛋白質(zhì)的157Kd前體分子編碼。這一糖基化的蛋白質(zhì)是典型表面結(jié)構(gòu)的主要組分，也稱為噬菌體刺突，它在所有冠形病毒中，包括IBV中存在。從IBV病毒株M41，一種屬于Massachusetts血清型的病毒株中分離出這一基因的復(fù)制物cDNA，并被放置在從勞氏肉瘤病毒(RSV)的長端重復(fù)序列(LTR)中產(chǎn)生的啟動子要素后面。然后，包括啟動子的基因被轉(zhuǎn)移至與先前為插入β-半乳糖苷酶表達(dá)盒所用相同的在pMD07中的單一BglⅡ限制性位點(diǎn)，并重組成HVT病毒基因組。篩分病毒的重組體后代以表達(dá)噬菌體刺突基因并分離規(guī)定的選擇物，以限定的稀釋度通過一種或多種平皿培養(yǎng)被無性系化。建立重組體IB/HVT病毒的純系原種并用于隨后的體內(nèi)和試管內(nèi)的鑒定。
1、從IBV病毒株M41中分離噬菌體刺突基因通過將尿囊腔與104半卵傳染劑量/每個(gè)卵接種使IBV病毒株M41中的病毒在10天久的含胚卵中生長。在37℃下24小時(shí)培養(yǎng)后，在4℃下將卵冷藏過夜。收集尿囊液，小心地使其在冰上冷卻。通過在4℃及600xg經(jīng)30分鐘離心分離將血紅細(xì)胞和碎片分離。在貝克曼19轉(zhuǎn)子中于4℃以54000xg經(jīng)4小時(shí)，從上清液中將病毒壓成小丸。通過穿過注射針的重復(fù)通道將小丸再懸浮在冷TNE(10mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5)中并在32ml，線性梯度20-60%蔗糖的TNE溶液中分層。在SW28轉(zhuǎn)子中以24000rpm于4℃離心分離過夜后，通過側(cè)壁用注射器將管道刺穿收集病毒帶。用2體積TNE稀釋后，在SW28轉(zhuǎn)子中于4℃以18000rpm經(jīng)90分鐘將病毒壓成小丸。將物料重新懸浮在小體積TNE中并添加十二烷基硫酸鈉至最終濃度為0.5%。用200μg/ml蛋白酶K(Boehringer)將該制劑在37℃消化2小時(shí)并用1∶1酚/氯仿混合物萃取二次。用二體積乙醇，在有0.1M乙酸鈉存在時(shí)，pH6.0，于-20℃下沉淀水相中的病毒RNA。在離心分離并用乙醇沖洗管子后，將小丸在真空中干燥并溶解在無菌水中，得到濃度為0.5mg/ml的RNA。該制劑含有通過瓊脂糖凝膠電泳檢查的＞90%IBV基因組RNA并貯存在-20℃。在75μl反應(yīng)體積中使用5μg病毒RNA在有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶存在時(shí)用低(dT)12-18進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。在44℃下培養(yǎng)30分鐘后，通過在100℃加熱3分鐘使DNA/RNA雜種變性，隨后在有E.coliDNA聚合酶Ⅰ的大片斷存在時(shí)合成第二鏈，在20℃下使該反應(yīng)物培養(yǎng)2小時(shí)。用乙醇沉淀cDNA并在200μl反應(yīng)體積中用10單位S1-核酸酶在37℃下消化30分鐘。在10mM Tris-HCl，5mM EDTA，500mM NaCl，pH7.5的3.2ml 5-20%蔗糖梯度中將反應(yīng)產(chǎn)物分層并在SW65轉(zhuǎn)子中以30000rpm于15℃離心分離16小時(shí)。收集大小在500和5000堿基對之間沉淀的物料，用乙醇沉淀并溶解在20μl 0.1 SSC(15mM NaCl，1.5mM檸檬酸鈉)中。按照酶供應(yīng)者推薦的條件通過在30μl反應(yīng)體積中用15單位末端轉(zhuǎn)移酶(Gibco-BRL)在37℃下培養(yǎng)2分鐘，雙鏈cDNA的末端以10到15dG殘基延伸。用5mM EDTA使反應(yīng)停止。將10毫微克具尾的cDNA與在10μl TEN最終體積中的25摩爾過量磷酸化合成低聚物5′-dAATTCCCCCCCCCCC-3′在65℃加熱2分鐘，并通過在50℃培養(yǎng)過夜一起退火。在20μl 30mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mMDTT，0.1mMATP中與10μg EcoRⅠ消化的λgt10 DNA連接(Huynh等，1985)，添加1單位T4DNA連接酶并在4℃培養(yǎng)過夜。將DNA加入試管內(nèi)封裝的反應(yīng)混合物(Promega)中并在E.coli的hf1A病毒株上平皿培養(yǎng)后通過對重組噬菌體的選擇得到IBV菌株M41的cDNA庫。
對于為噬菌體刺突蛋白質(zhì)片斷編碼的cDNA克隆，通過在E.coli菌苔的培養(yǎng)皿中平皿培養(yǎng)100-200pfu篩分該庫。準(zhǔn)備硝化纖維的復(fù)式過濾器(Benton and Davis，1978)并用在含有10mM Tris-HCl，pH7.5，1M NaCl，0.1%SDS的雜化溶液和4×Denhardt′s溶液中的32P標(biāo)記的合成低聚物于42℃下培養(yǎng)過夜(Maniatis等，1982)。
使用三種合成低聚物作為這些雜化溶液中的探針，它們含有如下核苷酸序列結(jié)構(gòu)Ⅰ.5′－dTTAGGTGGTCTGAAGGCACTTTGGTAGTAGTA－3′
Ⅱ.5′－dTACCTACTAATTTACCACCAGAAACTACAAACTGCTG－3′Ⅲ.5′－dTGGATCATTAAACAGACTTTTTAGGTCTGTATTGTT－3′選擇用一個(gè)或較好為二個(gè)這些探針給出信號的重組噬菌體通過標(biāo)準(zhǔn)方法提純噬菌斑(Maniatis等，1982)。來自λ噬菌體重組體的cDNA片斷由EcoRⅠ限制性位點(diǎn)側(cè)接并因此由使載體pGEM3Z(Promega)無性系化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到EcoRⅠ位點(diǎn)中。
對兩個(gè)選擇物的限制性分析和局部定序表明，一個(gè)對完全的S1編碼，而另一個(gè)對噬菌體刺突基因的S2的半個(gè)編碼。這兩個(gè)DNA片斷的序列彼此部分重疊。特別是相對于S1/S2交點(diǎn)附近單一的M1uI-限制性位點(diǎn)彼此部分重疊。然后利用這一位點(diǎn)收集上述兩個(gè)片斷并得到具有載有編碼IBV菌株M41的蛋白質(zhì)膜粒的3.7Kb BamHⅠ插入物的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
2、受LTR啟動子控制的M41編碼噬菌體刺突基因的HVT重組體質(zhì)粒pIB18的結(jié)構(gòu)從RSV的LTR序列中選擇在其插入進(jìn)HVT病毒基因組后可以直接表達(dá)外部基因的一種強(qiáng)啟動子。在pRSVcat的580bpNdeⅠ/HindⅢ限制性片斷上繪制出了該啟動子圖(Gorman等，1982)并借助在片斷兩個(gè)側(cè)面上雙鏈合成銜接物將該啟動子在pGEM3Z(Promega)的HindⅢ和PstⅠ位點(diǎn)之間插入。使載有LTR-啟動子的載體pGEM3Z的HindⅢ位點(diǎn)和RSV片斷的NdeⅠ位點(diǎn)之間的連接具有30bp含有在一個(gè)位點(diǎn)上與HindⅢ相容而在另一位點(diǎn)上與NdeⅠ相容的粘性末端的銜接物。然而，由于在六個(gè)堿基對識別序列的外核苷酸中仔細(xì)的修飾，在連接以后兩個(gè)限制性位點(diǎn)都不復(fù)原。除了分離這兩個(gè)位點(diǎn)外，在相應(yīng)的位置形成在銜接物本身內(nèi)部存在的一個(gè)新的限制性位點(diǎn)(BamHⅠ)。將把LTR片斷的HindⅢ位點(diǎn)連接到pGEM3Z的PstⅠ位點(diǎn)的第二20Kb銜接物合成，這樣不破壞在兩端的識別序列并將三個(gè)合適的單一限制性位點(diǎn)加到已在pGEM3Z的聚銜接物，如PstⅠ、SalⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ中存在的位點(diǎn)中。從而，生成的pGEM3Z的衍生物，即特指的pVECO1，含有650bp載有LTR啟動子序列的限制性片斷，繼而立即再含七個(gè)可以插入外部基因的限制性位點(diǎn)。該650bp片斷在兩端通過BamHⅠ限制性位點(diǎn)側(cè)接并因此由pMD07轉(zhuǎn)移到1.2KbHVT插入物中存在的單一的BglⅡ位點(diǎn)。這兩種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的接合端是相容的，但無論是對BglⅡ或BamHⅠ的原始識別序列，連接都不能復(fù)原。在朝TRs取向上載有LTR的一種生成的結(jié)構(gòu)物被指定為pVECO4并通過限制性圖檢驗(yàn)(圖4)。這一通用的HVT重組載體的結(jié)構(gòu)可以使LTR啟動子直接插入下游的外部基因并通過體內(nèi)重組使完全表達(dá)盒隨后綜合成HVT基因組。LTR下游的，特別是對酶BglⅡ，XhoⅠ和EcoRV那些不同的限制性位點(diǎn)的位置以這樣的方式設(shè)計(jì)，即甚至可以設(shè)想多基因的插入。這一載體的首要用途是構(gòu)成表達(dá)IBV病毒株M41的噬菌體刺突基因的重組HVT病毒，它的分離已公開在上述段落。載有M41噬菌體刺突基因的3.7Kb BamHⅠ限制性片斷被插入LTR啟動子下游的pVECO4的單一BglⅡ位點(diǎn)。而且這一操作不能使連接后的各限制性位點(diǎn)復(fù)原。通過確認(rèn)如圖5中所存在的預(yù)期結(jié)構(gòu)的限制性圖分析含有在相對LTR啟動子正確取向中插入基因的一個(gè)選擇物。這一質(zhì)粒特指為pIB18并隨后用于雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)的并發(fā)轉(zhuǎn)染。
3、IBV刺突基因的基因組插入進(jìn)HVT以及膜粒蛋白質(zhì)的表達(dá)按照為構(gòu)成β-半乳糖苷酶重組體的實(shí)施例1中所述的方法，使pIB18的線性化DNA與HVT感染的雞細(xì)胞的總DNA一起轉(zhuǎn)染。
通過使用對IBV單或多價(jià)血清的免疫熒光染色進(jìn)行了表達(dá)噬菌體刺突蛋白質(zhì)的HVT重組體的檢測。如前面例1所述，在新鮮CEF上通過一次轉(zhuǎn)染后的初步培養(yǎng)，收集并聲學(xué)處理。滴定無細(xì)胞溶解產(chǎn)物后，使用小于1pfu/每孔，在限定的稀釋度下使含CEF的微量滴定血感染并培養(yǎng)直至CPE的檢測。通過與新鮮CEF一起的二重微量滴定皿分別分離每個(gè)孔的細(xì)胞懸浮液并且再培養(yǎng)2天。然后固定一個(gè)皿，用IBV特殊血清染色并在顯微鏡下進(jìn)行免疫熒光檢查，計(jì)算含有大量IBV-正染色HVT噬菌斑的那些孔。
從相應(yīng)的二重微量滴定皿的孔中發(fā)現(xiàn)存活的感染細(xì)胞并通過在新鮮CEF上的一或二個(gè)孔口放大。這一基于限定稀釋度的無性系化步驟重復(fù)許多次并得到一些單獨(dú)的在感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上IBV特殊免疫熒光化驗(yàn)中為正染色的重組HVT病毒的分離物。
實(shí)施例51、由新城病病毒(NDV)分離編碼融合(F)和血球凝集素(HN)蛋白質(zhì)基因?qū)DV疫苗病毒株克隆30(Intervet International，Holland)的病毒在受胚卵上生長30小時(shí)并在4℃培養(yǎng)過夜后收集尿囊液。通過單蔗糖梯度提純病毒并通過在有SDS存在時(shí)的蛋白酶K的消化作用萃取基因組RNA。
用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，使用20μg/ml無規(guī)10堿性低聚物使反應(yīng)啟動。
第二鏈的合成、S1-處理及包括插入進(jìn)λgt10宿主的后續(xù)步驟如上面例4的部分1所述進(jìn)行。
F基因特殊序列庫的篩分通過噬菌斑32P標(biāo)記的低核苷酸雜交進(jìn)行。
Ⅰ.5′GGCAGGCCTCTTGCGGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGG 3′Ⅱ.5′GCAAAAGGCGCAACAGAAGACCTTGTTGTGGCTTGGC 3′分別識別代碼區(qū)的5′和3′末端。HN基因序列的鑒別用低核苷酸進(jìn)行。
Ⅲ.5′GAAAGAGAGGCGAAGAATACATGGCGCTTGGTATTCCGG3′Ⅳ.5′GAAATAATCTAATACTCTTCGGGAATTCAGGATCGT3′通過比較在NDV-病毒株Australia-Victoria(McGinnes等，1986)，Italien(Espion等，1987和Wemers等，1987)，Beaudette(Chambers等，1986和Millar等，1986)和D26(Sato等，1987)方面所公布的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)這些探針的序列。
分離給出具有至少兩個(gè)探針信號的正選擇物并以限制性圖表征。從這一系列中選擇二個(gè)，分別復(fù)蓋來自NDV病毒株一克隆30的F和HV。
DNA插入物被轉(zhuǎn)移入質(zhì)粒載體pGEM4Z中并用核酸外切酶Bal31操作以分離F和HV基因?qū)嶋H編碼區(qū)上游或下游的過?；蛑丿B序列。
這導(dǎo)致了含有對通過BamHⅠ限制性位點(diǎn)分別側(cè)接的F、HV的完全基因編碼的質(zhì)粒pNDVO1和pNDVO3。
2、NDF的F和HV基因的基因組插入HVT分別含有編碼F和HV基因的質(zhì)粒pNDVO1和pNDVO3的BamHⅠ片斷被插入HVT重組載體pNE04的BglⅡ位點(diǎn)，生成pNDVO4和pNDVO5。
通過根據(jù)圖6所示的這些結(jié)構(gòu)的物理圖的限制性分析驗(yàn)明相對于LTR啟動子的插入基因的正確取向。
這些質(zhì)粒的DNA與HVT感染細(xì)胞的DNA一起共同轉(zhuǎn)染成例1部分2中所述的CEF。
在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物放大后，得到無細(xì)胞溶解產(chǎn)物并在微量滴定皿中平血培養(yǎng)。
通過使用多價(jià)NDV血清或抗特殊NDV抗原的單克隆抗體的免疫熒光染色進(jìn)行表達(dá)F或HN蛋白質(zhì)的HVT重組體的檢測。
通過如例4的部分3中所述的限定稀釋度進(jìn)行重組病毒的富集。通過單噬菌斑分離和為分別表達(dá)由免疫熒光染色感染的CEF中F、HN的試驗(yàn)，建立純系重組病毒制劑。
附圖的說明圖1基本上相應(yīng)于HVT基因組Us區(qū)域的DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖。指明了由四個(gè)開放讀碼和在其中未編碼序列組成的插入?yún)^(qū)的相對位置。
圖2A)pMD07gal的限制性圖，這一質(zhì)粒已通過將β-半乳糖苷酶基因插入在HVT基因組的1·2Kb XhoⅠ片斷中存在的單一Bg1Ⅱ限制性位點(diǎn)，由pMD07衍生。
B)pMD12gal的限制性圖。這一質(zhì)粒已通過將β-半乳糖苷酶基因插入在HVT基因組的3·5Kb XhoⅠ片斷中存在的單一Bg1Ⅱ限制性位點(diǎn)，由pMD12衍生。
圖3A)pMD40的限制性圖。通過合成含有SalT位點(diǎn)的低核苷酸取代pMD12中存在的1117bp SpeⅠ片斷。
B)pMD14的限制性圖。通過將由SalⅠ位點(diǎn)側(cè)接的4.0KS β-半乳糖苷酶標(biāo)志的基因插入pMD40的SalⅠ位點(diǎn)而由pMD40衍生。
圖4表示插入pMD071·2Kb XhoⅠ HVT片斷的單一BglⅡ位點(diǎn)的LTR啟動子的pMEC04的限制性內(nèi)切酶圖。
圖5表示載有插入LTR啟動子下游pVEC04的Bg1Ⅱ位點(diǎn)的IBV病毒株M41的噬菌體刺突基因的3.7Kb BamHⅠ片斷的pIB18的限制性內(nèi)切酶圖。
圖6A)pNDV04的限制性圖。質(zhì)粒含有由插入pVECO4 Bg1Ⅱ位點(diǎn)的BamHⅠ位點(diǎn)側(cè)接的NDV-F基因(見圖4)。
B)pNDV05的限制性圖質(zhì)粒含有由插入pVECO4Bg1Ⅱ位點(diǎn)的BamHⅠ位點(diǎn)側(cè)接的NDV-HV基因。
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序列表(2)序列標(biāo)志(SEQ ID)信息No1(ⅰ)序列特征(A)長度4527堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙(d)布局直線(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體Turkey皰疹病毒(B)病毒株P(guān)B-THV1(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)定位1..81(D)其它信息/1abel＝ORF1的末端(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)定位316..945(D)其它信息/1abe1＝ORF2(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)定位補(bǔ)碼(1084..2124)(D)其它信息/1abe1＝ORF3
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)定位補(bǔ)碼(2322..3170)(D)其它信息/1abe1＝ORF4(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)定位3320..4504(D)其它信息/1abe1＝ORF權(quán)利要求
1.重組HVT，其特征在于該重組體含有一個(gè)異種核酸序列，所述核酸序列在HVT基因組的插入?yún)^(qū)被引入，該區(qū)域相應(yīng)于在具有基本上由圖1所定義的限制性內(nèi)切酶圖的HVT基因組的一個(gè)DNA片段內(nèi)部從ORF-1末端直至并包括ORF-5的基因組區(qū)域。
2.重組HVT，其特征在于該重組體含有一個(gè)異種核酸序列，所述核酸序列在HVT基因組的插入?yún)^(qū)被引入，該區(qū)域相應(yīng)于基本上由序列標(biāo)志(SEQ ID)No1所示的DNA序列定義的核酸位置82和4504之間的DNA序列。
3.按照權(quán)利要求1-2的重組HVT，其特征在于插入?yún)^(qū)相應(yīng)于ORF-2、ORF-3、ORF-4或ORF-5。
4.按照權(quán)利要求3的重組HVT，其特征在于異種核酸序列是在ORF-2或ORF-3中存在的BglⅡ限制性位點(diǎn)摻入。
5.按照權(quán)利要求1-4的重組HVT，其特征在于至少一部分插入?yún)^(qū)內(nèi)的HVT核酸序列被缺失。
6.按照權(quán)利要求1-5的重組HVT，其特征在于異種核酸序列對多肽編碼并在所述重組HVT感染的細(xì)胞中調(diào)節(jié)表達(dá)所述核酸序列的啟動子的控制之下。
7.按照權(quán)利要求1-6的重組HVT，其特征在于異種核酸序列對鳥類病原體的抗原編碼。
8.按照權(quán)利要求7的重組HVT，其特征在于抗原是從包括Marek′s Disease Virus，Infectious Bronchitis Virus，Newcastle Disease Virus或InfectiousBursal Disease Virus的組中衍生來的。
9.核酸序列在與從HVT基因組的插入?yún)^(qū)衍生的DNA序列側(cè)接(該插入?yún)^(qū)相該于從ORF-1直到并包括ORF-5的HVT基因組區(qū)域)的啟動子控制下包含至少一個(gè)對HVT，或其部分異種的基因。
10.包含一個(gè)權(quán)利要求9的核酸序列的重組DNA分子。
11.從權(quán)利要求9的核酸序列，或權(quán)利要求10的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
12.制備權(quán)利要求1-8重組HVT的方法，其特征在于一個(gè)合適的細(xì)胞培養(yǎng)物與HVT DNA和權(quán)利要求10的重組DNA分子共同轉(zhuǎn)染。
13.用權(quán)利要求1-8的重組HVT感染的細(xì)胞培養(yǎng)物。
14.含有權(quán)利要求1-8重組HVT的疫苗。
15.疫苗、藥用或診斷用組合物，包含有權(quán)利要求1-8重組HVT所表達(dá)的多肽。
16.制備疫苗的方法，其特征在于HVT含有的物料從權(quán)利要求13的細(xì)胞培養(yǎng)物中收集并處理成疫苗。
17.制備疫苗、藥用或診斷用組合物的方法，其特征在于將由權(quán)利要求1-8的重組HVT所表達(dá)的一種多肽處理成具有免疫、治療或診斷活性的制劑。
18.含有針對權(quán)利要求1-8重組HVT的抗體的抗血清。
19.動物抗傳染性疾病的免疫方法，該方法包括給所述動物使用權(quán)利要求14的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Turkeys重組皰疹病毒(HVT)該病毒含有摻入HVT基因組一個(gè)插入?yún)^(qū)的異種基因。本發(fā)明還涉及一種包含表達(dá)異種抗原多肽并對合適的動物宿主的感染誘導(dǎo)適應(yīng)免疫反應(yīng)的這樣一種重組HVT的載體疫苗。
文檔編號A61K39/395GK1052896SQ90110319
公開日1991年7月10日 申請日期1990年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月4日
發(fā)明者帕樂斯·杰克巴斯·安東尼斯·桑德美哲, 約哈尼斯·安東尼斯·約瑟夫·克拉森斯, 阿爾伯特·菲利普·亞德蘭·墨齊特 申請人:阿克佐公司