專利名稱：可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域，涉及重組腺病毒伴隨病毒的生產(chǎn)方法及獲得的產(chǎn)品的用途，尤其是在基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的用途。本發(fā)明是中國專利98101753.3(申請(qǐng)?zhí)?和98120033.8(申請(qǐng)?zhí)?的延續(xù)。
基因傳遞系統(tǒng)(gene delivery system)是基因治療研究和應(yīng)用的核心技術(shù)，包括病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體等。其中腺病毒伴隨病毒(adeno-associated virus，AAV)載體因其安全、穩(wěn)定、既可感染分裂細(xì)胞又可感染不分裂細(xì)胞、感染效率高、可長期表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注。
AAV病毒是一種非致病性的微小病毒，基因組為4680nt的單鏈DNA。AAV病毒的生活周期有潛伏性感染和裂解性感染兩種方式。AAV病毒的裂解性復(fù)制需要有輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的參與。在沒有輔助病毒存在時(shí)，AAV病毒以前病毒方式整合在宿主細(xì)胞染色體中。AAV基因組的末端分別有145nt的ITR序列，該序列是AAV病毒必需的順式作用元件，在AAV病毒基因組的拯救、復(fù)制、包裝和整合等功能中具有重要作用。兩個(gè)ITR之間為反式作用的rep和cap基因，對(duì)AAV病毒DNA的復(fù)制和病毒顆粒的產(chǎn)生是必不可少的。Rep基因編碼4種蛋白R(shí)ep78，Rep68，Rep52，Rep40，與AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救等功能有關(guān)。Cap基因編碼3種外殼蛋白，VP1，VP2，VP3，構(gòu)成AAV的20面體外殼。
Samulski RJ等(Cloning of adeno-associated virus into pBR322rescue of intact virus from therecombinant plasmid in human cells，Proc.Natl Acad.Sci USA，792077-2031，1982)將完整的雙鏈AAV DNA克隆于pBR322質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒中的AAV前病毒基因組亦具有感染性。因此將外源基因表達(dá)單位置于AAV病毒的兩個(gè)ITR之間，而rep和cap基因及輔助病毒的功能則由其它方式反式提供，在細(xì)胞中可獲得含有外源基因的重組腺病毒伴隨病毒(recombinantadeno-associated virus，rAAV)。
經(jīng)典的rAAV產(chǎn)生方法是用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以及輔助病毒如5型腺病毒(Ad5)感染。雙質(zhì)粒中一個(gè)是重組AAV載體質(zhì)粒，另一個(gè)為含有AAV rep/cap基因的輔助質(zhì)粒。由于這種方法操作較復(fù)雜，影響rAAV產(chǎn)生的因素多，難以獲得高滴度的rAAV，不易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，因此許多研究者致力于改進(jìn)rAAV的產(chǎn)生方法。這些改進(jìn)包括以下幾類1)將rep/cap基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞株中，建成一種包裝細(xì)胞系。其中的rep/cap的表達(dá)受其自身的啟動(dòng)子控制，或換成其它組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。2)將AAV ITRs和其間的外源基因表達(dá)單位DNA插入腺病毒基因組中，構(gòu)建成一種嵌合型重組腺病毒。3)將AAV ITRs和其間的外源基因表達(dá)單位DNA置于自主復(fù)制的EBV病毒載體中，轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中，建成一種攜帶具有自主復(fù)制能力的重組AAV載體質(zhì)粒的細(xì)胞株。4)將rep/cap基因插入腺病毒基因組中，構(gòu)建成一種具有完全輔助功能的重組腺病毒。然而許多實(shí)驗(yàn)證明，這種思路難以實(shí)現(xiàn)?？赡苁怯捎趓ep蛋白對(duì)腺病毒的強(qiáng)烈抑制作用使得含有rep/cap基因的重組腺病毒無法產(chǎn)生。5)用HSV病毒擴(kuò)增子攜帶rep/cap基因，產(chǎn)生具有完全輔助功能的HSV混合病毒。
盡管在rAAV產(chǎn)生方法上的各種改進(jìn)都不同程度地提高了rAAV病毒的產(chǎn)量或簡化了其制備方法，然而這些方法仍然沒有很好地解決rAAV病毒的規(guī)模化高效生產(chǎn)問題。目前要制備足夠人體試驗(yàn)用量的rAAV病毒成本(包括時(shí)間成本和資金成本)仍然極高。因此發(fā)明一種可用于大規(guī)模高效生產(chǎn)rAAV病毒的方法十分必要。
本發(fā)明的目的在于提出一種可用于大規(guī)模制備的高效重組腺病毒伴隨病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體的生產(chǎn)方法，即“一株載體細(xì)胞/一株輔助病毒”的生產(chǎn)方法。該方法具有產(chǎn)量高、操作簡便、易于進(jìn)行規(guī)?；凸に嚮a(chǎn)的特點(diǎn)。本發(fā)明可用來進(jìn)行重組AAV病毒的大量生產(chǎn)，生產(chǎn)的重組AAV病毒可用于各種疾病的基因治療。
制備rAAV病毒的傳統(tǒng)方法是用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及用輔助病毒(5型腺病毒)感染細(xì)胞。其中雙質(zhì)粒包括重組AAV載體質(zhì)粒如pAB11和含有AAV rep/cap基因的輔助質(zhì)粒如pAd8。這種方法由于要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因此具有轉(zhuǎn)染效率低或不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、不易于擴(kuò)大規(guī)模和工藝化的缺點(diǎn)。雖然經(jīng)過改進(jìn)，用磷酸鈣共沉淀方法可使293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到或接近100％，但轉(zhuǎn)染方法難以用于大量的細(xì)胞及對(duì)293細(xì)胞本身的要求(代次低于50代，細(xì)胞呈扁平狀，倍增時(shí)間為36hr～48hr)限制了用該方法獲得大批量的rAAV病毒。
針對(duì)目前在rAAV生產(chǎn)中影響因素多、操作復(fù)雜、不利于規(guī)?；a(chǎn)、從而難以獲得高產(chǎn)量的rAAV病毒的弊病，本發(fā)明提出了“一株載體細(xì)胞/一株輔助病毒”的生產(chǎn)策略用攜帶了AAV病毒rep/cap基因的重組HSV-1病毒(HSV1-rc)感染穩(wěn)定整合了重組AAV載體DNA的生產(chǎn)細(xì)胞株，從病變的細(xì)胞中可獲得大量的rAAV病毒。HSV1-rc病毒可同時(shí)提供rAAV包裝所必需的輔助病毒HSV-1及反式作用蛋白R(shí)ep及外殼蛋白，這兩種功能通常是由野生型輔助病毒如Ad5或HSV-1及含有rep/cap基因的輔助質(zhì)粒如pAd8提供。被包裝進(jìn)入重組AAV病毒顆粒中的重組AAV基因組DNA(單鏈)來源于重組AAV載體細(xì)胞株。重組AAV載體細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合了一個(gè)或多個(gè)拷貝的重組AAV載體DNA，其中包含AAV病毒的兩個(gè)ITR序列及位于其間的治療基因表達(dá)單位。治療基因表達(dá)單位由真核表達(dá)啟動(dòng)子(如HCMV IE啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、β珠蛋白基因啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、各種組織特異性啟動(dòng)子等)、治療基因、mRNA加尾信號(hào)組成，長度不超過5.0kb。
用rHSV-rc病毒感染載體細(xì)胞株時(shí)，HSV1-rc病毒進(jìn)入細(xì)胞后其DNA大量復(fù)制并最終產(chǎn)生子代病毒。HSV1-rc病毒DNA復(fù)制時(shí)攜帶的rep/cap基因亦同步復(fù)制，從而產(chǎn)生高拷貝的rep/cap基因。rep基因編碼產(chǎn)生4種Rep蛋白(Rep78，Rep68，Rep52，Rep40)，使重組AAV載體DNA從細(xì)胞基因組上拯救出來并大量復(fù)制最終成為單鏈被包裝到AAV殼粒中；cap基因編碼3種外殼蛋白VP1，VP2，VP3，在細(xì)胞核內(nèi)組裝成殼粒。
本發(fā)明產(chǎn)生rAAV病毒的過程與野生型AAV病毒在HSV-1為輔助病毒的情況下裂解性感染和增殖的過程十分相似，不同之處在于野生型的AAV病毒基因組的ITRs之間是rep/cap基因，輔助病毒是野生型的HSV-1；而本發(fā)明將rep/cap基因插入到輔助病毒HSV-1的基因組中，獲得具有完全輔助功能的重組HSV-1病毒rHSV1-rc；AAV的ITRs及其間的治療基因表達(dá)單位則由載體細(xì)胞株提供。用rHSV1-rc感染從載體細(xì)胞克隆中篩選出來的rAAV病毒產(chǎn)量高的單克隆細(xì)胞株，在一定的條件下可獲得與野生型HSV-1輔助野生型AAV產(chǎn)生效率相近的rAAV病毒產(chǎn)生效率，用BHK細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)rAAV病毒產(chǎn)生率可達(dá)104～5particles rAAV/cell。
rAAV病毒的大量生產(chǎn)分4個(gè)步驟進(jìn)行a)HSV1-rc病毒的大量生產(chǎn)。由于該病毒具有復(fù)制能力，很容易在BHK細(xì)胞或其它敏感細(xì)胞上大量培養(yǎng)，被感染的細(xì)胞將發(fā)生明顯病變，在上清和細(xì)胞中都存在大量的有感染性的HSV1-rc病毒。上清中HSV1-rc病毒滴度可達(dá)到107pfu/ml；凍融法裂解細(xì)胞可得到108pfu/ml HSV1-rc病毒。對(duì)獲得的病毒液經(jīng)過低速離心除去細(xì)胞碎片就可用于下一步；b)大量培養(yǎng)載體細(xì)胞株。可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞發(fā)酵罐培養(yǎng)及其它高密度培養(yǎng)細(xì)胞的設(shè)備和方法；c)用HSV1-rc感染大量培養(yǎng)的載體細(xì)胞株。細(xì)胞發(fā)生完全病變后，裂解細(xì)胞得到的細(xì)胞裂解液，其中即含有大量的rAAV病毒。d)rAAV病毒的分離純化。
本發(fā)明涉及攜帶AAV病毒rep/cap基因的重組HSV-1病毒HSV1-rc的制備及攜帶重組AAV載體的生產(chǎn)細(xì)胞株的建立。HSV1-rc病毒的制備方法和用途在中國專利98120033.8(申請(qǐng)?zhí)?中已有論述。HSV1-rc的產(chǎn)生是在對(duì)HSV1病毒全基因組分成5個(gè)大片段(其末端序列依次有部分重疊)插入其中的一套粘性質(zhì)粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)進(jìn)行操作的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。首先，用體外重組DNA技術(shù)將AAV-2病毒的rep/cap基因插入其中一個(gè)粘粒的HSV-1基因組中，例如插入cos6的HSV1 UL2基因中構(gòu)建成cos6-rcΔUL2；插入cos56的HSV1 UL44基因中構(gòu)建成cos56-rcΔUL44。亦可將rep/cap基因插入HSV-1基因組的其它位置。上述過程在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)。將插入了rep/cap的重組粘粒DNA與相應(yīng)的其余4個(gè)粘粒DNA一起用PacI酶切(切下粘粒骨架部分)，用酚/氯仿抽提純化酶切的DNA，用脂質(zhì)體方法或其它轉(zhuǎn)染方法將其轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞或其它對(duì)HSV1病毒感染敏感的細(xì)胞中，5～7天后可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)病變和蝕斑，表明5個(gè)HSV1片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組產(chǎn)生了重組HSV1。分別挑取單個(gè)蝕斑進(jìn)行檢測(cè)，包括用PCR方法檢測(cè)其中rep基因和cap基因片段，并檢測(cè)其包裝rAAV的功能。檢測(cè)結(jié)果為陽性的即為插入了rep/cap基因的重組HSV1病毒(HSV1-rc)。對(duì)獲得的HSV1-rc進(jìn)行兩次空斑純化，以保證其純一性。
攜帶重組AAV載體的生產(chǎn)細(xì)胞株即載體細(xì)胞株的建立將含有重組AAV載體DNA(AAVITRs及其間的治療基因表達(dá)單位)的質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法或其它轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入細(xì)胞中，再經(jīng)過新霉素類似物G418選擇培養(yǎng)獲得抗性細(xì)胞克隆。分別挑取單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選出在HSV1-rc感染下能產(chǎn)生高滴度rAAV病毒的穩(wěn)定傳代細(xì)胞株，大量凍存?zhèn)溆谩＿x擇基因neo可在重組AAV載體質(zhì)粒上，位于AAV ITRs之間或在其之外的質(zhì)粒骨架上；neo也可以在另一個(gè)質(zhì)粒如pSV2neo上，用其與重組AAV載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
本發(fā)明的方法中BHK-21細(xì)胞是一種良好的rAAV生產(chǎn)細(xì)胞株。其它細(xì)胞如293細(xì)胞、KB細(xì)胞、HeLa細(xì)胞也可用來產(chǎn)生rAAV。
本發(fā)明產(chǎn)生的rAAV病毒中可攜帶各種目的基因。這些rAAV病毒可用于遺傳病、腫瘤、心血管病、感染性疾病的基因治療。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的方法可用于rAAV病毒的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明采用的“一種載體細(xì)胞株/一種輔助病毒”的策略，克服了傳統(tǒng)方法及各種改進(jìn)方法中的操作復(fù)雜、影響因素多或難以放大生產(chǎn)等弊病，極大地簡化了影響rAAV產(chǎn)生的因素和生產(chǎn)過程。其中的載體細(xì)胞株和全功能輔助病毒HSV1-rc及均具有穩(wěn)定傳代和擴(kuò)增的特性，有利于生產(chǎn)放大。rAAV病毒產(chǎn)生過程中，AAV病毒的rep/cap基因可隨輔助病毒HSV1-rc的復(fù)制而復(fù)制成高拷貝，模擬了野生型AAV病毒復(fù)制的過程，有利于產(chǎn)生高滴度的rAAV。本發(fā)明涉及的微生物菌種本發(fā)明涉及HSV1-rc制備中應(yīng)用的微生物菌種包括DH5α/cos6-rcΔUL2和DH5α/cos56-rcΔUL44，這兩株菌株于1998年9月24日保存于中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)分別為CGMCC No.0361-1和CGMCC No.0360-2。
實(shí)施例以下列舉的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的可用于大規(guī)模生產(chǎn)的腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途作了詳細(xì)說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1 攜帶報(bào)告基因GFP的重組AAV載體質(zhì)粒的構(gòu)建1) pSNAV-1/GFP的構(gòu)建GFP(綠色熒光蛋白)基因來源于pGreen Lantern-1(GIBCO BRL，#10642-015)。通用型AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1為本室構(gòu)建(中國專利申請(qǐng)?zhí)?)。
用NotI酶切pGreen Lantern-1質(zhì)粒DNA，回收GFP片段，插入pcDNA2.1質(zhì)粒(Invitrogen公司)的相應(yīng)位點(diǎn)中，構(gòu)建成pcDNA2.1/GFP(+/-)。將GFP轉(zhuǎn)錄方向與T7啟動(dòng)子方向相反的重組質(zhì)粒命名為pcDNA2.1/GFP(-)。用EcoR I和Xho I雙酶切pcDNA2.1/GFP(-)，回收GFP片段，插入pSNAV-1的EcoRI和SalI位點(diǎn)中，構(gòu)建成pSNAV-1/GFP。該質(zhì)粒依次包括以下元件ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-ITR-SV40啟動(dòng)子-neo-polyA-ampR-E.coli ori.。2) pSNAV-2/GFP的構(gòu)建GFP(綠色熒光蛋白)基因來源于pGreen Lantern-1(GIBCO BRL，#10642-015)。通用型AAV載體質(zhì)粒pSNAV-2為本室構(gòu)建(中國專利申請(qǐng)?zhí)? )。
用KpnI和XhoI雙酶切pcDNA2.1/GFP(-)，回收GFP片段，插入pSNAV-2的KpnI和Sal I位點(diǎn)中，構(gòu)建成pSNAV-2/GFP。該質(zhì)粒依次包括以下元件ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-SV40啟動(dòng)子-neo-polyA-ITR-ampR-E.coli ori.。
該質(zhì)粒與pSNAV-1/GFP的主要不同之處在于，在pSNAV-1/GFP中，neo基因的表達(dá)單位位于兩個(gè)ITR序列之內(nèi)；而pSNAV-2/GFP中，neo基因的表達(dá)單位位于兩個(gè)ITR序列的之外。實(shí)施例2 AAV-GFP病毒載體細(xì)胞株的建立分別用pSNAV-1/GFP和pSNAV-2/GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞經(jīng)選擇培養(yǎng)得到兩株AAV-GFP病毒載體細(xì)胞株BHK/pSNAV-1/GFP和BHK/pSNAV-2/GFP。
BHK細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)。將pSNAV-1/GFP和pSNAV-2/GFP質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體lipofectamine(GIBCO BRL)轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，24hr后消化，12～5傳代。加G418 800μg/ml選擇培養(yǎng)。10天后可形成明顯抗性細(xì)胞克隆。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆，挑取有綠色熒光的單細(xì)胞克隆各20個(gè)分別擴(kuò)大培養(yǎng)并分別凍存保種。用全功能輔助病毒HSV1-rc感染各株克隆化細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各株細(xì)胞都不同程度地產(chǎn)生重組AAV-GFP病毒。分別測(cè)定重組AAV-GFP病毒的滴度。挑選出重組AAV病毒滴度高的細(xì)胞株作為AAV-GFP病毒載體細(xì)胞株。由載體細(xì)胞株BHK/pSNAV-1/GFP包裝出來的重組AAV病毒顆粒中的基因組DNA(單鏈)長約1600nt，由兩端ITR和其間的CMV-GFP-SV40 polyA組成。而由載體細(xì)胞株BHK/pSNAV-2/GFP包裝出來的重組AAV病毒顆粒中的基因組DNA(單鏈)長約3700nt，由兩端ITR和其間的CMV-intron-GFP-SV40 polyA-SV40 promoter-neo-polyA組成。實(shí)施例3 制備重組AAV-GFP病毒用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)細(xì)胞。將5×106載體細(xì)胞BHK/pSNAV-1/GFP接種于15-cm培養(yǎng)板中，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48hr。加全功能輔助病毒HSV1-rc 1ml(moi＝0.5～1)，吸附1hr。加含2％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液至30ml/培養(yǎng)板。37℃培養(yǎng)36～48hr。收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，反復(fù)凍融4次裂解細(xì)胞，用1500rpm離心10min，取上清，56℃滅活輔助病毒。用硫酸銨鹽析法濃縮rAAV-GFP病毒，氯化銫梯度離心純化。對(duì)PBS緩沖液透析除鹽。保存于4℃或加5％甘油或蔗糖保存于-70℃。
權(quán)利要求
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域，特別涉及用于基因治療的重組腺病毒相關(guān)病毒載體(rAAV)的制備和用途。1.本發(fā)明的特征是采用“一株細(xì)胞/一株病毒”的方法制備rAAV病毒。
2.用“一株載體細(xì)胞/一株全功能輔助病毒”的方法制備rAAV病毒，包括(a)重組AAV載體細(xì)胞株的建立；(b)全功能輔助病毒的產(chǎn)生和制備；(c)用全功能輔助病毒感染載體細(xì)胞株，產(chǎn)生rAAV病毒。
3.通過將重組AAV載體質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并經(jīng)過抗性選擇培養(yǎng)獲得穩(wěn)定傳代的重組AAV載體細(xì)胞株。
4.載體細(xì)胞株中含有穩(wěn)定整合在染色體中的AAV ITRs及治療基因表達(dá)單位。
5.將AAV病毒rep/cap基因插入單純皰疹病毒基因組中構(gòu)成全功能輔助病毒。
6.生產(chǎn)的rAAV病毒攜帶目的基因用于遺傳病、腫瘤、心血管病、感染性疾病的基因治療。
7.根據(jù)權(quán)利要求4，載體細(xì)胞來源于BHK細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求4，載體細(xì)胞來源于KB細(xì)胞、293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，抗生素抗性基因由重組AAV載體質(zhì)粒提供。
10.根據(jù)權(quán)利要求4，抗性基因由另一個(gè)質(zhì)粒提供。
11.根據(jù)權(quán)利要求4，抗性基因?yàn)閚eo基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求4，抗性基因?yàn)閔ph基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入I型單純皰疹病毒(HSV-1)基因組中。
14.根據(jù)權(quán)利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入II型單純皰疹病毒(HSV-1)基因組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入I單純皰疹病毒(HSV-1)基因組的UL2和/或UL44中。
16.根據(jù)權(quán)利要求6，AAV病毒rep/cap基因插入單純皰疹病毒載基因組的任何位點(diǎn)中。
全文摘要
本發(fā)明提出一種“一株載體細(xì)胞/一株輔助病毒”生產(chǎn)重組AAV病毒的方法。其中載體細(xì)胞株是將含有外源基因表達(dá)單位的重組AAV載體質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,經(jīng)抗性篩選獲得的整合了可拯救的重組AAV DNA的穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。輔助病毒是攜帶AAVrep/cap基因的重組HSV－1病毒。用這種全功能輔助病毒感染載體細(xì)胞株即可產(chǎn)生大量有感染性的重組AAV病毒。本發(fā)明可用于重組AAV病毒的規(guī)?；咝a(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1252441SQ99119039
公開日2000年5月10日 申請(qǐng)日期1999年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月10日
發(fā)明者吳小兵, 伍志堅(jiān), 侯云德 申請(qǐng)人:病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室