一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體及制備方法，屬于納微材料制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)疫苗是滅活或低活性的病原體，在使用過程中存在安全隱患。新型疫苗(如DNA、蛋白質(zhì)疫苗等)安全有效，但易被酶降解且免疫原性較弱，需要借助其他手段保護(hù)疫苗并刺激免疫應(yīng)答。傳統(tǒng)疫苗佐劑對這些抗原無效，因此急待開發(fā)新型疫苗載體。
[0003]鋁鹽是第一個被批準(zhǔn)可用于人的佐劑。鋁鹽佐劑(Al (OH)3)能有效刺激B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。通常認(rèn)為是氫氧化鋁溶膠對疫苗的緩釋作用以及氫氧化鋁本身對巨噬細(xì)胞的刺激作用。有研究者認(rèn)為氫氧化鋁對巨噬細(xì)胞的刺激作用歸根于Al (III)。因此，基于Al (III)且具有抗原緩釋作用的疫苗載體將可能有效的刺激體液免疫反應(yīng)。
[0004]然而，鋁鹽佐劑對細(xì)胞免疫無效，不能作為細(xì)胞病原體疫苗的佐劑，例如HIV、瘧疾和肺結(jié)核等疾病的疫苗。此外，鋁鹽佐劑與高純度蛋白質(zhì)抗原使用時抗體應(yīng)答反應(yīng)較弱。因此，設(shè)計制備新型的疫苗佐劑，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)疫苗體內(nèi)高效呈遞仍是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。微顆粒型佐劑(0.1?ΙΟμπι)模仿了細(xì)菌和病毒的尺寸，能與樹突狀細(xì)胞相互作用，從而活化樹突狀細(xì)胞并提高抗原的細(xì)胞呈遞。目前，基于Al(III)與鞣酸的配位作用制備微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0008]—種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)將蛋白質(zhì)模擬抗原加入到10mL、0.2?0.5M碳酸鈉水溶液中，使模擬抗原濃度為0.5?5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為I?6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.2?0.5M，攪拌20?60s，離心，去離子水洗2?4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0010](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
0.5?1.5mL、8?24mM的鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為8.0，振蕩I?5min，離心，顆粒用去離子水洗2?4次，用20?40mL、pH =8.0的EDTA水溶液洗滌3?5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0011]蛋白質(zhì)模擬抗原優(yōu)選雞卵清白蛋白。
[0012]上述方法制備的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0013]本發(fā)明的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體直徑4±0.5 μ m，厚度約17±2nm，雞卵清白蛋白包埋于微囊空腔內(nèi)。由于Al(III)與鞣酸配位鍵受pH影響，使得微囊具有pH響應(yīng)性。本發(fā)明制備過程在室溫水相下進(jìn)行，條件溫和，保證了蛋白質(zhì)疫苗的活性及載體的使用安全性；原料廉價易得，制備工藝簡單易行。
【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例1所制得的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的掃描電子顯微鏡照片。
[0015]圖2為實(shí)施例1所制得的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的透射電子顯微鏡照片。
[0016]圖3為實(shí)施例1所制得的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的元素能譜圖。
[0017]圖4為實(shí)施例1所制得的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的原子力顯微鏡照片及其高度差圖。其中A為原子力顯微鏡照片；B為高度差圖。
[0018]圖5為實(shí)施例2所制得的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體在不同pH下雞卵清白蛋白的釋放曲線。
[0019]實(shí)施方式
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0021]實(shí)施例1
[0022]—種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0023](I)將10mL、0.33M碳酸鈉水溶液倒入等體積含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為2mg/mL，氯化鈣的濃度為0.33M，攪拌30s，離心，去離子水洗3次，得到碳酸鈣顆粒；
[0024](2)將步驟⑴獲得的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入lmL、24mM的鞣酸水溶液并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩lmin，離心，顆粒用去離子水洗3次，用40mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌3次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法。
[0025]見圖1、2、3 和 4。
[0026]實(shí)施例2
[0027]—種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0028](I)將蛋白質(zhì)模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.33M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為2mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為2mg/mL，氯化鈣的濃度為0.33M，攪拌30s，離心，去離子水洗3次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0029](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入lmL、24mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩lmin，離心，顆粒用去離子水洗3次，用40mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌3次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0030]實(shí)施例3
[0031]—種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0032](I)將蛋白質(zhì)模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.2M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為0.5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙烯磺酸鈉的濃度為lmg/mL，氯化鈣的濃度為0.2M，攪拌20s，離心，去離子水洗2次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0033](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
0.5mL、12mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩3min，離心，顆粒用去離子水洗2次，用20mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌4次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0034]實(shí)施例4
[0035]—種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，包括如下步驟:
[0036](I)將蛋白質(zhì)模擬抗原-雞卵清白蛋白加入到10mL、0.5M碳酸鈉水溶液中，使雞卵清白蛋白濃度為5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.5M，攪拌60s，離心，去離子水洗4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；
[0037](2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入
1.5mL、8mM的鞣酸水溶液，振蕩1s使其分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，并在漩渦儀上振蕩1s使其分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3- (N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH為8.0，并在漩渦儀上振蕩5min，離心，顆粒用去離子水洗4次，用30mL、pH = 8.0的EDTA水溶液洗滌5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
[0038]實(shí)施例5
[0039]將實(shí)施例2制備的一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體分散于10mL，pH分別為5.0、6.0、7.4且濃度為1mM的磷酸鹽緩沖溶液中，放置于37°C、200rpm的震蕩培養(yǎng)箱中并開始計時，每隔一定時間，將樣品離心并分別取出5mL的上清液，之后再分別加入5mL新鮮配置的不同PH的磷酸鹽緩沖溶液，并再次放置于37°C、200rpm的震蕩培養(yǎng)箱中。用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白濃度并計算出釋放了的蛋白總量，即蛋白累積釋放量，蛋白釋放率=(蛋白累積釋放量/載體中蛋白總量)*100%。
[0040]見圖5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體的制備方法，其特征在于包括如下步驟:(1)將蛋白質(zhì)模擬抗原加入到10mL、0.2?0.5M碳酸鈉水溶液中，使模擬抗原濃度為0.5?5mg/mL，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，所述聚苯乙稀磺酸鈉的濃度為I?6mg/mL，氯化I丐的濃度為0.2?0.5M，攪拌20?60s，離心，去離子水洗2?4次，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒； (2)將步驟(I)獲得的含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于20mL去離子水中，加入0.5?1.5mL、8?24mM的鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入與鞣酸水溶液等體積、等濃度的氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入20mL、pH = 8.0的3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為8.0，振蕩I?5min，離心，顆粒用去離子水洗2?4次，用20?40mL、pH =8.0的EDTA水溶液洗滌3?5次，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述蛋白質(zhì)模擬抗原為雞卵清白蛋白。3.權(quán)利要求1或2的方法制備的pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。
【專利摘要】一種pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體及制備方法，制備方法為：(1)將蛋白質(zhì)模擬抗原加入到碳酸鈉水溶液中，溶解后倒入等體積的含有聚苯乙烯磺酸鈉的氯化鈣水溶液中，攪拌，離心，去離子水洗，得到含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒；(2)將含有模擬抗原的碳酸鈣顆粒分散于去離子水中，加入鞣酸水溶液，振蕩使分散均勻，加入氯化鋁水溶液，振蕩使分散均勻，加入3-(N-嗎啉)丙磺酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，振蕩，離心，顆粒用去離子水洗，用EDTA水溶液洗滌，去除碳酸鈣，用去離子水清洗，得到pH響應(yīng)性微囊型蛋白質(zhì)疫苗載體。本發(fā)明制備過程在室溫水相下進(jìn)行，條件溫和，保證了蛋白質(zhì)疫苗的活性及載體使用安全性；原料廉價易得，制備工藝簡單。
【IPC分類】A61P37/04, A61K47/48, A61K39/39
【公開號】CN105214100
【申請?zhí)枴緾N201510785244
【發(fā)明人】王曉莉, 孫洪范, 張超, 繆丹丹
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年11月16日