本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乙型肝炎病毒基因組dna的5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷的標記和檢測方法。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒(hepatitisbvirus，hbv)，是一種dna病毒，屬于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)。hbv只對人和猩猩有易感性，其慢性感染與肝硬化及肝癌關(guān)系密切，是肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)最為重要的誘發(fā)因素。血清學證據(jù)證實全球人口中有30％曾感染過hbv，其中約2.5億人是hbv慢性感染者，但迄今hbv致病機制仍未闡明。hbv具有嚴格的種屬特異性，其自然宿主僅限于人和猩猩，且hbv病毒基因組雖僅包含3200bp，但結(jié)構(gòu)有效，復制周期特殊，缺乏良好的動物模型和病毒標記技術(shù)嚴重限制了hbv相關(guān)機制研究。

hbv感染依賴于肝細胞表面特異性受體鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide，ntcp)，決定了hbv感染的種屬和組織特異性。hbv病毒結(jié)合受體ntcp入侵肝細胞后，病毒松散環(huán)狀基因組dna(rc-dna)進入細胞核，經(jīng)過修復形成共價閉合的環(huán)狀dna(cccdna)，并結(jié)合宿主細胞組蛋白、病毒核心蛋白等以微小染色體形式存在。cccdna轉(zhuǎn)錄形成pgrna和亞基因組rna，在pol蛋白作用下，pgrna在核衣殼內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄形成rc-dna，包裹囊膜形成成熟病毒粒子，而rc-dna還可轉(zhuǎn)運胞核內(nèi)再次形成cccdna。cccdna是hbv轉(zhuǎn)錄的唯一模板和體內(nèi)病毒儲存庫，也是hbv持續(xù)存在的主要原因。

目前hbv感染及與細胞相互作用的分子機制等諸多方面仍不甚清楚，如hbv結(jié)合ntcp受體后，如何進一步侵染宿主細胞，cccdna如何形成、維持及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，嚴重限制了hbv相關(guān)肝病的機制研究及針對hbv特異性治療靶點的開發(fā)。建立hbv基因組dna標記和檢測方法，有助于hbv侵染和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制研究，對探尋抑制和阻斷hbv復制的潛在靶點具有重要的意義，然而迄今為止鮮有關(guān)于hbv基因組dna標記和檢測方法的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種hbv基因組dna的5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷的標記和檢測方法，為hbv侵染過程和cccdna維持及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制等研究提供了重要的研究工具。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，公開了了5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷在對hbv基因組dna進行標記和檢測的應用；

本發(fā)明的第二方面，公開了一種hbv基因組dna的5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷的標記和檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)擴增ntcp基因，構(gòu)建ntcp真核表達質(zhì)粒pcdna-ntcp，將pcdna-ntcp轉(zhuǎn)入huh7肝癌細胞中構(gòu)建ntcp穩(wěn)定表達的huh7-ntcp細胞系；

(2)使用5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(edu)處理hepg2.2.15細胞，獲取含edu-hbv的細胞上清，使用peg8000處理，離心，棄上清，對沉淀中進行hbv基因組拷貝數(shù)定量；

(3)將huh7-ntcp細胞傳代培養(yǎng)至細胞匯合度為50-80％時，使用edu-hbv感染huh7-ntcp細胞，然后進行edu-hbv熒光檢測。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，步驟(1)包括：

1)擴增ntcp基因，插入載體pcdna3.0中，構(gòu)建了ntcp真核表達質(zhì)粒pcdna-ntcp；

2)將pcdna-ntcp轉(zhuǎn)染huh7細胞，使用遺傳霉素g418進行篩選；

3)挑取遺傳霉素g418抗性陽性克隆，使用間接免疫熒光試驗(ifa)和qrt-pcr檢測ntcp表達；

4)選擇ntcp高表達克隆，擴大培養(yǎng)；

5)感染hbv，用elisa檢測hbsag，確定huh7-ntcp細胞系支持hbv感染性。

優(yōu)選的，對ntcp基因進行擴增時的選用的擴增引物為：

pc3ntcp-f:cccaagcttgccaccatggaggcccacaacgcgtctg；

pc3ntcp-r:ccgctcgagctaggctgtgcaaggggagcag；

優(yōu)選的，對構(gòu)建的pcdna-ntcp質(zhì)粒進行線性化，進一步優(yōu)選的，對pcdna-ntcp質(zhì)粒進行線性化的所用的線性化酶為pvui內(nèi)切酶；

優(yōu)選的，對ntcp擴增基因和pcdna3.0進行酶切選用的限制性內(nèi)切酶為hindiii和xhoi；

優(yōu)選的，遺傳霉素g418的使用濃度為700ug/ml，使用遺傳霉素g418進行篩選的時間為4-6周；

優(yōu)選的，進行qrt-pcr時，選用gapdh為內(nèi)參，各引物序列分別為：

hntcp-qf:gggacatgaacctcagcatt；

hntcp-qr:cgtttggatttgaggacgat；

hgapdh-qf:ggagtccactggcgtcttcac；

hgapdh-qr:gaggcattgctgatgatcttgagg；

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，步驟(2)包括：

1)將hepg2.2.15肝癌細胞使用mem培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，細胞長滿后，更換含10μmedu和2％胎牛血清fbs的mem培養(yǎng)基進行培養(yǎng)3d，收集細胞上清；然后再補加含10μmedu和2％fbs的mem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并再收集細胞上清一次；

2)對收集的細胞上清進行病毒純化，去除細胞碎片及雜質(zhì)，然后向細胞上清中加入peg8000，冰上緩慢混勻4-6h；離心，棄上清，沉淀重懸后進行hbv基因組拷貝數(shù)定量；

優(yōu)選的，步驟2)中peg8000的加入量為使peg8000的終濃度達到5-10％；

優(yōu)選的，步驟2)中離心條件為3000-5000rpm，4℃離心20min；

優(yōu)選的，步驟2)中對沉淀中進行hbv基因組拷貝數(shù)定量分析的具體方法為：對濃縮的hbv采用pcr-熒光探針法進行hbv基因組拷貝數(shù)定量分析；

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，步驟(3)包括：

1)huh7-ntcp細胞傳代，匯合度50-80％時，用含4％peg8000和10％fbs的dmem稀釋edu-hbv后感染huh7-ntcp細胞；

2)感染2-12h后，棄去上清，用pbs洗3遍后，更換含10％fbs的mem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

3)到預期時間點后，進行edu-hbv熒光檢測。棄去培養(yǎng)基，pbs洗一遍后，用4％多聚甲醛室溫固定30min；

4)棄去固定液，加入甘氨酸，室溫孵育后，棄去甘氨酸溶液，pbs洗一遍；

5)加入tritonx-100，室溫孵育后，棄去打孔液，pbs洗三遍；

6)加入熒光染色反應液，室溫避光孵育后，棄去染色液后，pbs洗三遍；

7)用甲醇繼續(xù)沖洗；

8)用dapi染色液避光染色；

9)pbs沖洗后，用抗熒光淬滅劑封片和熒光共聚焦顯微鏡分析；

優(yōu)選的，步驟4)中甘氨酸的濃度為2mg/ml；

優(yōu)選的，步驟6)中熒光染色反應液的配置方法為：以1ml染色液配置，所屬反應緩沖液50ul，催化緩沖液10ul，熒光染料alexafluor488azide溶液3ul，緩沖添加劑10mg，ddh2o938ul。

本發(fā)明的第三方面，公開了上述方法在hbv感染動態(tài)分析、抗病毒藥物篩選、細胞與hbv相互作用、hbvdna結(jié)合蛋白中的應用。

本發(fā)明首次利用edu對hbv的dna進行標記，edu(5’-ethynyl-2’-deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(t)滲入正在復制的dna分子中，并通過基于點擊化學(clickchemistry)的方法，與含疊氮基的熒光染料或生物素等分子結(jié)合，完成熒光標記或進行dna介導的免疫沉淀反應。但是迄今尚未有關(guān)于使用edu對hbv進行標記的報道，發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度的edu對hbv的產(chǎn)量和細胞的狀態(tài)影響較大，進而影響hbv對肝細胞的感染能力，因此選擇合適濃度的edu對結(jié)果影響極大，申請人通過優(yōu)化試驗步驟和工藝參數(shù)，最終得到了上述乙型肝炎病毒基因組dna的5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷的標記和檢測方法，同時，在制備pcdna-ntcp質(zhì)粒后，申請人意外發(fā)現(xiàn)，將pcdna-ntcp質(zhì)粒進行線性化，可以增加dna整合效率和陽性細胞克隆的比例，同時考慮到線性化后必須不能影響目的基因表達，經(jīng)過大量篩選，最終確定選用pvui內(nèi)切酶作為對pcdna-ntcp質(zhì)粒進行線性化的線性化酶；經(jīng)過試驗驗證，本申請制備得到的edu-hbv具有和親本病毒相近的感染能力，為進一步探討hbv感染動態(tài)分析、抗病毒藥物篩選、細胞與hbv相互作用、尋找hbvdna結(jié)合蛋白奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，操作簡單，同時，在標記過程中，本發(fā)明將edu摻入染色、dapi復染與hbv相結(jié)合，經(jīng)本發(fā)明標記和檢測方法得到的圖片標記顏色鮮亮，信號強度強，圖像結(jié)果無需進行后期處理，且各染色結(jié)果互不干擾。

附圖說明

圖1(a)為ntcp基因擴增圖，圖1(b)為pcdna-ntcp質(zhì)粒酶切圖；

圖2(a)為pcdna-ntcp質(zhì)粒進行線性化酶切圖(其中，m道為15000bpdnaladder電泳圖，1道為使用pvui內(nèi)切酶進行pcdna-hntcp線性化電泳圖；2道為對照組電泳圖)；

圖2(b)為pcdna質(zhì)粒圖譜(含pvui酶切位點)；

圖3為huh7-ntcp陽性克隆qpcr分析ntcp表達水平圖；

圖4為huh7-ntcp細胞克隆ifa鑒定圖；

圖5為edu-hbv和hbv感染性比較柱狀圖；

圖6為點擊化學反應和熒光檢測感染的edu-hbv圖；

圖7為edu-hbv感染不同時間的定位變化圖。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復數(shù)形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

實施例1huh7-ntcp細胞系的建立

1.擴增ntcp基因，插入載體pcdna3.0中，構(gòu)建了ntcp真核表達質(zhì)粒pcdna-ntcp，具體的，將擴增后的ntcp基因和載體pcdna3.0分別進行hindiii、xhoi雙酶切反應，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測其產(chǎn)物并使用pvui內(nèi)切酶對構(gòu)建的ntcp-pcdna質(zhì)粒進行線性化，以增加dna整合效率和陽性細胞克隆的比例；利用t4dna連接酶連接上述線性質(zhì)粒載體pcdna3.0及ntcp基因。擴增ntcp基因引物如下所示：

pc3ntcp-f:cccaagcttgccaccatggaggcccacaacgcgtctg

pc3ntcp-r:ccgctcgagctaggctgtgcaaggggagcag

2.pcdna-ntcp轉(zhuǎn)染huh7細胞，700ug/mlg418篩選4-6周

3.挑取g418抗性陽性克隆，ifa和qrt-pcr檢測ntcp表達

qrt-pcr所用引物：

hntcp-qf:gggacatgaacctcagcatt

hntcp-qr:cgtttggatttgaggacgat

hgapdh-qf:ggagtccactggcgtcttcac

hgapdh-qr:gaggcattgctgatgatcttgagg

4.選擇ntcp高表達克隆，擴大培養(yǎng)

5.感染hbv，用elisa檢測hbsag，確定huh7-ntcp細胞系支持hbv感染性

實施例2edu-hbv的制備

材料：

5-ethynyl-2’-deoxyuridine(edu)(sigma)indmso

hepg2.2.15cell

hbv基因組dna定量試劑盒(qiagen)

peg8000(sigma)

步驟:

1.1x10⁷hepg2.2.15細胞傳代于t75培養(yǎng)瓶中

2.培養(yǎng)24h后，更換含10μmedu和2％fbs的mem，2d后收集細胞上清，然后再補加含10μmedu和2％fbs的mem，2d后再收集細胞上清一次

3.收集的細胞上清，進行病毒純化：首先用0.45um濾膜(millipore)進行過濾或12000rpm離心2min，去除細胞碎片等雜質(zhì)

4.上清轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管中，加入終濃度為5-10％peg8000，冰上緩慢混勻4-6h

5.3000-5000rpm4℃離心20min

6.棄上清，沉淀用原培養(yǎng)上清1/10體積的dmem培養(yǎng)基重懸，小份分裝后凍存于-80℃。

7.濃縮的hbv用qiagen公司的hbv核酸定量檢測試劑盒(pcr-熒光探針法)進行hbv基因組拷貝數(shù)定量，簡要步驟：樣本處理

1)加入100ul樣本前處理液，加入50ul標準品+50ulpbs，振蕩混勻定量標準品1-4:3x10^7、2.5x10^5、2.5x10^4、7x10^2(單位：iu/ml)，陽性對照，陰性對照樣品做同樣處理

2)15000rpm離心10min，吸進上清(勿碰沉淀，富集的病毒粒子)

3)加入25ul裂解液，徹底振蕩混勻(3-5min)，100℃金屬浴或沸水浴10min(裂解病毒粒子)

4)4℃，15000rpm離心10min

5)配制qpcrmix

6)加樣：

22.5ulqpcrmix

2.5ul樣本上清

pcr擴增條件：

37℃5min(消除utp-dna)；

95℃5min(變活ung酶)；

95℃15s；

60℃40s；擴增45cycle，60℃采集信號。

實施例3病毒感染

1.huh7-ntcp細胞傳代，匯合度50-80％時，用含4％peg8000和10％fbs的dmem稀釋edu-hbv和hbv后感染huh7-ntcp細胞(100-1000geq/cell)；

2.感染2-12h后，棄去上清，用pbs洗3遍后，更換2％培養(yǎng)基，預期時間點檢測hbsag分泌和進行edu-hbv熒光檢測。

實施例4edu-hbv感染熒光檢測

1.edu-hbv和hbv感染huh7-ntcp細胞感染6h后，棄去培養(yǎng)基，pbs洗一遍后，用4％多聚甲醛室溫固定30min；

2.棄去固定液，加入2mg/ml甘氨酸，室溫孵育5min后，棄去甘氨酸溶液，pbs洗一遍，

3.加入0.5％tritonx-100，室溫孵育10min后，棄去打孔液，pbs洗3遍；

4.加入熒光染色反應液(1ml染色液配制：反應緩沖液50ul，催化緩沖液10ul，熒光染料alexafluor488azide溶液3ul，緩沖添加劑10mg，ddh2o938ul)，室溫避光孵育30min-1h后，棄去染色液后，pbs洗3遍，每次10min；

5.用甲醇繼續(xù)洗2遍，每次5min；pbs洗1次；

6.用dapi染色液避光染色5min；

7.pbs洗3遍后，用抗熒光淬滅劑封片和熒光共聚焦顯微鏡分析。

實施例5hbsagelisa檢測

1.edu-hbv和hbv感染huh7-ntcp細胞感染12h后，棄去培養(yǎng)基，pbs洗一遍后，補加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后，收集細胞上清；

2.上清用pbs5x稀釋后加入至反應孔，100ul/孔，37℃反應1h；

3.加入50ulhrp酶標記抗體，37℃繼續(xù)反應30min；

4.pbst洗3-5遍；

5.分別加入50ul顯色液a和顯色液b；

6.37℃反應30min后，加入50ul終止液于450nm波長下讀取od值。

本發(fā)明乙型肝炎病毒(hbv)基因組dna的edu標記方法建立，是hbv標記的一種新的方法。通過實施例5對感染huh7-ntcp細胞系后的hbsag檢測分析表明本發(fā)明得到的edu-hbv具有和親本病毒相近的感染能力；熒光分析表明edu-hbv可以被特異性檢測到，感染不同時間檢測顯示了edu-hbv病毒早期從胞漿遷移至胞核的變化。