本發(fā)明一般涉及流感病毒和免疫原性組合物以及治療和預(yù)防流感感染的方法。具體來說，本發(fā)明涉及表達(dá)多于一種血凝素(ha)亞型的重組、嵌合型豬流感病毒。發(fā)明背景豬流感(si)是由a型和c型流感病毒引起的豬的急性呼吸道疾病。a型流感病毒是節(jié)段化的負(fù)鏈rna病毒，且可從多種其他動(dòng)物宿主物種分離，包括鳥、人、馬、鯨和貂。盡管整個(gè)流感病毒很少跨越物種屏障，但基因節(jié)段可以通過基因重排或遺傳漂移過程跨越該屏障。豬支持人和鳥a型流感病毒的復(fù)制，并被假定為通過用作不同宿主物種特異性病毒間重排的“混合容器”在種間傳播中起重要作用(scholtissek,eur.j.epidemiol.(1994)10:455-458)。這可能導(dǎo)致能跨越物種屏障傳播至人的流感病毒的產(chǎn)生。流感病毒體包含含有單鏈rna基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心(螺旋形核衣殼)和內(nèi)襯以基質(zhì)蛋白(m1)的外部脂蛋白包膜。a型流感病毒的基因組由8個(gè)節(jié)段化的負(fù)義單鏈rna分子組成。每個(gè)節(jié)段都具有節(jié)段特異性rna包裝信號(hào)，其由5’端和3’端的非編碼區(qū)和短的編碼區(qū)組成。8個(gè)節(jié)段化的rnas編碼11種病毒蛋白，包括rna依賴性rna聚合酶蛋白(pb2、pb1和pa)以及形成核衣殼的核蛋白(np)；基質(zhì)膜蛋白(m1、m2)；血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)，其為從含脂包膜突出的兩種表面糖蛋白；非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1)、核輸出蛋白(nep，也稱為ns2)、促凋亡因子pb1-f2。ha對(duì)病毒結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞至關(guān)重要，并且為主要的中和抗體靶標(biāo)，然而na在子代病毒釋放中起作用，并且為病毒增殖所必需?；蚪M的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在核內(nèi)發(fā)生，并且通過在質(zhì)膜上出芽而發(fā)生組裝。病毒可以在混合感染期間重排(reassort)基因。盡管存在可用的疫苗，多種豬流感病毒(siv)亞型在豬群體中仍持續(xù)傳播。目前，h1n1、h3n2和h1n2為在北美豬群體中引起疾病的主要亞型。h3n2亞型的sivs通過人、鳥間的重排產(chǎn)生，并且典型的豬病毒正經(jīng)歷快速進(jìn)化，且通常引起比典型的h1n1siv更嚴(yán)重的疾病。當(dāng)前的siv疫苗并不提供針對(duì)多抗原siv變體的交叉保護(hù)。因此，仍然需要開發(fā)治療和預(yù)防豬流感感染的有效策略。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有來自兩種或更多種sivs亞型的has的重組、嵌合型流感病毒，以及其制備和使用方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組病毒缺失na節(jié)段的全部或部分，以便阻止病毒增殖。因?yàn)閚a為病毒增殖所必需，可以通過使病毒在唾液酸酶存在下生長(zhǎng)而在培養(yǎng)物中提供na的功能?？梢詫⒈磉_(dá)多于一種ha類型的重組病毒用于免疫原性組合物中以刺激針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)，以及用于治療和預(yù)防流感病毒感染。因?yàn)榇嬖趤碜圆煌瑂ivs亞型的has，可以將包含嵌合型流感病毒的組合物用來提供針對(duì)多種流感株的廣泛覆蓋。具體來說，本文的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包含h1和h3，并且保留了na3’端和5’端病毒rna特異性包裝信號(hào)但缺少na節(jié)段其余部分的嵌合型病毒，可在培養(yǎng)物中有效生長(zhǎng)，并且在豬體內(nèi)為減毒的，因?yàn)樵谪i體內(nèi)不存在唾液酸酶。na包裝信號(hào)得到大量保留以用于有效包裝。此類嵌合型構(gòu)建物可以用作有效和安全的、活的減毒疫苗。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含來自多于一種流感亞型的多于一個(gè)血凝素(ha)節(jié)段(節(jié)段4)的重組、嵌合型豬流感病毒。具體來說，所述病毒包含來自第一流感亞型的節(jié)段1-5、7和8以及來自第二流感亞型的第二節(jié)段4。另外，所述第一流感亞型的神經(jīng)氨酸酶(na)節(jié)段(節(jié)段6)的全部或部分缺失，使得成為減毒病毒。在某些實(shí)施方案中，第二節(jié)段4包含來自所述第一流感亞型的na包裝序列，其位于所述第二節(jié)段4的3’端以及任選地5’端。在其他的實(shí)施方案中，na包裝序列包含來自3’nautr和3’na編碼序列的3’na包裝序列，以及任選地，來自5’nautr和5’na編碼序列的5’na包裝序列。在另外的實(shí)施方案中，上述流感病毒來自a型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，流感病毒包含來自h1n1亞型的ha節(jié)段和來自h3n2亞型的ha節(jié)段。在某些實(shí)施方案中，第一流感亞型為h1n1，如a/swine/saskatchewan/18789/02。在其他實(shí)施方案中，第二流感亞型為h3n2，如a/swine/texas/4199-2/98。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含來自h1n1流感亞型的節(jié)段1-5、7和8以及來自h3n2流感亞型的節(jié)段4的減毒、重組豬流感病毒。另外，來自h1n1流感亞型的節(jié)段6的全部或部分缺失，并且h3n2節(jié)段4側(cè)翼為來自h1n1亞型的na包裝序列。所述包裝序列包含來自3’nautr和3’na編碼序列的3’na包裝序列以及來自5’nautr和5’na編碼序列的5’na包裝序列。在某些實(shí)施方案中，h1n1亞型為a/swine/saskatchewan/18789/02，并且h3n2亞型為a/swine/texas/4199-2/98。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含任何一種上述重組病毒和藥學(xué)可接受的賦形劑的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述組合物還包含佐劑。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘發(fā)脊椎動(dòng)物個(gè)體體內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法，包括給予所述個(gè)體所述組合物。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防脊椎動(dòng)物個(gè)體體內(nèi)的流感感染的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的所述組合物個(gè)體。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及針對(duì)流感病毒給個(gè)體接種疫苗的方法，包括給予所述個(gè)體有效量的所述組合物個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體為豬個(gè)體。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的重組構(gòu)建物，其包含：(a)豬流感h3n2亞型ha節(jié)段；和(b)位于所述h3n2ha節(jié)段的3’端以及任選地5’端的豬流感h1n1亞型na包裝序列。在某些實(shí)施方案中，所述h3n2ha節(jié)段側(cè)翼為h1n1na包裝序列，所述包裝序列包含來自3’nautr和3’na編碼序列的3’na包裝序列以及來自5’nautr和5’na編碼序列的5’na包裝序列。在其他的實(shí)施方案中，所述h1n1亞型為a/swine/saskatchewan/18789/02，并且所述h3n2亞型為a/swine/texas/4199-2/98。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備重組、嵌合型流感病毒的方法，包括用(a)包含來自h1n1流感亞型的節(jié)段1-5、7和8的單獨(dú)的質(zhì)粒；和(b)上述的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以及在引起產(chǎn)生所述重組、嵌合型流感病毒的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞：(a)包含來自h1n1流感亞型的節(jié)段1-5、7和8的單獨(dú)的質(zhì)粒；和(b)如上所述的重組構(gòu)建物。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備組合物的方法，包括將任何上述的重組、嵌合型豬流感病毒與藥學(xué)可接受的賦形劑組合。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備流感疫苗的方法，包括：(a)使任何一種上述的重組、嵌合型豬流感病毒增殖；(b)純化所述病毒；和(c)將純化的病毒與藥學(xué)可接受的賦形劑組合。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的試劑盒，其包含任何一種上述重組病毒或上述組合物的一個(gè)或多個(gè)容器。鑒于本文的公開，本發(fā)明的這些和其他的實(shí)施方案容易為本領(lǐng)域技術(shù)人員理解。附圖說明圖1a和1b描述了用于本發(fā)明的不同流感節(jié)段。圖1a描述了野生型a型流感h1n1siv病毒——a/swine/saskatchewan/18789/02(本文中稱為“sk02”)的8個(gè)節(jié)段以及按實(shí)施例中所述制備的重組、嵌合型減毒病毒(本文中稱為“siv-606”)的8個(gè)節(jié)段。圖1b為圖1a中稱為“h3-ha”的節(jié)段的圖示。圖1b中描述的ha節(jié)段來源于h3n2a型流感病毒——a/swine/texas/4199-2/98(本文中稱為“tx98”)，并且包含來自sk02的3’端和5’端na包裝信號(hào)。圖2顯示了siv-606和siv/sk02的生長(zhǎng)曲線。圖3a-3c顯示了感染了高和低劑量的sk02(圖3a)、tx98(圖3b)和siv-606(圖3c)的豬的體溫。圖4顯示了感染了高和低劑量的siv/sk02、sivtx98和siv-606的豬的肺病毒滴度。圖5a和5b(seqidnos:1和2)分別顯示了來自sivsk02的ha的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619961.1)。圖6a和6b(seqidnos:3和4)分別顯示了來自sivsk02的na的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619960.1)。圖7a-7c(seqidnos:5,6和7)顯示了來自sivsk02的基質(zhì)核苷酸序列(圖7a)以及m2(圖7b)和m1(圖7c)的氨基酸序列(genbank:ay619959.1)。圖8a和8b(seqidnos:8和9)分別顯示了來自sivsk02的np的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619958.1)。圖9a-9c(seqidnos:10,11和12)顯示了來自sivsk02的非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列(圖9a)以及nep(圖9b)和ns1(圖9c)的氨基酸序列(genbank:ay619957.1)。圖10a和10b(seqidnos:13和14)分別顯示了來自sivsk02的pa的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619956)。圖11a和11b(seqidnos:15和16)分別顯示了來自sivsk02的pb1的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619955.1)。圖12a和12b(seqidnos:17和18)分別顯示了來自sivsk02的pb2的核苷酸序列和氨基酸序列(genbank:ay619954.1)。圖13a和13b(seqidnos:19和20)分別顯示了來自sivtx98的ha的核苷酸序列和氨基酸序列。圖14a-14c顯示了接種siv-606的豬體內(nèi)的siv/sk02特異性血清igg滴度(圖14a)；siv/tx98特異性血清igg滴度(圖14b)；以及h1n1halifax特異性血清igg滴度(圖14c)。圖15a-15c顯示了接種siv-606的豬體內(nèi)的siv/sk02特異性鼻iga滴度(圖15a)；siv/tx98特異性鼻iga滴度(圖15b)；以及h1n1halifax特異性鼻iga滴度(圖15c)。圖16a-16c顯示了接種siv-606的豬體內(nèi)的siv/sk02特異性balfiga滴度(圖16a)；siv/tx98特異性balfiga滴度(圖16b)；以及h1n1halifax特異性balfiga滴度(圖16c)。圖17a和17b顯示了用siv/sk02(圖17a)和siv/tx98(圖17b)攻擊的未接種的對(duì)照豬以及接種了siv-606的豬的直腸溫度。圖18a和18b顯示了未接種siv/sk02和siv/tx98的豬以及接種了siv-606的豬體內(nèi)的肺組織病變百分比(圖18a)和肺病毒載荷(圖18b)。圖19a-19e顯示了以下豬體內(nèi)的組織病理學(xué)病變：未接種的、未攻擊的豬(圖19a)；接種了mem并進(jìn)行攻擊的豬(圖19b)；接種了siv-606并用siv/sk02攻擊的豬(圖19c)；接種了mem并用siv/tx98攻擊的豬(圖19d)；以及接種了siv-606并用siv/tx98攻擊的豬(圖19e)。發(fā)明的詳細(xì)描述除非指出并非如此，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的病毒學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組dna技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整說明。參見，例如，fundamentalvirology,currentedition,vol.i&ii(b.n.fieldsandd.m.knipe,eds.)；handbookofexperimentalimmunology,vols.i-iv(d.m.weirandc.c.blackwelleds.,blackwellscientificpublications)；t.e.creighton,proteins:structuresandmolecularproperties(w.h.freemanandcompany)；a.l.lehninger,biochemistry(worthpublishers,inc.,最新版本)；sambrook,etal.,molecularcloning:alaboratorymanual(currentedition)；methodsinenzymology(s.colowickandn.kaplaneds.,academicpress,inc.)。以下氨基酸縮寫用于整個(gè)文本中：1.定義在本發(fā)明描述中，將采用以下術(shù)語(yǔ)，且旨在按如下所示加以定義。必須注意，如本說明書和所附的權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文明確指示并非如此。因此，例如，提及“a型流感病毒”包括兩種或更多種此類病毒的混合物，以此類推。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“流感病毒”是指具有節(jié)段化的反義rna基因組的正粘病毒科的包膜病毒的成員(knipeandhowley(eds.)fieldsvirology,4thedition,lippincottwilliamsandwilkins,philadelphia,pa.,2001)。術(shù)語(yǔ)流感病毒可以包括任何流感(如a、b或c型流感)病毒株，其能引起動(dòng)物或人個(gè)體體內(nèi)的疾病。具體來說，該術(shù)語(yǔ)包括選自h1-h15和n1-n9的任何a型流感病毒亞型，諸如但不限于h1n1、h1n2、h3n2、h3n1、h9n2和h5n1，或h和n的任何組合。大量的流感分離物已得到部分或完全測(cè)序。參見，例如，流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)(influenzasequencedatabase,isd)(網(wǎng)站為flu.lanl.gov；由mackenetal.,"thevalueofadatabaseinsurveillanceandvaccineselection."optionsforthecontrolofinfluenzaiv.a.d.m.e.osterhaus,n.cox&a.w.hampson(eds.)amsterdam:elsevierscience,2001,103-106描述)和genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是流感病毒資源數(shù)據(jù)庫(kù)(influenzavirusresource)(網(wǎng)站為ncbi.nlm.nih.gov/genomes/flu/flu.html)。所述isd和genbank數(shù)據(jù)庫(kù)含有a、b和c型流感基因組節(jié)段的完整序列。本文使用術(shù)語(yǔ)“來源于”來確定分子的原始來源，但不試圖限制產(chǎn)生該分子的方法，例如，方法可以為，通過化學(xué)合成或重組方法。流感病毒分子為來源于流感病毒的分子，包括但不限于來自a、b或c型流感亞型的任何不同分離物的如本文中定義的多肽、蛋白、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。所述分子不必在物理上來源于談及的特定分離物，而是可以為合成或重組產(chǎn)生的。已知多種流感病毒分離物的核酸和多肽序列。代表性的流感序列提供在本文的圖5-13中。來自在不同物種中發(fā)現(xiàn)的流感分離物的其他代表性序列，包括8個(gè)流感節(jié)段的其他序列，在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)數(shù)據(jù)庫(kù)和創(chuàng)建于fludb.org的流感研究數(shù)據(jù)庫(kù)(infleunzaresearchdatabase)中列出，所述8個(gè)流感節(jié)段包括編碼血凝素(ha)、神經(jīng)氨酸酶(na)、聚合酶酸性蛋白(pa)、聚合酶堿性蛋白1和2(pb1和pb2)、基質(zhì)膜蛋白1和2(m1和m2)、核蛋白(np)和非結(jié)構(gòu)蛋白1和2(ns1和nep，也稱為ns2)的那些節(jié)段。對(duì)于流感病毒的序列比較和遺傳多樣性的討論及系統(tǒng)發(fā)育分析，還參見fergusonetal.(2003)nature422:428-433；linetal.(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97,9654-9658；nguyenetal.(2005)j.virol.79:4201-4212；haetal.(2002)emboj.21:865-875；和chanetal.(2004)j.microbiol.immunol.infect.37:135-144。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“豬流感病毒”是指來自引起豬流感的正粘病毒科的a型或c型流感病毒。雖然正粘病毒具有3個(gè)類群：a型、b型和c型，僅a型和c型流感病毒感染豬。豬流感病毒的亞型包括h1n1、h1n2、h3n2、h3n1、h9n2和h5n1。在某些實(shí)施方案中，豬流感病毒為從豬分離的流感病毒。為了本發(fā)明的目的，豬流感病毒為野生型豬流感病毒或來源于野生型豬流感病毒的重組、嵌合型流感病毒。如本文中所使用，短語(yǔ)“野生型豬流感病毒”是指流行的、天然傳播的并引起典型的疾病暴發(fā)的豬病毒類型。野生型豬流感病毒的實(shí)例包括但不限于a/swine/saskatchewan/18789/02、a/swine/colorado/1/77、a/swine/colorado/23619/99、a/swine/coted'armor/3633/84、a/swine/coted'armor/3633/84、a/swine/england/195852/92、a/swine/finistere/2899/82、a/swine/hongkong/10/98、a/swine/hongkong/9/98、a/swine/hongkong/81/78、a/swine/illinois/100084/01、a/swine/illinois/100085a/01、a/swine/illinois/21587/99、a/swine/indiana/1726/88、a/swine/indiana/9k035/99、a/swine/indiana/p12439/00、a/swine/iowa/30、a/swine/iowa/15/30、a/swine/iowa/533/99、a/swine/iowa/569/99、a/swine/iowa/3421/90、a/swine/iowa/8548-1/98、a/swine/iowa/930/01、a/swine/iowa/17672/88、a/swine/italy/1513-1/98、a/swine/italy/1523/98、a/swine/korea/cy02/02、a/swine/minnesota/55551/00、a/swine/minnesota/593/99、a/swine/minnesota/9088-2/98、a/swine/nebraska/1/92、a/swine/nebraska/209/98、a/swine/netherlands/12/85、a/swine/northcarolina/16497/99、a/swine/northcarolina/35922/98、a/swine/northcarolina/93523/01、a/swine/northcarolina/98225/01、a/swine/oedenrode/7c/96、a/swine/ohio/891/01、a/swine/oklahoma/18717/99、a/swine/oklahoma/18089/99、a/swine/ontario/01911-1/99、a/swine/ontario/01911-2/99、a/swine/ontario/41848/97、a/swine/ontario/97、a/swine/quebec/192/81、a/swine/quebec/192/91、a/swine/quebec/5393/91、a/swine/taiwan/7310/70、a/swine/tennessee/24/77、a/swine/texas/4199-2/98、a/swine/wisconsin/125/97、a/swine/wisconsin/136/97、a/swine/wisconsin/163/97、a/swine/wisconsin/164/97、a/swine/wisconsin/166/97、a/swine/wisconsin/168/97、a/swine/wisconsin/235/97、a/swine/wisconsin/238/97、a/swine/wisconsin/457/98、a/swine/wisconsin/458/98、a/swine/wisconsin/464/98和a/swine/wisconsin/14094/99。術(shù)語(yǔ)“ha基因”是指編碼從流感的含脂包膜突出的血凝素(ha)表面糖蛋白的基因。ha為一種由a型流感病毒和其他病毒的節(jié)段化的基因組編碼的分子?！柏i流感病毒ha基因”為從豬流感病毒分離的ha基因，如來自任何上述病毒株的ha基因。代表性的豬ha基因的多核苷酸和氨基酸序列可以參見公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)如genbank。例如，來自h1n1的ha基因包括但不限于genbank登錄號(hào)ay619961.1(參見圖5a和5b)；gq457549.1；gq457548.1；gq457547.1；cy091769.1；cy091745.1；cy091737.1；cy091729.1；gu721143.3；jf820285.1；jf820277.1；jf707784.1；cy087136.1；cy087104.1；cy087096.1；cy087080.1；cy087072.1；cy087064.1；cy087056.1；cy087048.1；cy086863.1；cy086839.1；cy086353.1；cy086006.1；cy085990.1；cy085982.1；cy085974.1；cy085966.1；cy085958.1；cy085950.1；cy085942.1；cy085934.1；cy085926.1；cy085918.1；cy085910.1；cy085902.1；cy085894.1；cy085886.1；cy085878.1；cy085870.1；cy085854.1；cy085846.1；cy085838.1；cy085830.1；cy085822.1；cy085814.1；cy085806.1；cy085798.1；cy085790.1；cy085782.1；cy085774.1；cy085766.1；cy085758.1；cy085742.1；cy085726.1；cy085718.1；cy085710.1；cy085702.1；cy085694.1；cy085686.1；cy085670.1；jf833344.1；jf833343.1；jf833341.1；jf833339.1；jf833338.1；jf833337.1；jf833335.1；jf916682.1；jf812292.1；jf812291.1；jf812290.1；jf812287.1；jf812284.1；jf812281.1；jf812280.1；jf812279.1；jf812278.1；jf812273.1；jf812272.1；jf812271.1；af091317.1；af091315.1；af091314.1。來自h3n2的ha基因包括但不限于圖13a和13b中所示的序列；以及genbank登陸號(hào)ay377927.2；cy092324.1；af153233.1；jn105973.1；hq315643.1；fj519977.1；fj519976.1；fj519975.1；fj519974.1；fj519973.1；fj519972.1；fj519971.1；gu937743.1；jf833345.1；jf833340.1；jf833336.1；jf833334.1；jf812293.1；jf812289.1；jf812277.1；jf812276.1；jf812275.1；jf812274.1；cy045575.1；cy045567.1；cy045559.1；cy045551.1；hq825243.1；hq825235.1；hq825229.1；hq825226.1；hq825223.1；hq825218.1；hq825210.1；hq825210.1；hq825198.1；hq825190.1；hq825182.1；hq825174.1；hq825166.1；jf312065.1；jf312064.1；cy086920.1；jf312073.1；jf312072.1；jf312071.1；jf316643.1；jf263536.1；jf263535.1；hq734204.1；hq734201.1；hq734198.1；hq734195.1；hq734192.1；hq734189.1；hq734186.1；cy077942.1；cy077934.1。術(shù)語(yǔ)“na基因”是指編碼從流感的含脂包膜突出的神經(jīng)氨酸酶(na)表面糖蛋白的基因。na為一種由a型流感病毒和其他病毒的節(jié)段化的基因組編碼的分子?！柏i流感病毒na基因”為從豬流感病毒分離的na基因，如來自任何上述病毒株的na基因。代表性的豬na基因的多核苷酸和氨基酸序列可以參見公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)如genbank。例如，來自h1n1的na基因包括但不限于ay619960.1(參見圖6a和6b)；jf833356.1.；jf833355.1；jf833353.1；jf833351.1；jf833350.1；jf833349.1；jf833355.1；jf833347.1；jf812315.1；jf812314.1；jf812313.1；jf812310.1；jf812307.1；jf812304.1；jf812303.1；jf812302.1；jf812301.1；jf812294.1；fj791299.1；fj791298.1；fj791297.1；fj791296.1；fj791295.1；fj791294.1；fj791293.1；fj791292.1；fj791291.1；fj791290.1；fj791289.1；fj791288.1；fj791287.1。術(shù)語(yǔ)“na包裝信號(hào)”是指na的3’端和5’端病毒rna特異性包裝信號(hào)，其提供病毒rna到病毒粒子的有效整合。包裝信號(hào)存在于5’端和3’端非翻譯區(qū)(utrs)中，并且延伸到na節(jié)段的編碼區(qū)內(nèi)。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生重組、嵌合型病毒的na包裝信號(hào)僅包括足夠包裝的na區(qū)，且不包括整個(gè)na編碼序列。na包裝信號(hào)在以下將更詳細(xì)地描述。如本文中所使用，短語(yǔ)“感染復(fù)數(shù)”或“moi”為每個(gè)感染細(xì)胞的病毒的平均數(shù)目。通過用加入的病毒數(shù)目(加入的mlxpfu)除以加入的細(xì)胞數(shù)目(加入的mlx細(xì)胞/ml)確定moi。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“減毒的”指相對(duì)于野生型流感病毒，諸如本文描述的重組、嵌合型病毒的流感病毒變體展現(xiàn)出復(fù)制效率的可測(cè)量的減少?？梢詼y(cè)定流感病毒的復(fù)制效率，例如，通過測(cè)量mdck細(xì)胞中的噬斑大小、通過測(cè)量多個(gè)生長(zhǎng)周期的病毒滴度或通過從感染的肺組織分離病毒并測(cè)量滴度。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”是指氨基酸殘基聚合物，且不限于產(chǎn)物的最小長(zhǎng)度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在該定義中。全長(zhǎng)蛋白及其片段都包括在該定義中。該術(shù)語(yǔ)還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?。此外，為了本發(fā)明的目的，“多肽”是指這樣的蛋白，其包括對(duì)天然序列的修飾如缺失、添加和取代，只要該蛋白保持期望的活性。這些修飾可以為有意的，如通過定點(diǎn)突變，或可以為偶然的，如通過對(duì)產(chǎn)生蛋白的宿主的突變或由于pcr擴(kuò)增而產(chǎn)生的錯(cuò)誤?！盎旧霞兊摹蓖ǔＪ侵阜蛛x物質(zhì)(重組病毒、化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽組合物)以便該物質(zhì)構(gòu)成其所存在的樣品的主要百分比。通常在樣品中，基本上純的組分構(gòu)成樣品的50％，優(yōu)選80％-85％，更優(yōu)選90-95％。純化目的分子的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知且包括，例如，離子交換層析、親和層析和依密度沉降。當(dāng)提及多肽時(shí)，通過“分離的”表示，所指出的分子是單獨(dú)的，且與自然界中該分子所存在的整個(gè)有機(jī)體分離，或者在基本上沒有相同類型的其他生物大分子的情形下存在。就多核苷酸而言，術(shù)語(yǔ)“分離的”為全部或部分缺乏自然界中通常與其相關(guān)的序列的核酸分子；或如在自然界中存在，但具有與其相關(guān)的異源序列的序列；或從染色體分離的分子?！巴础笔侵竷蓚€(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分間的百分比同一性。當(dāng)序列在該分子的指定長(zhǎng)度上展現(xiàn)至少約50％的序列同一性，優(yōu)選至少約75％的序列同一性，更優(yōu)選至少約80％-85％的序列同一性，更優(yōu)選至少約90％的序列同一性，且最優(yōu)選至少約95％-98％的序列同一性時(shí)，兩條核酸或兩條多肽序列為彼此“基本上同源的”。如本文中所使用，基本上同源的還指顯示出與指定序列的完全同一性的序列。一般來說，“同一性”分別指兩條多核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸的一致性?？梢酝ㄟ^以下方式確定百分比同一性：經(jīng)序列比對(duì)直接比較兩個(gè)分子間的序列信息、對(duì)兩條比對(duì)序列間的精確匹配數(shù)計(jì)數(shù)、除以較短序列的長(zhǎng)度，以及將結(jié)果乘以100。容易獲得的計(jì)算機(jī)程序可用來幫助分析，如align、dayhoff、m.o.atlasofproteinsequenceandstructurem.o.dayhoffed.,5suppl.3:353358,nationalbiomedicalresearchfoundation,washington,dc，其采用了smithandwatermanadvancesinappl.math.2:482489,1981的用于肽分析的局部同源性算法。用于確定核苷酸序列同一性的程序可獲自wisconsinsequenceanalysispackage,version8(可獲自geneticscomputergroup,madison,wi)，例如，bestfit、fasta和gap程序，其也依賴于smithandwaterman算法?？墒褂蒙a(chǎn)商建議的和以上提及的wisconsinsequenceanalysispackage中描述的默認(rèn)參數(shù)容易地利用這些程序。例如，可以利用smithandwaterman的同源性算法、采用6個(gè)核苷酸位置的默認(rèn)記分表(scoringtable)和空位罰分確定特定核苷酸序列與參照序列的百分比同一性。本發(fā)明上下文中建立百分比同一性的另一方法為利用愛丁堡大學(xué)擁有版權(quán)的、由johnf.collins和shanes.sturrok開發(fā)的并且由intelligenetics,inc.(mountainview,ca)銷售的mpsrch程序包。可以采用來自該套程序包的smithwaterman算法，其中默認(rèn)參數(shù)被用于記分表(例如，空位開放罰分為12，空位延伸罰分為1，且空位為6)。從該數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“匹配”值反應(yīng)“序列同一性”。其他合適的用于計(jì)算序列間的百分比同一性或相似性的程序通常為本領(lǐng)域已知，例如，另一比對(duì)程序?yàn)槭褂媚J(rèn)參數(shù)的blast。例如，可以利用以下默認(rèn)參數(shù)使用blastn和blastp：遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；濾除＝無；鏈＝兩條鏈；閾值＝60；期望值＝10；矩陣＝blosum62；描述＝50條序列；排序方式＝高分；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非冗余,genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcds翻譯+swissprotein+spupdate+pir?？扇菀椎氐玫竭@些程序的詳細(xì)信息?？蛇x地，可以通過以下方式確定同源性：在同源區(qū)域間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下使多核苷酸雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化，并確定消化片段的大小?？梢栽诶?，為該特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)緊條件下，在southern雜交實(shí)驗(yàn)中確定基本上同源的dna序列。確定合適的雜交條件處于本領(lǐng)域技術(shù)能力范圍內(nèi)。參見，例如sambrooketal.,同上；dnacloning,同上；nucleicacidhybridization,同上。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括任何長(zhǎng)度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的聚合形式。該術(shù)語(yǔ)僅指該分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括三鏈、雙鏈和單鏈dna，以及三鏈、雙鏈和單鏈rna。其還包括多核苷酸的修飾(如通過甲基化和/或通過加帽)和未修飾形式。更具體而言，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-d-核糖)、多核糖核苷酸(含有d-核糖)、任何其他類型的多核苷酸——其為嘌呤或嘧啶堿基的n-或c-糖苷，含有非核苷酸骨架的其他聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(pnas))和聚嗎啉(可從antivirals,inc.,corvallis,oregon,asneugene購(gòu)得)聚合物，以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，只要該聚合物含有這樣構(gòu)型的核苷堿基：其允許堿基配對(duì)和堿基堆積，諸如在dna和rna中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)型。不試圖在長(zhǎng)度上區(qū)分術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”，并且這些術(shù)語(yǔ)可交換使用。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括例如，3'-脫氧-2'、5'-dna、寡脫氧核糖核苷酸n3'p5'磷酰胺酯、2'-o-烷基取代的rna、雙鏈和單鏈dna，以及雙鏈和單鏈rna、dna：rna雜聚物以及pnas和dna或rna間的雜聚物，并且還包括已知類型的修飾，例如，本領(lǐng)域已知的標(biāo)記、甲基化、“帽”、用類似物對(duì)一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸的取代、核苷酸間的修飾，例如，具有不帶電的連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的那些、具有帶負(fù)電的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，以及具有帶正電的連接(例如，氨基烷基磷酸酰胺、氨基烷基磷酸三酯)的那些、含有側(cè)基(pendant)部分諸如例如，蛋白(包括核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚l-賴氨酸等)的那些、具有嵌入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的那些、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些、含有烷化劑的那些、具有修飾的連接的那些(例如，α端基異構(gòu)核酸等)，以及未修飾形式的多核苷酸或寡核苷酸。具體來說，dna為脫氧核糖核酸?！皝碓从凇敝付ㄐ蛄械亩嗪塑账崾侵高@樣的多核苷酸序列，其包含與該指定的核苷酸序列區(qū)域?qū)?yīng)(即相同或互補(bǔ))的至少約6個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約8個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約10-12個(gè)核苷酸，且甚至更優(yōu)選至少約15-20個(gè)核苷酸的連續(xù)序列。所述來源的多核苷酸不必物理上來源于目的核苷酸序列，而是可以以任何方式生成，包括但不限于，化學(xué)合成、復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄，其基于多核苷酸源自的區(qū)域中堿基序列提供的信息。正因如此，其可以代表原始多核苷酸的正義或反義取向。本文使用的描述核酸分子的“重組體”指基因組、rna、cdna、病毒、半合成或合成來源的多核苷酸，其借助其來源或操作與在自然界中與其相關(guān)的多核苷酸的全部或部分不相關(guān)。結(jié)合病毒使用的術(shù)語(yǔ)“重組體”指通過操作病毒基因組產(chǎn)生的病毒。“重組宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”以及其他指示作為單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的微生物或較高等真核細(xì)胞系的此類術(shù)語(yǔ)是指可以或已用作重組病毒和載體或其他轉(zhuǎn)移的核酸的受體的細(xì)胞，并且包括轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的原始子代?！熬幋a”選定多肽的“編碼序列”或序列，為當(dāng)置于合適的調(diào)控序列(或“控制元件”)控制下時(shí)，在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽的核酸分子?？梢酝ㄟ^5'(氨基)端的起始密碼子和3'(羧基)端的翻譯終止密碼子確定編碼序列的邊界。編碼序列可以包括但不限于來自病毒、原核或真核mrna的rna或cdna、來自病毒或原核dna的基因組dna序列，以及甚至合成的dna序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3'端。典型的“控制元件”包括但不限于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、聚腺苷酸化序列(位于翻譯終止密碼子的3'端)、翻譯起始的優(yōu)化序列(位于編碼序列的5’端)以及翻譯終止序列?！翱刹僮鞯剡B接的”是指這樣的元件布置，其中配置了如此描述的組件以便執(zhí)行它們的通常功能。因此，給定的可操作地連接至編碼序列的啟動(dòng)子在存在合適的酶的情況下能影響編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子不必與編碼序列連續(xù)，只要其能發(fā)揮功能來指導(dǎo)其表達(dá)即可。因此，例如，插入的未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，并且所述啟動(dòng)子序列仍然可以被認(rèn)為“可操作地連接”至編碼序列。“由…編碼”是指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有來自由所述核酸序列編碼的多肽的至少3至5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少8至10個(gè)氨基酸，且甚至更優(yōu)選至少15至20個(gè)氨基酸的氨基酸序列?！氨磉_(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建物”是指能指導(dǎo)目標(biāo)序列或基因的表達(dá)的組件。表達(dá)盒通常包括如上所述的控制元件，如可操作地連接至目標(biāo)序列或基因(以便指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄)的啟動(dòng)子，且常常還包括聚腺苷酸化序列。表達(dá)盒可以包含在質(zhì)粒構(gòu)建物內(nèi)。除了表達(dá)盒組件外，質(zhì)粒構(gòu)建物還可以包含一個(gè)或多個(gè)可選標(biāo)志物——允許所述質(zhì)粒構(gòu)建物作為單鏈dna存在的信號(hào)(例如，m13復(fù)制起點(diǎn))、至少一個(gè)多克隆位點(diǎn)以及“哺乳類”復(fù)制起點(diǎn)(例如，sv40或腺病毒復(fù)制起點(diǎn))。使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是指細(xì)胞攝取外來核酸。當(dāng)外源核酸被引入至細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞被“轉(zhuǎn)染”。多種轉(zhuǎn)染技術(shù)通常為本領(lǐng)域已知。參見，例如，grahametal.(1973)virology,52:456,sambrooketal.(1989)molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratories,newyork,davisetal.(1986)basicmethodsinmolecularbiology,elsevier,andchuetal.(1981)gene13:197。此類技術(shù)可被用來引入一個(gè)或多個(gè)外源dna部分至合適的宿主細(xì)胞內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定和瞬時(shí)攝取，并且包括肽或抗體連接的核酸的攝取。“載體”能轉(zhuǎn)移核酸序列至靶細(xì)胞(例如，病毒載體、非病毒載體、粒性載體和脂質(zhì)體)。通常，“載體構(gòu)建物”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”指能指導(dǎo)目標(biāo)核酸表達(dá)以及可以轉(zhuǎn)移核酸序列至靶細(xì)胞的任何核酸構(gòu)建物。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體以及病毒載體。對(duì)抗原或組合物的“免疫反應(yīng)”是個(gè)體體內(nèi)發(fā)展的對(duì)存在于目標(biāo)組合物中的抗原的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，“體液免疫反應(yīng)”是指由抗體分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而“細(xì)胞免疫反應(yīng)”是由t淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要的方面涉及由細(xì)胞溶解性t細(xì)胞(“ctl”s)引起的抗原特異性反應(yīng)。ctls具有針對(duì)存在的與由主要組織相容性復(fù)合體(mhc)編碼的并表達(dá)于細(xì)胞表面上的蛋白相關(guān)的肽抗原的特異性。ctls幫助誘導(dǎo)和促進(jìn)胞內(nèi)微生物的摧毀或感染了此類微生物的細(xì)胞的裂解。細(xì)胞免疫的另一方面涉及由輔助t細(xì)胞引起的抗原特異性反應(yīng)。輔助t細(xì)胞作用以幫助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞的功能并聚集非特異性效應(yīng)細(xì)胞的活性，所述非特異性效應(yīng)細(xì)胞針對(duì)這樣的細(xì)胞：其呈遞與其表面上的mhc分子相關(guān)的肽抗原?！凹?xì)胞免疫反應(yīng)”還指細(xì)胞因子、趨化因子以及由活化的t細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞產(chǎn)生的其他此類分子，包括來源于cd4+和cd8+t細(xì)胞的那些分子的產(chǎn)生。引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的組合物或疫苗通過在細(xì)胞表面呈遞與mhc分子相關(guān)的抗原，可以用來敏化脊椎動(dòng)物個(gè)體。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)針對(duì)表面呈遞抗原的細(xì)胞或表面呈遞抗原的細(xì)胞附近。另外，可以生成抗原特異性t淋巴細(xì)胞以允許免疫宿主的未來防護(hù)。可以通過多種測(cè)定方法確定特定抗原刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力，諸如通過淋巴細(xì)胞增殖(淋巴細(xì)胞活化)測(cè)定、ctl細(xì)胞毒性細(xì)胞測(cè)定或通過測(cè)定敏化個(gè)體體內(nèi)抗原的特異性t淋巴細(xì)胞。此類測(cè)定為本領(lǐng)域熟知。參見，例如，ericksonetal.,j.immunol.(1993)151:4189-4199；doeetal.,eur.j.immunol.(1994)24:2369-2376。最近的測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法包括測(cè)量細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或由t細(xì)胞群分泌的細(xì)胞因子，或通過測(cè)量表位特異性t細(xì)胞(例如，通過四聚物技術(shù))(mcmichael,a.j.,ando’callaghan,c.a.,j.exp.med.(1998)187:1367-1371；mcheyzer-williams,m.g.,etal,immunol.rev.(1996)150:5-21；lalvani,a.,etal,j.exp.med.(1997)186:859-865的綜述)。因此，本文使用的免疫反應(yīng)可以為刺激抗體(例如，中和抗體，其通過結(jié)合至毒素和病原體阻止諸如進(jìn)入細(xì)胞并復(fù)制的病毒的病原體，通常保護(hù)細(xì)胞免受感染和損傷)產(chǎn)生的反應(yīng)。目標(biāo)抗原還可以引發(fā)ctls產(chǎn)生。因此，免疫反應(yīng)可以包括一種或多種下述效應(yīng)：通過b細(xì)胞產(chǎn)生抗體；和/或活化特異性針對(duì)存在于目標(biāo)組合物或疫苗中的抗原的抑制性t細(xì)胞和/或記憶/效應(yīng)t細(xì)胞。這些反應(yīng)可以用來中和感染，和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體，或抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)，以提供對(duì)免疫宿主的防護(hù)?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定和中和測(cè)定確定此類反應(yīng)。(參見，例如，montefiorietal.j.clinmicrobiol.(1988)26:231-235；dreyeretal.,aidsreshumretroviruses(1999)15:1563-1571)。哺乳動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)還通過免疫細(xì)胞上的toll樣受體和類似的受體分子的活化識(shí)別和響應(yīng)病原有機(jī)體的分子特征。先天免疫系統(tǒng)活化后，多種非適應(yīng)性免疫反應(yīng)細(xì)胞被活化，例如，以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子。通過先天免疫反應(yīng)活化的細(xì)胞包括單核細(xì)胞和類漿細(xì)胞譜系(mdc,pdc)的未成熟的和成熟的樹狀細(xì)胞，以及γ、δ、α和βt細(xì)胞和b細(xì)胞等。因此，本發(fā)明還包括免疫反應(yīng)，其中所述免疫反應(yīng)包括先天反應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)?！懊庖咴越M合物”為包含抗原分子的組合物，其中將所述組合物給予個(gè)體導(dǎo)致所述個(gè)體體內(nèi)出現(xiàn)如上所述的免疫反應(yīng)。“抗原”是指含有一個(gè)或多個(gè)可刺激宿主的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生如上所述的免疫反應(yīng)的表位(線型、構(gòu)象型或二者均存在)的分子，如蛋白、多肽或其片段，或減毒病毒。該術(shù)語(yǔ)可與術(shù)語(yǔ)“免疫原”交換使用。術(shù)語(yǔ)“抗原”表示兩種亞單位抗原(即，單獨(dú)的，且與自然界中該抗原有關(guān)的整個(gè)有機(jī)體分離的抗原)，以及殺死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其他微生物。類似地，體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，諸如在基因治療和核酸免疫應(yīng)用中的寡核苷酸或多核苷酸，也包括在本文抗原的定義中。通過“脊椎動(dòng)物個(gè)體”表示脊索動(dòng)物亞門的任何成員，包括但不限于人和其他靈長(zhǎng)類，包括非人的靈長(zhǎng)類如黑猩猩和其他猿和猴類物種；家畜如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴養(yǎng)的哺乳類如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥，包括馴養(yǎng)的鳥、野生的鳥和獵鳥如雞、火雞和其他鶉雞類的鳥、鴨、鵝等。該術(shù)語(yǔ)不指示特定年齡。因此，本文試圖包括成體和新生個(gè)體。通過“治療有效量”在免疫原性組合物情形下指誘導(dǎo)用于抗體產(chǎn)生或用于治療或預(yù)防流感病毒感染的免疫反應(yīng)的免疫原即重組、嵌合型流感病毒的量。此類反應(yīng)通常引起個(gè)體體內(nèi)出現(xiàn)針對(duì)組合物的抗體介導(dǎo)的和/或分泌性或細(xì)胞性免疫反應(yīng)。通常，此類反應(yīng)包括但不限于一種或多種下述效應(yīng)；來自任何免疫類型如免疫球蛋白a、d、e、g或m的抗體產(chǎn)生；b和t淋巴細(xì)胞的增殖；為免疫細(xì)胞提供活化、生長(zhǎng)和分化信號(hào)；輔助t細(xì)胞、抑制性t細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性t細(xì)胞和/或γδt細(xì)胞群的擴(kuò)增。“腸胃外給藥”是指在消化道外引入身體，如通過皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。這與遞送至粘膜表面(如經(jīng)口、鼻、陰道或直腸)形成對(duì)比。“粘膜給藥”是指通過任何粘膜表面引入身體，如經(jīng)胃內(nèi)、肺、經(jīng)皮、腸、眼睛、鼻內(nèi)、口、陰道、直腸、氣管內(nèi)等。如本文中所使用，“治療”是指任何以下情形：(i)感染或再感染的預(yù)防，如在常規(guī)疫苗中，(ii)癥狀的減輕或消除，以及(iii)從感染個(gè)體大幅或完全清除流感病毒?？梢灶A(yù)防性(感染前)或治療性(感染后)實(shí)現(xiàn)治療。2.實(shí)施本發(fā)明的模式在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于特定構(gòu)思或運(yùn)行參數(shù)，因?yàn)槠洚?dāng)然可以發(fā)生變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案的目的，且并不意圖限制。盡管類似或等同于本文描述的那些方法和材料的多種方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的材料和方法。本發(fā)明提供了具有受損的體內(nèi)復(fù)制能力的減毒的重組、嵌合型豬流感病毒、制備此類減毒的豬流感病毒的方法以及此類病毒在疫苗和藥物制劑中的應(yīng)用。此類病毒能產(chǎn)生免疫反應(yīng)并產(chǎn)生免疫力，但不引起疾病或引起較少和/或較低嚴(yán)重性的癥狀，即，該病毒具有減少的毒力。因此，它們是活病毒疫苗的完美候選者。此外，因?yàn)榇嬖趤碜圆煌瑂ivs亞型的ha，包含嵌合型流感病毒的組合物可用來提供針對(duì)多種流感株的廣泛覆蓋。具體來說，本發(fā)明涉及重組、嵌合型流感病毒(其包含來自多于一種流感亞型的ha節(jié)段，并且包含na節(jié)段的全部或部分缺失)、包含該病毒的免疫原性組合物，以及刺激針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)的方法和干擾流感病毒復(fù)制的方法。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下文提供了關(guān)于重組、嵌合型流感病毒的產(chǎn)生及在組合物中將其用于治療和/或預(yù)防流感病毒感染的方法的更為詳細(xì)的論述。a.重組、嵌合型流感病毒野生型豬流感病毒通常包含8個(gè)節(jié)段化的基因組，其中所述節(jié)段命名如下：節(jié)段基因產(chǎn)物名稱1pb2(聚合酶(堿性)蛋白2)2pb1(聚合酶(堿性)蛋白1)3pa(聚合酶(酸性)蛋白)4ha(血凝素)5np(核蛋白)6na(神經(jīng)氨酸酶)7m1(基質(zhì)蛋白1)；m2(基質(zhì)蛋白2)8ns1(非結(jié)構(gòu)蛋白1)；nep，也稱為ns2(非結(jié)構(gòu)蛋白2)本文描述的重組、嵌合型流感病毒包含來自兩種或更多種流感病毒亞型的兩個(gè)或更多個(gè)ha節(jié)段(節(jié)段4)。所述重組流感病毒可以包含來自任何流感病毒亞型的has，并且優(yōu)選來自a型流感病毒，選自h1-h15和n1-n9，諸如但不限于h1n2、h1n1、h3n2、h3n1、h9n2和h5n1或h和n的任何組合。特別優(yōu)選來自感染豬的病毒的ha節(jié)段。代表性豬ha基因的多核苷酸和氨基酸序列可以參見公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)如genbank。例如，來自h1n1的ha基因包括但不限于genbank登錄號(hào)ay619961.1(參見圖5a和5b)；gq457549.1；gq457548.1；gq457547.1；cy091769.1；cy091745.1；cy091737.1；cy091729.1；gu721143.3；jf820285.1；jf820277.1；jf707784.1；cy087136.1；cy087104.1；cy087096.1；cy087080.1；cy087072.1；cy087064.1；cy087056.1；cy087048.1；cy086863.1；cy086839.1；cy086353.1；cy086006.1；cy085990.1；cy085982.1；cy085974.1；cy085966.1；cy085958.1；cy085950.1；cy085942.1；cy085934.1；cy085926.1；cy085918.1；cy085910.1；cy085902.1；cy085894.1；cy085886.1；cy085878.1；cy085870.1；cy085854.1；cy085846.1；cy085838.1；cy085830.1；cy085822.1；cy085814.1；cy085806.1；cy085798.1；cy085790.1；cy085782.1；cy085774.1；cy085766.1；cy085758.1；cy085742.1；cy085726.1；cy085718.1；cy085710.1；cy085702.1；cy085694.1；cy085686.1；cy085670.1；jf833344.1；jf833343.1；jf833341.1；jf833339.1；jf833338.1；jf833337.1；jf833335.1；jf916682.1；jf812292.1；jf812291.1；jf812290.1；jf812287.1；jf812284.1；jf812281.1；jf812280.1；jf812279.1；jf812278.1；jf812273.1；jf812272.1；jf812271.1；af091317.1；af091315.1；af091314.1。來自h3n2的ha基因包括但不限于genbank登錄號(hào)af153233.1(參見圖13a和13b)；ay377927.2；cy092324.1；jn105973.1；hq315643.1；fj519977.1；fj519976.1；fj519975.1；fj519974.1；fj519973.1；fj519972.1；fj519971.1；gu937743.1；jf833345.1；jf833340.1；jf833336.1；jf833334.1；jf812293.1；jf812289.1；jf812277.1；jf812276.1；jf812275.1；jf812274.1；cy045575.1；cy045567.1；cy045559.1；cy045551.1；hq825243.1；hq825235.1；hq825229.1；hq825226.1；hq825223.1；hq825218.1；hq825210.1；hq825210.1；hq825198.1；hq825190.1；hq825182.1；hq825174.1；hq825166.1；jf312065.1；jf312064.1；cy086920.1；jf312073.1；jf312072.1；jf312071.1；jf316643.1；jf263536.1；jf263535.1；hq734204.1；hq734201.1；hq734198.1；hq734195.1；hq734192.1；hq734189.1；hq734186.1；cy077942.1；cy077934.1。任何上述has或其他容易獲得的ha序列都可以用于本發(fā)明。另外，所述重組、嵌合型流感病毒通常包含編碼神經(jīng)氨酸酶的na基因組節(jié)段(節(jié)段6)的突變，以便病毒復(fù)制受損。突變可以包括損害病毒復(fù)制的缺失、倒位、插入或取代。在某些實(shí)施方案中，所述病毒變體包含na節(jié)段的全部或部分缺失，以便阻止病毒增殖。因?yàn)閚a為病毒增殖所必需，可以通過使病毒在唾液酸酶存在下生長(zhǎng)而在培養(yǎng)物中提供na的功能。優(yōu)選地，在所述重組病毒中保留na包裝序列，其位于na序列側(cè)翼的3’端以及任選地5’端非翻譯區(qū)(utrs)并延伸到編碼序列內(nèi)。具體來說，特定順式作用包裝信號(hào)存在于3’端和5’端(utrs)，其延伸到大多數(shù)(如果不是所有節(jié)段)包括na節(jié)段的編碼區(qū)內(nèi)，所述包裝信號(hào)通過從細(xì)胞糖綴合物和病毒糖蛋白去除唾液酸，負(fù)責(zé)從感染細(xì)胞釋放病毒。每種病毒rna主要由編碼序列(以反義方向)組成，兩端側(cè)翼均為19至58個(gè)堿基長(zhǎng)度的utrs。在這些utrs中，分別形成每個(gè)節(jié)段的最3’和5’末端的遠(yuǎn)端12個(gè)和13個(gè)非編碼堿基在病毒株以及8個(gè)節(jié)段自身間高度保守。這些遠(yuǎn)端保守的序列彼此部分互補(bǔ)，且可以退火形成該節(jié)段的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制必不可少的凸出的雙鏈結(jié)構(gòu)。所述utrs具有有助于rna包裝的順式作用信號(hào)，因?yàn)閷⒄嬲膗trs連接到異源rna上可以使得該rna能夠包裝到流感病毒粒子內(nèi)并通過流感病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)。至少一些節(jié)段如na、ha和ns的最佳包裝不僅需要utrs，還需要短部分的編碼區(qū)域。報(bào)道構(gòu)建物的缺失分析表明有效包裝所需的最少序列延伸超出每個(gè)utr，包括節(jié)段任一端的鄰近的編碼序列的9至80個(gè)堿基(fujiietal.,j.virol.(2005)79:3766–3774；fujiietal.,proc.natl.acad.sci.usa(2003)100:2002–2007；watanabeetal.,j.virol.(2003)77:10575–10583)。編碼區(qū)3’端的序列似乎比5’端的序列發(fā)揮更大的定量效應(yīng)。因此，這些區(qū)域?qū)Πb和維持野生型narna以及突變型narnas(例如，具有內(nèi)部缺失和/或插入的rnas)有用。因此，本發(fā)明的重組、嵌合型病毒至少包含來自3’utr以及3’na編碼區(qū)的一部分的包裝信號(hào)，并且優(yōu)選包含來自na序列的3’和5’utrs以及3’和5’端部分的包裝信號(hào)。定位包裝信號(hào)的方法是已知的。具體來說，gogetal.,nucl.acidsres.(2007)35:1897-1907發(fā)現(xiàn)了位于節(jié)段的末端區(qū)域的統(tǒng)計(jì)上高度顯著的密碼子簇，其具有低于流感病毒基因組內(nèi)預(yù)期的同義變異，其中存在的具體包裝信號(hào)是已知的。這些區(qū)域的同義突變分析證實(shí)了它們的方法在單核苷酸水平上鑒定病毒基因組中功能上重要的順式作用元件(即包裝信號(hào))的能力。然后，可以利用這些方法容易地確定各種病毒株和亞型的na節(jié)段的包裝信號(hào)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行重組病毒rna節(jié)段的包裝效率的確定。參見，例如dosetal.,virology(2005)341:34-46。通常，用于本發(fā)明的na包裝序列包含來自3’utr的、鄰近na編碼序列的至少19個(gè)核苷酸，優(yōu)選19-30個(gè)核苷酸如19、20...25...30...35個(gè)核苷酸，以及來自5’utr的、鄰近na編碼序列的至少28個(gè)核苷酸，優(yōu)選28-50個(gè)核苷酸，如28、29、30...35...40...45...50個(gè)核苷酸。所述na包裝序列還包含至少來自編碼序列的3’端，且任選來自na節(jié)段的編碼區(qū)的每一端的約145至250個(gè)，優(yōu)選150-200個(gè)核苷酸。因此，例如，流感病毒包裝序列可以包含對(duì)應(yīng)于na病毒rna的3'端的序列，包括對(duì)應(yīng)于na編碼區(qū)的n端序列，例如，a型na病毒rna的3'端的至少150個(gè)核苷酸，如150、151、152、153、154、155...160...165...170...175...180...185...190個(gè)等，并且任選地，對(duì)應(yīng)于na病毒rna的5'端的包裝序列，包括對(duì)應(yīng)于na編碼區(qū)的c端的序列，例如，150、151、152、153、154、155...160...165...170...175...180...185...190個(gè)等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以提供這樣的構(gòu)建物：其包含來自一種豬流感亞型的ha節(jié)段，以及來自另一豬流感亞型的、位于所述ha節(jié)段的3’端以及任選地5’端的na包裝序列。如實(shí)施例中所描述，制備了包含側(cè)翼為h1n1包裝序列的h3n2ha的構(gòu)建物。該具體構(gòu)建物包含h3n2ha序列，其側(cè)翼為來自3’utr的、鄰近h1n1na序列的19個(gè)核苷酸，來自3’na編碼區(qū)的183個(gè)核苷酸和來自5’utr的、鄰近該na序列的28個(gè)核苷酸，以及來自5’na編碼區(qū)的157個(gè)核苷酸。然而，na編碼區(qū)的剩余部分缺失。通常，使用的包裝序列與骨架病毒同源。因此，如果h1n1亞型用作骨架(即，除na節(jié)段的全部或部分外的所有h1n1節(jié)段都存在于重組病毒中)，則將保留來自h1n1的na包裝序列，并用來自不同亞型的ha序列如h3n2ha序列方便地取代h1n1na序列的剩余部分。如有需要，不是缺失，而是可以將na編碼區(qū)突變，以便阻止病毒增殖。可以通過取代合適的核苷酸以產(chǎn)生期望的氨基酸變化，在體外誘變na區(qū)。此類變化可以包括產(chǎn)生單個(gè)氨基酸改變的少至一個(gè)核苷酸的改變，或可以包括幾個(gè)核苷酸的改變。可以通過定點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生突變?？梢岳媚茈s交至親本核苷酸序列(通常為對(duì)應(yīng)于rna序列的cdna)的錯(cuò)配引物，在低于錯(cuò)配雙鏈的解鏈溫度的溫度下產(chǎn)生突變?？梢酝ㄟ^保持引物長(zhǎng)度和堿基組成在相對(duì)窄的限制內(nèi)和通過保持突變堿基位于中心來產(chǎn)生特異性引物。參見，例如，innisetal,(1990)pcrapplications:protocolsforfunctionalgenomics；zollerandsmith,methodsenzymol.(1983)100:468；wu(ed.),meth.inenzymol.vol.217,sandiego:academicpress(1993)；kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.usa,82:488-492。na突變(例如，na編碼序列的、除具有包裝信號(hào)的序列外的全部或部分缺失)優(yōu)選為阻止病毒增殖的突變?？梢源_定減毒流感病毒的復(fù)制效率，例如，通過在馬丁達(dá)比狗腎(mdck)細(xì)胞中測(cè)量噬斑大小、通過測(cè)量多個(gè)生長(zhǎng)周期的病毒滴度或通過從感染的肺組織分離病毒并測(cè)量滴度。例如，本發(fā)明的減毒豬流感病毒允許所述減毒病毒，以0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1的感染復(fù)數(shù)(moi)，或者0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的moi，生長(zhǎng)至低于細(xì)胞培養(yǎng)物中野生型豬流感病毒約1至約100倍,約2至約90倍,約5至約80倍,約20至約80倍,或約40至約80倍,約1至約10倍,約1至約5倍,約1至約4倍,約1至約3倍,約1至約2倍,約3至約15倍的滴度，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍的滴度，所述細(xì)胞培養(yǎng)物為，例如mdck細(xì)胞；人細(xì)胞(例如，perc6——一種來源于用腺病毒5的e1區(qū)轉(zhuǎn)化的人胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞的生產(chǎn)細(xì)胞系)；小鼠；雞(例如，雞胚成纖維細(xì)胞)；大鼠、鳥；或豬(例如，pk(d1)細(xì)胞、pk(15)細(xì)胞、pk13細(xì)胞、nsk細(xì)胞、llc-pk1細(xì)胞、llc-pk1a細(xì)胞、esk-4細(xì)胞、st細(xì)胞、pt-k75細(xì)胞、pk-2a/cl13或sjpl細(xì)胞)?？梢酝ㄟ^在感染后約2至10天、3至7天、3至5天或2、3、5、6、7、8、9、10天或者當(dāng)病毒在mdck細(xì)胞上產(chǎn)生噬斑時(shí)進(jìn)行的來自豬或豬細(xì)胞的上清液的balf的血凝試驗(yàn)確定復(fù)制效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的減毒豬流感病毒的生長(zhǎng)與特定標(biāo)準(zhǔn)或參照如，野生型豬流感病毒a/swine/texas/4199-2/98進(jìn)行比較。減毒性的另一種測(cè)量方法為相對(duì)于如上述的參照野生型病毒株，在無唾液酸酶下培養(yǎng)病毒并測(cè)量滴度。除了ha序列和上述的包裝序列，所述重組、嵌合型流感病毒還包含剩余的病毒節(jié)段——節(jié)段1-3、5、7和8，即編碼pb2(節(jié)段1)、pb1(節(jié)段2)、pa(節(jié)段3)、np(節(jié)段5)、m1和m2(節(jié)段7)、ns1和nep(節(jié)段8)的節(jié)段。這些節(jié)段以及來自多種流感病毒分離物的節(jié)段4(編碼ha)和6(編碼na)的核酸和多肽序列是已知的。代表性的流感序列顯示在本文的圖5-13中。來自多種物種中所見的流感分離物的8個(gè)流感節(jié)段的其他代表性序列在國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)和流感研究數(shù)據(jù)庫(kù)(其網(wǎng)站為fludb.org)中列出。對(duì)于序列比較和流感病毒的遺傳多樣性和進(jìn)化分析的討論，也參見fergusonetal.(2003)nature422:428-433；linetal.(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97,9654-9658；nguyenetal.(2005)j.virol.79:4201-4212；haetal.(2002)emboj.21:865-875；和chanetal.(2004)j.microbiol.immunol.infect.37:135-144。任何這些序列及其變體都可以用來制備所述重組、嵌合型流感病毒。因此，本發(fā)明包括上述序列的變體，所述變體與上述序列展現(xiàn)至少約80-100％(包括這些范圍內(nèi)的任何百分比同一性)的序列同一性，如與其展現(xiàn)81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。上述節(jié)段可以來源于任何不同的豬流感病毒，包括但不限于a/swine/saskatchewan/18789/02、a/swine/colorado/1/77、a/swine/colorado/23619/99、a/swine/coted'armor/3633/84、a/swine/coted'armor/3633/84、a/swine/england/195852/92、a/swine/finistere/2899/82、a/swine/hongkong/10/98、a/swine/hongkong/9/98、a/swine/hongkong/81/78、a/swine/illinois/100084/01、a/swine/illinois/100085a/01、a/swine/illinois/21587/99、a/swine/indiana/1726/88、a/swine/indiana/9k035/99、a/swine/indiana/p12439/00、a/swine/iowa/30、a/swine/iowa/15/30、a/swine/iowa/533/99、a/swine/iowa/569/99、a/swine/iowa/3421/90、a/swine/iowa/8548-1/98、a/swine/iowa/930/01、a/swine/iowa/17672/88、a/swine/italy/1513-1/98、a/swine/italy/1523/98、a/swine/korea/cy02/02、a/swine/minnesota/55551/00、a/swine/minnesota/593/99、a/swine/minnesota/9088-2/98、a/swine/nebraska/1/92、a/swine/nebraska/209/98、a/swine/netherlands/12/85、a/swine/northcarolina/16497/99、a/swine/northcarolina/35922/98、a/swine/northcarolina/93523/01、a/swine/northcarolina/98225/01、a/swine/oedenrode/7c/96、a/swine/ohio/891/01、a/swine/oklahoma/18717/99、a/swine/oklahoma/18089/99、a/swine/ontario/01911-1/99、a/swine/ontario/01911-2/99、a/swine/ontario/41848/97、a/swine/ontario/97、a/swine/quebec/192/81、a/swine/quebec/192/91、a/swine/quebec/5393/91、a/swine/taiwan/7310/70、a/swine/tennessee/24/77、a/swine/texas/4199-2/98、a/swine/wisconsin/125/97、a/swine/wisconsin/136/97、a/swine/wisconsin/163/97、a/swine/wisconsin/164/97、a/swine/wisconsin/166/97、a/swine/wisconsin/168/97、a/swine/wisconsin/235/97、a/swine/wisconsin/238/97、a/swine/wisconsin/457/98、a/swine/wisconsin/458/98、a/swine/wisconsin/464/98和a/swine/wisconsin/14094/99。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，h3n2ha被用于取代h1n1骨架中的h1n1na序列的全部或部分。因此，產(chǎn)生的重組病毒包含兩種組分——has和病毒節(jié)段的剩余部分。參見，圖1?？梢允褂靡阎姆椒◤牟《緍na中分離上述節(jié)段的每一段。例如，可以通過篩選來自感染了病毒的細(xì)胞的cdna和/或基因組文庫(kù)，或通過從已知包含基因的載體得到該基因來獲得核酸。例如，可以從來源于感染個(gè)體的病毒rna的基因組文庫(kù)分離目標(biāo)多核苷酸?？蛇x地，可以從感染哺乳動(dòng)物或從收集自感染個(gè)體的生物樣品(例如，鼻、鼻咽、喉或結(jié)膜分泌物、血液或肛門拭樣)分離流感病毒。一旦得到病毒，即可利用已知的技術(shù)進(jìn)行增殖，諸如mochalovaetal.,virology(2003)313:473-480；linetal.,virology(1997)233:402-410；hardyetal.,virology(1995)211:302-306；hinshawetal.,j.gen.virol.(1978)41:115-127中所描述的技術(shù)。還可以直接從所考慮的流感病毒得到核酸。因此，特定核苷酸序列可以從具有期望序列的載體得到或利用本領(lǐng)域已知的不同寡核苷酸合成技術(shù)完全或部分合成，諸如合適時(shí)使用的定點(diǎn)突變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)。參見，例如，sambrook,同上。一種獲得編碼期望序列的核苷酸序列的方法為，通過使在常規(guī)的自動(dòng)化多核苷酸合成儀中產(chǎn)生的重疊的合成寡核苷酸的互補(bǔ)組退火，然后用合適的dna連接酶連接，并通過pcr擴(kuò)增連接的核苷酸序列。參見，例如，jayaramanetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:4084-4088。另外，寡核苷酸指導(dǎo)的合成(jonesetal.(1986)nature54:75-82)、寡核苷酸指導(dǎo)的已有核苷酸區(qū)的突變(riechmannetal.(1988)nature332:323-327和verhoeyenetal.(1988)science239:1534-1536)以及利用t4dna聚合酶的缺口寡核苷酸的酶促填補(bǔ)(queenetal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:10029-10033)可以用來產(chǎn)生修飾的分子。諸如pcr的擴(kuò)增方法可以用來擴(kuò)增包含不同節(jié)段的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些節(jié)段被逆轉(zhuǎn)錄為cdna并利用rt-pcr進(jìn)行擴(kuò)增。參見，例如，hoffmannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6108-6113。來自每個(gè)節(jié)段的cdna被克隆以提供分離的用于制備所述重組、嵌合型流感病毒的質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，可以使用克隆載體phw2000(hoffmannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6108-6113)。然而，所述節(jié)段可以克隆至任何合適的載體。許多克隆載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且合適克隆載體的挑選是選擇的關(guān)鍵。用于克隆的重組dna載體和它們可以轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括噬菌體λ(大腸桿菌)、pbr322(大腸桿菌)、pacyc177(大腸桿菌)、pkt230(革蘭氏陰性細(xì)菌)、pgv1106(革蘭氏陰性細(xì)菌)、plafr1(革蘭氏陰性細(xì)菌)、pme290(非大腸桿菌的革蘭氏陰性細(xì)菌)、phv14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、pbd9(芽孢桿菌)、pij61(鏈霉菌)、puc6(鏈霉菌)、yip5(酵母菌)、ycp19(酵母菌)和牛乳頭狀瘤病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。通常參見，dnacloning:vols.i&ii,同上；sambrooketal.,同上；b.perbal,同上。然后可以通過任何本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生包含來自多于一種流感亞型的多于一種ha序列的重組、嵌合型減毒流感病毒。優(yōu)選地，反向遺傳學(xué)方法被用來產(chǎn)生重組病毒。反向遺傳學(xué)方法利用從流感病毒感染的細(xì)胞分離的rna聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)錄含有突變的人工流感病毒基因組節(jié)段。利用輔助病毒將合成的rna節(jié)段并入到病毒粒子內(nèi)，然后挑選包含期望改變的病毒。用于流感病毒的反向遺傳學(xué)方法描述于，例如，enamietal.,proc.natl.acad.sci.(1990)87:38023805；enamiandpalese,j.virol.(1991)65:2711-13；luytjes,cell(1989)59:1107-13；fodoretal.,j.virol.(1999)73:9679-9682；gaoetal.,j.virol.(2008)82:6419-6426；quinlivanetal.,j.virol.(2005)79:8431-8439；和美國(guó)專利第5,578,473號(hào)、第6,974,686號(hào)和第7,037,707號(hào)。最近開發(fā)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)完全基于cdna，其允許操作流感病毒基因組。參見，例如paleseet.,proc.natl.acad.sci.usa(1996)93:11354；neumannandkawaoka,adv.virusres.(1999)53:265；neumannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(1999)96:9345；fodoretal.,j.virol.(1999)73:9679。在一種技術(shù)中，在存在純化的np、pb1、pb2和pa蛋白的情況下，于體外從cdna構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄修飾的病毒rna轉(zhuǎn)錄本。然后將產(chǎn)生的合成rnp轉(zhuǎn)染到先前感染了流感輔助病毒的細(xì)胞內(nèi)。該輔助病毒通常具有條件性生長(zhǎng)缺陷，諸如宿主范圍限制或溫度敏感性，其允許隨后挑選轉(zhuǎn)染子病毒。例如，宿主范圍性輔助病毒已被成功用來回收合成的na和pb2基因。參見enami,同上，和subbarao,jvirol(1993)67:7223-28。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，8質(zhì)粒系統(tǒng)被用來產(chǎn)生減毒流感病毒。參見，例如hoffmannetal.,vaccine(2002)20:3165-3170；hoffmannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6108-6113；和美國(guó)專利公開第20040029251號(hào)。在該實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒具有期望流感病毒的8個(gè)節(jié)段，如2個(gè)ha節(jié)段以及編碼聚合酶酸性蛋白(pa)的節(jié)段、編碼聚合酶堿性蛋白1和2(pb1和pb2)的節(jié)段、編碼基質(zhì)蛋白1和2(m1和m2)的基質(zhì)(m)節(jié)段、編碼核蛋白(np)的節(jié)段和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1和2(ns1和nep)的非結(jié)構(gòu)(ns)節(jié)段，其被共轉(zhuǎn)染至合適的細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生本文所述的重組、嵌合型病毒。還參見美國(guó)專利第6,951,754號(hào)，其描述了用于利用poli-polii系統(tǒng)產(chǎn)生減毒流感病毒的8質(zhì)粒雙啟動(dòng)子反向遺傳學(xué)系統(tǒng)?；顪p毒病毒疫苗制劑的制備利用常規(guī)方法完成，包括在允許病毒生長(zhǎng)至足夠進(jìn)一步使用的滴度的任何基質(zhì)中培養(yǎng)所述重組、嵌合型病毒。通常，病毒在細(xì)胞、含胚卵中和/或動(dòng)物體內(nèi)增殖，然后純化。通常，利用已知的技術(shù)將流感病毒培養(yǎng)在雞胚胎或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如馬丁達(dá)比狗腎(mdck)細(xì)胞、馬丁達(dá)比牛腎(mdbk)細(xì)胞、豬細(xì)胞或非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞。參見，例如mochalovaetal.,virology(2003)313:473-480；linetal.,virology(1997)233:402-410；hardyetal.,virology(1995)211:302-306；hinshawetal.,j.gen.virol.(1978)41:115-127。代表性的豬細(xì)胞包括豬腎細(xì)胞系、豬睪丸細(xì)胞系和豬肺細(xì)胞系，諸如但不限于pk(d1)細(xì)胞、pk(15)細(xì)胞、pk13細(xì)胞、sjpl細(xì)胞、nsk細(xì)胞、llc-pk1細(xì)胞、llc-pk1a細(xì)胞、esk-4細(xì)胞、st細(xì)胞、pt-k75細(xì)胞和pk-2a/cl13細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述重組、嵌合型豬流感病毒培養(yǎng)在雞細(xì)胞，例如，來源于例如6-14天齡的含胚卵的雞胚成纖維細(xì)胞中增殖。在其他的實(shí)施方案中，幼含胚卵或未成熟的含胚卵可以用來使本發(fā)明的病毒增殖。未成熟的含胚卵包括小于10天齡卵的卵。未成熟的含胚卵還可以為由于改變生長(zhǎng)條件而人為地模擬未成熟的卵的卵，例如，改變孵化溫度；藥物處理；或任何其他導(dǎo)致產(chǎn)生發(fā)育遲延的卵的改變?？梢栽诤呗训牟煌恢?，例如，尿囊腔中使豬流感病毒增殖。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的減毒豬流感病毒在任何基質(zhì)中增殖，所述基質(zhì)允許該病毒生長(zhǎng)至與測(cè)定的野生型豬流感病毒株的滴度相當(dāng)?shù)牡味取?yōu)選地，在唾液酸酶存在下培養(yǎng)病毒體，因?yàn)樗鲋亟M、嵌合型病毒中的na節(jié)段存在缺陷。優(yōu)選地，在配制疫苗前高度純化病毒。通常，純化過程將引起細(xì)胞dna、其他細(xì)胞成分和外源因子的大量去除。還可以使用大量降解或變形dna的方案。參見，例如，mizrahi,ed.,viralvaccines,wiley-liss,newyork(1990)。純化方法為本領(lǐng)域已知且可以包括以下一種或多種，例如，梯度離心、超速離心、區(qū)帶超速離心、連續(xù)流超速離心和層析法，如離子交換層析、體積排阻層析和液相親和層析、聚乙二醇或硫酸銨沉淀。b.抗病毒組合物可以將重組、嵌合型流感病毒以及隨后滅活的重組、嵌合型流感病毒配制在組合物中，用于遞送至個(gè)體以抑制感染或促進(jìn)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)。因此，可以配制活的重組豬流感病毒疫苗或免疫原性制劑或滅活的重組豬流感病毒疫苗或免疫原性制劑?；畹囊呙缁蛎庖咴灾苿┛梢允莾?yōu)選的，因?yàn)樵谒拗黧w內(nèi)的繁殖引起與天然感染中所發(fā)生的類似的類型和幅度的延長(zhǎng)刺激，并因此給予大量的、長(zhǎng)期的免疫力。此類活的重組豬流感病毒疫苗制劑和免疫原性制劑的產(chǎn)生可以利用常規(guī)方法完成，包括如上所述的增殖。當(dāng)配制為活病毒疫苗時(shí)，可以使用約102至108的范圍，每劑量應(yīng)當(dāng)優(yōu)選使用約103至107，更優(yōu)選104pfu至約5x106，且最優(yōu)選104至107pfu?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)“殺死”減毒病毒來制備滅活的疫苗制劑。滅活的疫苗為“死的”，意指它們的感染力被破壞。理想地，在不影響其免疫原性的情況下破壞病毒的感染力。為了制備滅活的疫苗，按如上所述培養(yǎng)和純化所述減毒病毒。然后利用本領(lǐng)域已知的幾種方法中的一種滅活純化的病毒。此類方法包括化學(xué)或物理方法。滅活流感病毒的化學(xué)方法包括用有效量的一種或多種下述試劑處理病毒：洗滌劑、甲醛、福爾馬林、β-丙內(nèi)酯或uv光。病毒滅活的其他方法為本領(lǐng)域已知，例如二乙胺、乙?；颈せ颚谜丈?。參見，例如美國(guó)專利第6,635,246號(hào)；第5,891,705號(hào)；第5,106,619號(hào)和第4,693,981號(hào)。本發(fā)明的組合物可以包含非流感抗原或抗原組合或與非流感抗原或抗原組合共給予，如與組合型流感疫苗共給予。制備此類制劑的方法描述于，例如，remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pennsylvania,18edition,1990。可以制備本發(fā)明的組合物用于經(jīng)粘膜遞送、腸胃外遞送，例如，作為液體溶液或懸浮液的注射劑。還可以制備適合于注射前溶解于或懸浮于液體介質(zhì)的固體形式。還可以將制劑乳化或?qū)⒒钚猿煞址庋b在脂質(zhì)體介質(zhì)內(nèi)。有活性的免疫原性成分通常與兼容的藥學(xué)介質(zhì)混合，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及以上的組合。另外，若需要，所述介質(zhì)可以含有微量的輔助性物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑和ph緩沖劑。如果用來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，還可以將其他增加組合物效力的佐劑添加到制劑中。佐劑可以包括例如，胞壁酰二肽、阿夫立定(avridine)、氫氧化鋁、二甲基雙十八烷基溴化銨(dda)、油、水包油乳劑、皂苷、細(xì)胞因子及本領(lǐng)域已知的其他物質(zhì)。為了增加疫苗的免疫原性，還可以使用載體。合適的載體包括大的、緩慢代謝的大分子如蛋白，包括血清白蛋白、鑰孔蟲戚血藍(lán)素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他蛋白；多糖，如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等；聚合氨基酸如聚谷氨酸、聚賴氨酸等；氨基酸共聚物；以及滅活的病毒粒子。此外，可以以中性或鹽形式將流感分子配制到組合物中。藥學(xué)可接受的鹽包括酸酸加成鹽(以活性多肽的游離氨基形成)，并且所述酸加成鹽以無機(jī)酸或有機(jī)酸形成，所述無機(jī)酸為，例如，鹽酸或磷酸，所述有機(jī)酸為，諸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由游離羧基形成的鹽還可以來源于無機(jī)堿，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機(jī)堿，諸如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)等。制劑含有“治療有效量”的活性成分，即，能在給予所述組合物的個(gè)體體內(nèi)獲得期望的反應(yīng)的量。在流感感染的治療和預(yù)防中，例如，“治療有效量”優(yōu)選為預(yù)防、減少或改善流感癥狀的量。所需的精確劑量存在差異，這取決于治療個(gè)體；治療個(gè)體的年齡和一般狀況；個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；期望的防護(hù)程度；治療病癥的嚴(yán)重程度；所選的具體病毒制劑及其給藥方式，以及其他因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定合適的有效量。因此，“治療有效量”落入相對(duì)廣的范圍，其可以通過常規(guī)試驗(yàn)確定。所述重組、嵌合型流感病毒通常為所述組合物的約1％至約95％(w/w)，或者根據(jù)需要甚至更高或更低。適合其它給藥方式的其他制劑包括栓劑，并且在一些情形下，包括氣霧劑、鼻內(nèi)制劑、口服制劑和緩釋制劑。對(duì)于栓劑，介質(zhì)組合物包括常規(guī)的粘合劑和載體，如聚烷基二醇(polyalkalineglycol)或甘油三酯。此類栓劑可以由含有約0.5％至約10％(w/w)，優(yōu)選約1％至約2％的活性成分的混合物構(gòu)成?？诜橘|(zhì)包括常用的賦形劑，例如，藥用等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉纖維素、碳酸鎂等。這些口服疫苗組合物可以采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉末形式，且含有約10％至約95％，優(yōu)選約25％至約70％的活性成分。鼻內(nèi)制劑通常包含不造成鼻粘膜刺激，也不顯著干擾纖毛功能的介質(zhì)。本發(fā)明可以采用稀釋劑如水、鹽水或其他已知的物質(zhì)。鼻用制劑還可以含有防腐劑，諸如但不限于氯丁醇和苯扎氯銨。可以存在表面活性劑以增加鼻粘膜對(duì)個(gè)體蛋白的吸收。通過將蛋白并入載體或介質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生受控或緩慢釋放的制劑，所述載體或介質(zhì)為，諸如脂質(zhì)體、不可吸收的非滲透性的聚合物如乙烯醋酸乙烯共聚物和hytrel共聚物、可膨脹的聚合物如水凝膠、可吸收的聚合物如膠原，以及某些多元酸或多元酯如用來產(chǎn)生可吸收縫線的那些、聚磷腈、藻脘酸鹽、微粒、明膠納米球、殼聚糖納米粒子等。還可以利用植入的本領(lǐng)域熟知的小型泵遞送所述流感病毒。c.給藥通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者?？梢酝ㄟ^以下方式完成直接遞送：腸胃外注射(例如，皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)注射或注射至組織間隙)，或經(jīng)粘膜給藥，如通過氣管內(nèi)、直腸、經(jīng)口(例如，片劑、噴霧)、陰道、局部、經(jīng)皮(transdermal)(參見例如wo99/27961)或經(jīng)皮膚(transcutaneous)(參見例如wo02/074244和wo02/064162)、鼻內(nèi)(參見例如wo03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜給藥。還可以通過直接轉(zhuǎn)移至皮膚表面局部給予免疫原性組合物?？梢圆焕萌魏窝b置，或通過利用繃帶或繃帶樣裝置使裸露的皮膚接觸所述免疫原性組合物(參見，例如，美國(guó)專利第6,348,450號(hào))來完成局部給藥。優(yōu)選的給藥模式為腸胃外、粘膜或粘膜和腸胃外免疫的組合。甚至更優(yōu)選的給藥模式為以1-3周的間隔，經(jīng)腸胃外、粘膜或粘膜和腸胃外免疫的組合總共給予1-2次接種。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于經(jīng)口遞送、肌內(nèi)遞送以及經(jīng)口和肌內(nèi)遞送的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療流感病毒感染的方法包括經(jīng)粘膜將包含本發(fā)明的流感病毒的第一免疫原性組合物給予有需要的個(gè)體，然后腸道外給予治療有效量的包含本發(fā)明的流感病毒的第二免疫原性組合物。所述免疫原性組合物可以用來引發(fā)全身和/或粘膜免疫，優(yōu)選引發(fā)增強(qiáng)的全身和/或粘膜免疫。優(yōu)選地，免疫反應(yīng)特征為誘導(dǎo)血清igg和/或iga免疫反應(yīng)。在包括共給予的任何方法中，可以以任何次序遞送不同的組合物。因此，在包括遞送多種不同組合物或分子的實(shí)施方案中，無需在其他免疫原性物質(zhì)前遞送所述流感病毒。例如，引發(fā)步驟可以包括遞送一種或多種多肽，并且加強(qiáng)可以包括遞送一種或多種減毒的流感病毒。可以在多次給予流感病毒后多次給予其他物質(zhì)?？梢砸匀魏未涡蜻M(jìn)行給藥。因此，可以將流感病毒和其他免疫原性物質(zhì)的任何組合用來引發(fā)免疫反應(yīng)。d.劑量方案可以按照單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行劑量處理。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可以通過相同的或不同的途徑給予多種劑量，例如腸胃外初次免疫和粘膜加強(qiáng)免疫、粘膜初次免疫和腸胃外增強(qiáng)等。優(yōu)選的劑量方案增加抗體反應(yīng)的親合力，產(chǎn)生具有中和特征的抗體。體外中和測(cè)定可以用來測(cè)試中和抗體(參見例如asanakaetal.,j.ofvirol.(2005)102:10327；wobusetal.,plosbiology(2004)2；e432；和dubektietal.,j.med.virol.(2002)66:400)。e.確定免疫反應(yīng)效力的測(cè)試評(píng)估治療性治療效力的一種方法包括在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測(cè)感染。評(píng)估預(yù)防性治療效力的一種方法包括在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測(cè)針對(duì)該組合物中的抗原的免疫反應(yīng)。檢測(cè)治療性治療效力的另一種方法包括在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測(cè)感染。檢測(cè)預(yù)防性治療效力的一種方法包括在給予本發(fā)明組合物后，監(jiān)測(cè)針對(duì)該組合物中的抗原的全身性(如監(jiān)測(cè)igg1和igg2a的產(chǎn)生水平)和粘膜性(如監(jiān)測(cè)iga的產(chǎn)生水平)免疫反應(yīng)。通常，在免疫后但在攻擊前確定血清特異性抗體反應(yīng)，然而，在免疫和攻擊后確定粘膜特異性抗體反應(yīng)?？梢杂谒拗鹘o藥前，在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中評(píng)估本發(fā)明的免疫原性組合物?？梢酝ㄟ^用所述免疫原性組合物攻擊感染的動(dòng)物模型，例如豚鼠或小鼠或豬，在體內(nèi)確定本發(fā)明的免疫原性組合物的效力。所述免疫原性組合物可以來源于與攻擊株相同的或不同的病毒株。優(yōu)選的免疫原性組合物來源于與攻擊株相同的病毒株。特別有用的小鼠模型包括這樣的模型：其中在腹膜內(nèi)免疫后進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊或鼻內(nèi)攻擊。體內(nèi)效力小鼠模型包括但不限于利用豬病毒株的鼠感染模型和鼠病模型，所述鼠病模型為利用小鼠適應(yīng)性病毒株如對(duì)小鼠特別毒的病毒株的鼠模型。所述免疫反應(yīng)可以為th1免疫反應(yīng)和th2反應(yīng)中的一種或兩種。所述免疫反應(yīng)可以為改善的或增強(qiáng)的或改變的免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)可以為全身免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)為增強(qiáng)的全身和/或粘膜反應(yīng)。增強(qiáng)的全身和/或粘膜免疫反映在增強(qiáng)的th1和/或th2免疫反應(yīng)當(dāng)中。優(yōu)選地，增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括igg1和/或igg2a和/或iga產(chǎn)生的增加。優(yōu)選地，粘膜免疫反應(yīng)為th2免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，粘膜免疫反應(yīng)包括iga產(chǎn)生的增加?；罨膖h2細(xì)胞增加抗體產(chǎn)生，并因此對(duì)響應(yīng)細(xì)胞外感染具有價(jià)值?；罨膖h2細(xì)胞可以分泌il-4、il-5、il-6和il-10中的一種或多種。th2免疫反應(yīng)可以引起igg1、ige、iga和用于未來防護(hù)的記憶b細(xì)胞的產(chǎn)生。th2免疫反應(yīng)可以包括以下中的一種或多種：與th2免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子(如il-4、il-5、il-6和il-10)中的一種或多種的增加，或igg1、ige、iga和記憶b細(xì)胞產(chǎn)生的增加。優(yōu)選地，增強(qiáng)的th2免疫反應(yīng)包括igg1產(chǎn)生的增加。th1免疫反應(yīng)可以包括以下中的一種或多種：ctls的增加、與th1免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子(如il-2、ifnγ和tnfβ)中的一種或多種的增加、活化的巨噬細(xì)胞的增加、nk活性的增加，或igg2a產(chǎn)生的增加。優(yōu)選地，增強(qiáng)的th1免疫反應(yīng)包括igg2a產(chǎn)生的增加。本發(fā)明免疫原性組合物，尤其是本發(fā)明的包含一種或多種抗原的免疫原性組合物可以單獨(dú)或與其他抗原組合使用，任選與能引發(fā)th1和/或th2反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑組合使用。為了有效處理感染，本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。該免疫反應(yīng)優(yōu)選誘導(dǎo)持久性(例如，中和)抗體以及暴露于一種或多種傳染性抗原后能快速響應(yīng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。例如，患者血液樣品中的中和抗體證據(jù)被認(rèn)為是防護(hù)的替代參量，因?yàn)樗鼈兊男纬蓪?duì)tbe感染的病毒消除至關(guān)重要(參見kaiserandholzmann,infection28；78-84)。f.試劑盒本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明組合物的容器的試劑盒。組合物可以為固體形式、液體形式或可以為凍干的。組合物的合適容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和試管?？梢杂啥喾N材料制備容器，包括玻璃或塑料。容器可以具有無菌進(jìn)入口(例如，所述容器可以為靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針刺破的塞子的小瓶)。所述試劑盒還可以包含第二容器，其含有藥學(xué)可接受的緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。其還可以含有對(duì)最終用戶有用的其他材料，包括其他藥學(xué)可接受的配制溶液如緩沖液、稀釋劑、過濾器、針和注射器或其他遞送裝置。所述試劑盒還可以包含含佐劑的第三組分。對(duì)于粘膜途徑，可以包裝所述組合物用于鼻內(nèi)給藥，如通過鼻用噴霧、鼻用滴劑、凝膠或粉末。參見，例如almeida&alpar,j.drugtargeting(1996)3:455-467；agarwal&mishra,indianj.exp.biol.(1999)37:6-16或在本領(lǐng)域熟知的吸入裝置內(nèi)給藥。所述試劑盒還可以包含包裝說明書，其含有誘導(dǎo)免疫或治療感染的方法的書面指導(dǎo)。所述包裝說明書可以為還未批準(zhǔn)的包裝說明書草稿，或可以為食品和藥物管理局(fda)或其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的包裝說明書。本發(fā)明還提供已裝滿了本發(fā)明的免疫原性組合物的遞送裝置。3.實(shí)驗(yàn)以下為執(zhí)行本發(fā)明的具體實(shí)施方案的實(shí)施例。提供實(shí)施例僅用于說明目的，并且不試圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。已進(jìn)行了努力來確保所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的精確性，但無疑會(huì)允許存在一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。實(shí)施例1包含h1和h3ha的重組病毒的產(chǎn)生具有8個(gè)節(jié)段化的基因組的重組、嵌合型a型流感病毒按如下所詳述制備。該病毒包含豬h1n1病毒的7個(gè)節(jié)段，其na節(jié)段的大部分被側(cè)翼為na包裝序列的h3ha編碼區(qū)序列取代。因此，該病毒包含來自兩種不同類型的豬流感的has——h1ha和h3ha。因?yàn)閚a為病毒增殖所必需，通過使病毒在唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)存在下生長(zhǎng)來提供na的功能。具體來說，為了產(chǎn)生攜帶兩種不同ha分子的重組豬流感病毒，用來自h3n2a型流感病毒——a/swine/texas/4199-2/98(本文中稱為“sivtx98”)的h3ha節(jié)段取代了h1n1豬流感病毒——a/swine/saskatchewan/18789/02(本文中稱為“sivsk02”，獲自prairiediagnosticservices,加拿大薩斯喀徹溫大學(xué)西部獸醫(yī)學(xué)院(westerncollegeofveterinarymedicine))(圖1a)的na節(jié)段。來源于siv-tx98的h3ha開放閱讀框(orf)側(cè)翼為na包裝信號(hào)，該na包裝信號(hào)包含來自siv-sk02(h1n1)病毒株的3’端的202nt(來自3’utr的19nt和來自3’na編碼區(qū)的183nt)，和5’端的185nt(來自5’utr的28nt和來自5’na編碼區(qū)的157nt)(圖1b)。編碼側(cè)翼為na包裝信號(hào)的h3ha的質(zhì)粒phw-siv-na-h3ha通過修飾原始質(zhì)粒phw-siv/sk-na構(gòu)建。簡(jiǎn)單地說，利用phw-siv/sk-na作為模板，并采用以下引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增3’和5’端的na節(jié)段特異性包裝信號(hào)(分別為202nt和185nt)：擴(kuò)增3’na包裝信號(hào)——采用5'-taatacgactcactataggg-3'(seqidno:21)和5’-gtcatttccgggaagtttttgcacccaagtattgttttcgtag-3’(seqidno:22)；擴(kuò)增5’na包裝信號(hào)——采用5’-gctgaaatcaggatacaaagattgaggccttgcttctgggttg-3’(seqidno:23)和5’-acaggtgtccgtgtcgcg-3’(seqidno:24)。利用phw-tx98ha作為模板，并采用5’-ctacgaaaacaatacttgggtgcaaaaacttcccggaaatgac-3’(seqidno:25)和5’-caacccagaagcaaggcctcaatctttgtatcctgatttcagc-3’(seqidno:26)作為引物，通過pcr擴(kuò)增來自siv/tx98的h3ha胞外域(不包括信號(hào)肽序列)。通過重疊pcr將3段pcr產(chǎn)物連接在一起。最終，通過naei/nhei消化該pcr產(chǎn)物，并取代phw-siv/sk-na相應(yīng)的節(jié)段。對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行dna測(cè)序以確保在重疊pcrs期間未引入另外的突變。將該構(gòu)建物插入克隆載體phw2000(hoffmannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6108-6113)來產(chǎn)生質(zhì)粒606?？寺≥d體phw2000含有225bp的人poli啟動(dòng)子序列和33bp的鼠終止子序列，它們被兩個(gè)bsmb1位點(diǎn)隔開。所述poli啟動(dòng)子和終止子元件側(cè)翼為截短了的人巨細(xì)胞病毒的極早期(immediate-early)啟動(dòng)子和編碼牛生長(zhǎng)激素的基因。在10mu/ml的霍亂弧菌唾液酸酶存在下，將phw2000載體與質(zhì)粒606和包含來自siv-sk02病毒株(如masicetal.,j.gen.virol.(2009)90:375-385中所描述)的pb2、pb1、pa、ha、np、m和ns節(jié)段的7種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，這引起稱為“siv/sk-606或siv-606”的重組、嵌合型病毒的成功回收。利用8質(zhì)粒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)回收該siv/h1h3siv突變病毒，所述系統(tǒng)描述于hoffmannetal.,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6108-6113中。簡(jiǎn)單地說，在6孔盤中以相同的密度(2.5×105細(xì)胞/孔)共培養(yǎng)293t和mdck細(xì)胞，并于37℃、5％co2下維持在含有10％fbs的dmem中24hrs。轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，用新鮮opti-mem(invitrogen)替換含有fbs的培養(yǎng)基。為了回收siv/sk-606，通過transit-lt1轉(zhuǎn)染試劑(mirus,madison,wisconsin)用8種質(zhì)粒構(gòu)建物(phw-siv/sk-pb2、phw-siv/sk-pb1、phw-siv/sk-pa、phw-siv/sk-ha、phw-siv/sk-np、phw-siv-na-h3ha、phw-siv/sk-m和phw-siv/sk-ns)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6小時(shí)后，用1ml的新鮮opti-mem替換轉(zhuǎn)染混合物。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將含0.4％bsa的1mlopti-mem、2μg/ml的tpck處理的胰蛋白酶和10mu/ml霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶(sigma,n6514)加入至轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后96小時(shí)收集上清液。第三次連續(xù)傳代后觀察mdck細(xì)胞上的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)，并通過血凝試驗(yàn)確認(rèn)病毒存在。實(shí)施例2siv/sk-606的表征為了確認(rèn)該重組病毒siv/sk-606在其基因組中具有h1和h3ha節(jié)段，從純化的病毒體分離出了病毒rna。簡(jiǎn)單地說，通過超速離心收集組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的病毒，并使其經(jīng)歷蔗糖梯度離心(masicetal.,j.gen.virol.(2009)90:375-385)。對(duì)于rna純化，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)用trizol(invitrogen)處理純化的病毒體。利用特異性擴(kuò)增病毒rnas的uni12引物(hoffmanetal.,arch.virol.(2001)146:2275-2289)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。通過利用h1特異性引物(fw5'tggccaaaccatgagacaac3'(seqidno:27)和bw5'ggcgttattcctcagttgtg3'(seqidno:28))以及h3has特異性引物(fw5’cgcaatcgcaggtttcatag3’(seqidno:29)和bw5’caacccagaagcaaggcctcaatctttgtatcctgatttcagc3’(seqidno:30))進(jìn)行pcr。雖然代表h1ha節(jié)段的pcr產(chǎn)物僅在sk02和siv-606基因組中檢測(cè)到，但在tx98和siv-606病毒rna提取物中觀察到代表h3ha節(jié)段的pcr條帶。這些數(shù)據(jù)證明siv-606的基因組包含h1和h3ha節(jié)段。為了檢測(cè)是否兩種has都得到表達(dá)，利用h1ha、h3ha和m1的特異性抗體對(duì)感染病毒的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western印跡分析。簡(jiǎn)單地說，用野生型siv/sk02、野生型siv/tx98或siv-606以0.01的moi感染mdck細(xì)胞。感染后48小時(shí)，制備細(xì)胞裂解物，并利用h1ha(抗ha(a/california/06/2009)(h1n1)單克隆抗體,eenzyme(maryland,usa)、h3ha(抗多血凝素(h3n2)抗體,兔igg,eenzyme(maryland,usa)和m1(shinetal.,jgenvirol(2007)88:942-950)的特異性抗體進(jìn)行western印跡分析。在所有感染病毒的細(xì)胞中都檢測(cè)到m1蛋白，然而，僅在感染sk02和siv-606的細(xì)胞中見到h1ha，并且在tx98和siv-606樣品中見到h3ha?？傊@些數(shù)據(jù)證明h3節(jié)段被整合到siv-606的基因組中，并且兩種has都得到表達(dá)。為了觀察重組病毒的形態(tài)，進(jìn)行了負(fù)染透射電子顯微鏡觀察。大多數(shù)的病毒體展現(xiàn)為約100nm直徑的球形包膜的粒子，其類似野生型病毒的形態(tài)。在mdck細(xì)胞中研究了siv-606的復(fù)制潛力。在唾液酸酶存在下，siv-606形成與野生型病毒大小相似的噬斑。相反，siv-606在無唾液酸酶下不能生長(zhǎng)，表明重組病毒的復(fù)制依賴于唾液酸酶。還測(cè)定了siv-606的生長(zhǎng)潛力和動(dòng)力。如圖2所示，siv-606在24h.p.i.時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平，與野生型病毒一樣。siv-606生長(zhǎng)至7x106pfu/ml的滴度，比野生型病毒低約1log。這些結(jié)果表明盡管siv-606具有稍低的滴度，其在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)至相對(duì)高的滴度，這使得病毒能夠增殖。實(shí)施例3siv-606在豬內(nèi)的致病性在豬體內(nèi)評(píng)估了siv-606的致病性。35只4周齡的siv陰性豬被隨機(jī)分成7組，每組5只豬。用含1x105或1x106pfu/mlsk02wt、siv-606或tx98的4mlmem經(jīng)氣管內(nèi)感染這些豬。對(duì)照組內(nèi)的動(dòng)物僅用培養(yǎng)基模擬感染(表1)。每天監(jiān)測(cè)直腸溫度。感染后第5天，將豬安樂死，并進(jìn)行尸體剖檢。如圖3a-3c中所示，感染野生型病毒的豬在感染后第1天具有增加的體溫，并且體溫在隨后逐漸降低。然而，感染了siv-606的豬相比對(duì)照組未顯示升高的體溫。尸體剖檢時(shí)，記錄肉眼可見的肺組織病變。模擬的、siv-606高劑量和低劑量感染的豬未顯示任何典型的肉眼可見的肺組織病變。相比之下，在感染了高和低劑量sk02和tx98的豬的心葉內(nèi)觀察到特征為紫色至紫紅色實(shí)變區(qū)的總病變。與這些結(jié)果一致，可從感染了低和高劑量sk02的所有動(dòng)物的肺組織重新獲得中值滴度分別為2.4x104pfu/ml和2.6x104pfu/ml的sk02野生型病毒。類似地，可從低和高劑量組中感染了tx98病毒的所有豬的肺組織分離中值滴度分別為1x104pfu/ml和3.4x104pfu/ml的野生型病毒。然而，僅從低劑量組的1只豬和高劑量組的3只豬檢測(cè)到非常低滴度(中值滴度分別為0和20pfu/ml)的siv-606病毒。這些結(jié)果證明siv-606病毒在豬體內(nèi)為高度減毒的，并因此可以用作活的、減毒的豬流感疫苗。表1.病毒感染的豬分配、劑量和途徑實(shí)施例4豬體內(nèi)siv-606的防護(hù)效應(yīng)為了確定siv-606是否具有免疫原性，以及是否能提供針對(duì)siv感染的防護(hù)，在豬體內(nèi)進(jìn)行了以下接種和病毒攻擊研究。23只h1n1和h3n2血清陰性豬被隨機(jī)分成5組(n＝5,除了第5組中n＝3外)(表2)。兩組豬被給予mem，且兩組豬被經(jīng)氣管內(nèi)接種4×106pfu的siv-606病毒。豬在第21天接受第二次接種。第二次接種后10天(第31天)，用siv/sk02或siv/tx98經(jīng)氣管內(nèi)對(duì)豬進(jìn)行攻擊，并在感染后第5天將其安樂死。于第一次接種前，在第一次接種后21天和第二次接種后10天(病毒攻擊前)收集血清。在第0天、第21天和第31天測(cè)量抗原特異性血清igg和鼻iga。第一次接種后，血清中的siv/sk02特異性igg顯著增加，并在第31天測(cè)量到第二劑量的siv-606加強(qiáng)了igg反應(yīng)(圖14a)。針對(duì)siv/tx98或異源h1n1halifax210病毒株(在2009年流行病期間分離)的血清igg，在一次接種后略微增加，且在第二次接種后顯著增加(圖14b和14c)。為了評(píng)估上呼吸道和下呼吸道的粘膜表面處h1n1和h3n2流感病毒的特異性iga抗體的存在，從所有組的豬收集了鼻拭樣和支氣管肺泡灌洗液(balf)樣品，并通過elisa測(cè)試。siv-606的第一次接種誘導(dǎo)鼻分泌物中中等的iga水平，且第二次接種加強(qiáng)了siv/sk02、siv/tx98和halifax210的特異性iga誘導(dǎo)(圖15a、15b和15c)。類似地，balf中的iga滴度在第一次接種后維持低水平，并在第二次接種后顯著增高(圖16a、16b和16c)。在第31天病毒攻擊后，每天測(cè)量直腸溫度，測(cè)量5天直至尸體剖檢。感染后第一天，用mem接種并用siv/sk02攻擊的豬開始發(fā)燒，平均直腸溫度為40.9℃。相比之下，用siv-606接種并用siv/sk02攻擊的豬在這5天內(nèi)具有39.1℃至39.6℃的正常體溫(圖17a)。類似地，接種了mem并用tx98攻擊的豬的體溫在感染后第1天升至40.1℃，然后在第二天降至39.6℃，并在感染后第5天回復(fù)至39.3℃。在接種了siv-606并用tx98攻擊的豬體內(nèi)未見到發(fā)燒(圖17b)。在感染后5天期間，該組的體溫在39.2℃至39.7℃間波動(dòng)。尸體剖檢時(shí)，檢測(cè)了siv誘導(dǎo)的總肺組織病變，并通過病變與總肺面積相比所占的表面百分比打分(圖18a)。未接種組并用siv/sk02或siv/tx98攻擊的所有豬都顯示siv典型總病變，其顯示為主要在尖葉和心葉中所見的深紫色實(shí)變區(qū)的清晰界線。這兩組的平均分值分別為8.6和14.6。相比之下，接種了siv-606并用siv/sk02或siv/tx98攻擊的豬的肺沒有總肺組織病變。為了測(cè)量肺內(nèi)的病毒荷載(圖18b)，在尸體剖檢時(shí)收集了來自右尖葉、心葉和膈葉的組織。在來自未接種并用siv/sk02攻擊的組內(nèi)的所有豬的肺組織中均檢測(cè)到病毒(平均病毒滴度為1.90×104pfu/克)。在未接種并用siv/tx98攻擊的組內(nèi)，僅從1只豬分離到病毒。在接種了siv-606并用siv攻擊的豬的肺組織中未檢測(cè)到病毒。利用尸體剖檢中采自右尖葉、心葉和膈葉的肺組織樣品檢測(cè)了組織病理學(xué)病變。如圖19b和19d所示，在未接種并用病毒攻擊的組的肺組織中觀察到病理學(xué)病變。組織病理學(xué)病變包括由于細(xì)支氣管上皮壞死引起的支氣管上皮減少、彌補(bǔ)細(xì)支氣管上皮壞死的細(xì)支氣管上皮肥大和增生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)穿過粘膜并進(jìn)入細(xì)支氣管內(nèi)腔、細(xì)支氣管周和血管周的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)增厚和細(xì)支氣管相關(guān)的淋巴組織的增生。相比之下，在接種siv-606并受到攻擊的組的肺組織中未觀察到組織病理學(xué)變化(圖19c和19e)。兩個(gè)siv-606接種的組都維持健康的細(xì)支氣管上皮和蜂窩結(jié)構(gòu)，其具有輕微的間質(zhì)增厚，這類似于未接種其未攻擊的組中所示的組織(圖19a)。表2.病毒攻擊的豬分配因此，本文公開了重組、嵌合型流感病毒，以及用于治療和預(yù)防流感的組合物和方法。盡管相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解可以在不脫離所附權(quán)利要求確定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行明顯的改變。序列表<110>薩斯喀徹溫大學(xué)<120>重組豬流感病毒及其應(yīng)用<130>08922540wo<140>未知<141>2012-07-31<150>us61/514,156<151>2011-08-02<160>30<170>patentinversion3.5<210>1<211>1701<212>dna<213>a型流感病毒<220><221>misc_feature<222>(1)..(1701)<223>圖5a:a型流感病毒(a/swine/saskatchewan/18789/02(h1n1))血凝素(ha)基因(genbank:ay619961.1)<400>1atggaagcaaaactgttcgtactattctgtacattcactgtactgaaagctgacactatc60tgtgtgggctaccatgcaaacaactctacaaacactgttgatacagtactggaaaagaac120ataactgtgactcactcagtgaatttgctcgaagacagccataatgggaagctctgcagt180ctgaatgggatagctcctttacaattggggaagtgtaatgtagcgggatggctcctgggc240aacccagaatgtgaccttctactcactgcaaactcatggtcctatataatagagacgtcc300aattcagagaacgggacatgctatcctggtgagttcatagattatgaggaattaagggag360caattgagttcggtttcttcatttgaaaagtttgaaattttccccaaggcaaactcatgg420ccaaaccatgagacaactaaaggtgttacagctgcctgctcttactctggggccagcagt480ttttaccgaaatttgctgtggataacaaagaagggaacttcatatccaaaactcagcaag540tcatacacgaacaataaagggaaagaagtgcttgtgctctggggagtgcaccatcctccg600accaccagtgatcaacagagtatataccagaacactgatgcatacgtctcagttgggtca660tcaaagtacaaccgaagattcactccagagatagcagctagacccaaagttagaggacag720gcaggcaggatgaactattattggacactactagaccaaggagacaccataacatttgag780gccactgggaatctgatagcaccatggtatgccttcgcactaaataaggggtcagactca840gggattataacatcagatgctccagttcacaattgcgacacaaggtgccaaacccctcac900ggggcgttgaacagtagcctcccttttcagaatgtgcatcctatcaccattggagaatgt960cccaaatatgtcaagagcaccaagctaagaatggcaacaggactaagaaatgtcccatcc1020attcaatccagaggactgtttggagcaattgccggattcattgagggaggatggacaggc1080atgatagatgggtggtatgggtaccaccaccagaatgagcaaggatcagggtatgccgct1140gatcagaaaagcacacagaatgcaatcgacggaataactaacaaggtgaattcggtaatt1200gagaaaatgaacactcaattcactgcagtgggtaaggaattcaacaatctagagaggaga1260attgaaaatctgaataggaaagtcgatgatgggttcctggatgtttggacatacaatgct1320gaactgctcgttctactggagaatgaaagaactctggactttcatgattccaatgtgagg1380aatttgtatgaaaaggtcagatcacaactgaggaataacgccaaagaacttggaaatggt1440tgctttgagttctatcacaagtgtgatgatgaatgcatggaaagtgtgaagaacggcaca1500tatgactatcccaaatattcagaagagtctaaattgaatcgggaagaaatagacggagtg1560agactagaatcgatgggagtttaccaaattttggcgatctattccacagtcgccagttct1620ctagtcttgttagtctccctgggggcaatcagcttctggatgtgttctaatgggtcattg1680caatgcagaatatgcatttag1701<210>2<211>566<212>prt<213>a型流感病毒<220><221>misc_feature<222>(1)..(566)<223>圖5b:a型流感病毒(a/swine/saskatchewan/18789/02(h1n1))血凝素(ha)基因(genbank:ay619961.1)<400>2metglualalysleuphevalleuphecysthrphethrvalleulys151015alaaspthrilecysvalglytyrhisalaasnasnserthrasnthr202530valaspthrvalleuglulysasnilethrvalthrhisservalasn354045leuleugluaspserhisasnglylysleucysserleuasnglyile505560alaproleuglnleuglylyscysasnvalalaglytrpleuleugly65707580asnproglucysaspleuleuleuthralaasnsertrpsertyrile859095ilegluthrserasnsergluasnglythrcystyrproglygluphe100105110ileasptyrglugluleuarggluglnleuserservalserserphe115120125glulysphegluilepheprolysalaasnsertrpproasnhisglu130135140thrthrlysglyvalthralaalacyssertyrserglyalaserser145150155160phetyrargasnleuleutrpilethrlyslysglythrsertyrpro165170175lysleuserlyssertyrthrasnasnlysglylysgluvalleuval180185190leutrpglyvalhishisproprothrthrseraspglnglnserile195200205tyrglnasnthraspalatyrvalservalglyserserlystyrasn210215220argargphethrprogluilealaalaargprolysvalargglygln225230235240alaglyargmetasntyrtyrtrpthrleuleuaspglnglyaspthr245250255ilethrpheglualathrglyasnleuilealaprotrptyralaphe260265270alaleuasnlysglyseraspserglyileilethrseraspalapro275280285valhisasncysaspthrargcysglnthrprohisglyalaleuasn290295300serserleupropheglnasnvalhisproilethrileglyglucys305310315320prolystyrvallysserthrlysleuargmetalathrglyleuarg325330335asnvalproserileglnserargglyleupheglyalailealagly340345350pheilegluglyglytrpthrglymetileaspglytrptyrglytyr355360365hishisglnasngluglnglyserglytyralaalaaspglnlysser370375380thrglnasnalaileaspglyilethrasnlysvalasnservalile385390395400glulysmetasnthrglnphethralavalglylysglupheasnasn405410415leugluargargilegluasnleuasnarglysvalaspaspglyphe420425430leuaspvaltrpthrtyrasnalagluleuleuvalleuleugluasn435440445gluargthrleuaspphehisaspserasnvalargasnleutyrglu450455460lysvalargserglnleuargasnasnalalysgluleuglyasngly465470475480cysphegluphetyrhislyscysaspaspglucysmetgluserval485490495lysasnglythrtyrasptyrprolystyrserglugluserlysleu500505510asnargglugluileaspglyvalargleuglusermetglyvaltyr515520525glnileleualailetyrserthrvala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