一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種藻裂解病毒，尤其是設(shè)及一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 赤潮是被公認(rèn)的海洋環(huán)境災(zāi)害，對(duì)海洋漁業(yè)生產(chǎn)和海洋生態(tài)平衡表現(xiàn)出很強(qiáng)的破 壞性。赤潮藻體通過水流進(jìn)入魚類的觸部，造成魚類窒息死亡；有些赤潮藻還分泌毒素，魚 類吞食后，會(huì)造成魚類死亡。另外，藻體死亡后，在分解過程中還會(huì)消耗水中的大量溶解氧， 致使大量海洋生物因缺氧而死，導(dǎo)致水質(zhì)惡化，影響水資源的合理利用。目前國內(nèi)外除藻方 法主要為物理法、化學(xué)法和生物法3大類。物理方法成本高，不能從根本上解決營養(yǎng)成分對(duì) 藻類的刺激作用；化學(xué)除藻劑雖然具有一定效果，可快速殺死藻類，但會(huì)產(chǎn)生二次污染，同 時(shí)化學(xué)藥品的生物富集和放大對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的負(fù)面影響較大，長期使用低濃度的化學(xué)藥 物會(huì)使藻類產(chǎn)生抗藥性，易造成環(huán)境污染甚至破壞生態(tài)平衡。微生物控藻技術(shù)是一種生態(tài) 修復(fù)技術(shù)，其通過強(qiáng)化或減弱系統(tǒng)內(nèi)藻功能的力度對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有經(jīng)濟(jì)性、有效性、 安全性的特點(diǎn)。微生物除藻技術(shù)包括病毒除藻、原生動(dòng)物除藻和細(xì)菌除藻3方面。其中，病 毒控藻技術(shù)的主要優(yōu)勢在于它能夠強(qiáng)化系統(tǒng)固有生態(tài)功能，其利用浮游生物一一病毒回路 的作用，實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物向高營養(yǎng)級(jí)的傳遞，恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)平衡，同時(shí)利用病毒感染的特異性， 可將技術(shù)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)控制到很低水平，因此該技術(shù)有良好的發(fā)展前景。
[0003] 中肋骨條藻是一種在全球近岸海域分布極廣的廣溫廣鹽性浮游娃藻，在黃、東、南 海均有該種赤潮記錄，中肋骨條藻已經(jīng)成為我國赤潮的優(yōu)勢種。2005年9月23-27日，江 蘇海州灣海域赤潮，最大面積為1000km2,主要赤潮生物為中肋骨條藻，直接經(jīng)濟(jì)損失500萬 _7Π〇
[0004] 將藻類病毒很好地應(yīng)用到赤潮控制中是非常迫切的，也是非常有發(fā)展前景的。自 2004年化gasaki等首次發(fā)現(xiàn)剛毛根管藻病毒W(wǎng)來，迄今已有16株娃藻病毒陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)， 但是并未發(fā)現(xiàn)能夠特異性裂解中肋骨條藻的藻病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法和應(yīng) 用，該裂解病毒可安全、高效、快速、特異性的降解海水中中肋骨條藻，使其藻葉綠素a濃度 減少率達(dá)76. 14%。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種中肋骨條藻裂解病毒：該 病毒為ScssDNAV株，分類命名為中肋條藻單鏈DNA裂解病毒（Skeletonemacostatum single-strandDMvirus),于2015年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10599。
[0007] 該病毒的生物學(xué)特征如下：該病毒為球狀，直徑98±2nm，無鞭毛無外膜包被，單 鏈DNA分子；該病毒液分別在20°C中放置兩周、65°C中放置30min，其活性穩(wěn)定；在抑3、 抑10環(huán)境下，其活性穩(wěn)定；在紫外線下處理10分鐘，活性穩(wěn)定；在-80°c中反復(fù)凍融1、3、5、 7次，其活性均穩(wěn)定。
[0008] 上述中肋骨條藻裂解病毒的分離純化方法：將含有中肋骨條藻裂解病毒的水域表 層水樣依次經(jīng)中速濾紙、0. 45μm、0. 22μm濾膜后，經(jīng)超濾系統(tǒng)濃縮成濃縮水樣，其濃縮倍 數(shù)為100倍；將濃縮水樣與指數(shù)生長期的中肋骨條藻按體積比1 :4的比例混合后，在恒溫 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強(qiáng)度2500LX，光暗比12h:12h，得到中肋骨 條藻裂解液；然后經(jīng)0. 22μm的微孔濾膜過濾取濾液，在濾液中加入PEG6000使其終濃度 達(dá)到lOw/v%，4°C冰箱內(nèi)黑暗下放置過夜，第二天將病毒濾液經(jīng)4°C，36,OOOg離屯、1.化，去 上清，用含有添加量為30mg/L娃酸鹽的f/2培養(yǎng)基懸浮沉淀即為純化的肋骨條藻裂解病毒 液。
[0009] 上述中肋骨條藻裂解病毒的應(yīng)用，用于抑制中肋骨條藻生長并殺死中肋骨條藻。
[0010] 其對(duì)中肋骨條藻NMBguh004-l、NMBguh004-2株具有強(qiáng)裂解作用。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明公開了一種中肋骨條藻裂解病毒及 其分離方法和應(yīng)用，將中肋骨條藻裂解病毒用于控制在特定環(huán)境下由于中肋骨條藻爆發(fā)性 增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解病毒具有高復(fù)制率、高感染率的特點(diǎn)，可高效裂解中 肋骨條藻；該病毒具有高特異性，可專一裂解中肋骨條藻，運(yùn)是保證生態(tài)安全的重要前提； 成本低，病毒的高復(fù)制率，培養(yǎng)大量中肋骨條藻裂解病毒較為容易；操作簡單，且不會(huì)造成 環(huán)境污染；是一種新型的治理中肋骨條藻赤潮的技術(shù)，具有良好的發(fā)展前景。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明提供一株中肋骨條藻裂解菌的分離方法和應(yīng)用，該裂解菌可高 效、快速降解海水中中肋骨條藻，該菌10天能使藻葉綠素a濃度減少76. 14%。
[0013] -種中肋骨條藻裂解病毒：該病毒為ScssDNAV株，分類命名為中肋條藻單鏈DNA 裂解病毒（Skeletonemacostatumsingle-strandDNAvirus),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10599，，保藏單 位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101。
【附圖說明】
[0014] 圖1為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV負(fù)染圖； 圖2為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV經(jīng)不同抑、溫度、紫外線處理后對(duì)中肋骨條藻葉 綠素a的影響； 圖3為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV反復(fù)凍融后對(duì)中肋骨條藻葉綠素a的影響；圖中 1、3、5、7分別表不凍融1、3、5、7次； 圖4為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV對(duì)中肋骨條藻NMBg址004-2葉綠素a濃度的影 響。
【具體實(shí)施方式】
[0015] W下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016] 一、實(shí)驗(yàn)方法 取5mL藻液，6000g離屯、15min后去上清，加入5mL體積分?jǐn)?shù)為90 %的乙醇水溶液或 者體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酬水溶液，在4°C冰箱內(nèi)避光放置。24h后7000g離屯、lOmin，上 清液用分光光度計(jì)檢測在663nm和645nm時(shí)的吸光度，用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇水溶液 或者體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酬水溶液調(diào)零。藻葉綠素a濃度利用W下公式計(jì)算得到：a= (12.7D謝 3-2.59〇645)*ν/Α a代表藻葉綠素a濃度，V為加入的體積分?jǐn)?shù)為90 %的乙醇水溶液或者體積分?jǐn)?shù)為 90%的丙酬水溶液體積，A為藻細(xì)胞重量（g)。藻細(xì)胞裂解，藻葉綠素a濃度下降。
[0017] 二、具體實(shí)施例 實(shí)施例1 中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV的分離、純化 表層水樣采自浙江省寧波市寧海雙盤涂水產(chǎn)養(yǎng)殖場，于冰浴下保存，水樣依次經(jīng)中速 濾紙、0. 45μm、0. 22μm濾膜后，經(jīng)超濾系統(tǒng)濃縮成濃縮水樣，其濃縮倍數(shù)為100倍。
[001引配制濃縮水樣與指數(shù)生長期的中肋骨條藻NMBg址004-2按體積比1 :4的比例 混合后，在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強(qiáng)度2500LX，光暗比化/ D) 12h: 12h，得到中肋骨條藻裂解液。將不含病毒的濃縮液與處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻 共培養(yǎng)作為對(duì)照組。分別用肉眼、光學(xué)顯微鏡、藻葉綠素a濃度變化和電鏡觀察藻生長情 況。
[0019] 選取與對(duì)照組相比具有裂解現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)0. 22μπι的微孔濾膜過濾，除去中 肋骨條藻裂解碎片。濾液中加入PEG6000使其終濃度達(dá)到10% (質(zhì)量體積百分比），4°C冰 箱內(nèi)黑暗下放置過夜。第二天將病毒濾液經(jīng)4°C，36,OOOg離屯、1.化，去上清，用含有添加量 為30mg/L娃酸鹽的f/2培養(yǎng)基（中肋骨條藻培養(yǎng)基）懸浮沉淀即為純化的病毒液。 W20] 純化的中肋骨條藻裂解病毒該病毒命名為中肋條藻單鏈DNA裂解病毒 (Skeletonema.costatumsingle-strandDNAvirus,ScssDNAV),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10599。
[0021]其中f/2培養(yǎng)基的成分為：硝酸鋼75mg/l，憐酸二氨鋼5mg/l，六水合Ξ氯化鐵 3. 15mg/l，邸了4-胞2 4. 36mg/l，五水硫酸銅lOmg/L，屯水硫酸鋒22mg/L，六水氯化鉆lOmg/ L，四水氯化儘18mg/l，二水鋼酸鋼6. 3mg/L，維生素Bi2Img/L，維生素ΗImg/L，維生素Bi 200mg/l，加人工海水至IL。 陽0巧實(shí)施例2 用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察肋骨條藻裂解病毒的形態(tài) 取純化的病毒感染中肋骨條藻NMBg址004-2,4d后藻液顏色變淡，光學(xué)顯微鏡下觀察 藻細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大部分藻細(xì)胞裂解。
[0023] 取實(shí)施例1所分離純化的中肋骨條藻裂解病毒滴于銅網(wǎng)格上，W2%乙酸軸酷溶 液（W/V)進(jìn)行負(fù)染，再置于電子顯微鏡（日立H-7650)下觀察中肋骨條藻裂解病毒的形態(tài)。
[0024] 結(jié)果如圖1所示，中肋骨條藻裂解病毒顆粒系為球狀，直徑98±2nm，無鞭毛無外 膜包被。 陽〇2引實(shí)施例3 不同抑、溫度、紫外線W及凍融對(duì)中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV穩(wěn)定性的影響 (1)不同抑對(duì)中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV穩(wěn)定性的影響 取實(shí)施例1分離純化得到的新鮮病毒液2份，測病毒液原始抑值并記錄，隨后用0.