專利名稱：具有溶解中肋骨條藻能力的庫氏鹽芽孢桿菌hsqay1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于水體富營養(yǎng)化等原因?qū)е碌某喑睘?zāi)害，對水生生態(tài)系統(tǒng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重影響，已經(jīng)成為全球性的環(huán)境問題之一。采用硫酸銅等化學(xué)藥劑可以有效抑制和殺滅赤潮藻類，但易對環(huán)境產(chǎn)生二次污染。利用改性粘土等物理方法可以絮凝沉淀赤潮藻，但是可能對底棲生物造成負(fù)面影響。利用溶藻細(xì)菌抑制或防治赤潮藻類具有高效快速、安全可靠，對環(huán)境負(fù)面影響小的優(yōu)點，已經(jīng)成為國內(nèi)外赤潮防治研究的熱點問題。采用微生物技術(shù)治理赤潮的關(guān)鍵之一便是獲得具有高效溶解赤潮藻能力的優(yōu)良菌株。目前，國內(nèi)外對赤潮的生物防治開展了大量的研究工作，多集中在銅綠微囊藻、藍(lán)藻和塔瑪亞歷山大藻等有毒藻類防治研究方面。而中肋骨條藻雖為無毒藻類，但其是廣泛分布于世界各個海域的廣溫廣鹽性種類，且是我國從渤海至南海沿海的主要赤潮種類，因此，對中肋骨條藻赤潮治理的研究也更為重要。本發(fā)明所獲得的溶藻細(xì)菌分泌物可高效溶解中肋骨條藻，因此，在實際應(yīng)用中可發(fā)揮重要的作用。經(jīng)檢索專利和其它相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)在好氧條件下應(yīng)用庫氏鹽芽孢桿菌
(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)溶解赤潮藻類-中肋骨條藻的報道；該溶藻菌
的發(fā)現(xiàn)對海洋細(xì)菌控藻技術(shù)的開發(fā)及探討赤潮治理的有效方法具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種庫氏鹽芽孢桿菌株，該菌株可以高效快速的溶解中肋骨條藻；并且不會帶來二次污染以及外種入侵等狀況。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供上述庫氏鹽芽孢桿菌株在降解赤潮暴發(fā)海區(qū)中的中肋骨條藻中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1)，于 2012 年 6 月 12 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012221。本發(fā)明的第二個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:上述庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl在降解赤潮暴發(fā)海區(qū)中的中肋骨條藻中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明提供的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAY1，該菌株能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細(xì)胞斷裂，而后膨脹成圓球形并最終破裂死亡，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，實際上，該菌株主要通過其代謝的活性物質(zhì)來溶解中肋骨條藻；(2)本發(fā)明提供的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl為土著細(xì)菌，在實際應(yīng)用中不會造成二次污染或外種入侵等污染情況；能夠在赤潮的生物治理的實踐中發(fā)揮重要作用。


圖1為實施例1中正常中肋骨條藻細(xì)胞(A)及庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)作用下的中肋骨條藻(B)細(xì)胞形態(tài)顯微照片；圖2 為實施例 2 中庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3 為實施例 3 中庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl(Halobacillus kuroshimensisHSQAYl)的透射電鏡照片；圖4 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以10%的體積分?jǐn)?shù)與中肋骨條藻混合時的藻菌數(shù)量變化圖；圖5 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以5%的體積分?jǐn)?shù)與中肋骨條藻混合時的藻菌數(shù)量變化圖；圖6 為實施例 5 中庫氏鹽芽抱桿菌(Halobacillus kuroshimensis HSQAYI)HSQAYl以1%的體積分?jǐn)?shù)與中肋骨條藻混合時的藻菌數(shù)量變化圖；圖7為實施例5中中肋骨條藻初始密度及不同處理方式的細(xì)菌菌液作用48h的藻細(xì)胞密度圖(圖中相同字母表示無顯著差異P>0.05)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實施例1中肋骨條藻海洋溶藻細(xì)菌的篩選方法1.海洋細(xì)菌的分離及純化從深圳大鵬灣南澳赤潮爆發(fā)海域采集表層海水樣品，0.7 U m玻璃纖維素膜過濾后，梯度稀釋后涂布細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板，28°C恒溫培養(yǎng)48h，挑取特征差異明顯的菌落劃線，28°C恒溫培養(yǎng)48h。重復(fù)以上操作兩次，得到純培養(yǎng)的細(xì)菌。所用的細(xì)菌分離培養(yǎng)基為2216E瓊脂培養(yǎng)基，成分為:蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸高鐵0.lg，瓊脂粉20g，陳海水1000ml, pH 7.6 8.2。2.中肋骨條藻海洋溶藻細(xì)菌的篩選從固體斜面培養(yǎng)基上挑取I環(huán)菌落接種于50mL細(xì)菌活化液體培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)48h后，獲得的細(xì)菌菌液備用，所用細(xì)菌活化液體培養(yǎng)基為2216E海水培養(yǎng)基，成分為蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸高鐵0.lg，陳海水1000mL，pH 7.6 8.2。細(xì)菌菌液以10%的體積分?jǐn)?shù)與處于對數(shù)生長期的無菌藻液(藻細(xì)胞濃度約1.0X104cells/mL)混合加到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板孔中(每個板孔容積約1.2mL),每株菌加2個板孔作為篩選試驗組(對照組以無菌海水代替細(xì)菌懸液)。用石蠟密封篩選試驗的細(xì)胞培養(yǎng)板，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度23°C，光暗循環(huán)比llh:13h)。連續(xù)觀察120h，每天用倒置顯微鏡(Olympus 1X70，日本)觀察板孔中的藻細(xì)胞形態(tài)變化及其存活情況并拍照。所用的藻類液體培養(yǎng)基為 f/2 培養(yǎng)基:75mg NaNO3>5mg NaH2PO4 H20、20mg Na2SiO3 9H20、
4.36mg Na2EDTA、3.15mg FeCl3 6H20、0.0lmg CuSO4 5H20、0.022mg ZnSO4 7H20、
0.0lmgCoCl2 6H20、0.18mg MnCl2 4H20、0.006mg Na2MoO4 2H20，陳海水 1000ml，經(jīng)脫脂棉過濾后，121°C滅菌20min后，再添加0.1 y g鹽酸硫胺、0.5 u g生物素以及0.5 y gVB12。最終獲得能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細(xì)胞斷裂成單個細(xì)胞，而后單個細(xì)胞膨脹成圓球形并最終破裂死亡的溶藻細(xì)菌，圖1為中肋骨條藻及該菌作用下的藻細(xì)胞形態(tài)變化顯微照片，其中A圖為正常中肋骨條藻細(xì)胞；圖B為庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl作用下的中肋骨條藻(B)細(xì)胞形態(tài)顯微照片。實施例2庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl的系統(tǒng)發(fā)育樹1.16S rDNA的基因序列測定采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取庫氏鹽芽孢桿菌HSQAYl的DNA，對基因組DNA進(jìn)行電泳分析后，以其為模板進(jìn)行PCR擴增，擴增的上游引物為27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物為1492R:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)過程包括:98°C 預(yù)變性 5min 后，95°C 變性 35S，55°C 退火35s以及72°C延伸90s共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)在72°C保持8min使產(chǎn)物延伸完整。將 PCR 產(chǎn)物電泳純化后，測定其全序列。ATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGCGAGTGGATCCCTTCGGGGTGAAGCTCGTGGAACGAGCG 60GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGAATAACCCCGGGAAAC 120CGGGGCTAATGCCGGGTAATACTTTTCTTCGCATGAAGATAAGTTGAAAGATGGCTTCTC 180GCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA 240AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC 300CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGA 360GCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGAAGAAC 420AAGTACCGTGCGAATAGAGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGGAAGCCCCGGCTAACT 480ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA 540AAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGG 600TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGGACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT 660GAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTTTCTG 720ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG 780TAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATT 840AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC 900CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT 960TGACATCCTTGGACCTCCCTAG AGATAGGGATTTCCCTTCGGGGACCAAGTGACAGGTGG 1020TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA 1080CCCCTAATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC 1140CGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT 1200GCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGTAGCAAATCCCATAAAACC 1260ATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATC1320GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC 1380ACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAA14152.菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖將庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的 16SrDNA基因序列同GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，圖2為該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。實施例3 庫氏鹽芽抱桿菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的菌落形態(tài)、生理和生化特征
庫氏鹽芽抱桿菌HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)菌落呈深黃色，圓形，不透明，邊緣整齊，光滑濕潤；電鏡觀察該菌體的形態(tài)為稍短粗桿菌，大小為(0.6
1.2) UmX (1.6 2.4) iim，有鞭毛，細(xì)胞形態(tài)見圖3，生理和生化特征見表I。結(jié)合細(xì)菌的16S rDNA序列分析結(jié)果，最終確定HSQAYl為庫氏鹽芽孢桿菌屬細(xì)菌。表I 庫氏鹽芽抱桿菌 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAYl)的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種庫氏鹽芽抱桿菌株 HSQAYl (Halobacillus kuroshimensis HSQAY1),于 2012 年6月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012221。
2.權(quán)利要求1所述的庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAYl在降解赤潮暴發(fā)海區(qū)中的中肋骨條藻中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種庫氏鹽芽孢桿菌株HSQAY1(Halobacillus kuroshimensisHSQAY1)，于2012年6月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2012221。還公開了該菌株在降解赤潮暴發(fā)海區(qū)中的中肋骨條藻中的應(yīng)用；該菌株能使條鏈狀排列的中肋骨條藻細(xì)胞斷裂，而后膨脹成圓球形并最終破裂死亡。并且該菌株為土著細(xì)菌，在實際應(yīng)用中不會造成二次污染或外種入侵等污染情況，有望在赤潮的生物治理實踐中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N1/20GK103114050SQ20121043937
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者黃洪輝, 史榮君, 齊占會, 胡維安 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所