專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于流感病毒亞單位疫苗研究的合成多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于流感病毒亞單位疫苗研究的合成多肽。
背景技術(shù)：
流行性感冒病毒稱(chēng)流感病毒，是一類(lèi)具有高度傳染性的呼吸道病毒，也是被列入 生物恐怖武器的其中一種。。目前，接種流感病毒疫苗被認(rèn)為是預(yù)防流感發(fā)生與控制病毒傳 播的最佳方法，但由于流感病毒變異速度非常快，致使WHO每年都需要公布當(dāng)前流行性病 毒疫苗，給疫苗的研制和生產(chǎn)造成諸多不便。因此研制一種具有廣泛保護(hù)作用的疫苗對(duì)于 控制流感病毒流行具有極其重要的意義。而且，目前的流感亞單位疫苗主要是通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增基因，再通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 大腸該菌，獲得工程菌，最終獲得重組蛋白。操作過(guò)程繁瑣，且耗時(shí)。本發(fā)明多肽采用化學(xué) 合成的方法，簡(jiǎn)單快速，且有良好的抗原性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于流感病毒亞單位疫苗 研究的合成多肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明合成多肽的序列為CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。上述合成多肽的篩選方法為(1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用以知 DNA-STAR進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析比對(duì)，篩選出HA分子中信號(hào)肽之后到蛋白酶切位點(diǎn) 之間具有良好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區(qū)段和500-520區(qū)段作為候選片 段；(2)對(duì)候選肽段通過(guò)抗體的篩選，最終得到針對(duì)新型Hmi、H3N2和Hmi三 種流感病毒具有保護(hù)作用的合成多肽，該多肽為498-520AA的氨基酸，其序列為 CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。進(jìn)一步，所述載體蛋白為KLH血藍(lán)蛋白。上述步驟(2)具體為以包被免疫家兔的偶聯(lián)多肽檢測(cè)免疫血清，當(dāng)兔多抗血清滴度已經(jīng)達(dá)到 1 100000，進(jìn)行終放血，收獲血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對(duì)免疫兔的多克隆血清抗體進(jìn) 行篩選，其中，包被液稱(chēng)取Na2CO3 0. 15g，NaHCO3 0. 293g，蒸餾水稀釋至 100ml，得到 0. 05mol/L PH9.6碳酸緩沖液，4°C，保存；洗滌液(稀釋液)稱(chēng)取NaCl 8g，KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20,0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. 01mol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液，4°C， 保存；
封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出對(duì)新型Hmi流感病毒具 有特異性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過(guò) 夜；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置2min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置 在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加封閉液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗滌同 2);5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加IOOul，同時(shí)作稀 釋液對(duì)照，37 °C放置Ih;6)洗滌同 2)；7)加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，反應(yīng)板每孔IOOul，37°C放置 lh；8)洗滌同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min ；10)加終止液反應(yīng)板每孔50ul ；11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。本發(fā)明多肽合成過(guò)程簡(jiǎn)單快速，而且所得到的多肽偶聯(lián)抗原就有較廣泛的保護(hù)作 用。對(duì)于亞單位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有積極的意義。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明合成多肽的篩選方法包括如下步驟(1)肽抗原表位的生物信息學(xué)選擇與合成、修飾從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索流感病毒的HA氨基酸序列，用已知DNA-STAR和anth印rot 5. 0分析顯示，330-350之間部分無(wú)論在抗原性、親水性還是易溶性分析都是很好的候選片 段；在400位下游存在大量的α螺旋結(jié)果，且主要位于疏水性片段，而且該區(qū)段變異度很 低，序列穩(wěn)定，因此判斷為可能的穿膜部分，該區(qū)域放棄。但該區(qū)域(500-520)之后有較短 的變異較大的區(qū)域，且該部分抗原性和親水性均很強(qiáng)。同時(shí)，流感病毒的各亞型的表位線性 肽的序列如表2和表3所示。故在330-350和500-520區(qū)域中，選擇不同亞型的差異性片 段合成十條備選多肽，見(jiàn)表1。表 1
4 表 2 表 3 (2)抗體的制備以包被免疫家兔的偶聯(lián) 1 100000，進(jìn)行終放血，收獲血清，
值見(jiàn)表4。
(3)合成多肽免疫血清中抗體的篩選ELISA實(shí)驗(yàn)的建立利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對(duì)免疫兔的多克隆血清抗體進(jìn) 行篩選。1.實(shí)驗(yàn)材料與試劑HlNl、H3N2、新甲型Hmi流感病毒疫苗株來(lái)自長(zhǎng)春生物制品所。酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Sigma公司96孔酶標(biāo)板購(gòu)自欣經(jīng)科公司牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Roch公司Tween20 購(gòu)自 Sigma 公司。包被液稱(chēng)取Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g,蒸餾水稀釋至 100ml,即為 0. 05mol/L pH9. 6 (包被液)碳酸緩沖液，40C，保存；洗滌液(稀釋液)稱(chēng)取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液(稀釋液)，4°C，
保存；封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液。2. ELISA 步驟1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過(guò) 夜；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置2min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置 在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3)加封閉液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗滌同 2);5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔IOOul，同時(shí)作稀釋 液對(duì)照，37 °C放置lh；6)洗滌同 2)；7)加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，每孔IOOul，37°C放置Ih ；8)洗滌同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min ；10)加終止液每孔50ul ；11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。3. ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5表 5 ELISA結(jié)果判讀屮州值> 2. 1，判為陽(yáng)性；P/N < 2. 1，判為陰性。從表5的結(jié)果可以看出，免疫血清KLH-H5m_2與三種流感病毒(H1N1、新型Hmi 和H3N2)反應(yīng)，得到的P/N值均大于2.1，可以判讀為陽(yáng)性。進(jìn)而可以說(shuō)明由合成多肽ZS-5 偶聯(lián)KLH得到的抗原刺激產(chǎn)生的免疫血清具有一定范圍的保護(hù)作用，能夠?yàn)榱鞲胁《緛唵?位疫苗的研究提供一定的佐證。
權(quán)利要求
一種用于流感病毒亞單位疫苗研究的合成多肽，其特征在于，所述合成多肽的序列為CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
2.—種權(quán)利要求1所述合成多肽的篩選方法，其特征在于，具體如下(1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用以知DNA-STAR進(jìn) 行序列比對(duì)和同源性分析比對(duì)，篩選出HA分子中信號(hào)肽之后到蛋白酶切位點(diǎn)之間具有良 好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區(qū)段和500-520區(qū)段作為候選片段；(2)對(duì)候選肽段通過(guò)抗體的篩選，最終得到針對(duì)新型Hmi、H3N2和Hmi三 種流感病毒具有保護(hù)作用的合成多肽，該多肽為498-520AA的氨基酸，其序列為 CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
3.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述載體蛋白為KLH血藍(lán)蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為以包被免疫家兔的偶聯(lián)多肽檢測(cè)免疫血清，當(dāng)兔多抗血清滴度已經(jīng)達(dá)到1 100000， 進(jìn)行終放血，收獲血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對(duì)免疫兔的多克隆血清抗體進(jìn)行篩 選，其中，包被液稱(chēng)取 Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g，蒸餾水稀釋至 100ml，得到 0. 05mol/L ρΗ9· 6 碳酸緩沖液，4°C，保存；洗滌液(稀釋液)稱(chēng)取 NaCl 8g，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液，4°C，保存；封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出對(duì)新型Hmi流感病毒具有特 異性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過(guò)夜；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置2min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸 水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加封閉液200ul，37°C放置Ih；4)洗滌同2)；5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加lOOul，同時(shí)作稀釋液 對(duì)照，37 °C放置lh；6)洗滌同2)；7)加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，反應(yīng)板每孔lOOul，37°C放置Ih;8)洗滌同2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min；10)加終止液反應(yīng)板每孔50ul；11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于流感病毒亞單位疫苗研究的合成多肽，該合成多肽的序列為CVKNGTYDYPQYS EEARLNREEIS。本發(fā)明多肽合成過(guò)程簡(jiǎn)單快速，而且所得到的多肽偶聯(lián)抗原有較廣泛的保護(hù)作用。對(duì)于亞單位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有積極的意義。
文檔編號(hào)C07K14/00GK101899101SQ20101023302
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 王琳, 胡孔新, 郭雪, 馬雪征 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院