一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1）PK-15細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)；2）接種病毒培養(yǎng)制備病毒液；3）病毒濃縮、滅活及制成疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明通過(guò)使用連續(xù)灌流式生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)增PCV-2，具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作空間相對(duì)較小、工藝操作簡(jiǎn)單、勞動(dòng)力明顯降低、可通過(guò)級(jí)聯(lián)放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)、維持液中血清含量低、生產(chǎn)成本相對(duì)較低、產(chǎn)品質(zhì)量可控性高。最終所得到的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(PCV)于1997年首次在加拿大爆發(fā)，隨后在全球很多國(guó)家相繼報(bào)道該病的出現(xiàn)。PCV有PCVl和PCV-2兩種基因型，Tischer等最早在PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PCV-1的存在，該基因型病毒的基因組全長(zhǎng)1759bp，與PCV-2的核苷酸相似性在70%左右。豬腎上皮細(xì)胞PK-15，來(lái)源于豬腎，中文名為豬腎上皮細(xì)胞，正常的細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)。該細(xì)胞對(duì)多種病毒比較敏感，如豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)等，可應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備。PCVl并不能引起豬只的發(fā)病，但PCV-2則是能引發(fā)仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，是仔豬的重要傳染病，同時(shí)也是育肥豬的皮炎和腎病綜合征(PDNS)的主要誘因。據(jù)最新研究報(bào)道，PCV-2型還能夠與其他病毒共感染誘發(fā)典型的PMWS癥狀，例如:豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。易感豬群的發(fā)病率約為5%~25%，但發(fā)病后死淘率高達(dá)80%左右，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型主要同傳統(tǒng)的大方瓶或轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行培養(yǎng)的，這種生產(chǎn)工藝技術(shù)含量低，操作簡(jiǎn)便，便于技術(shù)推廣；但勞動(dòng)力投入高、無(wú)法級(jí)聯(lián)放大、批次差異明顯以及難以標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制等技術(shù) 瓶頸使其無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出大量的高質(zhì)量的疫苗產(chǎn)品。另外，PCV-2具有特殊的生物學(xué)特性使其在傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝下無(wú)法達(dá)到較高的病毒滴度，同樣限制了 PCV-2疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。生物反應(yīng)器是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種新型細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，由于其可以裝載的載體容量大從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供更大的貼壁面積，使細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為了可能。隨著生物反應(yīng)器技術(shù)的不斷成熟，越來(lái)越多的病毒疫苗生產(chǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)向利用該技術(shù)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)方式。生物反應(yīng)器具有傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)所不具備的多種技術(shù)優(yōu)勢(shì)，這種先進(jìn)的生產(chǎn)工藝可以很好的解決上述傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)中的各種技術(shù)瓶頸。
[0004]當(dāng)前使用的PCV-2疫苗均是用礦物油作為佐劑，但這種佐劑具有副作用大、安全性低等缺點(diǎn)。MontanideTM ISA206是一種新型的佐劑，由于獨(dú)特的分子特點(diǎn)使其與水相的混合乳化時(shí)避免添加其他乳化劑。另外，該新型佐劑中使用的油分也有所改進(jìn)，使用了可代謝的礦物油替換了初期的礦物油，可以進(jìn)一步提高生物安全性。
[0005]因此，尋找一種更為高效的大規(guī)模生產(chǎn)方式制備PCV-2疫苗成為了當(dāng)前首要的任務(wù)。另外，如何提高該疫苗的安全性同樣值得我們?nèi)ヌ剿骱脱芯俊?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明基于生物反應(yīng)器制備豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，為豬圓環(huán)病毒2型提供一種安全連續(xù)封閉式的培養(yǎng)方法,與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。[0007]一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I) PK-15細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
[0009]將2~3X IO5個(gè)/ml的PK-15細(xì)胞接入到生物反應(yīng)器中，加入片狀載體補(bǔ)充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)啟進(jìn)液泵和出液泵進(jìn)行流加培養(yǎng)，其中:每接入IL所述PK-15細(xì)胞，加入片狀載體250g，補(bǔ)充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基至4~5L ;
[0010]2)接種病毒的培養(yǎng)及制備病毒液
[0011]所述PK-15細(xì)胞在所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)至72小時(shí)后排出細(xì)胞生長(zhǎng)液，將重量百分含量為1%的血清的維持液接入所述生物反應(yīng)器內(nèi)，接入圓環(huán)病毒(YZ株)F15代種毒，病毒接種量為400nmL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，將pH調(diào)整為7.4，溫度設(shè)定為36.5°C，培養(yǎng)至24小時(shí)開(kāi)始收獲毒液并同時(shí)補(bǔ)充新鮮維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至病毒接種后240小時(shí)，其中:所述步驟I)中每接入IL所述PK-15細(xì)胞，每天灌注量為15L ；
[0012]3)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產(chǎn)品。
[0013]優(yōu)選的，所述生物反應(yīng)器為續(xù)灌注式生物反應(yīng)器。
[0014]優(yōu)選的，在所述步驟I)之前先確定PK-15細(xì)胞培養(yǎng)圓環(huán)病毒的生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件，其中所述生物反應(yīng)器為連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器。
[0015]更優(yōu)選的，所述確定PK-15細(xì)胞培養(yǎng)圓環(huán)病毒生物反應(yīng)器培養(yǎng)的條件為:將2~3 X IO5個(gè)/ml的PK-15細(xì)胞接入到所述生物反應(yīng)器內(nèi)，選用片狀載體，攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，pH為7.2，溫度為37°C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)始流加灌注培養(yǎng)，至312小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。 [0016]優(yōu)選的，所述步驟3)包括乳化，乳化后制得PCV-2 (YZ株)水包油包水劑型滅活疫苗。
[0017]更優(yōu)選的，所述乳化的方法為:將佐劑與合格的滅活抗原等量混合于乳化缸內(nèi)，低速攪拌乳化30分鐘。
[0018]更優(yōu)選的，取乳化后的試劑5~IOmL,以3000r/min離心15分鐘，如有分層現(xiàn)象，
重復(fù)乳化。
[0019]本發(fā)明還提供給了所述豬圓環(huán)2型滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產(chǎn)品。
[0020]其中，所述的生物反應(yīng)器可選用NBS公司連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器，涉及的載體為片狀載體，片狀載體裝載量為250g，約合50g/L。灌流培養(yǎng)過(guò)程中可以保持細(xì)胞生長(zhǎng)液或病毒維持液體積不變。疫苗制備時(shí)所用的佐劑為雙相油乳劑，例如法國(guó)賽比克公司的MontanideTM ISA206。
[0021]本發(fā)明通過(guò)使用連續(xù)灌流式生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)增PCV-2，具有以下優(yōu)點(diǎn):操作空間相對(duì)較小、工藝操作簡(jiǎn)單、勞動(dòng)力明顯降低、可通過(guò)級(jí)聯(lián)放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)、維持液中血清含量低、生產(chǎn)成本相對(duì)較低、產(chǎn)品質(zhì)量可控性高。最終所得到的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明中使用的連續(xù)灌流式生物反應(yīng)器示意圖。
[0023]圖中，I為培養(yǎng)基加流袋，2為生物反應(yīng)器主體，3為培養(yǎng)物接收裝置?！揪唧w實(shí)施方式】
[0024]以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1
[0026]本實(shí)例說(shuō)明PK-15細(xì)胞培養(yǎng)圓環(huán)病毒生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件以及PCV-2增殖條件的確定。
[0027](I)將2X IO5個(gè)/ml左右的PK-15細(xì)胞接入到反應(yīng)器中，補(bǔ)充含5%牛血清的DMEM培養(yǎng)基至5L，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)啟進(jìn)液泵和出液泵進(jìn)行流加培養(yǎng)，每天定時(shí)取樣檢測(cè)葡萄糖的消耗量并記錄堿液(l%NaOH)的消耗量，連續(xù)培養(yǎng)至13天，打開(kāi)罐體，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。最終確定培養(yǎng)條件為:為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C。
[0028](2)在細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)至48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)排出細(xì)胞生長(zhǎng)液，將含1%血清的維持液接入反應(yīng)器內(nèi)，接入已準(zhǔn)備好的圓環(huán)病毒(YZ株)F15代種毒，接毒量分別為200mL、400mL和600mL，病毒維持液中含D-氨基葡萄糖濃度為2mmol/L，設(shè)定反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，PH7.4，溫度36.5°C，培養(yǎng)至24小時(shí)開(kāi)始收獲毒液并同時(shí)補(bǔ)充新鮮維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至240小時(shí)，每日取樣檢測(cè)葡萄糖含量同時(shí)記錄堿液(l%NaOH)的消耗量，從接毒后24小時(shí)開(kāi)始，每天取2個(gè)樣分別檢測(cè)毒液的TCID50，并取接毒后24-240小時(shí)的混合樣檢測(cè)TCID5tlt5最終確定培養(yǎng)條件為:在細(xì)胞增殖72小時(shí)后以總體積的8%的量接種病毒液，D-氨基葡萄糖的終濃度為2mmol/L，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.4，溫度 36.5 0C o
[0029]實(shí)施例2
[0030]本實(shí)施例說(shuō)明將病毒接種并培養(yǎng)制備病毒液的方法。
[0031]將體積為IL濃度為2~3X IO5個(gè)/ml左右的PK-15細(xì)胞接入到反應(yīng)器中，補(bǔ)充含5%牛血清的DMEM培養(yǎng)基至5L，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37 °C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)啟進(jìn)液泵和出液泵進(jìn)行流加培養(yǎng)；在細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)至72小時(shí)后排出細(xì)胞生長(zhǎng)液，將含1%血清的維持液接入反應(yīng)器內(nèi)，接入已準(zhǔn)備好的圓環(huán)病毒(YZ株)F15代種毒，接毒量為400mL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，將PH調(diào)整為7.4，溫度設(shè)定為36.5°C，培養(yǎng)至24小時(shí)開(kāi)始收獲毒液并同時(shí)補(bǔ)充新鮮維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至接毒后240小時(shí)，每天灌注量為15L。最終得到的病毒上清液的病毒含量≤IO6-5TCID50/
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[0032]實(shí)施例3
[0033]本實(shí)施例說(shuō)明將病毒液滅活及制備成疫苗產(chǎn)品的方法。
[0034]病毒液的滅活:
[0035]收集實(shí)施例2中最終得到的病毒液，采用終濃度為1.0%。的環(huán)化BEI，中心溫度32°C滅活48h，用終濃度為2%的滅菌硫代硫酸鈉溶液終止滅活。
[0036]滅活疫苗的制備:
[0037]取法國(guó)賽比克公司MontanideTM ISA206VG佐劑1份，檢驗(yàn)合格的滅活抗原1份，等量混合于乳化缸內(nèi)，低速攪拌乳化30分鐘，制得PCV-2 (YZ株)水包油包水劑型滅活疫苗。[0038]實(shí)施例4
[0039]本實(shí)施例說(shuō)明得到的疫苗產(chǎn)品的效果及安全試驗(yàn)。
[0040]一、免疫效力與持續(xù)期試驗(yàn)
[0041]其中，PCV-2抗原、抗體均陰性的斷奶仔豬、后備母豬購(gòu)自鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)云立牧業(yè)有限公司；豬圓環(huán)病毒2型抗血清購(gòu)自VMRD公司；羊抗豬突光二抗購(gòu)自SouthernBiotech公司；Taq酶等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自大連TaKaRa生物工程有限公司；其它均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。
[0042]I試驗(yàn)方法:
[0043]1.1斷奶仔豬免疫抗體產(chǎn)生及攻毒保護(hù)體免疫試驗(yàn)
[0044]1.1.1斷奶仔豬免疫后血清抗體監(jiān)測(cè)
[0045]選擇30頭3~5周齡斷奶仔豬進(jìn)行試驗(yàn)，將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組，前3組分別免疫我公司試制的3批疫苗，采用頸部肌肉注射免疫，分2次免疫，在首免后第3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫；免疫劑量為Iml/頭/次。另設(shè)I組非免疫攻毒對(duì)照組，I組非免疫非攻毒對(duì)照組。分別于首次免疫后第7天、14天、21天、28天和35天采血并分離血清，進(jìn)行血清IFA抗體檢測(cè)。
[0046]1.1.2斷奶仔豬免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0047]二免后14天各組 豬逐頭稱重，并用4 X 105_ tlTCID5tl劑量的PCV-2強(qiáng)毒對(duì)免疫組和非免疫攻毒組進(jìn)行攻毒，攻毒后第4、7天分別在豬的兩腋下及兩臀部分4點(diǎn)接種用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml),4ml/頭，腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，IOml/頭；攻毒后第11、19天腹腔接種相同劑量巰基乙酸培養(yǎng)基，攻毒后I~28d測(cè)量體溫，觀察臨床癥狀。分別于攻毒后7d、14d、21d和28d采血，用PCR方法檢測(cè)血清中有無(wú)PCV-2抗原。死亡豬進(jìn)行病理解剖，于攻毒后28天時(shí)對(duì)所有豬稱重、剖殺，比較各攻毒組與非免疫非攻毒組間平均相對(duì)日增重，用免疫組化染色法檢測(cè)肺門及腸系膜淋巴結(jié)中的PCV-2抗原。
[0048]1.2疫苗免疫斷奶仔豬抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫持續(xù)期攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0049]1.2.1抗體持續(xù)期檢測(cè)試驗(yàn)選30頭PCV-2抗原、抗體均為陰性的斷奶仔豬進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)隨機(jī)分為5組，前3組分別免疫我公司生產(chǎn)的3批疫苗(YH001、YH002、YH003)，并設(shè)非免疫攻毒對(duì)照組I組、非免疫非攻毒對(duì)照組I組。采用頸部肌肉注射免疫，分2次免疫，5周齡首免，間隔3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為Iml/頭/次。于免疫后2、3、4、5、6、7、8周及3、4、5、6、7、8個(gè)月分別采血并分離血清，運(yùn)用IFA方法測(cè)定血清中抗體水平。
[0050]1.2.2免疫持續(xù)期攻毒保護(hù)試驗(yàn)分別在免疫后第8個(gè)月，各組取5頭豬逐頭稱重，并用4X 105_ tlTCID5tl劑量的PCV-2強(qiáng)毒對(duì)免疫組和非免疫攻毒組豬進(jìn)行攻毒，攻毒后第4、7天分別在豬的兩腋下及兩臀部分4點(diǎn)接種用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/ml)，4ml/頭，同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，IOml/頭；攻毒后第14、21天分別按相同劑量(IOml/頭)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，每組隔離觀察28天。攻毒后I~28d測(cè)量體溫，觀察臨床癥狀。于攻毒后28天時(shí)對(duì)所有豬采血、稱重、撲殺，PCR法檢測(cè)血清病毒血癥，比較各攻毒組與非免疫非攻毒組間平均相對(duì)日增重，免疫組化染色法檢測(cè)肺門及腸系膜淋巴結(jié)中的PCV-2抗原。根據(jù)體溫變化、平均相對(duì)日增重、血清病毒血癥、淋巴結(jié)免疫組化，評(píng)價(jià)疫苗持續(xù)期保護(hù)效果。[0051]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0052]2.1斷奶仔豬免疫抗體產(chǎn)生及攻毒保護(hù)體免疫試驗(yàn)結(jié)果
[0053]2.1.1斷奶仔豬免疫抗體產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果
[0054]疫苗免疫前所有仔豬的血清抗體效價(jià)均低于1:50,于首免后第2周免疫豬血清中即可檢測(cè)到特異性抗PCV-2抗體，抗體效價(jià)約為1:100~200，隨后抗體效價(jià)逐漸攀升，首免后第3周血清抗體效價(jià)介于1:200~400 ;此時(shí)加強(qiáng)免疫一次，之后血清抗體效價(jià)迅速升高，在二免后7天抗體效價(jià)約為1:400~700，到二免后2周左右血清抗體效價(jià)達(dá)1:600~900，結(jié)果見(jiàn)下表1。
[0055]表1斷奶仔豬免疫后抗體產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟: 1)PK-15細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) 將2~3X IO5個(gè)/ml的PK-15細(xì)胞接入到生物反應(yīng)器中，加入片狀載體，補(bǔ)充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)啟進(jìn)液泵和出液泵進(jìn)行流加培養(yǎng)，其中:每接入IL所述PK-15細(xì)胞，加入片狀載體250g，補(bǔ)充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基至4~5L ; 2)接種病毒的培養(yǎng)及制備病毒液 所述PK-15細(xì)胞在所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)至72小時(shí)后排出細(xì)胞生長(zhǎng)液，將重量百分含量為1%的血清的維持液接入所述生物反應(yīng)器內(nèi)，接入圓環(huán)病毒(YZ株)F15代種毒，病毒接種量為400nmL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，將pH調(diào)整為7.4，溫度設(shè)定為36.5°C，培養(yǎng)至24小時(shí)開(kāi)始收獲毒液并同時(shí)補(bǔ)充新鮮維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至病毒接種后240小時(shí)，其中:所述步驟I)中每接入IL所述PK-15細(xì)胞，每天灌注量為15L ； 3)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述生物反應(yīng)器為續(xù)灌注式生物反應(yīng)器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，在所述步驟I)之前確定的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)圓環(huán)病毒的生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件為:將2 ~3X IO5個(gè)/ml的PK-15細(xì)胞接入到所述生物反應(yīng)器內(nèi)，選用片狀載體，攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，pH為7.2，溫度為37°C，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后開(kāi)始流加灌注培養(yǎng)，至312小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，其中所述生物反應(yīng)器為連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，所述步驟3)包括乳化，乳化后制得PCV-2(YZ株)水包油包水劑型滅活疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述乳化的方法為:將佐劑與合格的滅活抗原等量混合于乳化缸內(nèi)，低速攪拌乳化30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,取乳化后的試劑5~IOmL,以3000r/min離心15分鐘，如有分層現(xiàn)象，重復(fù)乳化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一所述的豬圓環(huán)2型滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK103623402SQ201310618744
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】范娟, 李群, 劉俊斌, 錢鐘, 宋慶慶 申請(qǐng)人:揚(yáng)州優(yōu)邦生物制藥有限公司