基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，本發(fā)明本發(fā)明針對(duì)ORF1基因就PCV1和PCV2的ORF1閱讀框同源性高達(dá)86%進(jìn)行核酸疫苗研究，可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)高水平的抗體，體現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性，針對(duì)PCV1和PCV2引發(fā)豬的感染和傳播，通過(guò)兩種病毒類似的閱讀框?qū)煞N病毒起到防控效果，可達(dá)到安全和有效的效果。
【專利說(shuō)明】基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科（Circoviridae)圓環(huán)病毒 屬成員，單股環(huán)狀DNA病毒，為已知的最小動(dòng)物病毒之一。根據(jù)基因組和抗原性的差異，分 為PCVl和PCV2兩種基因型（或血清型），其中PCVl至今未發(fā)現(xiàn)有致病性，PCV2則被認(rèn)定 是導(dǎo)致仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS) 的主要病原。PCV2常與細(xì)小病毒（PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬肺炎支原 體、偽狂犬病毒（PRV)混合感染，造成豬的免疫失敗。PCVl和PCV2的基因組包含有2個(gè)主 要的開(kāi)放閱讀框，即ORFl和0RF2,病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白由0RF2編碼，ORFl基因編碼Rep和 較小的^兩種與復(fù)制有關(guān)的蛋白。將體外表達(dá)的ORFl編碼蛋白與表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子（GM2CSF)的真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫豬群，能起到抵抗PCV2攻擊的作用，這 提示針對(duì)ORFl基因編碼蛋白的抗體可能具有中和病毒的作用。PCVl與PCV2的ORFl閱讀 框同源性高達(dá)86%，目前大多數(shù)報(bào)道稱PCVl無(wú)致病性，但已有報(bào)道稱其可引起繁殖障礙，豬 圓環(huán)病毒的免疫程序已經(jīng)很成熟，但其帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失卻持續(xù)增加，可以很好的解釋PCVl 的存在對(duì)PCV2的致病性有促進(jìn)作用。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于PCV2基因工程疫苗包括PCV2亞單位疫苗和重組PCV2活載體疫 苗。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原，能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2 的特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亞單位 疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要是昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。其中重組PCV2活載體疫苗又包 括PCV2病毒活載體疫苗和PCV2細(xì)菌活載體疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是：提供一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，它所制備或的 疫苗能有效預(yù)防PCVl及PCV2的感染與傳播，可達(dá)到很好的免疫效果，而不產(chǎn)生致病性，并 體現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，包括如下步驟 1) 將豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因具有如序列 表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴(kuò)增條件為：PCR體系總體積50 μ L，其中CldH2O 為 37 μ L，IOXPCR Buffer 5 μ L，dNTP LO μ L，上下游引物各 LO μ L，DNA 模板 4.0 μ L， Taq酶1.0 yL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 I. 5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后延伸72°C IOmin ;上游引物的序列為Primer F 5' -CGGGT ACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3'，下游引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITT CATATGGAA-3;； 2) 將擴(kuò)展獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，在37°C下培養(yǎng)12 h，挑取上述白色菌落，接種到含有氨芐青霉素的2XYT液體 培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定； 3) 將重組質(zhì)粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化 目的片段，將二者用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，用試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，用試劑盒提取獲得陽(yáng)性重組質(zhì) 粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定； 4) 真核構(gòu)建體系為：目的DNA片段8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA ligase0.5yL、10XT4 DNA ligase buffer I. 5 μ L、滅菌 ddH20 3· O μ L，總體積 15. O μ L ; 5) 培養(yǎng)并收獲處于指數(shù)生長(zhǎng)期的ΡΚ-15細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL營(yíng)養(yǎng)液懸浮細(xì) 胞；然后取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加 I mL上述細(xì)胞懸液和I mL生長(zhǎng)液，放入37°C 5%C02恒溫 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)709Γ80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofecttamine TM2000試劑說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行重組質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平， 同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-Cl和不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照。
[0006] 6)經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后，獲得的pEGFP-Cl- PCV2- ORFl質(zhì)粒作為基于豬圓環(huán)病毒核酸疫 苗。
[0007] 本發(fā)明將針對(duì)PCVl的存在對(duì)PCV2的致病性有促進(jìn)作用這一問(wèn)題設(shè)計(jì)了疫苗，用 于預(yù)防并控制PCVl和PCV2對(duì)豬的感染，適用于對(duì)豬的免疫，為豬圓環(huán)病毒病的防治提供安 全有效的免疫產(chǎn)品，并減少對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明安全性好，針對(duì)豬圓環(huán)病毒其 中一個(gè)重要的閱讀框展開(kāi)研發(fā)，通過(guò)對(duì)豬制定合理的免疫程序，從而達(dá)到對(duì)豬圓環(huán)病毒病 的預(yù)防與控制，可達(dá)到很好的免疫效果，而不產(chǎn)生致病性；本發(fā)明針對(duì)ORFl基因就PCVl和 PCV2的ORFl閱讀框同源性高達(dá)86%進(jìn)行核酸疫苗研究，可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)高水平的 抗體，體現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性；本發(fā)明針對(duì)PCVl和PCV2引發(fā)豬的感染和傳播，通過(guò)兩種病毒 類似的閱讀框?qū)煞N病毒起到防控效果，有很好的科學(xué)性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】 附圖1為本發(fā)明的流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 本發(fā)明的實(shí)施例：基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法： 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒 抽提相關(guān)試劑等。
[0009] 包括如下步驟： 第一，引物的設(shè)計(jì)及合成 引物經(jīng)登錄661161^111^(?^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)獲取3/?-321株（登錄號(hào)疋11747085)、 Vos_2689006 株（登錄號(hào)：EUM555I)、Ρ701-1 株（登錄號(hào)：FJ905468)、PCV2_HZ0 20l 株（登 錄號(hào)：AY-188355)和PCV2herd D株（登錄號(hào)：EU136720)序列，以Bioedit軟件比對(duì)選取保 守序列后經(jīng)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因（具有如序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列)通用引物；上游引物的序列為Primer F 5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，，下游引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA _3' ； 第二，最佳反應(yīng)體系的確定 PCR 體系總體積 50yL，其中 ddH20 37yL，10XPCR Buffer 5yL，dNTP LOyL，上下 游引物各I. 0μ L，DNA模板4. 0 μ L，Taq酶I. 0 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min ;94°C 變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1.5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后延伸72°C IOmin; 第三，最佳反應(yīng)體系的確定 在50. 0 μ L的反應(yīng)體系中，設(shè)定不同的引物濃度各0· 4pmol/ μ L、0. 6pmol/ μ L、 0· 8pmol/ μ L、I. 2pmol/ μ L、I. 6pmol/ μ L，不同的 dNTP 濃度 0· 2nmol/ μ L、0. 3nmol/ μ L、 0· 4nmol/ μ L、0. 5nmol/ μ L、0. 6nmol/ μ L，以最適退火溫度對(duì) Mycoplasma mycoides cluster與Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因部分序列克隆質(zhì)粒等量混合模板進(jìn) 行擴(kuò)增，以確定最佳的反應(yīng)體系； 第四，PCV2-0RF1基因的克隆 PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的條帶的凝膠，參照DNA膠回收試劑盒 說(shuō)明書(shū)回收PCR產(chǎn)物，用常規(guī)方法與PMD18-T載體連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)12 h，挑取上述轉(zhuǎn)化平皿中的白色菌落，接種到含有氨芐青霉 素的2 X YT液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，篩選出陽(yáng) 性并進(jìn)行測(cè)序； 第五，真核質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl的構(gòu)建 重組質(zhì)粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化目的 片段，將二者用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，酶切正確，試劑盒提取獲得陽(yáng)性重組 質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定，并送公司測(cè)序驗(yàn)證。其中真核構(gòu)建 體系為：目的 DNA 片段 8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA IigaseO. 5μ L、10XT4 DNA Iigase buffer I. 5 μ L、滅菌 ddH20 3· 0 μ L，總體積 15. 0 μ L ; 第五，真核質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl體外培養(yǎng) 培養(yǎng)并收獲處于指數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL營(yíng)養(yǎng)液懸浮細(xì) 胞。然后取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加 I mL上述細(xì)胞懸液和I mL生長(zhǎng)液，放入37°C 5% C02恒溫 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)709Γ80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照Lipofecttamine TM2000試劑 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染水 平，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-Cl和不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照； 第七，基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的研究及應(yīng)用，動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)如下： (1) 經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)pEGFP-Cl- PCV2- ORFl后，制備大量無(wú)內(nèi)毒素的pEGFP-Cl- PCV2-ORFl質(zhì)粒，免疫小白鼠，監(jiān)測(cè)小白鼠血清中PCV2-0RF1特異性抗體水平； (2) 5-6周齡小白鼠(購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院）隨機(jī)分成3組，分別為生理鹽水空白組， pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質(zhì)粒試驗(yàn)組，pEGFP-Cl空質(zhì)粒試驗(yàn)組； (3) 免疫程序?yàn)椋合嗤课患∪庾⑸?，在首免?d注射0. 25%普魯卡因100 μ 1/只，每 組質(zhì)粒免疫劑量為100 μ g/只，于首免后間隔I4d加免一次； (4) 分別于首免后0、7、14、21、28、35d小鼠血清，用已建立的間接ELISA法測(cè)定血清中 ORFl抗體的水平；其中所建立的間接ELISA法抗原包被最佳濃度1. 5 μ g/ μ 1，血清最佳稀 釋度為1:10,二抗最佳工作濃度為1:1000 ; (5)PCV2-0RF1抗體陽(yáng)性判定值為0. 231，pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質(zhì)粒刺激小鼠機(jī) 體產(chǎn)生抗體水平出現(xiàn)很高的陽(yáng)性水平； 第八，臨床應(yīng)用 pEGFP-Cl- PCV2- ORFl質(zhì)粒接種免疫豬，監(jiān)測(cè)其刺激豬產(chǎn)生的抗體水平，以驗(yàn)證方法 的臨床應(yīng)用性； 通過(guò)第一至第七步驟的比較及驗(yàn)證，證實(shí)基豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的研究及應(yīng)用確實(shí)能 使小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗豬圓環(huán)病毒的高抗體水平。
[0010] pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質(zhì)粒刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗體水平出現(xiàn)很高的陽(yáng)性水 平，如表1 : 表1抗體檢測(cè)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于：包括如下步驟 1) 將豬圓環(huán)病毒II型0RF1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，豬圓環(huán)病毒II型0RF1基因具有如序 列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴(kuò)增條件為：PCR體系總體積50 y L，其中ddH20 為 37 ii L，10XPCR Buffer 5 ii L，dNTP 1. 0 ii L，上下游引物各 1. 0 ii L，DNA 模板 4. 0 ii L， Taq酶1.0 iiL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 1. 5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后延伸72°C lOmin ;上游引物的序列為5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，下游引物的序列為 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA-3，； 2) 將步驟1)中獲得的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量百分比為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的 條帶的凝膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在37°C下培養(yǎng)12 h，挑取上述白色菌落，接種 到含有氨芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行 酶切鑒定； 3 )將重組質(zhì)粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進(jìn)行Kpnl和Xmal雙酶切，回收純化目 的片段，將二者用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，用試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行Kpnl和Xmal雙酶切，用試劑盒(具體用什么試劑盒？） 提取獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定； 4) 真核構(gòu)建體系為：目的DNA片段8iiL、pEGFP-Cl 2iiL、T4 DNA ligase0.5iiL、10XT4 DNA ligase buffer 1. 5 u L、滅菌 ddH20 3. 0 u L，總體積 15. 0 u L ; 5) 培養(yǎng)并收獲處于指數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL營(yíng)養(yǎng)液懸浮細(xì) 胞；然后取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加1 mL上述細(xì)胞懸液和1 mL生長(zhǎng)液，放入37°C濃度為5%的C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)709T80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofecttamine TM2000試 劑進(jìn)行重組質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平； 6) 將pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后，獲得的pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1質(zhì)粒作為 基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104353084SQ201410234838
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】王開(kāi)功, 郭穎初, 周碧君, 文明, 程振濤 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)