豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)不僅可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)，而且也與 豬皮炎與腎病綜合征（PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、 豬增生性和壞死性肺炎等疾病密切相關(guān)。自從19世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)可致豬的疾病以來(lái)，PCV2 病毒在世界各國(guó)迅速蔓延。目前PCV2在豬群中的感染率非常高，造成豬的生長(zhǎng)緩慢，飼料 報(bào)酬下降，同時(shí)侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬的免疫機(jī)能下降，造成其它疾病的大暴發(fā)。我國(guó) 也于2000年檢測(cè)到了該病毒的存在，該病毒在我國(guó)豬群的感染率近乎50%。目前對(duì)于該病 毒的防制主要是依靠疫苗，而由于該病毒在細(xì)胞上增殖滴度很低，發(fā)展傳統(tǒng)的滅活疫苗和 弱毒疫苗非常困難，因此，研制安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗成為越來(lái)越多研宄者關(guān)注的焦 點(diǎn)，但目前的試驗(yàn)性疫苗誘發(fā)的免疫原性均不夠理想，使得對(duì)于PCV2的新型疫苗的研宄進(jìn) 展一直比較緩慢。
[0003] 構(gòu)建重組桿狀病毒毒株rBac/PCV20RF2可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)重組PCV2-0RF2 蛋白，所表達(dá)的重組0RF2蛋白具有良好的免疫活性和抗原性，可作為預(yù)防圓環(huán)病毒2型感 染引起的相關(guān)疫病用亞單位疫苗。但是該方法需要對(duì)蛋白進(jìn)行純化，然后加入滅活劑、防腐 劑等試劑乳化制苗并進(jìn)行注射免疫，制備疫苗的過(guò)程繁瑣，工藝復(fù)雜，作為常規(guī)注射疫苗， 容易引起應(yīng)激及疫苗吸收問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明旨在提供豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方 法，以解決上述提到的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明提出了豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步 驟：
[0006] 步驟1、將豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因進(jìn)行優(yōu)化改造，并且對(duì)所述0RF2基因序列進(jìn) 行合成，得到PUC18-0RF2質(zhì)粒；
[0007] 步驟2、對(duì)所述pUC18-0RF2質(zhì)粒在大腸桿菌中構(gòu)建pMG36e- 0RF2質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè) 序分析；
[0008] 步驟3、將所述pMG36e- 0RF2質(zhì)粒在乳酸乳球菌MG1363中構(gòu)建，得到乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ；
[0009] 步驟4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156接種到GM17液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)為菌液，28°C靜置培養(yǎng)8-10h，將所述菌液按5%接種到GM17液體培養(yǎng)基中， 28°C靜置培養(yǎng)約12_16h后尚心收集菌體，在所述靜置培養(yǎng)期間每隔4_6h、180_220r/min振 蕩培養(yǎng)IOmin;用滅菌PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集菌體，最后加入生理鹽水與含一定比例 蔗糖和脫脂牛奶的混合液按1:1體積混合均勻，制備疫苗。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備 方法具有以下有益效果：
[0011] 1、本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法不需要對(duì)抗原進(jìn) 行特殊處理，避免了抗原純化，減少抗原損失；
[0012] 2、優(yōu)化基因序列，提尚了抗原表達(dá)量；
[0013] 3、優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，解決了其他原核表達(dá)添加誘導(dǎo)劑對(duì)動(dòng)物存在毒性問(wèn)題以及 高成本問(wèn)題，并且避免了在表達(dá)過(guò)程中添加誘導(dǎo)劑增加污染幾率和加大工作量；
[0014] 4、采用本發(fā)明的方法，成本低，效果顯著；
[0015] 5、本發(fā)明采用口服疫苗，避免了常規(guī)注射疫苗所引起的應(yīng)激及疫苗吸收問(wèn)題。
[0016] 為了上述以及相關(guān)的目的，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例包括后面將詳細(xì)說(shuō)明并在權(quán)利要求 中特別指出的特征。其它的益處和新穎性特征將隨著下面的詳細(xì)說(shuō)明考慮而變得明顯，所 公開(kāi)的實(shí)施例是要包括所有這些方面以及它們的等同。
[0017] 牛物材料保藏
[0018]乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2
[0019] LactococcuslactisMG1363/pMG36e_0RF2
[0020] 保藏日期：2015年3月25日；
[0021] 保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2015156 ;
[0022] 保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC);
[0023] 地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例SDS-PAGE鑒定結(jié)果的示意圖；
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例的Westernblot分析結(jié)果的示意圖。
[0026]圖 1 中，M:Maker，1:乳酸乳球菌MG1363_pMG36e;2:乳酸乳球菌MG1363/ pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ；
[0027]圖 2 中，M:Maker;1:乳酸乳球菌MG1363-pMG36e;2:乳酸乳球菌MG1363/ pMG36e-0RF2CCTCC2015156。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 在以下詳細(xì)描述中，提出大量特定細(xì)節(jié)，以便于提供對(duì)本發(fā)明的透徹理解。但是， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，即使沒(méi)有這些特定細(xì)節(jié)也可實(shí)施本發(fā)明。
[0029] 下面參考附圖和優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述。
[0030] 在一些說(shuō)明性實(shí)施例中，豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法， 包括以下步驟：
[0031] 步驟1、將豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因進(jìn)行優(yōu)化改造，并且對(duì)所述0RF2基因序列進(jìn) 行合成，得到PUC18-0RF2質(zhì)粒；
[0032] 步驟2、對(duì)所述pUC18-0RF2質(zhì)粒在大腸桿菌中構(gòu)建pMG36e-0RF2質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè) 序分析；
[0033] 步驟3、將所述pMG36e- 0RF2質(zhì)粒在乳酸乳球菌MG1363中構(gòu)建，得到乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ；
[0034] 步驟4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156接種到GM17液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)為菌液，28°C靜置培養(yǎng)8-10h，將所述菌液按5%接種到GM17液體培養(yǎng)基中， 28°C靜置培養(yǎng)約12_16h后尚心收集菌體，在所述靜置培養(yǎng)期間每隔4_6h、180_220r/min振 蕩培養(yǎng)IOmin;用滅菌PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集菌體，最后懸浮于裂解緩沖液中進(jìn)行超 聲破碎，并對(duì)破碎產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，表明所表達(dá)的重組蛋白大 小約為30KDa;SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將未染色的蛋白凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用 1 %的BSA封閉，以兔抗PCV2血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG的二抗與之反應(yīng)，最后用 DAB顯色；WesternBlot鑒定結(jié)果如圖2所示，表明重組蛋白具有與豬圓環(huán)病毒2型全病毒 制備的抗血清發(fā)生反應(yīng)的能力，證明乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156表達(dá) 的目的抗原具有了良好的反應(yīng)原性；制備疫苗。
[0035] 基因序列為：
[0036]
[0037]其中，本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法不需要對(duì) 抗原進(jìn)行特殊處理，避免了抗原純化，減少抗原損失；優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，將乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 于GM17 培養(yǎng)基中 28°C靜置培養(yǎng)約 12-16h，期間每隔 4-6h、180-220r/min振蕩培養(yǎng)IOmin左右，即獲得了外源基因正常高效表達(dá)，不需要加入誘 導(dǎo)劑，解決了其他原核表達(dá)添加誘導(dǎo)劑對(duì)動(dòng)物存在毒性問(wèn)題以及高成本問(wèn)題，并且避免了 在表達(dá)過(guò)程中添加誘導(dǎo)劑增加污染幾率和加大工作量。
[0038] 在一些說(shuō)明性實(shí)施例中，所述步驟1中，所述優(yōu)化改造的方法為：將豬圓環(huán)病毒2 型0RF2基因序列中的稀有密碼子替換為偏愛(ài)