密碼子。
[0039] 其中，將稀有密碼子替換為偏愛密碼子，進(jìn)而篩選并得到一條最優(yōu)序列，提高了抗 原表達(dá)量，降低了制苗成本。
[0040] 在一些說明性實(shí)施例中，所述步驟1中，對所述0RF2基因進(jìn)行合成包括以下步 驟：
[0041]所述0RF2基因序列兩端分別加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)SalI和酶切位點(diǎn)SacI，合 成0RF2基因，連接到pBluescriptIISK載體上，按照設(shè)定的SalI和SacI進(jìn)行酶切， 克隆至PUC18質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)胞，選取陽性的所述pUC18-0RF2質(zhì)粒。
[0042] 在一些說明性實(shí)施例中，所述選取陽性的PUC18-0RF2質(zhì)粒，包括以下步驟：挑取 陽性的所述感受態(tài)JM109細(xì)胞的單菌落，OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽性所述 PUC18-0RF2 質(zhì)粒。
[0043] 在一些說明性實(shí)施例中，所述步驟2中，所述構(gòu)建pMG36e-0RF2質(zhì)粒，包括以下步 驟：對所述PUC18-0RF2質(zhì)粒用SalI和SacI進(jìn)行雙酶切，1 %瓊脂凝膠電泳，用DNA凝膠 回收試劑盒回收PUC18-0RF2質(zhì)粒酶切產(chǎn)物中的702bp片段，pMG36e質(zhì)粒同樣用SalI和 SacI進(jìn)行雙酶切，回收載體片段；T4DNA連接酶4°C反應(yīng)過夜，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸 桿菌DH5a，挑取單菌落，菌落擴(kuò)增產(chǎn)物（PCR)鑒定及序列測定分析正確的為陽性的重組質(zhì) 粒，命名為pMG36e- 0RF2。
[0044] 其中，所述正確的陽性的重組質(zhì)粒帶有上述基因序列。
[0045] 在一些說明性實(shí)施例中，所述步驟3中，所述pMG36e-0RF2質(zhì)粒在乳酸乳球菌 MG1363中構(gòu)建，包括以下步驟：所述pMG36e- 0RF2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MG1363,混勻， 冰上放置，將其轉(zhuǎn)入Imm的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，電擊，加入900y1冰預(yù)冷的SGM17培養(yǎng)基，混 勻，將菌液轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管中，放置于冰上，28°C靜置培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于含有 5yg/ml紅霉素的GM17瓊脂培養(yǎng)基上，28°C厭氧培養(yǎng)4天；平板上挑取單個(gè)菌落，分別接種 于GM17液體培養(yǎng)基中，28°C厭氧培養(yǎng)過夜后，從乳酸乳球菌中提取鑒定，將正確的陽性重 組菌命名為乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156。
[0046] 其中，所述正確的陽性重組菌帶有上述基因序列。
[0047] 在一些說明性實(shí)施例中，所述電擊的參數(shù)為：電壓2.OkV，電容25uF，電阻250Q。
[0048] 在一些說明性實(shí)施例中，所述GM17液體培養(yǎng)基中含5yg/ml紅霉素。
[0049] 其中，疫苗具有紅霉素的特性，避免了應(yīng)用過程中豬食用抗生素藥物對疫苗帶來 的負(fù)面影響。
[0050] 在一些說明性實(shí)施例中，所述步驟4中，所述制備疫苗，包括以下步驟：將所述乳 酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156凍干，加入體積1:1的生理鹽水，混合均勻， 即得。
[0051] 其中，制備得到的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗直接灌喂口服即可。 此方法避免了常規(guī)注射疫苗所引起的應(yīng)激及疫苗吸收問題。
[0052] 在一些說明性實(shí)施例中，所述步驟4中，所述制備疫苗還包括對所述乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 進(jìn)行重組菌保存實(shí)驗(yàn)。
[0053]其中，從乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 的培養(yǎng)液中取 200y1， 接種于含紅霉素的100mlGM17培養(yǎng)基中；28°C靜置培養(yǎng)至0D600 = 1. 0,與100mL含一 定比例蔗糖和脫脂牛奶的混合液進(jìn)行1:1混合均勻，分裝為2ml/管，凍干；凍干后分別經(jīng) 過7天、21天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月及12個(gè)月進(jìn)行菌體復(fù)蘇并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示活菌數(shù)均在 10 8CFU/ml，結(jié)果見表1。
[0054] 表1重組菌保存實(shí)驗(yàn)
[0055]
[0056] 疫苗的安全性試驗(yàn)
[0057] 1材料與方法
[0058]I. 1 材料
[0059] I.I. 1試驗(yàn)動物14日齡豬由山東某豬場提供（圓環(huán)檢測為陰性）。
[0060] 1.1. 2試驗(yàn)藥品
[0061] 由本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法制備的3批口服疫 苗，130410,130417,130424,產(chǎn)品經(jīng)各項(xiàng)檢測均合格。稀釋產(chǎn)品至活菌數(shù)為I.OX109/ml。
[0062] 1. 2試驗(yàn)方法
[0063] 本試驗(yàn)共采用了三批實(shí)驗(yàn)室制品，由于試驗(yàn)條件和場地限制，以下試驗(yàn)都是在不 同時(shí)間分別獨(dú)立進(jìn)行。
[0064]I. 2. 1單劑量安全性試驗(yàn)
[0065] 14日齡仔豬80頭，分為4組，每組20頭。試驗(yàn)組3組（灌喂三批口服苗），生理鹽 水對照1組。試驗(yàn)組每頭灌服稀釋后的重組乳酸菌lml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水， 灌服一次后，連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)，并對成 活率、增重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0066] 1. 2. 2單劑量重復(fù)安全性試驗(yàn)
[0067] 14日齡仔豬80頭，分為4組，每組20頭。試驗(yàn)組3組（灌喂三批口服苗），生理 鹽水對照1組。試驗(yàn)組每頭灌服重組乳酸菌lml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水，每天1 次，連用7天，用藥后連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)， 并對成活率、增重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0068] I. 2. 3超劑量安全性試驗(yàn)
[0069] 14日齡仔豬80頭，分為4組，每組20只。試驗(yàn)組3組（灌喂三批口服苗），生理 鹽水對照1組。試驗(yàn)組每頭灌服重組乳酸菌2ml，對照組灌服無菌生理鹽水2ml，灌服1次 后，連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)，并對成活率、增 重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0070] 2 結(jié)果
[0071] 2. 1仔豬單劑量試驗(yàn)，觀察14天后結(jié)果見表2。
[0072] 表2重組制品對14日齡仔豬單劑量使用的安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0073]
[0074] 2. 2仔豬單劑量重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見表3。
[0075] 表3重組制品對14日齡仔豬單劑量重復(fù)使用的安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0076]
[0077] 2. 3仔豬超劑量注射試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果見表4。
[0078] 表4重組制品對14日齡仔豬超劑量使用的安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0079]
[0080] 3 結(jié)論
[0081] 各試驗(yàn)組仔豬在灌服重組乳酸菌后，連續(xù)14天觀察仔豬的反應(yīng)，仔豬無腹瀉、采 食量下降等不良癥狀，所有試驗(yàn)仔豬均健康存活，體重增加。試驗(yàn)結(jié)束后隨機(jī)挑選4頭剖 殺，觀察剖檢變化，各組仔豬剖檢的組織和器官與生理鹽水對照組基本無差別。
[0082] 疫苗的效力試驗(yàn)
[0083] 1材料與方法
[0084]I. 1 材料
[0085] I.I. 1試驗(yàn)動物14日齡豬由山東某豬場提供（圓環(huán)檢測為陰性）。
[0086] 1.1. 2試驗(yàn)藥品
[0087] 由本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位口服疫苗的制備方法制備的3批口服疫 苗，130410,130417,130424,產(chǎn)品經(jīng)各項(xiàng)檢測均合格。稀釋產(chǎn)品至活菌數(shù)為I.OX109/ml。
[0088] 1. 2試驗(yàn)方法
[0089] 本試驗(yàn)共采用了三批實(shí)驗(yàn)室制品，由于試驗(yàn)條件和場地限制，以下所有試驗(yàn)都是 在不同時(shí)間分別獨(dú)立進(jìn)行。
[0090] I.2. 1免疫接種試驗(yàn)
[0091] 14日齡仔豬40頭，分為4組，每組10頭。試驗(yàn)組3組（灌喂三批口服苗），生理鹽 水對照1組。試驗(yàn)組每頭灌服稀釋后的重組乳酸菌lml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水， 灌服一次后，連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹