專利名稱：一種豬疫苗使用的pIFN－γ基因佐劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬疫苗使用的佐劑和其制備方法，以及用本發(fā)明的佐劑構(gòu)成的豬用疫苗。
背景技術(shù)：
自從上世紀20年代以來，許多物質(zhì)被嘗試作為免疫佐劑，但只有鋁膠佐劑獲得了人類疫苗的許可，并大量用于豬疫苗。它作為抗原的儲存庫和載體，緩慢釋放抗原從而延長誘導機體的體液免疫反應(yīng)，但缺點是僅誘導Th2體液免疫反應(yīng)，抗體以IgG1型為主，無TCL反應(yīng)。油佐劑和弗氏完全佐劑雖能明顯提高免疫應(yīng)答能力，但在實際應(yīng)用中常出現(xiàn)不良反應(yīng)，如注射部位腫脹、疼痛、發(fā)燒，或發(fā)生過敏等，僅限用于實驗室動物試驗。206佐劑是目前商品化的高效動物疫苗油佐劑，已廣泛使用于動物疫苗中，實踐證實是可靠的、有效的和安全的，但需要進口，價格較高。
我國是世界養(yǎng)豬大國，2002年以來生豬飼養(yǎng)量在11億頭以上，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有較大的比重，同時養(yǎng)豬業(yè)也是我國部分省區(qū)的主要生產(chǎn)支柱和新的經(jīng)濟增長點。但面對當前養(yǎng)豬業(yè)重大疫病發(fā)生和流行愈加復雜的形勢——舊病未除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學理論和生產(chǎn)技術(shù)來發(fā)展豬用安全、高效疫苗預防和控制各種疫病的發(fā)生和流行，而佐劑研制是疫苗研究的主要組成部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的供豬疫苗使用的基因佐劑，這種佐劑可使低應(yīng)答或無應(yīng)答以及應(yīng)答不全的疫苗產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種以本發(fā)明前述的基因佐劑與現(xiàn)有的某種佐劑配伍的新佐劑。
本發(fā)明的第三個目的是提供本發(fā)明的基因佐劑的制備方法。
本發(fā)明的第四個目的是提供兩類采用本發(fā)明佐劑的豬用疫苗。
本發(fā)明的豬疫苗使用的基因佐劑是指包含有豬γ-干擾素基因(pIFN-γ)的佐劑。
本發(fā)明的一個具體實例的佐劑為動物細胞表達質(zhì)粒pcDNA3.1和豬γ-干擾素基因(pIFN-γ)的重組質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ。
本發(fā)明所述的基因佐劑與現(xiàn)有的某種佐劑配伍的新佐劑是pcDNA-pIFN-γ基因佐劑和206佐劑的配伍。
本發(fā)明所述的佐劑中的豬干擾素-γ基因的重組質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ的制備方法是將豬的pIFN-γ分泌細胞經(jīng)刺激誘導培養(yǎng)后，采用RT-PCR技術(shù)擴增克隆獲得全基因序列，再根據(jù)pcDNA3.1載體的特性在豬IFN-γ基因閱讀框兩側(cè)設(shè)計表達型引物克隆其全基因序列，并引入相應(yīng)的酶切位點，擴增后用相應(yīng)的酶分別同時酶切目的基因和載體，用T4連接酶連接重組，構(gòu)建環(huán)形重組表達質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ，將所得的重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行擴增培養(yǎng)，然后再用堿性裂解法大量提取和純化所述這些目的基因的重組表達質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明的兩類豬疫苗是豬抗囊尾蚴病的疫苗組合物和豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗組合物，這兩類疫苗組合物分別是豬抗囊尾蚴病的疫苗組合物是由含有選自豬囊尾蚴蟲體抗原和TSO18重組抗原疫苗，與本發(fā)明的基因佐劑或基因佐劑與206佐劑的混合或乳化而成；豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗組合物是由豬口蹄疫病毒滅活疫苗與與本發(fā)明的基因佐劑或基因佐劑與206佐劑的混合或乳化而成。
細胞因子是機體內(nèi)免疫細胞或非免疫細胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學活性的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細胞，對免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用(孫衛(wèi)民等編著.細胞因子研究方法學，1999年第一版)。早在DNA疫苗產(chǎn)生之前就有人把細胞因子作為佐劑與疫苗聯(lián)用，但由于細胞因子在體內(nèi)細胞或體液中含量極低，且半衰期太短，故人工提取造價昂貴，未能在傳統(tǒng)疫苗中廣泛應(yīng)用。受DNA疫苗以質(zhì)粒作為抗原載體的啟發(fā)，構(gòu)建細胞因子重組表達質(zhì)粒的形式在動物體內(nèi)表達而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用即基因佐劑。用細胞因子基因佐劑與疫苗同時注射，可使低應(yīng)答或無應(yīng)答以及應(yīng)答不全的疫苗產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。這是建立本發(fā)明的佐劑的理論依據(jù)。
干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)是一種具有強烈抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，主要由激活的T細胞和NK細胞產(chǎn)生。IFN-γ是一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有強烈的免疫調(diào)節(jié)作用，對寄生在細胞內(nèi)的各種病原體均具有有效的抑制作用。無論作為疫苗佐劑或其它類型的生物制劑，IFN-γ均可明顯提高機體抗感染能力，主要是一種Th1類細胞因子基因佐劑。
本發(fā)明的基因佐劑的優(yōu)越性有1)在宿主體內(nèi)表達所所需的細胞因子，在構(gòu)象上接近天然分子結(jié)構(gòu)，活性不受影響；2)一次少量給予即可長時間低量表達，無須多次給藥；3)制備簡單，質(zhì)量易于控制，易規(guī)?；a(chǎn)，成本低廉，易于保存和運輸；4)安全性好。細胞因子是機體內(nèi)本身存在的免疫調(diào)節(jié)分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的控制；5)易于構(gòu)建和改造。利用分子生物學技術(shù)在基因水平可自由地選擇細胞因子種類，實現(xiàn)人們所期望的免疫應(yīng)答強度和類型。一般情況下，接種某種類型的細胞因子(Th1或Th2類)質(zhì)?？纱龠M相應(yīng)類型的免疫反應(yīng)。
經(jīng)相關(guān)的實驗表明，本發(fā)明的基因佐劑具有可使低應(yīng)答或無應(yīng)答以及應(yīng)答不全的疫苗產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)的作用，采用本發(fā)明的佐劑的疫苗較不使用佐劑的疫苗有更強烈的免疫作用。而采用本發(fā)明的基因與206佐劑配伍而成的新佐劑時，可兼有兩類不同佐劑的優(yōu)點，同時可以大大降低佐劑的制備成本。而本發(fā)明的方法提供了制備本發(fā)明的基因佐劑或配伍佐劑的有效措施。


圖1pcDNA-pIFN-γ表達質(zhì)粒對豬囊尾蚴蟲體抗原的免疫抗體的增強效果。圖1中CAg代表豬囊尾蚴抗原；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)粒；V代表pcDNA空質(zhì)粒；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸代表ELISA法檢測的OD值，橫軸代表免疫后的天數(shù)。
圖2pcDNA-pIFN-γ表達質(zhì)粒對豬囊尾蚴病TS018重組抗原的免疫抗體的增強效果。圖2中TSO18代表豬囊尾蚴病重組抗原；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)粒；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸代表ELISA法檢測的OD值，橫軸代表免疫后的天數(shù)。
圖3pcDNA-pIFN-γ表達質(zhì)粒對豬口蹄疫滅活疫苗的免疫抗體滴度的增強效果。圖3中FAg代表豬口蹄疫滅活疫苗；IFN代表pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)粒；V代表pcDNA空質(zhì)粒；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液?？v軸代表阻斷ELISA法檢測的抗體滴度值，橫軸代表免疫后的天數(shù)。
具體實施例方式
本發(fā)明的佐劑的制備方法詳述如下(1)從豬外周血或淋巴結(jié)中分離單個核細胞，經(jīng)誘導劑刺激培養(yǎng)后，RT-PCR克隆出目的細胞因子基因，經(jīng)序列同源性、遺傳演化關(guān)系以及其分子結(jié)構(gòu)與功能預測分析后，作為基因佐劑的候選基因；(2)采用基因工程重組技術(shù)，選擇合適的含酶切位點的表達型引物將目的細胞因子基因克隆入動物細胞表達質(zhì)粒載體；(3)用步驟(2)所得的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養(yǎng)；和(4)大量提取和純化目的基因的重組質(zhì)粒DNA。
其中步驟(2)中的質(zhì)粒載體是基因工程核酸疫苗中常用的載體即pcDNA3.1質(zhì)粒載體，用于目的基因的擴增，并使細胞因子在動物體內(nèi)穩(wěn)定、持久表達，以保持其佐劑效應(yīng)。這類載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，添加的酶切位點和克隆的方法是現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)手段，酶切位點通常是其多克隆位點的特定位點。
步驟(3)中的原核宿主菌也是基因工程領(lǐng)域中常用的，能夠大量擴增重組質(zhì)粒，例如大腸桿菌。宿主細胞的轉(zhuǎn)化、陽性克隆的篩選、序列測定、宿主菌株的培養(yǎng)以及重組表達質(zhì)粒的提取純化都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如描述于Sambrook等人的《Molecular CloningA Laboratory Manual》(紐約，冷泉港實驗室，2001年)。
以下是本發(fā)明的一個具體的實施例從長白豬外周血或淋巴結(jié)中用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，經(jīng)誘導劑(PHA、LPS或二者聯(lián)合)37℃刺激培養(yǎng)后，在不同時間段提取已刺激培養(yǎng)細胞的總RNA或mRNA，設(shè)計特異性引物(pIFN-γ的上游引物5′-CGGAATTCCTCTCCGAAACAATGAGTT-3′，下游引物5′ATTGCGGCCGCTGCAGGCAGGATGACAAT-3，酶切位點為EcoR I和NotI)，以其為模板RT-PCR克隆出目的細胞因子基因pIFN-γ的全序列，分別經(jīng)序列同源性、遺傳演化關(guān)系以及其分子結(jié)構(gòu)與功能預測分析后，作為基因佐劑的候選基因，即通過基因工程重組技術(shù)，定向?qū)⑵淇寺∪雱游锛毎磉_質(zhì)粒載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組表達載體pcDNA-pIFN-γ；將重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)所得產(chǎn)物的基因序列見后。
選擇細胞因子重組質(zhì)粒的高拷貝陽性菌株，接種到1000ml含氨芐的LB培養(yǎng)基中，在搖床中220rpm 37℃培養(yǎng)12～14小時后，用SDS堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒。粗提取的質(zhì)粒經(jīng)5M冰冷的LiCl分離后，其上清用等體積異丙醇沉淀，再用70％乙醇洗滌沉淀，離心除去上清；將沉淀用含RNase的TE緩沖液溶解，室溫處理30分鐘后，再用酚氯仿抽提2次，2倍無水乙醇沉淀離心；用1ml滅菌水溶解沉淀后，加入0.5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入40％PEG 8000)，充分混勻后放置15分鐘，13000rpm離心20分鐘，沉淀用70％的乙醇洗滌2次，再用TE緩沖液或無菌水溶解沉淀，即得到所謂的佐劑，經(jīng)用核酸蛋白檢測儀分別測定其含量和純度，在4℃保存?zhèn)溆谩?br> 以下為本發(fā)明基因佐劑的中pIFN-γ基因及其推導氨基酸序列atg agt tat aca act tat ttc tta gct ttt cag ctt tgc gtg act 45Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Thr-23 -20-15 -10ttg tgt ttt tct ggc tct tac tgc cag gcg ccc ttt ttt aaa gaa 90Leu Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu-5 -1 1 5ata acg atc cta aag gac tat ttt aat gca agt acc tca gat gta 135Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp Val10 15 20cct aat ggt gga cct ctt ttc tta gaa att ttg aag aat tgg aaa 180Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys25 30 35gag gag agt gac aaa aaa ata att cag agc caa att gtc tcc ttc 225Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe40 45 50tac ttc aaa ttc ttt gaa atc ttc aaa gat aac cag gcc att caa 270Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln55 60 65agg agc atg gat gtg atc aag caa gac atg ttt cag agg ttc cta 315Arg Ser MET Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu70 75 80aat ggt agc tct ggg aaa ctg aat gac ttc gaa aag ctg att aaa 360Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile Lys85 90 95att ccg gta gat aat ctg cag atc cag cgc aaa gcc atc agt gaa 405
Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu100 105 110ctc atc aaa gtg atg aat gat ctg tca cca aga tct aac cta aga 450Leu Ile Lys Val MET Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg115 120 125aag cgg aag aga agt cag act atg ttc caa ggc cag aga gca tca 495Lys Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser130 135 140aaa taa 501Lys***本發(fā)明的佐劑對疫苗免疫作用的影響見下述的相關(guān)實驗1、pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)?；蜃魟ωi囊尾蚴病抗原的免疫增強作用(1)將重組表達質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ與豬囊尾蚴蟲體抗原(200μg/只)配伍，制備疫苗免疫小鼠，以206佐劑(200μl/只)和pcDNA3.1空載體(100μg/只)為佐劑對照，接種劑量400μl，后肢股內(nèi)側(cè)各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加強免疫一次。在免疫后不同時間剪尾采血分離血清，測定血清中的抗體和免疫脾細胞分泌IFN-γ的含量。試驗證明pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)粒能明顯增強小鼠抗豬囊尾蚴蟲體抗原的體液免疫水平，稍高于或相當于206佐劑的免疫增強水平，且明顯高于空質(zhì)粒免疫對照組，(見圖1)。
(2)將重組表達質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ和206佐劑(250μl/頭)配伍與豬囊尾蚴病TS018重組抗原(200μg/只)組合，制備分子疫苗免疫家豬(500μl/頭)，在首免后7天，進行二免，二免后7天攻擊感染(25000個豬帶絳蟲蟲卵)，隨后采血檢查抗體，以及在感染后90天屠殺動物檢查囊尾蚴寄生情況，確定免疫保護效果。結(jié)果表明在誘導的抗體水平方面，pcDNA-pIFN-γ佐劑組顯著低于免疫對照組；但在減蟲率方面也顯著高于免疫對照組，參見附圖2。
2、pcDNA-pIFN-γ重組表達質(zhì)?；蜃魟ωi口蹄疫滅活疫苗的作用將重組表達質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ100μg單獨分別與豬口蹄疫滅活抗原(200μg/只)配伍，制備疫苗免疫小鼠(400μl/只)，以206佐劑(200μl/只)和pcDNA3.1空載體(100μg/只)為佐劑對照，后肢股內(nèi)側(cè)各注射200μl；在第一次免疫后，25d和63d各加強免疫一次。在免疫后不同時間剪尾采血分離血清，用液相阻斷ELISA法檢測口蹄疫抗體滴度。發(fā)現(xiàn)該種豬細胞因子重組質(zhì)粒基因佐劑對豬口蹄疫抗原有較強的佐劑效應(yīng)或免疫調(diào)節(jié)作用，其抗體滴度在初次免疫后90天可達300左右(見圖3)。
上述實驗表明，本發(fā)明的佐劑性能具體表現(xiàn)在(1)能顯著增強豬囊尾蚴病蟲體抗原和重組抗原的免疫效果。
a.在實驗動物小鼠該細胞因子重組質(zhì)粒同時與豬囊尾蚴蟲體抗原組合配制疫苗肌肉接種免疫小鼠，其能夠在小鼠體內(nèi)表達，調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，其增強囊尾蚴蟲體抗原誘導體液反應(yīng)的能力高于或相當于206標準佐劑，但其增強免疫應(yīng)答的強度和類型與細胞因子的種類有關(guān)。
b.在靶動物豬IFN-γ重組表達質(zhì)粒同時與豬囊尾蚴病TS018重組抗原組合配制分子疫苗肌肉接種免疫家豬，在體內(nèi)表達的這些細胞因子能調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，其中IFN-γ轉(zhuǎn)化淋巴細胞的能力明顯高于其他對照組，即細胞免疫水平較高；在攻擊感染保護方面，本發(fā)明的佐劑顯著增強宿主對豬帶絳蟲蟲卵的攻擊感染，其中減蟲率高達92％，而免疫對照組的減蟲率僅為70％。
(2)能顯著增強豬口蹄疫滅活抗原疫苗的免疫效果。用本發(fā)明的基因佐劑同時與豬口蹄疫滅活抗原疫苗肌肉接種免疫小鼠，重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)表達的這種細胞因子能夠調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，其增強豬口蹄疫滅活抗原疫苗誘導體液反應(yīng)的能力顯著高于標準疫苗對照，其誘導的抗體滴度在免疫后90天時可達300以上，而空質(zhì)粒標準疫苗對照組僅為60左右。
(3)該細胞因子重組表達質(zhì)粒具有使用劑量小，毒性低的特性。分別用100μg、300μg劑量的重組質(zhì)粒免疫刺激小鼠和家豬，可達到比206佐劑標準劑量更好的免疫效果，也未發(fā)現(xiàn)對小鼠和家豬的毒副作用。
(4)該豬細胞因子重組表達質(zhì)粒對小鼠的免疫刺激也具有交叉活性，因此該類基因佐劑適應(yīng)的動物譜和抗原譜較廣，實驗動物小鼠可作為該基因佐劑效果評價的動物模型。
有關(guān)的實驗還表明，當本發(fā)明的基因佐劑與206佐劑配伍可形成一種新的佐劑，既可以減小206佐劑的使用量，又可以兼有兩類不同佐劑的優(yōu)點。至于其具體的配伍比例可通過試驗確定。
權(quán)利要求
1.一種豬疫苗使用的基因佐劑，其特征在于該基因佐劑包含有豬γ-干擾素基因(pIFN-γ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疫苗使用的基因佐劑，其特征在于這種佐劑為動物細胞表達質(zhì)粒pcDNA3.1和豬γ-干擾素基因(pIFN-γ)的重組質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ。
3.一種豬疫苗使用的佐劑，其特征在于佐劑為動物細胞表達質(zhì)粒pcDNA3.1和豬γ-干擾素基因(pIFN-γ)的重組質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ的基因佐劑與206佐劑的配伍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的豬疫苗使用的佐劑中的豬γ-干擾素基因的重組質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ的制備方法，其特征在于將豬pIFN-γ分泌細胞經(jīng)刺激誘導培養(yǎng)后，采用RT-PCR技術(shù)擴增克隆獲得全基因序列，再根據(jù)pcDNA3.1載體的特性在豬IFN-γ基因閱讀框兩側(cè)設(shè)計表達型引物克隆其全基因序列，并引入相應(yīng)的酶切位點，擴增后用相應(yīng)的酶分別同時酶切目的基因和載體，用T4連接酶連接重組，構(gòu)建環(huán)形重組表達質(zhì)粒pcDNA-pIFN-γ，將所得的重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行擴增培養(yǎng)，然后再用堿性裂解法大量提取和純化所述這些目的基因的重組表達質(zhì)粒DNA。
5.一種豬抗囊尾蚴病的疫苗組合物，其特征在于組合物由含有選自豬囊尾蚴蟲體抗原和TSO18重組抗原疫苗，與權(quán)利要求1或2或3所述的佐劑混合或乳化而成。
6.一種豬口蹄疫病毒滅活疫苗組合物，其特征在于豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與權(quán)利要求1或2或3所述的佐劑混合或乳化而成。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬疫苗使用的佐劑和其制備方法，以及用本發(fā)明的佐劑構(gòu)成的豬用疫苗。本發(fā)明的豬疫苗使用的基因佐劑是指包含有豬γ－干擾素基因(pIFN－γ)的佐劑，或者本發(fā)明的佐劑為動物細胞表達質(zhì)粒pcDNA3.1和豬γ－干擾素基因(pIFN－γ)的重組質(zhì)粒pcDNA－pIFN－γ，或者是由pcDNA－pIFN－γ與206佐劑配伍的佐劑。本發(fā)明的豬疫苗是豬用抗囊尾蚴蟲的疫苗組合物和豬口蹄疫病毒滅活疫苗與基因佐劑的組合物。本發(fā)明的佐劑制備采用基因克隆，重組和重組質(zhì)粒的擴增、提取和純化等方法。
文檔編號A61P31/00GK1772297SQ200510119720
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者景志忠, 才學鵬, 竇永喜, 蒙學蓮, 王佩雅, 陳國華, 羅啟慧, 袁改玲, 侯俊玲, 駱學農(nóng) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所