Nras基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種NRAS基因突變檢測試劑盒，該試劑盒可用于檢測與癌癥有關(guān)的NRAS基因突變。所述試劑盒包含：(1)內(nèi)參檢測試劑，其包含內(nèi)參基因特異性引物、內(nèi)參基因特異性探針及dNTP溶液；(2)NRAS突變檢測試劑，其包含NRAS基因突變型特異性引物、NRAS基因突變型特異性探針、內(nèi)控基因特異性引物、內(nèi)控基因特異性探針及dNTP溶液；(3)Taq DNA聚合酶；和(4)NRAS陽性質(zhì)控品。
【專利說明】NRAS基因突變檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因突變檢測。具體地說，本發(fā)明涉及NRAS基因突變檢測試劑盒，該 試劑盒可用于檢測與癌癥有關(guān)的NRAS基因突變。

【背景技術(shù)】
[0002] Ras基因是一種原癌基因，最初從Harvey, Kirsten大鼠肉瘤病毒（rat sarcoma) 中克隆所得，被稱為HRas和KRas[1]。后來將人神經(jīng)母細胞瘤DNA感染NIH3T3細胞時發(fā)現(xiàn) 另一種相似的基因，被稱為NRas，三者是Ras基因家族最主要的成員 [2]。功能上Ras蛋白 具有分子開關(guān)的作用，正常表達下，能夠調(diào)控細胞生長。發(fā)生點突變，過表達或者基因易位 等異常情況會導致細胞異常增殖，并最終引發(fā)腫瘤形成，超過30%的人類腫瘤存在Ras的 突變 [3'4]?，F(xiàn)在研究最為深入的是KRas，其過表達和突變普遍發(fā)生在甲狀腺癌，乳腺癌等很 多癌癥中，在北美肺腺癌患者中，其突變率更是高達25%。并且KRas還與TKI耐藥有關(guān)，所 以它成為很多腫瘤診斷和治療的分子標志，在臨床上發(fā)揮了重要意義 [5'6]。作為Ras家族的 另一成員，NRas在結(jié)構(gòu)和功能上都與KRas具有很多相似性，并隨著近年研究的加深，逐漸 成為繼KRas之后另一個為臨床病情評估和治療提供重要依據(jù)的分子指標。
[0003] NRas基因位于人類1號染色體短臂上（1ρ22-ρ32)，編碼具有189個氨基酸p21 蛋白 [7]。NRas蛋白與Ras家族其他蛋白具有高達85%同源性，這些高度保守的結(jié)構(gòu)域包 括對蛋白功能發(fā)揮起著極其重要作用的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP)和 效應(yīng)分子的結(jié)合域以及將NRas蛋白定位于質(zhì)膜上的法尼基轉(zhuǎn)移酶作用位點-C端的CAAX 基序等[8'9]。所以功能上NRas也具有很多RAS家族蛋白共同的特征：位于細胞膜內(nèi)側(cè)，屬 于一種低分子量G蛋白，對鳥苷酸具有很強的親和性并具有GTPase活力；具有GTP結(jié)合 (Ras. GTP)及⑶P結(jié)合（Ras.⑶P)兩種構(gòu)象，在一定條件下二者可以發(fā)生互變；當Ras蛋 白與GDP結(jié)合時為失活狀態(tài)，與GTP結(jié)合時，為活化狀態(tài)，激活下游信號通路，由此在信號 傳導中起著極為重要的開關(guān)作用 [1°'11]。NRAS激活的下游信號通路也是現(xiàn)在研究最為明確 的 RAS 信號通路：PTK (protein tyrosine kinase) -Grb2 (growth factor receptor-bound protein2)-Ras-Raf-MAPK(mitogen activated protein kinase)-ERK(extracellular signal-regulated kinase)通路[12]。當外源刺激如生長因子（EGF)等與胞膜受體（EGFR) 結(jié)合，使受體上相應(yīng)的酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的酪氨酸殘基與Grb2的SH2區(qū)結(jié)合后，招 募鳥氨酸交換因子（S0S)與Grb2的SH3區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物Grb2-S0S，該復(fù)合物與Ras結(jié)合 并使Ras-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽as-GTP，從而激活Ras。激活后的Ras再激活下游Raf激酶，Raf激 酶磷酸化ΜΑΡΚ，MAPK激活ERK。ERK被激活后，轉(zhuǎn)至細胞核內(nèi)，直接激活c-myc各種轉(zhuǎn)錄因 子，從而參與細胞生長，發(fā)育，分裂及分化等多種生理過程 [13]。當NRas發(fā)生突變時，會導致 下游Raf以及MAPK等的異常激活從而在腫瘤惡變中起重要作用[14]。
[0004] Ras蛋白的突變主要發(fā)生在第12,13, 59和61位密碼子上，其中12,61位突變頻 率最高[15]。在不同癌癥中，突變類型不一樣，非小細胞肺癌中，主要的突變?yōu)榈?2位密碼 子中的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，而在結(jié)腸癌中同一位置主要是鳥嘌呤被腺嘌呤取代 [16]。 NRas突變主要發(fā)生在第61位密碼子，并且在黑色素瘤中頻率較高。Thoams等人利用突變 (mutation)和黑色素瘤（melanoma)為關(guān)鍵詞在pubmed中檢索分析了 1966年-2006年發(fā) 表的文章，發(fā)現(xiàn)在表面擴散和結(jié)節(jié)性黑色素瘤中NRas的突變率高達28% [17]。Vikas等人在 60例原發(fā)性黑色素瘤中檢測到10例（17%，10/16) NRas的突變，且這些突變?nèi)繛?1位密 碼子的突變[18]。非常值得關(guān)注的是，近年NRas已被確認為肺癌發(fā)生的驅(qū)動基因。Kris等 在 2011 年 ASC0 上發(fā)表了來自 LCMC (NCI ' s Lung Cancer Mutation Consortium)的一項研 究，對1000例肺腺癌標本中KRas，EGFR，NRas等10種驅(qū)動基因進行檢測，全部患者為Illb 期/IV期，并且有足夠的組織標本。研究共入組830例患者，60%患者有驅(qū)動基因突變，其 中NRas的突變率為0. 2% [19'2°]。
[0005] 由于Ras突變對腫瘤的影響大多集中在Ras/Raf/MEK/ERK通路上，所以現(xiàn)在針對 Ras突變的靶向抗腫瘤藥物主要集中在對該信號通路中的不同節(jié)點的靶向干預(yù)上。已開發(fā) 的藥物包括對Ras膜結(jié)合和脂質(zhì)修飾進行干擾的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（FTIs)，如替吡法尼 (tipifarnib)等[ 21]，針對Raf活化的ATP間接競爭劑索拉菲尼（sorafenib) [22'23]，針對MEK 靶向干預(yù)的CI-1040和AZD6244,其中后者已經(jīng)進入臨床試驗[24]。由于ERK是目前所知的 MEK唯一的底物，通常被描述為Ras下游的單一通路，所以人們一般認為只要在MEK靶點進 行抑制就等于阻斷了變異Ras引起的ERK的活化，還可以避免其他通路干擾所導致的無效 革巴向影響 [9]。
[0006] 需要特別指出的是，最新的研究表明，NRas突變與肺癌治療中的TKI耐藥有關(guān)。與 吉非替尼（gefitinib)敏感的PC-9細胞（PC-9/WT)相比，在產(chǎn)生吉非替尼耐藥的PC-9細胞 (PC-9/gef)中并未檢測到KRas，HER2等EGFR-TKIs耐藥基因，而發(fā)現(xiàn)了 NRas的61位密碼 子突變。并且，在吉非替尼或AZD6244/CI1040單獨用藥均不能促使細胞凋亡的情況下，兩 者聯(lián)合用藥時則可以有效促進細胞凋亡 [25]。這些實驗結(jié)果均表明，NRas突變在肺癌治療 的TKI耐藥中可能發(fā)揮著重要作用，這為肺癌檢測與治療提供了新的依據(jù)和可能。
[0007] 總之，越來越多的證據(jù)顯示，NRas突變在人類黑色素瘤，肺癌等很多腫瘤的發(fā)生發(fā) 展中具有重要意義。對其突變的檢測可準確預(yù)測對應(yīng)靶向藥物治療的有效性，便于臨床用 藥選擇，顯著提高治療效果，使患者最大程度受益；同時，還可以避免不合理用藥造成的病 人醫(yī)療費用負擔及社會醫(yī)療資源浪費，減少不必要的時效損失以及經(jīng)濟損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對以下檢測位點設(shè)計了檢測試劑盒：
[0009] 表1.突變檢測位點
[0010]

【權(quán)利要求】
1. 一種NRAS基因突變檢測試劑盒，其包含： (1) 內(nèi)參檢測試劑，其包含內(nèi)參基因特異性引物、內(nèi)參基因特異性探針及dNTP溶液； (2) NRAS突變檢測試劑，其包含NRAS基因突變型特異性引物、NRAS基因突變型特異性 探針、內(nèi)控基因特異性引物、內(nèi)控基因特異性探針及dNTP溶液； (3) Taq DNA聚合酶；和 (4) NRAS陽性質(zhì)控品，其包含內(nèi)參基因、NRAS基因突變型及內(nèi)控基因片段。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參檢測試劑中內(nèi)參基因特異性引物為SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2。
3. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參檢測試劑中內(nèi)參基因特異性探針為SEQ ID No ：16〇
4. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS突變檢測試劑中的NRAS基因突變型選自： NM1，即NRAS基因12密碼子34G > A ; NM2,即NRAS基因12密碼子35G > A ; NM3,即NRAS基因13密碼子38G > A ; NM4,即NRAS基因61密碼子181C > A ; NM5,即NRAS基因61密碼子182A > T ; NM6,即NRAS基因61密碼子182A > G ;和 NM7,即NRAS基因61密碼子183A > T。
5. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS突變檢測試劑中NRAS基因突變型特異性 引物如下： 針對NM1突變的引物為SEQ ID No :5和SEQ ID No :8 ; 針對NM2突變的引物為SEQ ID No :6和SEQ ID No :8 ; 針對NM3突變的引物為SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ; 針對NM4突變的引物為SEQ ID No :9和SEQ ID No :13 ; 針對NM5突變的引物為SEQ ID No :10和SEQ ID No :13 ; 針對NM6突變的引物為SEQ ID No :11和SEQ ID No :13 ; 針對NM7突變的引物為SEQ ID No :12和SEQ ID No :13。
6. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS突變檢測試劑中NRAS基因突變型特異性 探針選自 SEQ ID No :14 或 SEQ ID No :15。
7. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS突變檢測試劑中內(nèi)控基因特異性引物為 SEQ ID No :3 和 SEQ ID No :4。
8. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS突變檢測試劑中內(nèi)控基因特異性探針為 SEQ ID No ：17〇
9. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述探針的5'端連接FAM基團，3'端連接BHQ1基 團。
10. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述dNTP溶液的終濃度為400 μ M。
11. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參基因序列為SEQ ID No :18。
12. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述內(nèi)控基因序列為SEQ ID No :19。
13. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述NRAS基因序列為SEQ ID No :20或SEQ ID No: 21。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232750SQ201410234740
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】莫敏俐, 李暉, 陳釗, 丁鳳, 李雋
申請人:嘉興雅康博醫(yī)學檢驗所有限公司