專(zhuān)利名稱(chēng)：一種流感病毒裂解疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫 苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道傳播疾病，接種流感疫苗是預(yù)防流感 的有效手段。傳統(tǒng)的流感病毒疫苗包括流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亞單位 疫苗，這些疫苗均采用肌肉注射方法，不含佐劑。CpG ODN(oligodeoxynucleotides，0DN)是一種含有非甲基化 CpG 二核苷酸序 列的單鏈寡核苷酸，CpG ODN可以被免疫細(xì)胞上I10Il樣受體9 (Toll-like receptor 9， TLR-9)所識(shí)別，并增強(qiáng)免疫反應(yīng)。美國(guó)Dynavax公司以CpG ODN為佐劑的重組乙肝疫苗在 三期臨床研究中顯示了優(yōu)于普通乙肝疫苗的免疫效果，接種兩針后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到95%， 而普通乙肝疫苗接種三針后陽(yáng)轉(zhuǎn)率為81%。鋁佐劑于1擬6年研制成功并普遍應(yīng)用至今。由于鋁佐劑可以吸附抗原，對(duì)抗原起 到緩釋作用，被普遍應(yīng)用于蛋白類(lèi)疫苗的生產(chǎn)。其作用主要是刺激Th2有關(guān)抗體產(chǎn)生，增強(qiáng) 體液免疫應(yīng)答，但近年研究結(jié)果表明鋁佐劑對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用不是很明顯。傳統(tǒng)的流感病毒疫苗為流感病毒滅活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人劑量 是含每型血凝素15微克，兒童劑量是含每型血凝素7. 5微克，由于傳統(tǒng)疫苗不含佐劑，而利 用本專(zhuān)利制備的含CpG ODN和鋁佐劑的注射型流感病毒裂解疫苗，可以降低抗原用量，增加 疫苗供應(yīng)能力。以CpG ODN佐劑和鋁佐劑制備的流感病毒裂解疫苗目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)流感疫苗的缺陷，提供了一種免疫效果好、可以降低流感病毒 抗原用量的注射型流感病毒裂解疫苗，且可以應(yīng)付流感大流行。本發(fā)明的一種流感病毒裂解疫苗，含有H1NpH3N2和B型流感血凝素、CpG ODN佐劑 和鋁佐劑。優(yōu)選地，所述流感病毒裂解疫苗，每劑含H1Np H3N2和B型流感血凝素各2_10 μ g、 CpG ODN 佐劑 10-100 μ g、鋁佐劑 100-1000 μ g。本發(fā)明還提供了一種制備上述流感病毒裂解疫苗的方法，包括雞胚增值流感疫 苗，超濾濃縮，離心純化，裂解，二次純化，滅活，稀配分裝。更具體地，該制備方法包括下述步驟1)雞胚增值流感疫苗將H1NpH3N2A型流感病毒工作種子分別接種于10日齡健 康雞胚尿囊腔中，增值流感病毒；2)超濾濃縮分別收集H1Np H3N2、B型流感病毒尿囊液，用截留分子量為100-300kD的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液為純化的H1N1. H3N2, B型流感病毒液；4)裂解收集純化的病毒液，經(jīng)Triton X-100裂解純化，得到H1N^ H#2、B型流感 病毒裂解液；5) 二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒 峰的病毒液為二次純化液；6)滅活流感病毒二次純化液經(jīng)甲醛滅活，得到ΗΛ、H#2、B型流感病毒原液；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按每劑含 H1N1和H3N2和B型流感血凝素各2-10 μ g、CpG單鏈脫氧核苷酸佐劑10-100 μ g、鋁佐劑 100-1000 μ g的配比，分裝到預(yù)填充注射器，即獲得含CpG ODN佐劑的流感裂解疫苗。其中CpG ODN佐劑含有5，-GACGTT-3 ’和/或5 ’ -GTCGTT-3，的特征序列，其中所 述特征序列5’ -GACGTT-3’和5’ -GTCGTT-3’為非甲基化，并且全硫代修飾。非甲基化是指脫氧胞苷(dC)的第5位碳原子未被甲基化。所述鋁佐劑直接購(gòu)買(mǎi)，也可由本公司自制，其有效成分為氫氧化鋁。血凝素濃度根據(jù)國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果是利用CpG ODN和鋁的佐劑作用，使得可以在降低流感病毒 抗原用量的同時(shí)保持高的免疫效果從而可以擴(kuò)大流感病毒裂解疫苗的生產(chǎn)量，同時(shí)本發(fā)明 制備的疫苗不含硫柳汞，使用安全性更高。本發(fā)明制備的含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒 裂解疫苗，尤其適宜在全球大流感流行威脅下應(yīng)急增加流感病毒疫苗生產(chǎn)能力，對(duì)于保證 公共衛(wèi)生安全具有重大意義。附1 不同佐劑流感病毒裂解疫苗免疫原性比較。HA代表H1NpH3R和B型流感血 凝素各6 μ g組；HA+AL代表H1N^H3N2和B型流感血凝素各6 μ g+鋁佐劑600 μ g組；HA+CpG 代表H1N1, H3N2和B型流感血凝素各6 μ g+CpG佐劑60 μ g組；HA+AL+CpG代表H1N1、H3N2和 B型流感血凝素各6 μ g+鋁佐劑600 μ g+CpG佐劑60 μ g組；AL代表600 μ g鋁佐劑對(duì)照組； CpG代表60 μ gCpG對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。其中實(shí)施例中CpG ODN佐劑含有5’ -GACGTT-3’和/或5’ -GTCGTT-3，的特征序 列，其中所述特征序列5’ -GACGTT-3’和5’ -GTCGTT-3’為非甲基化，并且全硫代修飾。下 面的實(shí)施例沒(méi)有對(duì)該佐劑進(jìn)行進(jìn)一步的限定，但是可以為含有5’ -GACGTT-3’的特征序列， 或含有5’ -GTCGTT-3，的特征序列，或含有5’ -GACGTT-3’和5’ -GTCGTT-3，的特征序列。實(shí)施例11)雞胚增值流感病毒
將H1Np H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液23500毫升，分別將尿囊液經(jīng)6000rpm離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的 超濾膜濃縮至300毫升；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān) 測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共200毫升；4)裂解分別將純化的H1Np H諷、B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的 病毒液分別獲得H1Np H3N2、B型病毒液為二次純化液，共250毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml，滅活M小時(shí)，滅活后得氏&、 H3N2, B型病毒原液，共460ml ；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和HW2和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各2 μ g、CpG ODN佐劑10 μ g、鋁佐劑100 μ g的配比，分裝到預(yù)填 充注射器中，即獲得含CpGODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例21)雞胚增值流感病毒將H1Np H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液23000毫升，分別將尿囊液經(jīng)6000rpm離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的 超濾膜濃縮至320毫升；3)離心純化將超濾濃縮濃縮后的流感病毒液經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共220毫升；4)裂解分別將純化H1Np H3N2, B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化病毒裂解液經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)，收集有 病毒峰的病毒液分別獲得H1NpH3NyB型病毒液為二次純化液，共230毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml，滅活M小時(shí)，滅活 后得H1N^ H3N2, B型病毒原液，共450ml ；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各4 μ g、CpG ODN佐劑30 μ g、鋁佐劑300 μ g的配比，分裝到預(yù)填 充注射器中，即獲得含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例31)雞胚增值流感病毒將H1Np H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液22500毫升；分別將尿囊液經(jīng)6000rpm離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的 超濾膜濃縮至340毫升；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分別將純化的H1Np H諷、B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)， 收集有病毒峰的病毒液分別獲得H1NpH3N2J型病毒液為二次純化液，共240毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml滅活M小時(shí)，滅活 后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐劑60 μ g、鋁佐劑600 μ g的配比，分裝到預(yù)填 充注射器中，即獲得含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例41)雞胚增值流感病毒將H1Np H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集HiNpH^^B型流感病毒尿囊液，得到流感病毒 液23000毫升，分別將尿囊液經(jīng)6000g離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的超濾 膜濃縮至300毫升；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分別將純化的H1Np H諷、B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)， 收集有病毒峰的病毒液分別獲得H1NpH3N2J型病毒液為二次純化液，共240毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml滅活M小時(shí)，滅活后 得ΗΛ、H3N2, B型病毒原液，共400ml，將以上步驟分別得到的H1N1, H3N2, B型流感病毒原液 混合；
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7)稀配分裝根據(jù)H1N1和和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各8 μ g、CpG ODN佐劑80 μ g、鋁佐劑800 μ g的配比，分裝到預(yù)填 充注射器中，即獲得含CpGODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例51)雞胚增值流感病毒將H1N^ H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液2觀(guān)00毫升；分別將尿囊液經(jīng)6000rpm離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的 超濾膜濃縮至300毫升；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共220毫升；4)裂解分別將純化的H1Np H諷、B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)， 收集有病毒峰的病毒液分別獲得H1NpH3NyB型病毒液為二次純化液，共230毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml，滅活M小時(shí)，滅活 后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各10 μ g、CpG ODN佐劑100 μ g、鋁佐劑1000 μ g的配比，分裝到 預(yù)填充注射器中，即獲得含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例6-91)雞胚增值流感病毒將H1Np H3N2, B型流感病毒工作種子分別接種于2000枚10日齡健康雞胚尿囊腔 中，置34°C，將H1NpH諷、B型分別培養(yǎng)48、48和72小時(shí)；2)收獲流感病毒，超濾濃縮將雞胚置于4°C冷庫(kù)過(guò)夜，分別收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液22500毫升；尿囊液經(jīng)6000rpm離心20分鐘，上清液采用截留分子量300kD的超濾膜 濃縮至340毫升；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò) 280nm紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液即為一次純化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分別將純化ΗΛ、H3N2, B型流感病毒液加入Triton X-100至終濃度為 0. 5% (g/ml)，震搖裂解120分鐘；5) 二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)， 收集有病毒峰的病毒液分別獲得H1NpH3N2J型病毒液為二次純化液，共240毫升；6)滅活流感病毒二次純化液加入甲醛至終濃度為50 μ g/ml，滅活M小時(shí)，滅活后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分裝根據(jù)H1N1和H3N2和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照下列配比 稀配流感病毒裂解疫苗 ①每劑含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g ；②每劑含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、鋁佐劑600 μ g ；③每劑含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐劑60 μ g ；④每劑含H1N1和HJ2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐劑60 μ g、鋁佐劑 600 μ g。將稀配的樣品分裝到預(yù)填充注射器中，即獲得不含或含不同佐劑的流感病毒裂解疫苗。實(shí)驗(yàn)例1 免疫原性檢測(cè)1、流感病毒疫苗的動(dòng)物免疫原性檢測(cè)采用SPF級(jí)小鼠作為動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)施例1-5制備的流感病毒裂解疫苗與市售的 流感病毒裂解疫苗進(jìn)行了小鼠免疫原性比較，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下實(shí)施例1-5制備的流感病毒裂解疫苗與市售的流感病毒裂解疫苗對(duì)小鼠采用腹 腔接種的方式，每組10只小鼠，0. 2ml/只接種，于接種后21天采血分離血清，測(cè)定小鼠免疫 前免疫后血清中對(duì)H1N1、H3N2、B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計(jì)算每只小鼠(免后血 凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)的比值，并計(jì)算每組小鼠(免后血凝抑制抗體/免前血 凝抑制抗體)比值的幾何平均滴度。表1 流感病毒疫苗小鼠免疫原性結(jié)果比較
免疫組別(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)幾何平均數(shù)H1N1 型H3N2 型B型流感病毒裂解疫苗5.375.184.57實(shí)施例16.696.325.57實(shí)施例28.388.387.92實(shí)施例316.7616.0914.98實(shí)施例413.0312.311.53實(shí)施例513.0212.0711.42結(jié)果顯示本發(fā)明制備的含CpG ODN和鋁佐劑的流感病毒裂解疫苗的免疫原性?xún)?yōu) 于市售的流感病毒裂解疫苗的免疫原性，說(shuō)明本發(fā)明制備的含CpG ODN和鋁佐劑的流感病 毒裂解疫苗適宜于預(yù)防流行性感冒。2、不同佐劑流感病毒裂解疫苗佐劑作用比較采用SPF級(jí)小鼠作為動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)施例6-9制備的含不同佐劑的流感病毒裂解 疫苗的佐劑作用進(jìn)行了小鼠免疫原性比較，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下實(shí)施例6-9制備的不同佐劑流感病毒裂解疫苗對(duì)小鼠采用腹腔接種的方式，每組 10只小鼠，0. 2ml/只接種，于接種后21天采血分離血清，測(cè)定小鼠免疫前免疫后血清中對(duì)H1Np H3N2, B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計(jì)算每只小鼠(免后血凝抑制抗體/免前血 凝抑制抗體)的比值，并計(jì)算每組小鼠(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)比值的 幾何平均滴度，同時(shí)設(shè)60 μ g CpG ODN佐劑對(duì)照組和600 μ g鋁佐劑對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果顯示以CpG ODN和鋁佐劑為雙佐劑的流感病毒裂解疫苗的免疫原性明 顯優(yōu)于以CpG ODN為佐劑或以鋁為佐劑或不加佐劑的流感病毒裂解疫苗的免疫原性。實(shí)驗(yàn)例2 流感病毒疫苗的動(dòng)物安全性檢測(cè)采用清潔級(jí)豚鼠作為動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)施例1-5制備的流感病毒裂解疫苗進(jìn)行了豚 鼠安全性檢查，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下(1)實(shí)施例1-5制備的流感病毒裂解疫苗、PBS陰性對(duì)照和胎牛血清陽(yáng)性對(duì)照對(duì)豚 鼠隔日每只每次腹腔注射0. 5ml，共3次，進(jìn)行致敏，每組6只。(2)首次致敏和激發(fā)前稱(chēng)量并記錄每只動(dòng)物體重，然后將其分為2組，每組3只， 分別在首次注射后第14日和第21日，由靜脈每只注射供試品Iml進(jìn)行激發(fā)。觀(guān)察激發(fā)后 30分鐘內(nèi)動(dòng)物有無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，記錄抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、抽搐、大小便失常、休克、死
亡等過(guò)敏癥狀。2、流感病毒疫苗豚鼠過(guò)敏原性檢測(cè)結(jié)果表2 過(guò)敏原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種流感病毒裂解疫苗，其特征在于，該流感病毒裂解疫苗含有H1Np H3N2和B型三 種流感血凝素、CpG ODN佐劑和鋁佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述流感病毒裂解疫 苗每劑含有H1N^ H諷和B型流感血凝素各2-10 μ g、CpG ODN佐劑10-100 μ g、鋁佐劑 100-1000 μ g0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述CpGODN佐劑含有 5，-GACGTT-3，和 / 或 5，-GTCGTT-3，特征序列，其中特征序列 5，-GACGTT-3，和 5，-GTCGTT-3， 為非甲基化，并且全硫代修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述非甲基化是指脫氧胞 苷的第5位碳原子未被甲基化。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的流感病毒裂解疫苗的方法，包括以下步驟雞 胚增值流感疫苗，超濾濃縮，離心純化，裂解，二次純化，滅活，稀配分裝。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)雞胚增值流感疫苗將ΗΛ、Η3Ν2、Β型流感病毒工作種子分別接種于10日齡健康雞 胚尿囊腔中，增值流感病毒；2)超濾濃縮分別收集H1NpH3N2A型流感病毒尿囊液，用截留分子量100-300kD的超 濾膜進(jìn)行超濾濃縮；3)離心純化將超濾濃縮后的流感病毒液樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm 紫外監(jiān)測(cè)，收集有病毒峰的病毒液為純化的H1Np H#2、B型流感病毒液；4)裂解收集純化的病毒液，經(jīng)TritonX-100裂解純化，得到H1Np H3N2、B型流感病毒 裂解液；5)二次純化流感病毒裂解液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，通過(guò)^Onm紫外監(jiān)測(cè)，收集 有病毒峰的病毒液為二次純化液；6)滅活流感病毒二次純化液經(jīng)甲醛滅活，得到H1NpH3NyB型病毒原液；7)稀釋分配根據(jù)H1N1和H諷和B型流感病毒單價(jià)病毒液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每 劑含H1N1和HJ2和B型流感血凝素各2-10 μ g、CpGODN佐劑10-100 μ g、鋁佐劑100-1000 μ g 的配比，分裝到預(yù)填充注射器即獲得含CpG ODN和鋁佐劑的流感裂解疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種流感裂解疫苗及其制備方法，該流感裂解疫苗中每劑含H1N1、H3N2和B型三種流感血凝素、CpG ODN佐劑、鋁佐劑。本發(fā)明還提供了該流感疫苗的制備方法，包括以下步驟雞胚增值流感疫苗，超濾濃縮，離心純化，裂解，二次純化，滅活，稀配分裝。本發(fā)明提供的流感病毒裂解疫苗可以降低流感病毒抗原用量、降低流感疫苗生產(chǎn)成本，適宜在全球大流感流行威脅下迅速提高流感疫苗供應(yīng)能力。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102068692SQ201010623609
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者孟紅彥, 張現(xiàn)臣, 王春雨, 鐘漢斌, 魏文進(jìn), 黃秋香 申請(qǐng)人:北京民海生物科技有限公司