專利名稱：一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及 其制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物重要病原菌，能夠感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖 動物，包括蝦類、魚、貝等。目前對于哈氏弧菌的控制依賴于抗生素和滅活疫苗免疫?？股?的危害性，包括抗性菌株的產(chǎn)生、環(huán)境污染以及對人類健康的危害等，已成為一種世界性共 識，因而其使用已在國際上受到限制。滅活疫苗由于在每次制備過程中難免會有不同的抗 原結(jié)構(gòu)被破壞而造成免疫效果不穩(wěn)定。目前針對哈氏弧菌的重組亞單位疫苗有數(shù)例報道， 主要為具有免疫活性的哈氏弧菌膜蛋白。相對滅活疫苗而言，重組亞單位疫苗具有免疫特 異性強(qiáng)、重復(fù)性較好等特點，但其通常缺點是制備繁瑣、造價昂貴、需要特定的佐劑等。因而 對于重組亞單位疫苗而言，如何提高其制備以及自身免疫效率是尚待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為免疫保護(hù)性亞單位疫苗序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。免疫保護(hù)性亞單位疫苗的制備1)質(zhì)粒pETVP2的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28用Ncol/Xhol酶切，回收5. 3kb片段；以哈 氏弧菌T4為模板，用引物VhhPF5和VhhPRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后用Ncol/Xhol酶切， 回收0. 58kb片段，將其與上述5. 3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含卡那霉 素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETVP2 ；2)疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將質(zhì)粒PETVP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得轉(zhuǎn)化 子BL21/pETVP2 ；將BL21/pETVP2于含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過 夜后的培養(yǎng)液加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D_為0. 5，加入終濃度為ImM 的IPTG并于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，然后在離心后菌液中加入裂解液，在室溫?fù)u動1_2小時； 將菌液離心，回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所 編碼的免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白。所述步驟2)中每毫升菌液中加入5ml裂解液，同時菌液離心后的上清液用His Trap HP Columns 回收。免疫保護(hù)性亞單位疫苗的應(yīng)用將上述所得的免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白與經(jīng) LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B187至0D_為0. 8后溶于PBS的菌懸液混合，所得為疫苗混合液具 有對哈氏弧菌免疫保護(hù)的作用。將所述疫苗混合液注射于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的體內(nèi)，而后21-23天再將含有序列表 SEQ ID Nol中的堿基序列的疫苗蛋白的PBS強(qiáng)化免疫混合液注射于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的體內(nèi)，即可使水產(chǎn)養(yǎng)殖動物具有對哈氏弧菌免疫保護(hù)的作用。所述每毫升強(qiáng)化免疫混合液或疫苗混合液中含免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白 0. 2mg ；所述注射水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的強(qiáng)化免疫混合液或疫苗混合液為IOOul。所述經(jīng)LB培 養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B187至OD6tltl為0. 8后溶于PBS的菌懸液，為將菌株B187于LB培養(yǎng)基中 于30°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8，然后離心收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為2 X IO8Cfu/ ml，即為疫苗混合液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.高保護(hù)率。本發(fā)明的重組亞單位疫苗對哈氏弧菌的免疫保護(hù)效率達(dá)89.3%。2.無需任何商業(yè)化佐劑。本發(fā)明的疫苗應(yīng)用時不需如弗氏佐劑等有副作用的免疫 刺激劑。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細(xì)菌基因組DNA提取皆 使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實施例1免疫保護(hù)性亞單位疫苗由序列表SEQ ID No. 1中的vhhP2堿基序列所示。免疫保護(hù)性亞單位疫苗的制備方法1)質(zhì)粒pETVP2的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28(購于美國Novagen)用Ncol/Xhol酶切，回收5. 3kb片段。以哈氏 弧菌T4(保存于CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 1985)為模板，用引物VhhPF5 (5’ -AGTACCAT 巡八16六六6六6六六66六六了011(-3，，劃線堿基為NcoI位點)和VhhPRl (5’-CTGTCTCGAGTTTCAATCT AGTTGGTTTTG-3，，劃線堿基為XhoI位點)按下列條件進(jìn)行PCR :94°C 60s預(yù)變性模板DNA， 然后 94°C 40s, 52°C 60s, 72°C 60s，5 個循環(huán)后改為 94°C 40s,62°C 60s, 72°C 60s，25 個循環(huán) 后再在72°C延伸反應(yīng)7-lOmin。PCR產(chǎn)物純化后用Ncol/Xhol酶切，回收0. 58kb片段，與上 述5.3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固體 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETVP2 ；所述LB固體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1. 0% 氯化鈉，瓊脂1. 5%,97. 5%蒸餾水；2)疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述步驟1)的質(zhì)粒pETVP2用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自于“天根 生化科技有限公司”，北京)，在含有Kn (50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，而后 篩選抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子，挑取一個轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pETVP2。將BL21/pETVP2于含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液將其加入IOOml新 鮮的含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動培養(yǎng)至OD_為0. 5， 加入終濃度為 ImM 的 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，37°C 繼續(xù)以轉(zhuǎn)速 160rpm 搖動培養(yǎng)4-5h，而后離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌液，加入5ml裂解液(IOmM NaH2PO4, IOmM Tris，8M尿素，pH 8. 0)，在室溫于搖床上緩慢搖動1_2小時，直至菌懸液變澄清為止。 將菌液離心(10000g，30min，4°C )，回收上清。將上清用His Trap HP Columns (購于GE Healthcare)回收，即得含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的保護(hù)性疫苗抗原蛋白。序列表SEQ ID NolATGAAGAGAAGGAATCCTCAAGGCCTTACCCTACTAGAACTTATCATTGCGATAGTCATTCTCGGCATC CTAGCTGTTGTTGCAGCTCCCCGTTTTTTAAACCTCCAAGACGATGCGTATCAAGCAAAAATGGAATCCATCGCTGACCA ATTCGAAACAGGCGTGCGATTTACCCAAAGCCAATGGTTAGTCAATGGTGGAACACAGGAAGCTCAAACAGATATCGATG GATATGGTGGTGGCGAACTGGATGTAAATGAGTTTGGCTTTCCGCTTGGCACTAACAAGGGCAACAGAAATGGCGTGATT GGCAACCCGTATAACATAGGACAAGGGAATGCTGGTTGTATTGCCGTGTGGCAAGCTTTACTCGGCAACGAATACTCTCT ATCAAATAATCGTAACGCGAACGATAGGTTTGATTTTATTACCCGACGAGTCCAAGACAAAGAATCCCACCAATCTGTTT GTTATTATACCTTTACTAAAAAAGGTTACGATCGCAATCCTGATAACTCTAGCTTCGTCATATGGTATGACTCAAAAACA GGCAGCGTCACGACATCAAAACCAACTAGATTGAAATAA(a)序列特征 長度588bp 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源哈氏弧菌T4(f)特異性名稱vhhP2實施例2重組亞單位疫苗的免疫應(yīng)用步驟1)疫苗混合液及強(qiáng)化免疫混合液的制備。疫苗混合液將菌株B187 (保存于CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 2331)于LB培養(yǎng) 基中于30°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8，然后離心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮于PBS 中至終濃度為2X 108cfu/ml，即為B187-PBS。而后在每毫升B187-PBS混合液中加入0. 2mg的含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的疫苗蛋白；強(qiáng)化免疫混合液每毫升PBS中加入0. 2mg的含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序 列的疫苗蛋白。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2P04。步驟2)重組亞單位疫苗的免疫應(yīng)用。將60條牙鲆(每條重約Ilg)隨機(jī)分為2 組，每組30條。將這2組分別命名為A和B組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述 步驟1)的疫苗混合液。A組即為試驗組。將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟 1)的B187-PBS。B組即為對照組。21-23天后將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul強(qiáng)化免 疫混合液；將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul PBS0步驟3)哈氏弧菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌T4至0D_為0.5，然 后離心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為5X 108cfu/ml。步驟4)重組亞單位疫苗針對哈氏弧菌的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測。在步驟2)第一次免 疫注射后的第35天，用上述步驟3)的哈氏弧菌懸液腹腔注射步驟2)的兩組魚，每條魚的 注射量為lOOul。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。14天后，統(tǒng)計各 組魚的總死亡數(shù)目A組，3條；B組，28條。利用下列公式計算相對免疫保護(hù)效率(RPS)RPS = 100X (1_免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出重組亞單位疫苗針對哈氏弧菌的免疫保護(hù)效率為89. 3%，故其能夠高效地保護(hù)牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院海洋研究所<120> 一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用方法<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>588<212>DNA<213> 哈氏弧菌 T4<220><221>CDS<222>(1). . (588)<223><400>1atg aag aga agg aat cct caa ggc ctt acc cta cta gaa ctt ate att 48Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015gcg ata gtc att ctc ggc ate cta get gtt gtt gca get ccc cgt ttt 96
Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530tta aac ctc caa gac gat gcg tat caa gca aaa atg gaa tcc ate get 144Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045gac caa ttc gaa aca ggc gtg cga ttt acc caa age caa tgg tta gtc 192Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560aat ggt gga aca cag gaa get caa aca gat ate gat gga tat ggt ggt 240Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580ggc gaa ctg gat gta aat gag ttt ggc ttt ccg ctt ggc act aac aag 288Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095ggc aac aga aat ggc gtg att ggc aac ccg tat aac ata gga caa ggg 336Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110aat get ggt tgt att gcc gtg tgg caa get tta ctc ggc aac gaa tac 384Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125tct cta tea aat aat cgt aac gcg aac gat agg ttt gat ttt att acc 432Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140cga cga gtc caa gac aaa gaa tcc cac caa tct gtt tgt tat tat acc 480Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160ttt act aaa aaa ggt tac gat cgc aat cct gat aac tct age ttc gtc 528Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175ata tgg tat gac tea aaa aca ggc age gtc acg aca tea aaa cca act 576lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190aga ttg aaa taa588Arg Leu Lys195序列表.txt<210>2<211>195<212>PRT
<213> 哈氏弧菌 T4<400>2Met Lys Arg Arg Asn Pro GIn Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asa Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190Arg Leu Lys195.
權(quán)利要求
一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗，其特征在于序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。
2.一種按權(quán)利要求1所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的制備，其特征在于1)質(zhì)粒PETVP2的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28用Ncol/Xhol酶切，回收5.3kb片段；以哈氏弧 菌T4為模板，用引物VhhPF5和VhhPRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后用Ncol/Xhol酶切，回收 0. 58kb片段，將其與上述5. 3kb片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含卡那霉素的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PETVP2 ；2)疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將質(zhì)粒PETVP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得轉(zhuǎn)化子 BL21/pETVP2 ；將BL21/pETVP2于含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取過夜 后的培養(yǎng)液加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D_為0. 5，加入終濃度為ImM的 IPTG并于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，然后在離心后菌液中加入裂解液，在室溫?fù)u動1_2小時；將 菌液離心，回收上清；將上清液用凝膠柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所編 碼的免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白。
3.按權(quán)利要求2所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的制備，其特征在于所述步驟2)中每 毫升菌液中加入5ml裂解液，同時菌液離心后的上清液用His Trap HP Columns回收。
4.一種按權(quán)利要求1所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于將上述所得 的免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白與經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B187至0D_為0. 8后溶于PBS的 菌懸液混合，所得為疫苗混合液具有對哈氏弧菌免疫保護(hù)的作用。
5.按權(quán)利要求4所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于將所述疫苗混合 液注射于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的體內(nèi)，而后21-23天再將含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的 疫苗蛋白的PBS強(qiáng)化免疫混合液注射于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的體內(nèi)，即可使水產(chǎn)養(yǎng)殖動物具有對 哈氏弧菌免疫保護(hù)的作用。
6.按權(quán)利要求4或5所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述每毫升 強(qiáng)化免疫混合液或疫苗混合液中含免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白0. 2mg ；所述注射水產(chǎn)養(yǎng)殖 動物體內(nèi)的強(qiáng)化免疫混合液或疫苗混合液為IOOul。
7.按權(quán)利要求4所述的免疫保護(hù)性亞單位疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述經(jīng)LB培養(yǎng)基 培養(yǎng)的菌株B187至OD6tltl為0. 8后溶于PBS的菌懸液，為將菌株B187于LB培養(yǎng)基中于30°C 培養(yǎng)至0D_為0. 8，然后離心收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為2X 108cfu/ml，即為 疫苗混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及其制備和應(yīng)用方法。具體為所述保護(hù)性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列，其制備方法構(gòu)建質(zhì)粒pETVP2并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)并破碎細(xì)胞后，自上清中回收重組蛋白，將上述所得的免疫保護(hù)性亞單位疫苗蛋白與經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B187至OD600為0.8后溶于PBS的菌懸液混合，所得疫苗混合液具有對哈氏弧菌免疫保護(hù)的作用。本發(fā)明所得重組亞單位疫苗具高效保護(hù)性，并且應(yīng)用過程中不需任何商業(yè)化佐劑。
文檔編號A61K39/106GK101816784SQ20091001451
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者孫黎, 張衛(wèi)衛(wèi) 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所