專利名稱：:豬鏈球菌2型三組分亞單位疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是申請?zhí)枮?008102253466申請案的分案申請。本發(fā)明涉及家畜傳染病疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
：。具體涉及一種豬鏈球菌2型三組分亞單位疫苗及其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明涉及基于豬鏈球菌2型的三種抗原蛋白基因的克隆、表達及功能驗證和應(yīng)用。所述的基因表達的抗原蛋白能夠提高豬抵抗豬鏈球菌2型的能力。
背景技術(shù)：
：豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)是引起豬鏈球菌病的主要病原，依據(jù)細(xì)菌表面的莢膜多糖(CPS)可以將S.suis分為35個血清型，分別為1/2型和134型，但最近也有人提出32型和34型應(yīng)該歸于str印tococcusorisratti，而不應(yīng)該歸于豬鏈球菌，其中豬鏈球菌2型是毒力最強、其中豬鏈球菌2型(SS2)致病性強、流行廣，該型亦是臨床分離頻率最高的血清型。SS2是一種重要的人畜共患病病原體，能引起豬腦膜炎(meningitis)、心內(nèi)膜炎(endocarditi)、敗血癥(s印ticemia)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、菜膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起斷奶仔豬或育肥豬突然死亡；人類感染該菌，可導(dǎo)致腦膜炎，引發(fā)永久性耳聾、敗血癥、心內(nèi)膜炎，甚至死亡。1991年首次報道在廣東省發(fā)現(xiàn)豬2型鏈球菌疑似病例，1998-1999年江蘇省部分地區(qū)連續(xù)2年在盛夏季節(jié)暴發(fā)該病。目前已有足夠的流行病學(xué)資料證實，SS2已經(jīng)對我國的養(yǎng)殖業(yè)和人民健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。由于缺乏豬鏈球菌病的流行病學(xué)資料，致病機理不清，無有效的疫苗和敏感的診斷方法，在很多國家豬鏈球菌病一直未能得到有效地控制。盡管對豬鏈球菌2型的致病機理目前仍處在研究和發(fā)現(xiàn)階段，影響了豬鏈球菌2型疫苗研究的順利進行，但該疫苗的研究仍取得了一定的進展。目前研究的豬鏈球菌2型疫苗主要有滅活疫苗、活疫苗、基因工程活載體疫苗和亞單位苗，但在實際應(yīng)用中各有不足之處。滅活疫苗對同源的豬鏈球菌具有較好的免疫保護，但由于不同菌株的毒力基因表性存在較大差異，對于異源菌株的保護力不佳；活疫苗可使豬得到保護，但不能清除定居在扁桃體或關(guān)節(jié)里的2型豬鏈球菌，也不能清除隱性感染豬扁桃體內(nèi)的細(xì)菌；活載體疫苗主要是當(dāng)今與未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一，疫苗兼有常規(guī)活菌苗和滅活菌苗的優(yōu)點，但是按照美國食品與藥物管理局(Foodanddrugadministration,FDA)的規(guī)定，活疫苗中不能存在抗藥質(zhì)粒，并且在人和動物體內(nèi)，無法用抗生素來維持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性；亞單位苗具有活菌苗的免疫效力高、及滅活菌苗的安全性好等優(yōu)點，但是，亞單位苗的抗原成分單一，對其他血清型的保護作用有限。范紅結(jié)等研制的鏈球菌重組亞單位疫苗能對馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型提供較好的保護，但目前國內(nèi)豬鏈球菌病病原以豬鏈球菌2型為主，其它型豬鏈球菌也占了一定比例，而馬鏈球菌獸疫亞種比例則越來越小。因此，預(yù)防豬鏈球菌2型和其它型豬鏈球菌越來越重要。鑒于此，本發(fā)明著手于豬鏈球菌2型新型免疫保護性抗原的研究，尋找?guī)追N免疫保護效果好，并且在豬鏈球菌2型以外的其它豬鏈球菌血清型中廣泛存在的免疫原性蛋白，進而組合成有效的豬鏈球菌亞單位疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是獲得具有很好適用于豬鏈球菌2型的免疫原性蛋白，通過對編碼該基因的序列的克隆、表達，進一步驗證其功能，并制備能抵抗豬鏈球菌2型的三組分亞單位疫苗。解決本發(fā)明的核心技術(shù)方案是克隆報道的HP0197、HP1036和Enolase基因；通過大腸桿菌表達，制備對豬鏈球菌2型有免疫原性的抗原蛋白，進而制備一種豬鏈球菌2型亞單位疫苗。另外，本發(fā)明還包括所述重組大腸桿菌及其分泌的抗原蛋白在制備豬鏈球菌2型亞單位疫苗中的用途。本發(fā)明將報道的HP0197、HP1036和Enolase基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21中，分泌該抗原蛋白的大腸桿菌已于2008年10月9日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。具體保藏信息如下1、大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a_0197，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208146(在申請?zhí)枮?008102253466申請案的母體專利中已經(jīng)公開，其公開號為CN101412984)。2、大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a_1036N，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208147(在申請?zhí)枮?008102253466申請案的母體專利中已經(jīng)公開)。3、大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a_enolase，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208148(在申請?zhí)枮?008102253466申請案的母體專利中已經(jīng)公開)。本發(fā)明通過克隆表達HP0197、HP1036、Enolase基因，對該蛋白的特性進行實驗分析，證明了該蛋白組合具有較好的免疫原性，免疫小鼠和仔豬后能誘導(dǎo)較高抗體水平。攻毒保護力實驗表明該蛋白組合能夠增強小鼠和豬對豬鏈球菌2型的抵抗力，是一種有效的三組分亞單位疫苗，該疫苗適用于我國豬鏈球菌2型病的防制。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《具體實施方式》所述。圖1本發(fā)明使用的三個報道的基因序列的登錄號及其在鏈球菌98HAH33中所處的位置(括號內(nèi)顯示為有下劃線的為所述的三個抗原基因序列在Genebank的登錄號，其后的冒號后的數(shù)字為該登錄號所示基因序列在鏈球菌98HAH33基因組中的位置，該位置后顯示的加粗斜體字為所述的鏈球菌的菌株號)。圖2是本發(fā)明使用的原始pET_28a(+)質(zhì)粒圖譜。圖3重組抗原基因PCR圖；圖中A為HP0197基因片段，B為HP1036基因片段，C為Enolase基因片段。圖4重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖泳道3(Enolase)泳道4(HP0197)泳道5(HP1036)。[0019]圖5重組抗原純化SDS-PAGE電泳圖中圖5A1為enolase蛋白；A2為1036N蛋白、A3為0197蛋白。Western-blot分析圖中圖Bl為enolase蛋白、圖B2為1036N蛋白、圖B3為0197蛋白。圖6重組抗原免疫小鼠后的抗體水平。圖7重組抗原誘導(dǎo)小鼠抗體IgG亞類測定。圖8三種抗原分別免疫小鼠后5LD5Q攻毒保護力效果試驗。圖9三種抗原分別免疫小鼠后20LD5Q攻毒保護力效果試驗。圖10是免疫小鼠血清特異性抗體的檢測，圖中圖IOA為enolase抗體；圖IOB為0197抗體；圖IOC為1036N抗體。圖11重組抗原免疫小鼠后的攻毒(IOLD5tl)保護力效果。圖12本發(fā)明制備的三組分亞單位疫苗免疫仔豬后體溫變化。圖13本發(fā)明制備的三組分亞單位疫苗免疫小豬后各抗原蛋白血清特異性抗體水平檢測，其中圖13A為1036N抗體；圖13B為enolase抗體；圖13C為0197抗體。圖14本發(fā)明制備的三組分亞單位疫苗免疫仔豬后攻毒保護效果。具體實施方式實施例1三種豬鏈球菌2型抗原蛋白的克隆及表達一材料1)質(zhì)粒與菌株本發(fā)明采用的質(zhì)粒pET_28a(+)購自Noagen公司(該pET_28a(+)質(zhì)粒圖譜如圖1所示)大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)購自中國湖北省武漢生命技術(shù)有限公司。本發(fā)明所用菌株為豬鏈球菌2型CVCC606菌株購自中國北京中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，屬于一個商業(yè)菌株。2)豬鏈球菌2型來源基因登錄號，其基因序列在鏈球菌菌株基因組中位置參見說明書附圖1所述。3)主要試劑及緩沖液(Buffer)氯化鈉、EDTA二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅S、三氯乙酸(TCA)是上海國藥公司產(chǎn)品；Tris堿(Tris-HCl)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸鈉、乙酸鈉(購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)。甘氨酸、考馬斯亮藍R-250購自AMRESC0公司。牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制劑(PMSF)、甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品。蛋白酶K(貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為lmg/ml)購自上海華舜生物工程有限公司；氨芐青霉素(Ampcillin)、卡那霉素(Kanamycin)、胎牛血清、誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)均為Invitrogen公司產(chǎn)品；吸頭與離心管是AxyGen公司產(chǎn)品。Taq酶及10XTaq酶Buffer、BamHI、XholI等核酸內(nèi)切酶及相關(guān)Buffer,T4連接酶及10XT4連接酶Buffer、Rnase、UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、DNAmarker(DL-2000,DL-15000)均為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗豬IgG購自Sigma公司。底物液配制底物液A:0.006%H2O2緩沖液；底物液B:取Na2HPO4·12H2014.2g，檸檬酸10.5g，用雙蒸水定容至500mL配成0.1磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺(TMB)。使用時將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。大腸桿菌培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)液及固體培養(yǎng)基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g,NaCl10g，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.5，121°C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆?。在?00毫升LB液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂即為固體LB培養(yǎng)基，121°C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆?。鏈球菌培養(yǎng)基TSB、TSA培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司。純化三個豬鏈球菌2型抗原蛋白采用NiSepharose6FastFlow純化柱(GEHealthcare公司產(chǎn)品)。美國艾克森美孚白油購自東莞市行興行石化有限公司(埃克森美孚總代理)PBS緩沖液配制=NaCl8.0g,KCl0.2g,KH2PO4O.24g,Na2HPO4X12H203.628g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，121°C高壓滅菌20min，室溫保存。Western-blotting緩沖液配制電轉(zhuǎn)緩沖液39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris堿，0.037%SDS(電泳級)，20%甲醇。配制IOOOmL轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸，5.8gTris堿，0.37gSDS,加200mL甲醇，加ddH20至總量為1000mL。TBS(pH8.0)緩沖液10mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl。TBST緩沖液在上述TBS中加入終濃度為0.05%Tween-20即可。麗春紅S(IOX)貯存液2g麗春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加ddH20至IOOmL0質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液配制溶液I含0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/LTrisHCl(pH8.0),0.01mol/LEDTA,121°C高壓滅菌20min后置室溫備用。溶液II含0.2mol/LNaOH,1%SDS,現(xiàn)配現(xiàn)用。溶液III取5mol/L乙酸鈉60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL，調(diào)pH至5.0。2mol/LNaOH:8gNaOH加入IOOmLddH20。10%SDSIOgSDS加入80mLddH20中，加熱攪拌溶解，定容至100mL。5mol/LNH4Ac:327·7gNH4AC加入ddH20中溶解，定容至500mL。10mol/LNH4Ac:655·4gNH4AC溶于ddH20，定容至500mL。13%PEG8000(1.6mol/LNaCl):13gPEG8000，9.35gNaCl，溶于ddH20，定IOOmL,121°C高壓滅菌20min。3mol/LNaAc:80mLddH20中加入40.81g醋酸鈉，定容至lOOmL，121°C高壓滅菌20mino酚氯仿異戊醇(體積比為25241)取飽和酚25mL、氯仿24mL、異戊醇lmL，充分混勻后，用TE(pH8.0)覆蓋，于棕色瓶中保存。氯仿異戊醇(體積比241)取氯仿48mL、異戊醇2mL，充分混勻后，TE(pH8.0)覆蓋，棕色瓶中保存。TE溶液:lmmol/LEDTA,10mmol/LTris-ClpH值為8.O。4)引物設(shè)計與合成應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5.0，設(shè)計了用于擴增HP0197、HP1036、Enolase的引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。表1用于克隆本發(fā)明的抗原蛋白基因的引物設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>~~hypotheticalprotein正義引物5-GCTGAATTCACGACAGAGACTTCAACA(EcoRI)SSU98_0197(EP0197)反義引物5-TAGCTCGAGGCGCTGTTCACCTGT(XhoI)hypotheticalprotein正義引物5-AAGGGATCCAAAGCTATTGAAC(BamHI)SSU98_1036(HP1036)反義引物5-AAGCTCGAGTTCTTGTTCCGAA(XhoI)P7正義引物5-GGCGGATCCATGTCAATTAmCTGATG(BamHI)ηJin/αcp___反義引物ACGCTCGAGTTATTTTTTCAAGTTGTAGAATGAG(XhoI)5)試驗動物選擇7周齡雌性BALB/c小白鼠，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。4周齡豬鏈球菌血清陰性斷奶仔豬，購自武漢市黃陂區(qū)青草湖天種豬場。二制備方法舉例1)豬鏈球菌2型(SS2)基因組DNA的提取豬鏈球菌2型(SS2)菌培養(yǎng)將CVCC606株菌種接種于含有10%滅活新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，挑取單個菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中(150r/min)，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。SS2基因組DNA的提取取1.OmlSS2菌液于1.5ml的離心管中，8000r/min離心5min，棄上清。沉淀懸于500μ1ΤΕ(ΡΗ8.0)中，加10%的SDS，使其終濃度為1%，然后加3μ1蛋白酶K(20mg/ml)，37°C作用2h。離心取上清，用等體積的酚/氯仿抽提1次，上清用二倍體積的無水乙醇在-20°C沉淀lOmin，12000r/min離心20min，沉淀用70%的乙醇洗兩次，室溫放置20min，讓酒精揮發(fā)干凈。沉淀用20μ1滅菌的去離子水溶解，-20°C保存。目的基因的擴增以上述方法提取的CVCC606株菌的基因組作為PCR模板。使用表1所示的引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如下ddH2037.5μ1IOXTaqBuffer5.Oμ1dNTP(2.5mMeach)4.Oμ1正義引物Ι.ΟμΙ反義引物Ι.ΟμΙDNA模板1μ1Taq酶(5U/μ1)0.5μ1反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min；94°CImin；55°CImin；72°C5min；30個循環(huán)，延伸720CIOmin。[0087]PCR產(chǎn)物回收采用上海生工生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說明書的步驟進行，具體操作如下1)用0.8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長波紫外燈下，用在酒精燈火焰上燒過的手術(shù)刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1.5ml滅菌離心管中。2)按每IOOmg瓊脂糖膠加入400μ1BindingBuffer，置50_60°C水浴中l(wèi)Omin，使瓊脂糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時，每2min混勻一次)。3)將UNIQ-IO柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到UNIQ-IO柱中，室溫靜置2min,室溫8000rpm離心Imin。4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個收集管中，力口Λ500μ1WashSolution,室溫8000rpm離心Imin05)重復(fù)步驟4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，室溫12000rpm離心15sec。6)將UNIQ-10柱放入一個滅菌的1.5ml離心管中，根據(jù)PCR產(chǎn)物量的相對多少，在柱子底部的膜中央加1020μ1ElutionBuffer或ddH20，室溫或37°C放置2min。室溫12000rpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20°C備用。重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建利用EcoRI+XholI(購自寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品)同時酶切PCR擴增的HPO197基因片段和pET-28a(+)，利用BamHI+XholI同時酶切PCR擴增的HP1036、Enolase基因片段和pET-28a(+)，回收PCR片斷以及表達載體質(zhì)粒，將酶切后HP0197、HP1036和Enolase基因片段與酶切后pET_28a(+)連接，構(gòu)建出pET-28a_0197、pET-28a_1036N、pET-28a-enolase質(zhì)粒。上述酶切位點在本發(fā)明所用質(zhì)粒pET_28a(+)中均為單一酶切位點ο連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取感受態(tài)細(xì)胞DH5a100μ1加入到1.5mlEP管中，將連接后的三種重組質(zhì)粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase各510μ1加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90sec，冰浴3min-5min。加入400μ1LB，于37°C200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于4°C5000rpm離心lOmin，棄去400μ1上清，用剩余的100μ1重懸沉淀涂布于含25μg/mlKna的LB瓊脂平板。37°C增殖lh，再將平板翻過來，倒置37°C培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。重組質(zhì)粒的酶切鑒定質(zhì)粒的提取使用堿裂解法(參照《分子克隆實驗指南》第三版.黃培唐等譯，北京，科學(xué)出版社，2002版介紹的方法)進行，具體操作如下1)用滅菌牙簽在LB平板上隨機挑取數(shù)個單菌落，分別接種于3ml25μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。[0104]2)將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)，于4°C8000rpm離心3min，棄上清，再將剩余的1.5ml菌液重復(fù)離心，倒立離心管于吸水紙上，使液體流盡。3)加入100μ1冰預(yù)冷的溶液I，渦旋使菌體充分懸浮，再加入200μ1新配制的溶液II，反復(fù)顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，最后加入150.0μ1冰預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒離心管數(shù)次，冰浴lOmin。4)于4°C以12000rpm離心lOmin，吸取上清至另一支1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混和均勻，室溫靜置5min。5)室溫12000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。6)沉淀用200μ1含20μ1Rnase(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解，56°C水浴30min或37°C水浴Ih以除去RNA。7)力卩7.5mol/LNH4Ac100μ1，室溫靜置5min，再于室溫12000rpm離心5min。8)吸取上清到另一1.5ml的EP管中，加入2倍體積的冷無水乙醇，冰浴置lOmin。9)于4°C12000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μ1ddH20或TE(pH8.0)，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定利用EcoRI+XholI酶切pET-28a_0197，利用BamHI+XholI酶切pET-28a_1036N、pET-28a-en0lase表達質(zhì)粒，酶切后應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期大小的外源片段和載體片斷即為正確的重組質(zhì)粒。重組表達菌株的構(gòu)建取感受態(tài)細(xì)胞BL-21(DE3)100μ1力卩入到1.5mlEP管中，將三種重組質(zhì)粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase各0.5μ1加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90秒，冰浴3min-5min。將其涂布于含有25μg/mlKna的LB瓊脂平板。37°C正置lh，再將平板翻過來，倒置37°C培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。目的基因在大腸桿菌中的表達及純化目的基因的誘導(dǎo)表達將三種含重組抗原的表達菌株分別接種于含有25μg/mlKna的3mLLB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μL接種于IOmL含有25μg/mlKna的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)約3h，至0D_達到0.6-1.0時，加IPTG至終濃度為0.8mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析SDS-PAGE電泳樣品的制備將三種誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌8000r/min離心15min。沉淀用1/10體積的50mMTris-cl(pH8.0)重懸，并加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰浴30min。冰浴條件下進行超聲碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min,離心30min。分別取少量裂解后上清和沉淀，加入2X蛋白電泳上樣緩沖液125μ1，DTT25μ1及TE液100μ1，震蕩混勻，100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/min離心5min，進行SDS-PAGE電泳分析。SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制及電泳12%的分離膠配制純化水1.6ml，30%丙烯酰胺溶液2.0ml,1.5mol/LTris-Base溶液(ρΗ8·8)1.3ml,10%SDS0.05ml,10%過硫酸銨0.05ml,TEMED0.003ml；各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加純化水。5%積層膠配制純化水2.Iml,30%丙烯酰胺溶液0.5ml,1.Omol/LTris-Base溶液(ρΗ6·8)0.38ml,10%SDS0.03ml,10%過硫酸銨0.03ml,TEMED0.003ml；各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面，灌滿后插入加樣梳。待積層膠凝固后，取下梳子；將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品；電泳電壓200V，電流在20mA-40mA范圍內(nèi)，電泳Ih，至溴酚藍泳出膠底面，終止電泳。聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色卸下凝膠，用考馬斯亮藍R250染色液(45%甲醇，45%純化水，10%冰乙酸，0.25%的考馬斯亮藍R250)染色30min，再用脫色液(45%甲醇，45%純化水，10%冰乙酸)進行脫色lmin，觀察結(jié)果。重組蛋白的純化將收集的重組蛋白表達菌使用Bindingbuffer(20mMTris-HClpH7.9,5mMImidazole，0.5MNaCl)重懸，超聲波破碎，4°C12，OOOg離心15min取上清上樣。分別使用Bindingbuffer和Washingbuffer(20mMTris-HClρΗ7·9，15mMImidazole,0.5MNaCl)洗柱直至OD值達到基線附近，換用Elutionbuffer(20mMTris-HClpH7.9,40mMImidazole,0.5MNaCl)洗脫結(jié)合的重組抗原蛋白，本實施例收集波峰部分蛋白作為純化的重組蛋白用于進一步分析。本發(fā)明制備的重組抗原蛋白0197、1036N、enOlaSe基因PCR擴增結(jié)果見圖3；重組質(zhì)粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase的雙酶切鑒定結(jié)果見圖4；重組抗原蛋白0197、1036N、enolase進行SDS-PAGE電泳分析及純化結(jié)果見圖5。實施例2重組抗原蛋白的特性分析1.Western-blot分析重組蛋白的抗原性將上述純化的重組抗原蛋白0197、1036N、enolaSe分別進行SDS-PAGE電泳。步驟如下1)轉(zhuǎn)移切出6張Whatman3M濾紙和1張硝酸纖維膜(NC膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標(biāo)記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相對方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min；在另一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，將6張Whatman3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下方法安裝轉(zhuǎn)移電泳槽平放石墨電極的底座(陽極)，依次放3層3M濾紙、硝酸纖維膜、聚丙烯酰胺凝膠和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣泡；將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極-轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上；連接電源，根據(jù)凝膠板面積按照0.65mA/cm21.0mA/cm2的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5h2h。2)麗春紅染色轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下NC膜，于去離子水中漂洗2次-3次后，轉(zhuǎn)移至麗春紅染色液中染色5minlOmin，觀察轉(zhuǎn)印效果，并用鉛筆標(biāo)出蛋白Marker位置；室溫下用去離子水漂洗硝酸纖維膜直至顏色褪去；3)將NC膜置于5%的脫脂奶粉中，室溫封閉2h;4)洗膜棄封閉液，用IXTBST洗滌NC膜3遍，每次5min；5)一抗孵育將NC膜放入用5%的脫脂奶粉稀釋的兔抗SS2型菌陽性血清(體積比150)，37°C孵育2h；[0137]6)洗膜取出NC膜，用IXTBST洗膜3次，每次IOmin；7)二抗孵育將膜轉(zhuǎn)入5%的脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(體積比15000)，37°C孵育2h；8)洗膜取出NC膜，用IXTBST洗膜3次，每次IOmin；9)顯色將NC膜置于新配置的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達到要求后，用IXTBST沖洗以終止反應(yīng)。2.重組蛋白抗血清的制備1)重組蛋白濃度的測定參照《分子克隆實驗指南》第三版.黃培唐等譯，北京，科學(xué)出版社，2002版介紹的方法，將蛋白樣品牛血清白蛋白用PBS緩沖液溶解，然后按體積進行倍比稀釋。分別取每個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液100μ1，加入到5ml的考馬斯亮蘭染料液中，反應(yīng)IOmin后，在波長595nm處測吸光度，根據(jù)測得的OD值與相應(yīng)濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出換算公式。2)疫苗的制備及免疫重組蛋白疫苗的制備將重組鏈球菌2型抗原蛋白0197、1036N和enolase按體積比為11分別與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中每種抗原蛋白的終濃度為500yg/mL·第二次免疫用的疫苗采用弗氏不完全佐劑。免疫方法給所述的試驗小鼠腹腔接種弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為ΙΟΟμΙ/只)；2周后腹腔接種弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為100μ1/只)；間隔10天后于眼眶放血，收集血清。用Western-blot方法(見上述《分子克隆手冊》)分析重組抗原蛋白0197、1036N和enolase的免疫原性，結(jié)果如圖5所示。實施例3重組抗原蛋白免疫保護力試驗重組抗原的表達及純化將含pET-28a_0197、pET-28a_1036N、pET-28a_enolase質(zhì)粒的表達菌株分別接種于含0.25μg/ml的3mLLB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μL接種于IOmL含2.5μg卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)約3h，至0D_達到0.6-1.0時，加IPTG至終濃度為0.8mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。將以上收集的重組抗原表達菌體用Bindingbuffer(20mMTris_HClpH7.9，5mMImidazole，0.5MNaCl)重懸，超聲波破碎，4°C12，OOOg離心15min取上清上樣。分別使用Bindingbuffer和Washingbuffer(20mMTris-HClρΗ7·9，15mMImidazole,0.5MNaCl)洗柱直至OD值達到基線附近，換用Elutionbuffer(20mMTris-HClpH7.9,40mMImidazole,0.5MNaCl)洗脫結(jié)合的重組抗原蛋白，收集波峰部分蛋白作為純化的重組抗原蛋白。重組抗原蛋白濃度的測定將蛋白樣品牛血清白蛋白用PBS緩沖液溶解，然后進行倍比稀釋。分別取每個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液100μ1，加入到5ml的染料液中，反應(yīng)IOmin后，在波長595nm處測吸光度，根據(jù)測得的OD值與相應(yīng)濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出換算公式。重組抗原蛋白疫苗制備及免疫方法1)重組抗原疫苗的制備[0156]分別將重組抗原蛋白0197、1036N和enolase與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中每種抗原蛋白終濃度為500μg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐齊U，其余組分與首免相同。滅活疫苗制備將豬鏈球菌2型CVCC606株菌純培養(yǎng)后，挑取單個菌落810個，涂于TSA平板上(含10%滅活牛血清)。37°C培養(yǎng)16h18h后，用滅菌的O.Olmol/LPBS將平板上的菌苔洗下，稀釋至7.5X109CfU/ml，用甲醛滅活(3%。)24h48h，然后與弗氏佐劑按11體積混合乳化，使終濃度達到3.0X109cfu/mL·2)免疫方法將本發(fā)明制備的由弗氏完全佐劑乳化的疫苗按100μ1/只劑量腹腔免疫試驗小鼠；2周后改用弗氏不完全佐劑乳化的疫苗加強免疫1次(免疫劑量為100μ1/只)。3)半數(shù)致死量(LD5tl)的測定(1)預(yù)試驗在預(yù)試中求得8周齡雌性BALB/c小鼠全死亡或90%以上死亡的劑量和動物不死亡或10%以下死亡的劑量，分別作為正式試驗的最高與最低劑量。(2)注射方式腹腔注射(3)動物設(shè)立4個劑量組，每組6只BALB/c小鼠。(4)劑量將由預(yù)試驗得出的最高、最低劑量均換算為常用對數(shù)，然后將最高、最低劑量的對數(shù)差，按所需要的組數(shù)，分為幾個對數(shù)等距(或不等距)的劑量組。(5)試驗結(jié)果的計算與統(tǒng)計I列試驗數(shù)據(jù)及其計算表II包括各組劑量(CFU)，劑量對數(shù)(X)、動物數(shù)(η)、動物死亡數(shù)(r)、動物死亡百分比(P，以小數(shù)表示)，以及統(tǒng)計公式中要求的其它計算數(shù)據(jù)項目。IIILD50的計算公式IogLD50=Σ1/2X(XjXw)(Pw-Pi)。Xi與Xi+1及Pi+1與Pi分別為相鄰兩組的劑量對數(shù)以及動物死亡百分比。4)試驗分組及免疫取7周齡，體重18士2g雌性BALB/c小白鼠120只，平均分為6組、疫苗I組(0197)、疫苗II組(1036N)、疫苗IIIV組(enolase)、疫苗IV組(滅活疫苗)、佐劑對照組和PBS對照組，每組20只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫劑量為0.Iml/只，期間每周斷尾取血，用于血清特異性抗體的監(jiān)測。5)血清特異性抗體的檢測分別使用純化的重組抗原0197、1036N和enolase250ng/100μ1于4°C過夜包被酶聯(lián)板，BSA(牛血清白蛋白)37°C封閉lh，洗滌液洗板1次后封裝于-20°C保存。將加強免疫2周后的小鼠采血分離血清，倍比稀釋后取100μ1加入酶聯(lián)板，同時設(shè)弗氏佐劑對照和空白對照。37°C反應(yīng)30min。洗板3次后加入體積比15，000稀釋的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，37°CiS30min。洗板5次后加入100μ1底物液(見上所述)，避光顯色IOmin后加入0.25%HF終止反應(yīng)，于630nm讀數(shù)。取OD值大于0.3的血清最大稀釋倍數(shù)作為血清抗體滴度。6)重組抗原誘導(dǎo)小鼠抗體IgG亞類測定將加強免疫2周后的小鼠采血分離血清，倍比稀釋后取100μ1加入酶聯(lián)板，37°C反應(yīng)30min。洗板3次后每個稀釋度的血清分別加入體積比15，000稀釋的羊抗鼠IgGl-HRP、IgG2a-HRP，37°C反應(yīng)30min。洗板5次后加入100μ1底物液(見上所述)，避光顯色IOmin后加入0.25%HF終止反應(yīng)，于630nm讀數(shù)。取OD值大于0.3的血清最大稀釋倍數(shù)作為該IgG亞類的滴度。7)免疫鼠攻毒后保護情況對加強免疫兩周后的小鼠進行攻毒試驗。從每個免疫組隨機挑選16只小鼠進行攻毒保護力試驗。攻毒試驗分為兩批進行，每組8只，每個蛋白免疫的小鼠分別接種5LD5(i和20LD5(1劑量的SS2。連續(xù)觀察一周，記錄小鼠的臨床特征及死亡情況。本實施例中重組抗原的表達、純化同實施例2所述；CVCC606株菌半數(shù)致死量(LD50)為4XIO8CFU；對重組表達的抗原HP0197、HP1036、Enolase進行血清特異性抗體的檢測，結(jié)果表明所有的保護性抗原都能誘導(dǎo)很高的抗體水平，見圖6；重組抗原誘導(dǎo)小鼠抗體IgG亞類測定結(jié)果如圖7所示；三種抗原蛋白分別免疫小鼠后5LD5(I攻毒保護力效果情況如圖8所示；三種抗原蛋白分別免疫小鼠后20LD5Q攻毒保護力效果情況如圖9所示。實施例4重組亞單位疫苗免疫保護力試驗一重組亞單位疫苗小鼠保護力試驗1.重組蛋白的克隆、表達及純化。重組蛋白的克隆、表達及純化如實施例2所述。2.重組蛋白濃度的測定(Bradford法)蛋白質(zhì)濃度測定方法如實施例2所述。3.重組亞單位疫苗制備及免疫方法疫苗制備重組抗原HP0197、HP1036、Enolase等質(zhì)量均勻混合后與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中每種蛋白終濃度500yg/ml，用于首免，二次免疫使用弗氏不完全佐劑，其它成分不變。免疫方法腹腔免疫弗氏完全佐劑乳化的抗原100μ1/只；2周后腹腔免疫弗氏不完全佐劑乳化的抗原100μ1/只。4.半數(shù)致死量(LD5tl)的測定測定步驟參見實施例3。5.試驗分組及免疫取7周齡，18士2g雌性BALB/c小白鼠40只，平均分為4組、疫苗I組(HP0197+HP1036+Enolase)、疫苗II組(滅活疫苗)、佐劑對照組和PBS對照組，每組10只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫劑量為0.Iml/只，期間每周斷尾取血，用于血清特異性抗體的監(jiān)測。6.血清特異性抗體的檢測同實施例3所述。7.免疫鼠攻毒后保護情況對加強免疫兩周后的小鼠進行攻毒試驗。從每個免疫組隨機挑選8只小鼠進行攻毒保護力試驗。每組小鼠分別接種IOLD5tl劑量的SS2。連續(xù)觀察一周，記錄小鼠的臨床特征及死亡情況。本實施例中對保護性抗原Enolase、HPO197,HP1036組合進行免疫后抗體水平檢測結(jié)果如圖10；本發(fā)明的亞單位疫苗免疫鼠后攻毒保護效果如圖11所示。二重組亞單位疫苗仔豬保護力試驗1.疫苗制備多組份重組亞單位疫苗的制備將3種重組抗原EnOlase、HP0197、HP1036按質(zhì)量比1:1:1混合后與美國艾克森美孚白油佐劑按11.5體積混合無菌乳化，使疫苗中每種蛋白終濃度lmg/ml。對照組則用PBS代替抗原組份與美國艾克森美孚白油佐劑按11.5體積混合無菌乳化。2.疫苗無菌檢驗將制備好的疫苗無菌吸取20μ1涂布TSA平皿，37°C培養(yǎng)過夜。3.免疫及攻毒1)動物分組及免疫4周齡斷奶仔豬分為3組，疫苗組(HP1036+HP0197+enOlaSe)、艾克森美孚白油佐劑對照組和空白對照組(PBS)，每組6頭。頸部和臀部多點注射，每2周免疫1次，共2次，免疫劑量為2ml/頭，期間每周耳靜脈取血，用于血清特異性抗體的監(jiān)測。2)血清特異性抗體的檢測使用純化的重組抗原250ng/100l·!1于4°C過夜包被酶聯(lián)板，1%BSA37°C封閉lh，洗滌液洗板1次后封裝于_20°C保存。將免疫后的豬采血分離血清，倍比稀釋后取100μ1加入酶聯(lián)板，同時設(shè)佐劑對照和空白對照。37°C反應(yīng)30min。洗板3次后加入體積比15，000稀釋的羊抗豬IgG(H+L)-HRP，37°C反應(yīng)30min。洗板5次后加入100μ1底物液，避光顯色IOmin后加入0.25%HF終止反應(yīng)，于0D630nm讀數(shù)。取OD值大于0.3的血清最大稀釋倍數(shù)作為血清抗體滴度。3)免疫后仔豬臨床癥狀首次免疫后每天監(jiān)測體溫、采食及精神情況。4)免疫豬攻毒后保護情況對加強免疫兩周后的仔豬進行攻毒試驗。每組6頭進行攻毒保護力試驗。每組分別接種6.OX105cfu劑量的CVCC606株菌。連續(xù)觀察8天，記錄臨床特征及死亡情況。本實施例中疫苗檢測為無菌；免疫后仔豬沒有明顯臨床癥狀，體溫變化見圖12；對本發(fā)明的保護性抗原enOlase、0197、1036N組合進行免疫后抗體水平檢測，結(jié)果如圖13；免疫后仔豬攻毒保護情況見圖14。實施例5亞單位疫苗成分及制備方法1.疫苗用抗原蛋白抗原組分疫苗組分蛋白有三種，分別為0197、1036N和enolase。這三種蛋白的表達、鑒定、純化及定量如實施例3所述。劑型油包水型(W/0)佐劑疫苗用佐劑采用美國艾克森美孚白油。組成白礦油(Marcol52)吐溫80(CRILLET4)司盤80(CRILL4)油相白礦油加熱至透明后與司盤80按體積比946配制。水相蛋白與吐溫80組成，吐溫80占水相的0.4%。[0222]疫苗乳化三種抗原蛋白0197、1036N和enolase按質(zhì)量比為111混合，力口入吐溫80混勻制成水相，水相與油相按11.5體積混合乳化。使每種抗原蛋白的終濃度為2mg/ml。疫苗性狀檢測乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散開，第二滴油珠狀，晃動液面油珠不破乳。無菌檢測取少許疫苗涂布TSA平皿，37°C溫箱培養(yǎng)18小時無菌落長出。免疫程序免疫兩次，首次免疫頸部肌肉分點注射，每頭1ml。兩周后加強免疫一次，免疫劑量及部位與首免一致。本亞單位疫苗對豬鏈球菌2型能夠提供83%的保護率，該抗原組分在其它型豬鏈球菌中廣泛存在，具有抵抗其它型鏈球菌的潛力，經(jīng)過適當(dāng)佐劑添加有望獲得更好的效果，可以用于我國豬鏈球菌2型病的防制。權(quán)利要求能夠分泌豬鏈球菌2型抗原蛋白的重組大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a-0197，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOMM208146。2.包含權(quán)利要求1所述大腸桿菌分泌豬鏈球菌2型抗原蛋白的疫苗。3.權(quán)利要求2所述的疫苗是預(yù)防和/或防治豬鏈球菌2型三組分亞單位疫苗。4.權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型免疫保護性抗原蛋白中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型三組分亞單位疫苗中的應(yīng)用。專利摘要本發(fā)明屬于家畜傳染病疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
：。具體涉及豬鏈球菌2型三組分亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明的核心技術(shù)是制備了能夠分泌豬鏈球菌2型抗原蛋白1036N，0197和enolase，表達上述抗原蛋白的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21/pET-28a-0197，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號分別為CCTCCNoM208146。本發(fā)明還公開了適用于豬鏈球菌2型的三組分亞單位疫苗的制備方法及用途。文檔編號C12R1/19GKCN101824393SQ201010148649公開日2010年9月8日申請日期2008年10月30日發(fā)明者康超,張安定,李冉,王雅,金梅林,陳博,陳煥春申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan