專利名稱:蛋清中溶菌酶的提取及蛋清蛋白的綜合利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種溶菌酶的提取方法，更具體的說，是關(guān)于一種從蛋清中提取溶菌酶的方法，以及溶菌酶提取后剩余蛋清蛋白的綜合利用如干燥制成蛋白片或采用酶法降解制取活性肽。
背景技術(shù)：
溶菌酶(lysozyme)，又稱胞壁質(zhì)酶，是由129個氨基酸構(gòu)成的單純蛋白質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，pH值在1.2～11.3范圍內(nèi)劇烈變化時，其結(jié)構(gòu)幾乎不變；酸性環(huán)境中對熱的穩(wěn)定性也很強，pH4～7，100℃處理1分鐘仍保持原酶活性。溶菌酶的研究和應(yīng)用目前在我國尚處于起步階段，主要功能是分解細菌細胞壁，使細菌溶脹破裂，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌及陰性菌均有溶菌作用，在食品、醫(yī)療及生物工程等方面具有廣泛的應(yīng)用。
目前實際應(yīng)用的、業(yè)已商品化的大多是雞蛋清溶菌酶。雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4％～3.5％，作為溶菌酶類的典型代表，是目前重點的研究對象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。
在目前已公開的文獻中，如公開號為CN1475567A的專利文獻，一般是采用將蛋清用樹脂吸附，然后再用鹽溶液洗脫，接著進行透析、鹽析、干燥的方法來制備溶菌酶能得到較高產(chǎn)率的溶菌酶，但同時蛋清中的大部分蛋白質(zhì)被破壞，致使無法進行蛋清蛋白的后續(xù)加工應(yīng)用，并且溶菌酶干燥的方法大多是真空干燥或冷凍干燥，不僅干燥時間長，而且干燥品的活性受影響較大，一般均在6000個單位/mg左右，且干燥后所得到的溶菌酶產(chǎn)品非均勻粉末狀，不利于做成制劑。
本研究充分利用溶菌酶的特點，采用控制溫度75℃，加食品級鹽酸(2％)或乳酸(6％)，加氯化鉀量4％的最優(yōu)化分離工藝將溶菌酶分離，之后利用超濾濃縮到原體積的1/8～1/9，達到理想的脫鹽率，最后經(jīng)80～85℃的進風(fēng)溫度噴霧干燥得干制品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的從蛋清中提取溶菌酶的方法，該工藝簡單可行，操作方便，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，既能保證產(chǎn)品質(zhì)量，又能降低生產(chǎn)成本。提取后剩余的蛋清蛋白既可以干燥制成蛋白片又可利用中性蛋白酶水解法制備成活性多肽。
本發(fā)明的技術(shù)方案
1.蛋清中溶菌酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)工藝流程



(2)具體實施步驟
①蛋清液的制備蛋清以打蛋機慢速攪打(10～20r/min)均勻且不發(fā)泡(加適量0.1％～0.2％色拉油)為度。
②酶提取(酸鹽控溫組合法)將一定量的食品級鹽酸(2％)或乳酸(6％)、氯化鉀(4％)溶于與蛋清相等體積的純凈水中，然后在75℃溫度下與蛋清混合均勻。整個混合過程控制在10min內(nèi)完成。
③冷卻及離心上述混合液混勻后保溫10min，再迅速冷卻到25℃以下。4000r/min離心6～8min。上清液用食品級NaOH調(diào)pH到中性。
④超濾(中空纖維超濾膜法)采用截留量為11000的中空纖維超濾膜，控制氮氣壓力為0.20MPa，進行超濾脫鹽及濃縮。濃縮到原始體積的1/8～1/9左右時，尚能保持11.0～12.0L/min·m2的超濾速度和89％～90％的脫鹽率。
⑤噴霧干燥以80～85℃進風(fēng)溫度進行噴霧干燥，之后測定產(chǎn)品的水分含量及活力。其水分含量控制在4.3％～4.8％之間，產(chǎn)品活力可達10000u/mg。
2.提取后剩余的蛋清蛋白的綜合利用
(1)提取后剩余的蛋清蛋白于45～55℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.08～0.10MPa)制成成品蛋白片(水分含量5％以下)。
(2)將提取后剩余的蛋清蛋白利用細菌中性蛋白酶水解法制備活性多肽酶解制備活性多肽工藝
提取后剩余的蛋清蛋白→加入一定量的純凈水定量(底物濃度為60％～70％)→調(diào)pH值至6.5～7.0→加入一定量的細菌中性蛋白酶(1.5％～2.0％，酶活10萬u/g)→一定范圍溫度水解(45～50℃)一定的時間(5～6h)→沸水浴15min滅活酶→5000r/min離心20min棄去沉淀→取上清液(液氨基態(tài)氮含量達到1100～1200mg/kg)→冷凍干燥→蛋清活性肽粗品
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1.2％的食品級鹽酸或6％的乳酸的添加量既不會破壞溶菌酶，又便于雜蛋白的沉淀，使溶菌酶得到分離純化。
2.溶于純凈水中的食品級鹽酸或乳酸、氯化鉀，與蛋清在75℃溫度下混勻不僅有利于雜蛋白變性、脫除，而且還能保持較高的產(chǎn)品活力。
3.以80～85℃進風(fēng)溫度進行噴霧干燥得干制品，既能保證產(chǎn)品質(zhì)量，又能降低生產(chǎn)成本。
4.采用這種方法從蛋清中提取溶菌酶不僅得到了較高產(chǎn)率和純度的溶菌酶，而且提取后剩余的蛋清蛋白既可以干燥制成蛋白片，又可采用中性蛋白酶水解法制備活性多肽，可謂一舉多得。
具體實施方式
下面舉例對本發(fā)明做更詳盡的描述。
實例一
(1)溶菌酶的提取
用禽蛋(雞蛋、鴨蛋或鵝蛋)分離器將蛋黃與蛋清分開，機械攪打蛋清以均勻且不發(fā)泡為度。將2％的食品級鹽酸或6％的乳酸、4％氯化鉀溶于蛋清相等體積的純凈水中，然后在75℃下與蛋清混合均勻。整個混合過程控制在10min內(nèi)完成。上述混合液混勻后保溫10min，再迅速冷卻到25℃以下。4000r/min離心7min。上清液用食品級NaOH調(diào)pH到中性。采用截留量為11000的中空纖維超濾膜，控制氮氣壓力為0.20MPa，進行超濾脫鹽及濃縮。濃縮至原始體積的1/8時，尚能保持12.0L/min·m2的超濾速度和89％的脫鹽率。以82℃的進風(fēng)溫度進行噴霧干燥，之后測定產(chǎn)品的水分含量及活力。其含水量為4.6％，溶菌酶活力高達10009u/mg。
(2)提取后剩余的蛋清蛋白的綜合利用
①提取后剩余的蛋清蛋白50℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.09MPa)制成成品蛋白片(水分含量5％以下)。
②將提取后剩余的蛋清蛋白利用細菌中性蛋白酶水解法制備活性多肽。
提取后剩余的蛋清蛋白加入一定量的純凈水定量使其底物濃度為65％，調(diào)pH值至7.5加入一定量的細菌中性蛋白酶(1.6％，酶活10萬u/g)，48℃恒溫水解5.5h，沸水浴15min滅活酶后5000r/min離心20min棄去沉淀，取上清液測得液氨基態(tài)氮含量達到1138mg/kg，冷凍干燥得蛋清活性肽粗品。
權(quán)利要求
1.蛋清中溶菌酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)蛋清液的制備蛋清以打蛋機慢速攪打(10～20r/min)均勻且不發(fā)泡(加適量0.1％～0.2％色拉油)為度。
(2)酶提取(酸鹽控溫組合法)將一定量的食品級鹽酸(2％)或乳酸(6％)、氯化鉀(4％)溶于與蛋清相等體積的純凈水中，然后在75℃溫度下與蛋清混合均勻。整個混合過程控制在10min內(nèi)完成。
(3)冷卻及離心上述混合液混勻后保溫10min，再迅速冷卻到25℃以下。4000r/min離心6～8min。上清液用食品級NaOH調(diào)pH到中性。
(4)超濾(中空纖維超濾膜法)采用截留量為11000的中空纖維超濾膜，控制氮氣壓力為0.20MPa，進行超濾脫鹽及濃縮。濃縮到原始體積的1/8～1/9左右時，尚能保持11.0～12.0L/min·m2的超濾速度和89％～90％的脫鹽率。
(5)噴霧干燥以80～85℃進風(fēng)溫度進行噴霧干燥，之后測定產(chǎn)品的水分含量及活力。其水分含量控制在4.3％～4.8％之間，產(chǎn)品活力可達10000u/mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所加食品級鹽酸的濃度為2％或乳酸的濃度為6％、氯化鉀的濃度為4％、與蛋清的混合溫度為75℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中濃縮液的體積濃縮至原始體積的1/8～1/9。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中進行噴霧干燥的進風(fēng)溫度應(yīng)控制在80～85℃。
5.提取后剩余的蛋清蛋白的綜合利用，其特征在于，包括以下步驟
(1)提取后剩余的蛋清蛋白于45～55℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.08～0.10MPa))制成成品蛋白片。
(2)將提取后剩余的蛋清蛋白利用細菌中性蛋白酶水解法制備活性肽。
酶解制備活性肽工藝
提取后剩余的蛋清蛋白→加入一定量的純凈水定量(底物濃度為60％～70％)→調(diào)pH值至6.5～7.0→加入一定量的細菌中性蛋白酶(1.5％～2.0％，酶活10萬u/g)→一定范圍溫度水解(45～50℃)一定的時間(5～6h)→沸水浴15min滅活酶→5000r/min離心20min棄去沉淀→取上清液(液氨基態(tài)氮含量達到1100～1200mg/kg)→冷凍干燥→蛋清活性肽粗品。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的提取后剩余的蛋清蛋白的綜合利用，其特征在于，所述步驟(1)提取后剩余的蛋清蛋白的普通干燥烘干溫度為45～55℃，真空干燥真空度為0.08～0.10MPa。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種從禽蛋(雞蛋、鴨蛋或鵝蛋)中提取溶菌酶的新方法，通過酸鹽(鹽酸或乳酸、氯化鉀)控溫組合法酶提取分離、冷卻、離心、調(diào)pH值、中空纖維超濾膜法酶濃縮提純、噴霧干燥法等一系列工藝聯(lián)合制取蛋清溶菌酶。該工藝簡單可行，操作方便，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，既能保證產(chǎn)品質(zhì)量，又能降低生產(chǎn)成本。提取后剩余的蛋清蛋白既可以真空干燥制成蛋白片又可利用細菌中性蛋白酶水解法制備成蛋清活性肽粗品。
文檔編號C12P21/00GKCN101768577SQ201010134655
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月1日
發(fā)明者孫維軍, 孟慶文, 王超, 孫京新, 李兆順 申請人:德州天康食品有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan