專利名稱：一種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，尤其是一種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝。
背景技術(shù)：
流行性感冒，是由流感病毒引起的一種傳染性極強的病毒性疾病。流感病毒分為 甲、乙、丙三型，其中，最常引起發(fā)病的是甲型。甲型流感病毒常在10 15年內(nèi)發(fā)生突變， 出現(xiàn)新的亞型，引起大流行。由于人體對各型流感病毒之間無交叉免疫能力，故每年都有不 同范圍的新亞型流感流行。我國用于流感預(yù)防的疫苗有三種全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗。流感 疫苗中包含三個病毒株，2個甲型，1個乙型，這三個病毒株的活性成分在疫苗的生產(chǎn)過程 中都已經(jīng)被“殺死”，所以接種流感疫苗不會感染流感。上述三種疫苗各有特點全病毒滅活 疫苗免疫效果好，但副作用較大，只能用于成人接種，兒童不能接種；亞單位疫苗副作用較 小，但免疫效果一般；裂解疫苗免疫效果好，同時副作用也比較小。裂解疫苗和亞單位疫苗 對兒童和成人都可以接種。目前全球使用量最大的是裂解疫苗。目前，國內(nèi)廠家生產(chǎn)的主要是流感病毒裂解疫苗。各個廠家的工藝路線也不盡相 同，如病毒純化工藝有的廠家采用分子篩柱層析法，有的采用區(qū)帶離心法，有的兩種方法混 用。病毒滅活工藝也不一樣，有的先滅活后純化，有的先純化后滅活，有的在病毒裂解前滅 活，有的在病毒裂解后滅活等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝， 該方法步驟如下(1)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種稀釋至病毒量2. 0-6. 0LgEID50/ml的工 作種子批毒種(工作種子批毒種系由世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦、并經(jīng)國家藥品管理部門認(rèn) 可的甲型和乙型流感病毒的當(dāng)年流行株或相似株按常規(guī)方法傳代制備成主代毒種庫，再按 同法制備成工作毒種)，置33 35°C培養(yǎng)48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C —定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄 清過濾后每個容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醛，置 2-8°C滅活15 M小時；滅活結(jié)束分別對每個病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗證試驗 和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定；(4)、病毒收獲液濃縮滅活后的尿囊液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；
(5)、病毒純化5. 1蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入體積比為 50 60 %的蔗糖溶液，同時調(diào)節(jié)機器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min，連續(xù)泵入滅活后的 尿囊液，進(jìn)樣完畢，泵入3-4L緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機器停穩(wěn)，在280nm波長監(jiān)測 下，收集病毒峰；5. 2柱層析用kphr0Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8%， 洗脫液為0. Olmol/L、pH7. 2的PBS，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為 ^Onm，收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度的體積比為0. 3 0. 5 % Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘；(7)、加入PB去裂解劑向裂解后的病毒液中加入等量lmol/L pH7. 2磷酸鹽溶液 (PB)，混合均勻后用離心法或過濾法除去裂解劑，然后將樣品用100KD的超濾膜進(jìn)行超濾 洗濾，以進(jìn)一步去除裂解劑，超濾后的病毒液取樣進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定和微生物限度 檢查，細(xì)菌內(nèi)毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度檢查菌數(shù)應(yīng)小于10CFU/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為單價原液；(9)、半成品配制用0. Olmol/L、pH7. 2的PBS將各型原液稀釋至血凝素含量為 30 μ g/株/ml，經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。本發(fā)明有益的效果是本工藝采用了現(xiàn)有各種工藝的優(yōu)點，并增加了新型純化方 法，因而可以達(dá)到提高收率、提高有效抗原含量、大幅度降低可導(dǎo)致接種反應(yīng)的成份殘余卵 清蛋白和裂解劑含量。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明這種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝，該方法步驟如下(1)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種稀釋至病毒量2. 0-6. OLgEID5cZml的工 作種子批毒種(工作種子批毒種系由世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦、并經(jīng)國家藥品管理部門認(rèn) 可的甲型和乙型流感病毒的當(dāng)年流行株或相似株按常規(guī)方法傳代制備成主代毒種庫，再按 同法制備成工作毒種)，置33 35°C培養(yǎng)48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C —定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄 清過濾后每個容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醛，置 2-8°C滅活15 M小時；滅活結(jié)束分別對每個病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗證試驗 和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定；(4)、病毒收獲液濃縮滅活后的尿囊液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為iOOOKD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化5. 1蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入體積比為 50 60 %的蔗糖溶液，同時調(diào)節(jié)機器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min，連續(xù)泵入滅活后的
4尿囊液，進(jìn)樣完畢，泵入3-4L緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機器停穩(wěn)，在280nm波長監(jiān)測 下，收集病毒峰；5. 2柱層析用kphr0Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8%， 洗脫液為0. Olmol/L、pH7. 2的PBS，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為 ^Onm，收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度的體積比為0. 3 0. 5 % Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘；(7)、加入PB去裂解劑向裂解后的病毒液中加入等量lmol/L pH7.2磷酸鹽溶液， 混合均勻后用離心法或過濾法除去裂解劑，然后將樣品用100KD的超濾膜進(jìn)行超濾洗濾， 以進(jìn)一步去除裂解劑，超濾后的病毒液取樣進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定和微生物限度檢查， 細(xì)菌內(nèi)毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度檢查菌數(shù)應(yīng)小于10CFU/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為單價原液；(9)、半成品配制用0. Olmol/L、pH7. 2的PBS將各型原液稀釋至血凝素含量為 30 μ g/株/ml，經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。用專利工藝制備的半成品檢測結(jié)果見下表。
權(quán)利要求
1. 一種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝，其特征是該方法步驟如下(1)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種稀釋至病毒量2.0-6. OLgEID5tZml的工作種 子批毒種，置33 35°C培養(yǎng)48 72小時；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄清過 濾后每個容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ml的范 圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200μ g/ml的甲醛，置2-8°C滅 活15 M小時；滅活結(jié)束分別對每個病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗證試驗和細(xì)菌內(nèi) 毒素含量測定；G)、病毒收獲液濃縮滅活后的尿囊液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD的超 濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化[5. 1蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時以不超過離心腔容積50%的量泵入體積比為50 60%的蔗糖溶液，同時調(diào)節(jié)機器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min，連續(xù)泵入滅活后的尿囊 液，進(jìn)樣完畢，泵入3-4L緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機器停穩(wěn)，在^Onm波長監(jiān)測下， 收集病毒峰；[5. 2柱層析用kphr0Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8%，洗脫 液為0. 01mol/L、pH7. 2的PBS，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測波長為280nm，收 集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度的體積比為0.3 0. 5% Triton X-100及 去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘；(7)、加入PB去裂解劑向裂解后的病毒液中加入等量lmol/LpH7. 2磷酸鹽溶液，混合 均勻后用離心法或過濾法除去裂解劑，然后將樣品用100KD的超濾膜進(jìn)行超濾洗濾，以進(jìn) 一步去除裂解劑，超濾后的病毒液取樣進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定和微生物限度檢查，細(xì)菌 內(nèi)毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度檢查菌數(shù)應(yīng)小于10CFU/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)0.22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為單價原液；(9)、半成品配制用0.01mol/L、pH7. 2的PBS將各型原液稀釋至血凝素含量為30 μ g/ 株/ml，經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備流感病毒裂解疫苗的新工藝，步驟如下(1)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種稀釋至病毒量2.0-6.0LgEID50/ml的工作種子批毒種，置33～35℃培養(yǎng)48～72小時；(2)、病毒收獲、病毒滅活、病毒收獲液濃縮；(3)、病毒純化和病毒裂解，純化后的病毒液加入終濃度的體積比為0.3～0.5％Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20～30℃下作用90～120分鐘；(4)、加入PB去裂解劑，(5)、除菌過濾后再配制成半成品用0.01mol/L、pH7.2的PBS將各型原液稀釋至血凝素含量為30μg/株/ml，經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾，即為半成品。本發(fā)明有益的效果是增加了新型純化方法，因而可以達(dá)到提高收率、提高有效抗原含量、大幅度降低可導(dǎo)致接種反應(yīng)的成份殘余卵清蛋白和裂解劑含量。
文檔編號A61K39/145GK102133399SQ201110060229
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者姚偉, 蔣正東 申請人:浙江天元生物藥業(yè)有限公司