專利名稱：一種裂解病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種裂解病毒的方法，更具體地說，涉及一種用超臨界流體萃取技術裂解具有脂膜或類脂膜病毒的方法。
背景技術：
具有脂膜或類脂膜的病毒存在以下共性①脂膜和類脂膜對病毒具有保護性，脂膜和類脂膜被破壞后將導致病毒喪失活性和感染性；②脂膜和類脂膜上均嵌有病毒的結構蛋白，該蛋白對維持病毒結構的穩(wěn)定性以及病毒感染生物機體使機體產生中和抗體具有重要的生物學意義；③使用可以刺激機體產生中和抗體的病毒蛋白，可以制備用于預防該病毒引起感染的裂解疫苗或亞單位疫苗。
目前，具有脂膜或類脂膜病毒的裂解主要采用廣泛用于醫(yī)藥衛(wèi)生工業(yè)的裂解劑，這些裂解劑有表面活性劑、去污劑以及有機溶劑，例如吐溫-80、Triton系列、脫氧膽酸鈉、乙醚等。使用這些裂解劑破壞病毒的脂膜或類脂膜后，使其上的蛋白或包裹的蛋白處于溶解狀態(tài)，經過純化，用于其功能的研究和應用。以流感疫苗為例，在裂解疫苗的制備過程中，加入裂解劑將經過純化的病毒裂解，使血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)兩種抗原處于溶解狀態(tài)后再純化，然后還要經過去除裂解劑的工序，以及對去除的效果進行驗證后，才能制成安全的疫苗。
這些表面活性劑、去污劑以及有機溶劑的使用給操作者帶來人體危害，尤其在裂解疫苗工業(yè)化生產過程中，裂解劑的大量使用對環(huán)境造成極大污染。另外，去除殘留裂解劑的工序使工藝過程變得繁雜，如果這些溶劑(和試劑)有殘存，就會對后續(xù)的研究工作產生影響，尤其對于制成供人體直接使用的裂解疫苗或亞單位疫苗，即使裂解劑有微量的殘存也將對使用者產生潛在的危害。
另外，由于使用裂解劑裂解病毒的過程是一個漸變的過程，裂解劑隨機地破壞病毒脂膜或類脂膜的部分區(qū)域，使脂膜或類脂膜發(fā)生破裂，形成帶有缺口的半裂解病毒(見圖2中標號2)，只有部分血凝素從病毒表面脫落，因此裂解過程終止后，通過電鏡仍然會觀察到完整病毒顆粒的存在(見圖2中標號1)，所以其裂解并不是完全充分和均勻的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有技術中大量使用具有一定毒性的化學裂解劑，造成對環(huán)境的污染和人體的危害，以及裂解效果不佳致使有效物質不能完全獲取的問題，提供了應用超臨界流體萃取技術裂解病毒的方法。
本方法是利用某些處于超臨界狀態(tài)下的流體裂解具有脂膜或類脂膜的病毒。具體的做法是將病毒置于帶有通氣管路的密封良好的容器中，通入處于超臨界狀態(tài)下的流體，保持一定時間后，再將該流體導出，完成裂解。
本發(fā)明使用的超臨界流體一般是在常溫常壓條件下為氣體的流體，在本發(fā)明中，用于裂解病毒時，使該流體的溫度和壓力都處于高于其臨界溫度和臨界壓力的超臨界狀態(tài)下。這種處于超臨界狀態(tài)下的流體具有液體的溶解度、氣體的流動性和介于兩者之間的粘性，在臨界點附近，壓力微小的變化就會導致體積很大的變化，所產生的能量很大，能夠使病毒的脂膜或類脂膜被均一地完全破壞，血凝素從病毒表面完全脫落而使病毒完全裂解。
對于適用于本發(fā)明的超臨界流體沒有特別限制，只要該流體的臨界溫度不使病毒變性、活性物質不被破壞即可；臨界壓力只要是容器能夠耐受的壓力即可。例如，這樣的流體可以是二氧化碳(CO2)、氮(N2)、一氧化二氮(N2O)、氧(O2)等。其中，臨界點時溫度為31.1℃，臨界壓力為7.32Mpa的二氧化碳和臨界點時溫度為-147.1℃，臨界壓力為3.35Mpa的氮其臨界條件容易達到，且本身化學性質穩(wěn)定并且容易獲得，所以優(yōu)選使用這兩種氣體。另外，由于二氧化碳的臨界溫度最接近一般病毒裂解的最佳溫度，而且來源豐富、價格便宜、無爆炸性、無污染而特別適宜于裂解病毒。
同時，處于超臨界狀態(tài)下的流體對病毒表面的脂膜和類脂膜還具有萃取的作用，通過該作用能夠破壞病毒表面的化學結構，造成病毒表面的某些位置產生結構缺陷，從而使膜上物質和內容物脫離病毒，有助于實現良好的裂解效果。
作為具有脂膜或類脂膜的病毒可以列舉出正粘病毒科病毒(Orthomyxoviridae)、彈狀病毒科病毒(Rhabdoviridaes)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的漢坦病毒屬(Hantavirus)、風疹病毒(rubella virus)、副粘病毒科病毒、披膜病毒科的甲病毒屬、乙型腦炎病毒(又稱日本腦炎病毒)、登革病毒、丙型肝炎病毒等。其中，正粘病毒科病毒例如有流行性感冒病毒甲1型、甲3型和乙型等各亞型；彈狀病毒科病毒例如有狂犬病病毒屬的狂犬病病毒等；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的漢坦病毒屬例如有腎綜合征出血熱病毒等和它們的不同血清型；副粘病毒科病毒例如有人類呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等。
本發(fā)明采用的超臨界流體萃取技術為物理方法，完全能夠替代現有技術中的化學試劑裂解病毒，并且采用本發(fā)明的方法，由于脂膜或類脂膜被均一地完全破壞，血凝素和神經氨酸酶從病毒表面完全脫落，從而提高了病毒的裂解效果。
另外，由于裂解過程中避免使用了化學試劑，所用的超臨界流體在完成裂解后易于從體系中除去，并可以循環(huán)使用，因此大大減少了對環(huán)境造成的不良影響。
再有，在利用裂解后的病毒的有效成分制成疫苗時，采用本發(fā)明的方法由于超臨界流體無殘留，得到的疫苗純度很高，不會對使用者產生潛在危害，因此疫苗的安全性大大提高。


圖1為全病毒的透視電鏡照片；圖2為利用化學試劑裂解病毒顆粒后觀察到的透視電鏡照片；圖3為按實施例1的方法裂解甲1型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖4為按實施例2的方法裂解甲3型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖5為按實施例3的方法裂解乙型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；
圖6為按實施例4的方法裂解乙型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖7為按實施例1～4的方法裂解的病毒和使用化學裂解劑裂解相應病毒的蛋白電泳照片。
具體實施例方式
流行性感冒病毒屬于正粘病毒科，其外殼為類脂膜，膜上有可以產生中和抗體的血凝素蛋白和對預防流行性感冒病毒具有一定意義的神經氨酸酶，在具有脂膜或類脂膜病毒中具有一定的代表性，所以選取不同亞型的流感病毒，即甲1、甲3及乙型流感病毒，采用超臨界萃取技術進行裂解，進而具體說明本發(fā)明。
病毒的預處理分別取甲1、甲3及乙型流感病毒接種于9-11日齡的清潔級(SPF)雞胚，48小時(乙型為72小時)后冷胚，收集尿囊液，向其中加入甲醛，使甲醛的終濃度達到0.03～0.05g/100ml(W/V)，放置10天，或者向其中加入β-丙內酯，使β-丙內酯的終濃度為1∶4000-1∶2000(V/V)，放置24小時使病毒滅活，再放置7天使β-丙內酯水解，上述放置條件為2～8℃。滅活后使用超濾的方法進行濃縮，使用分子篩凝膠過濾的方法進行純化，將純化后的滅活病毒濃縮，濃縮后病毒的血凝效價為1∶10000到1∶100000以上，選取適量病毒濃縮液進行以下裂解試驗。
以二氧化碳作流體為例，其裂解病毒的具體過程為1.將上述純化濃縮的病毒裝入潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內，將萃取釜密閉。
2.通入CO2，將萃取釜內CO2的溫度調節(jié)為31.1～75℃、壓力為7.32～110Mpa的狀態(tài)，維持此狀態(tài)2～30分鐘或更長時間。
3.裂解完成后，關閉進氣閥門，從萃取釜導出裂解的病毒，收集排出的液體，即獲得裂解的流感病毒。
上述超臨界萃取釜內溫度調節(jié)原則是當萃取釜內的壓力在臨界壓力以上時，溫度的提高有利于病毒表面的脂膜和類脂膜在流體中溶解度的提高，有利于均勻快速的裂解。但由于病毒對熱的不穩(wěn)定性，當溫度超過75℃時，病毒就會被破壞，會影響其抗原性，因此萃取釜內的溫度應控制在75℃以內。
當超臨界流體為CO2時，適用的溫度范圍為31.1～75℃，適宜的壓力范圍為7.32～110Mpa，溫度范圍較佳為32～38℃，壓力范圍較佳為7.5～50Mpa。當超臨界流體為N2時，適用的溫度范圍為-147.1～75℃，適宜的壓力范圍為3.35～110Mpa。當超臨界流體為N2O時，適用的溫度范圍為36.5～75℃，適宜的壓力范圍為7.2～110Mpa。
對裂解的時間沒有特殊的限制，以達到裂解為目的，通常為2～30分鐘。延長裂解時間，并不會進一步增加裂解效果，因此實際操作中可盡量減少裂解的時間，以便提高生產效率，較佳裂解時間為2～10分鐘。
裂解后取樣，通過電鏡觀察病毒形態(tài)以驗證裂解效果。
實施例1甲1型流行性感冒病毒(A/New Caledonia/20/99(H1N1))的裂解取來源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的甲1型流行性感冒病毒(A/NewCaledonia/20/99(H1N1))接種于9-11日齡的清潔級(SPF)雞胚，按上述的病毒預處理方法，進行預處理，制備成血凝效價為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀(南通華安超臨界萃取設備有限公司，超臨界CO2萃取儀)的萃取釜內，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為25MPa，保持該狀態(tài)2分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過電鏡觀察病毒形態(tài)以驗證裂解效果。(結果見圖3)從圖3可見，超臨界流體裂解后的溶液中無完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過超速離心進行純化，純化也可以采用柱層析的方法進行。將純化后的樣品進行稀釋，使稀釋后血凝素含量為32μg/ml，進行效力實驗，其結果是接種小白鼠后產生50％中和抗體的效價為1∶640，達到疫苗要求的標準。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現。證明疫苗無異常毒性，并經過敏原性實驗證明該方法制備的疫苗中不存在過敏原。
實施例2甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))將來源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))按與實施例1相同的方法進行預處理，制備成血凝效價為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內，通入二氧化碳，控制溫度為35℃，壓力為10MPa，保持該狀態(tài)4分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過電鏡觀察病毒形態(tài)以驗證裂解效果。(結果見圖4)從圖4可見，超臨界流體裂解后的溶液中無完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過超速離心進行純化，純化也可以采用柱層析的方法進行。將純化后的樣品稀釋，稀釋后血凝素含量為31μg/ml，進行效力實驗，其結果是接種小白鼠后產生50％中和抗體的效價為1∶480，達到疫苗要求的標準。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現。證明疫苗無異常毒性，并經過敏原性實驗證明該方法制備的疫苗中不存在過敏原。
實施例3乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)將來源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)按與實施例1相同的方法進行預處理，制備成血凝效價為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為20MPa，保持該狀態(tài)10分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過電鏡觀察病毒形態(tài)以驗證裂解效果。(結果見圖5)從圖5可見，超臨界流體裂解后的溶液中無完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過超速離心進行純化，純化也可以采用柱層析的方法進行。將純化后的樣品進行稀釋，使稀釋后血凝素含量為34μg/ml，進行效力實驗，其結果是接種小白鼠后產生50％中和抗體的效價為1∶640，達到疫苗要求的標準。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現。證明疫苗無異常毒性，并經過敏原性實驗證明該方法制備的疫苗中不存在過敏原。
實施例4乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)將來源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)按與實施例1相同的方法進行預處理，制備成血凝效價為1∶51200的病毒液，取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為45MPa，保持該狀態(tài)20分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過電鏡觀察病毒形態(tài)以驗證裂解效果。(結果見圖6)從圖6可見，超臨界流體裂解后的溶液中無完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過超速離心進行純化，純化也可以采用柱層析的方法進行。將純化后的樣品進行稀釋，稀釋后血凝素含量為32μg/ml，進行效力實驗，其結果是接種小白鼠后產生50％中和抗體的效價為1∶640，達到疫苗要求的標準。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現。證明疫苗無異常毒性，并經過敏原性實驗證明該方法制備的疫苗中不存在過敏原。
另外，為進一步說明本發(fā)明方法裂解病毒的效果，將實施例1～4裂解的病毒和使用化學裂解劑裂解的相應的病毒一起做了蛋白電泳實驗，其結果見圖7。圖中標號1、2、3、4依次為實施例1～4分別裂解甲1、甲3、乙型病毒的兩個毒株后，再經純化的樣品；5、6、7、8依次為用化學裂解劑裂解甲1、甲3、乙型病毒的兩個毒株后，再經純化的樣品；9為標記物的蛋白分子量，從標號9原點處開始，分子量依次為116KD、66.2KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD和14.4KD。從圖7可看出，分子量為61KD的神經氨酸酶和分子量為50KD的血凝素呈現清晰的兩條條帶，化學裂解劑裂解的樣品5～8與超臨界裂解的樣品1～4相比，多了小分子量的蛋白，同時還存在由于未完全裂解而殘存于類脂膜上的大分子量的蛋白。因此，采用本發(fā)明的方法裂解病毒，可以獲得蛋白成分更均一、純度更高、含量更高的血凝素和神經氨酸酶。
權利要求
1.一種裂解病毒的方法，其特征在于，應用超臨界流體萃取技術裂解具有脂膜或類脂膜的病毒。
2.權利要求1所述的裂解病毒的方法，其特征在于所述病毒為正粘病毒科病毒。
3.權利要求2所述的裂解病毒的方法，其特征在于所述正粘病毒科病毒為流行性感冒病毒。
4.權利要求1～3任一項所述裂解病毒的方法，其特征在于超臨界流體為CO2，裂解溫度為31.1～75℃，裂解壓力為7.32～110Mpa。
5.權利要求4任一項所述裂解病毒的方法，其特征在于超臨界流體為CO2，裂解溫度為32～38℃，裂解壓力為7.5～50Mpa。
全文摘要
本發(fā)明提供一種裂解病毒的方法，更具體地說，提供一種用超臨界流體萃取技術裂解具有脂膜或類脂膜病毒的方法。該方法是將病毒置于密封良好的容器中，通入處于超臨界狀態(tài)下的流體，保持一定時間后，即完成裂解。本發(fā)明方法操作簡單，易放大，裂解效果好，無污染，產品無殘毒。
文檔編號A61K39/12GK1546657SQ20031012135
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權日2003年12月12日
發(fā)明者于曉光 申請人:長春百龍生物技術有限公司