一種人呼吸道博卡病毒半巢式pcr檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。該試劑盒包括：1)病毒保護(hù)液，其成份為青霉素200U/ml、鏈霉素200U/ml、兩性霉素B200U/ml和BSA0.125％；2)病毒裂解液，其成份為10mmol?Tris-HCl、1mmol?EDTA、15mmol?NaCl和0.5％SDS，pH為8.0，溶劑為水；3)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物為NS1545F、NS1962R和NS1835R。本發(fā)明對人呼吸道博卡病毒不僅檢出率高，而且不用提取病毒基因組DNA，同時也不需應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，降低了臨床患者博卡病毒的檢測成本，提高了檢測效率。
【專利說明】—種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]博卡病毒(Bocavirus),是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科的一個屬，博卡病毒于20世紀(jì)60年代初首次在動物上發(fā)現(xiàn)，2005年8月，瑞典科學(xué)家運用分子病毒篩查方法，首次在兒童呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)了一種新型的人類細(xì)小病毒，他們將這種病毒命名為人類博卡病毒。博卡病毒通過空氣傳播容易使嬰幼兒罹患肺炎、支氣管炎和支氣管肺炎等疾病。
[0003]早期對博卡病毒的檢測采用大規(guī)模分子病毒篩查的方法，這種方法是基于宿主DNA的提取、隨機(jī)PCR擴(kuò)增、大規(guī)模測序及生物信息學(xué)等技術(shù)，對下呼吸道感染患者鼻咽分泌物進(jìn)行檢測，其陽性檢出率為3.1 %。隨著PCR及熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，臨床呼吸系統(tǒng)疾病患者鼻咽分泌物樣本博卡病毒的檢出率也從1.5上升到21.3%。但是，由于患者檢測樣本中博卡病毒的數(shù)量較低，應(yīng)用傳統(tǒng)PCR技術(shù)進(jìn)行檢測勢必會導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致低檢出率。與傳統(tǒng)的PCR相比，熒光定量PCR具有高檢測率及高敏感性，但是需要相關(guān)的設(shè)備和制備特殊的探針，其高昂的價格限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。另外，普通PCR及熒光定量PCR均需要在檢測之前進(jìn)行病毒基因組的提取等繁瑣的準(zhǔn)備工作，這些都給患者樣本博卡病毒的檢測造成困難和錯誤判斷，有關(guān)博卡病毒的檢測目前沒有統(tǒng)一鑒定的試劑盒，同時尚未有相關(guān)的研究報道。
[0004]因此，現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進(jìn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)在檢測人呼吸道博卡病毒中存在的不足，提供了一種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]一種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒，包括:1)病毒保護(hù)液，其成份為青霉素200U / ml、鏈霉素200U / ml、兩性霉素B200U / ml和BSA0.125 % ;2)病毒裂解液，其成份為 IOmmol Tris-HClUmmol EDTA、15mmol NaCl 和 0.5 % SDS，pH 為 8.0，溶劑為水；3)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物為 NS1545F:5-TATGGCCAAGGCAATCGTCCAAG_3、NS1962R:5-CAGAGTACAGTCGTACTCATTC-3 和 NS1835R:5-GCCGCGTGAACATGAGAAACAGA_3。
[0008]所述的人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒的非診斷性檢測方法，是提取患者的呼吸道分泌物，然后加入等體積的病毒保護(hù)液，混勻；取80μ I病毒保護(hù)液稀釋的樣本加入20 μ I病毒裂解液，吹打混勻；100°C水浴5分鐘，1000Orcf離心5分鐘，收集上清液，進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束，在凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。[0009]所述的半巢式PCR擴(kuò)增步驟為:1)第一輪擴(kuò)增，取3μ I病毒裂解上清液作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物為NS1545F和NS1962R ;引物的最終濃度為400nM，dNTPs0.2mM, 5U DNA聚合酶；擴(kuò)增條件為95°C 5分鐘后，95°C 30秒，56°C 35秒，72°C 40秒，共35循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；2)第二輪擴(kuò)增，取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ I作為擴(kuò)增模板；擴(kuò)增引物為NS1545F和NS1835R ;引物的最終濃度為400nM，dNTPs0.2mM, 5U DNA聚合酶；擴(kuò)增條件為:擴(kuò)增條件為:95 °C，5分鐘后，依次95 °C 30秒，58 V 35秒，72 °C 40秒，共35循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。
[0010]本發(fā)明對人呼吸道博卡病毒不僅檢出率高，而且不用提取病毒基因組DNA，同時也不需應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，降低了臨床患者博卡病毒的檢測成本，提高了檢測效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為普通PCR敏感性和特異性分析。
[0012]圖2為半巢式PCR敏感性和特異性分析。
[0013]圖3為臨床樣本的普通PCR及半巢式PCR檢測分析。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0015]實施例
[0016]以寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科和兒科重癥室(Pediatric Intensive Care Unit,PI⑶)病房在2011年11月-2013年5月因急性呼吸道感染住院的202例患兒為對象。收集患兒在入院24小時內(nèi)留取的下呼吸道分泌物。方法:采用一次性無菌吸痰管，經(jīng)鼻腔或口腔插入7~8cm至咽部以下，負(fù)壓吸取深部I~2ml下呼吸道分泌物。加入等量的病毒保護(hù)液(青霉素 200U / ml、鏈霉素 200U / ml、兩性霉素 B200U / ml 和 BSA0.125% )l_2ml，混勻，部分保存于-80°C低溫冰箱儲備，部分直接加入裂解液進(jìn)行處理。
[0017]取80 μ I經(jīng)病毒保護(hù)液處理的樣本，加入20 μ I病毒裂解液(IOmmol Tris-HCl、lmmol EDTA、15mmol NaCl 和 0.5% SDS, pH 為 8.0，溶劑為水)，吹打混勻；100°C水浴 5 分鐘，1000Orcf離心5分鐘，收集上清液，作為普通PCR擴(kuò)增模板和半巢式PCR第一階段擴(kuò)增的模板。
[0018]第一步,普通PCR擴(kuò)增:取3μ I病毒裂解上清液作為PCR擴(kuò)增模板,總反應(yīng)體系為25 μ I。采用NS1545F和NS1835R作為擴(kuò)增引物，引物的最終濃度為400nM, dNTPs0.2mM, 5UDNA聚合酶。擴(kuò)增條件為:95°C，5分鐘后，依次95°C 30秒，8°C 35秒，72°C 40秒，共30循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0019]配制1.5%的瓊脂糖凝膠(內(nèi)含EB染液)，120V電壓電泳I小時左右，在凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增片段大小，目的片段為290bp。
[0020]第二步，半巢式PCR擴(kuò)增:取3 μ I病毒裂解上清液作為擴(kuò)增模板，以NS1545F和NS1962R引物作為半巢式PCR第一輪的擴(kuò)增引物。擴(kuò)增條件為:95°C，5分鐘后，依次95°C 30秒，56°C 35秒，72°C 40秒·，共35循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。取第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物2μ I進(jìn)行第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增引物采用NS1545F和NS1835R。擴(kuò)增的引物濃度、其他成分的濃度，擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)等各方面同普通PCR。電泳凝膠圖見圖3，(A) 202例下呼吸道分泌物首先進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為NS1545F和NS1835R。P1-P7代表擴(kuò)增得到的7份陽性樣本；N1，N2, N3分別代表3個不同的陰性樣本；(-)，陰性對照。(B)剩余195例樣本進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。Pl-PlO代表再次獲得的不同陽性樣本代表；N1-N4代表不同的陰性樣本代表；M, DNA Marker ；C,陽性質(zhì)粒對照；㈠，陰性對照。
[0021]202例臨床樣本首先通過普通PCR檢測方法，經(jīng)凝膠電泳發(fā)現(xiàn)有7例樣本在預(yù)期位置(290bp)出現(xiàn)明顯的單一擴(kuò)增條帶，陽性樣本的檢測率為3.4%。隨后對剩余樣本再次采用半巢式PCR方法進(jìn)行檢測，同樣在相應(yīng)的預(yù)期位置，又得到41例陽性擴(kuò)增條帶，加之第一輪的7例陽性，總共HBoV陽性樣本的檢測率達(dá)到23.76%。結(jié)果分析表明:半巢式PCR明顯增加了陽性檢測效率，從3.4%提高到23.76%。(見表1)
[0022]表1采用傳統(tǒng)PCR和半巢式PCR對HBoV的檢測效率對比
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:1)病毒保護(hù)液，其成份為青霉素200U / ml、鏈霉素200U / ml、兩性霉素B200U / ml和BSA0.125%；2)病毒裂解液，其成份為 IOmmol Tris-HClUmmol EDTA、15mmol NaCl 和 0.5 % SDS，pH為 8.0，溶劑為水；3)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物為 NS1545F:5_TATGGCCAAGGCAATCGTCCAAG_3、NS1962R:5-CAGAGTACAGTCGTACTCATTC-3 和 NS1835R:5-GCCGCGTGAACATGAGAAACAGA_3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人呼吸道博卡病毒半巢式PCR檢測試劑盒的非診斷性檢測方法，其特征是，提取患者的呼吸道分泌物，然后加入等體積的病毒保護(hù)液，混勻；取80μ I病毒保護(hù)液稀釋的樣本加入20 μ I病毒裂解液，吹打混勻；100°C水浴5分鐘，1000Orcf離心5分鐘，收集上清液，進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束，在凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷性檢測方法，其特征是，半巢式PCR擴(kuò)增步驟為:1)第一輪擴(kuò)增，取3μ I病毒裂解上清液作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物為NS1545F和NS1962R ;引物的最終濃度為400nM，dNTPs0.2mM, 5U DNA聚合酶；擴(kuò)增條件為95°C 5分鐘后，95°C 30秒，56°C 35秒，72°C 40秒，共35循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；2)第二輪擴(kuò)增，取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2μ I作為擴(kuò)增模板；擴(kuò)增引物為NS1545F和NS1835R ;引物的最終濃度為400ηΜ,dNTPs0.2mM, 5U DNA聚合酶；擴(kuò)增條件為:擴(kuò)增條件為:95 °C，5分鐘后，依次95°C 30秒，58 ℃ 35秒，72°C 40秒，共35 循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
【文檔編號】C12R1/93GK103667533SQ201310657249
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫玉寧, 姚青, 李建寧, 張茜, 楊怡, 高玉婧 申請人:寧夏醫(yī)科大學(xué)