一種人膽管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一種人膽管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性膽管癌是一類起源于上皮細(xì)胞的腫瘤，診斷較晚，預(yù)后差。由于早期缺乏特 異性的臨床表現(xiàn)和診斷指標(biāo)，因而臨床上發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性膽管癌多是中、晚期病例。膽管癌的 發(fā)生率約占胃腸道惡性腫瘤的3%。發(fā)病的平均年齡大約為50歲，男性的發(fā)病率約為女性 的1.5倍。亞洲人的發(fā)生率是黑人和白人的2倍。近Η十年來，全世界范圍內(nèi)膽管癌的發(fā) 病率在不斷升高，但它的發(fā)病機(jī)理仍不清楚。已知膽管癌的危險(xiǎn)因素與膽管慢性炎癥、病毒 感染、膽道先天崎形、環(huán)境或職業(yè)毒素暴露等狀態(tài)的有關(guān)。
[0003]目前膽管癌的治療方法W手術(shù)切除為主，但是總體效果欠佳，復(fù)發(fā)率高。大約80% 的膽管癌由于轉(zhuǎn)移或進(jìn)展期只能行姑息治療。雖然手術(shù)和肝移植可治療部分肝口部膽管癌 患者，但5年生存率仍然很低?；熆捎糜诓豢汕谐幕驈?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的膽管癌患者，W控制疾 病、延長(zhǎng)生存期并提高生活質(zhì)量。充分了解膽管癌的生物學(xué)機(jī)制、致病基因W及其腫瘤微環(huán) 境之間復(fù)雜的相互作用可為患者選擇最佳治療方案并提高患者生存率。
[0004] 目前報(bào)道的應(yīng)用于研究的膽管癌細(xì)胞系非常少，生物多樣性低。建立膽管癌細(xì)胞 系，可W為進(jìn)一步研究膽管癌的發(fā)生機(jī)制提供材料，也可W為檢測(cè)治療膽管癌的藥物提供 平臺(tái)。但包括膽管癌細(xì)胞在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)建系均非常困難，原發(fā)腫瘤組織 由于離體后環(huán)境變化，細(xì)胞往往會(huì)發(fā)生衰退死亡，導(dǎo)致體外細(xì)胞建系的成功率極低，即使能 在體外生存，也常發(fā)生某些生物學(xué)特性的改變或丟失，與臨床上膽管癌的生物學(xué)性狀相差 較大。
[0005]另一方面，臨床膽管癌患者確診往往已是中晚期，無法進(jìn)行手術(shù)，化療是唯一的治 療方法。因此，建立膽管癌動(dòng)物模型，對(duì)于腫瘤的藥效學(xué)研究顯得格外重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的人膽管癌細(xì)胞系存在的生物多樣性低， 與臨床上膽管癌的生物學(xué)性狀相差較大送一技術(shù)問題，提供一種新的人膽管癌細(xì)胞系及其 應(yīng)用。本發(fā)明的人膽管癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，在動(dòng)物體內(nèi)具有成瘤性，可W 成功制備膽管癌動(dòng)物模型，可W用來分析體外對(duì)藥物的敏感性和耐藥性、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì) 藥物的敏感性和耐藥性，進(jìn)而建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的抗腫瘤藥物檢測(cè)平臺(tái)，是應(yīng)用于 基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想人原發(fā)性膽管癌細(xì)胞系，使得通過原代培養(yǎng)建立的人源腫 瘤細(xì)胞更接近于腫瘤的臨床生物學(xué)特性，對(duì)藥物的敏感性和耐藥性將具有更好的預(yù)測(cè)性， 可用于臨床前抗腫瘤藥物的活性檢測(cè)，為進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制和藥物抗腫瘤活性檢 測(cè)提供了理想的材料。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是；一種人膽管癌細(xì)胞系，其保 藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中必，保藏編號(hào)為CCTCCNO;C201452。
[0008] 本發(fā)明還提供如上所述的人膽管癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞系。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是；本發(fā)明所述的人膽管癌細(xì)胞 系的用途，所述的人膽管癌細(xì)胞系用于制備在免疫缺陷哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生膽管癌的試劑。
[0010] 本發(fā)明所述的免疫缺陷哺乳動(dòng)物為本領(lǐng)域常規(guī)的免疫缺陷哺乳動(dòng)物，較佳的為免 疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠較佳的為裸小鼠。所述的膽管癌為本領(lǐng)域常規(guī)的膽管癌， 較佳地為低分化或中分化膽管癌細(xì)胞癌。
[0011] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之Η是；一種藥物的抑制膽管癌的活 性的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括W下步驟：將待測(cè)藥物施用于細(xì)胞模型中，施用后抑制細(xì) 胞增殖或?qū)е录?xì)胞調(diào)亡的藥物為具有抑制膽管癌活性的藥物，其中所述的細(xì)胞模型是本發(fā) 明所述的人膽管癌細(xì)胞系。
[0012] 其中所述檢測(cè)方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法較佳地包括W 下步驟：
[0013] (1)將一定數(shù)量的人膽管癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，培養(yǎng) 24小時(shí)；
[0014] (2)將待測(cè)化合物稀釋成不同濃度施用于細(xì)胞，待測(cè)化合物作用72小時(shí)后通過測(cè) 定細(xì)胞的活力，計(jì)算不同濃度的待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制能力，計(jì)算待測(cè)化合物半數(shù) 抑制濃度，用W判斷待測(cè)化合物的抑制腫瘤的活性。
[0015] 其中步驟（1)所述人膽管癌細(xì)胞系或其子代細(xì)胞的接種量較佳地為5000/孔。步 驟（2)所述檢測(cè)不同化合物半數(shù)抑制濃度，用W判斷待測(cè)化合物的抗腫瘤能力的方法為本 領(lǐng)域常規(guī)檢測(cè)和計(jì)算方法。其中所述半數(shù)抑制濃度檢測(cè)方法較佳地包括ΑΤΡ生物發(fā)光法或 Μ?Τ法，本發(fā)明所述檢測(cè)方法優(yōu)選地為ΑΤΡ生物發(fā)光法。所述的ΑΤΡ生物發(fā)光法是通過對(duì) 細(xì)胞中的ΑΤΡ進(jìn)行定量測(cè)定來檢測(cè)培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目的一種均質(zhì)檢測(cè)方法，其中所述的 ΑΤΡ是反應(yīng)活細(xì)胞新陳代謝能力的一個(gè)重要指標(biāo)。
[0016] 本發(fā)明還提供一種藥物的治療膽管癌的活性的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括W下 步驟；將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致膽管癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就 是治療膽管癌的候選化合物，其中所述的動(dòng)物模型具有如上所述的人膽管癌細(xì)胞系所導(dǎo)致 的膽管癌腫瘤。本發(fā)明所述檢測(cè)方法較佳地包括W下步驟：
[0017] (1)將所述的膽管癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于哺乳動(dòng)物皮下，進(jìn) 行飼養(yǎng)，獲得人膽管癌動(dòng)物模型；
[0018] (2)觀察和測(cè)量動(dòng)物的體重與腫瘤生長(zhǎng)情況；
[0019] (3)將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致膽管癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化 合物就是治療膽管癌的候選化合物。
[0020] 其中，所述的動(dòng)物模型較佳地為免疫缺陷動(dòng)物，優(yōu)選地為裸小鼠。較佳的可采用細(xì) 胞懸液注射方法來建立動(dòng)物模型。在施用步驟中，將測(cè)試化合物通過尾靜脈注射、口服、腹 腔注射或于腫瘤局部用藥等方式施用于膽管癌荷瘤動(dòng)物。較佳的使用對(duì)照實(shí)驗(yàn)，一種優(yōu)選 的對(duì)照實(shí)驗(yàn)方式是；同時(shí)還使用不含測(cè)試化合物的溶劑施用于膽管癌荷瘤動(dòng)物作為對(duì)照。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種人膽管癌細(xì)胞系的建立方法，所述的建立方法包括W下步 驟：
[002引（1)獲得新鮮的臨床人膽管癌手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，接種免疫缺陷哺乳動(dòng) 物；
[002引 似接種60~80天后，將荷瘤動(dòng)物安樂死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 和傳代培養(yǎng)。
[0024] 其中步驟（1)所述小塊的重量較佳地為20~50mg，所述免疫缺陷哺乳動(dòng)物較佳地 為免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠較佳地為裸小鼠。
[0025] 其中步驟（1)所述的新鮮的臨床膽管癌手術(shù)切除標(biāo)本較佳的用新鮮的皿SS緩沖 液（含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸鏈霉素和1. 25μg/mL兩性霉素B)漂洗后，再進(jìn) 行接種。所述的接種的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊 膜內(nèi)接種，優(yōu)選地為皮下穿刺接種。
[002引其中步驟似所述的腫瘤組織的體積較佳地為300mm3~500mm3,所述原代培養(yǎng)為 本領(lǐng)域常規(guī)的原代培養(yǎng)技術(shù)。其中步驟（2)所述的原代培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域常規(guī)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。較佳的所述的原代培養(yǎng)方法包括W下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊， 置入培養(yǎng)瓶中，于37°C賠箱5%C02條件下培養(yǎng)；6-8小時(shí)后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1640完全培 養(yǎng)液（含10%胎牛血清，10011/1^青霉素0、1004肖/血)，靜置培養(yǎng)。
[0027] 其中步驟（2)所述的傳代培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法。 所述的傳代培養(yǎng)方法較佳地包括W下步驟；吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的0. 05%膜蛋 白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞