R位點的核巧酸序列
[0057]
[0058] 表2STR位點的核巧酸序列及其拷貝數(shù)
[0059]
[0060]
[006。c.細胞生長曲線
[0062] 取對數(shù)生長期的細胞，膜酶消化后，用新鮮培養(yǎng)基重懸，分別接種2000、3000、 4000、5000、6000細胞/孔的細胞密度在細胞培養(yǎng)板中，放入37°C的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分 別在1、24、48、72小時，取出一塊板，按照發(fā)光法細胞活性檢測試劑盒（該試劑盒采購自 Promega，貨號為G7573)的說明書，加CE化TITER-GL0試劑（簡稱；CTG，是發(fā)光法細胞活性 檢測試劑盒的主要成分，該試劑通過對ATP進行定量測定來檢測培養(yǎng)物中活細胞數(shù)目和狀 態(tài)），測生物發(fā)光值。將5天的測量值匯總繪制細胞生長曲線，如圖2所示，W測定的時間 為橫坐標(biāo)，測出的生物發(fā)光值為縱坐標(biāo)。由圖2可知；可見在5天的觀察期內(nèi)，細胞濃度從 2000/孔增加至6000/孔，其生長速度呈濃度依賴性，根據(jù)體外藥效學(xué)的實驗要求，結(jié)合該 生長曲線，可W確定：4000/孔的細胞密度為細胞毒實驗最適接種密度。
[006引d.細胞動力學(xué)
[0064] 取對數(shù)生長期的細胞，膜酶消化后，用新鮮培養(yǎng)基重懸。接種2000細胞/孔的細 胞密度于37°CC化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24、48、72、96小時四個時間點分別取出一塊板，加CTG， 分析并計算其倍增時間。將4天的測量值匯總繪制增殖曲線，如圖3所示。
[0065] 倍增時間的計算公式為：倍增時間=Log2/曲線斜率；圖4中倍增時間狂）與Log 英光信號燈）的曲線方程為；y= 0.0081X+4. 726 (R2 = 0.9998)。根據(jù)公式可知斜率為 0. 0081 ;由此可W得到LIPF155C細胞的群體倍增時間為37小時。
[0066]e.細胞周期檢測
[0067] 利用賄化化巧標(biāo)記的方法，通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定， 可分析細胞周期各時相的百分比。消化細胞后用PBS清洗重懸細胞，用冰己醇固定，-2(TC 過夜保存。離必并用PBS清洗和重懸細胞，加入RNA酶重懸細胞，37°C條件消化30分鐘，W 除去RNA酶。加入賄化化巧，4°C避光染色30分鐘。轉(zhuǎn)入流式檢測管，分析細胞周期。
[006引檢測結(jié)果；如圖4所示；LIPF155C細胞Gi期為76. 14%，S期為11. 72%，Gz/M期 為 12. 14%。
[0069]f.免疫組化蛋白表達
[0070] 將LIPF155C細胞接種在蓋玻片上培養(yǎng)，待細胞伸展后，用4%甲醒固定，進行免疫 組化染色（DAB顯色法）。檢測結(jié)果如圖5所示，圖5(A)為陰性對照組；圖5度）為細胞角 蛋白CK19 ;圖5(C)為細胞角蛋白CKpan;圖5(D)為膽管癌細胞特異性蛋白（200X)。陰性 對照圖巧A)顯示該方法不造成背景。該結(jié)果顯示了LIPF155C符合膽管癌細胞膽管癌的特 征；細胞角蛋白CK19圖5度）、細胞角蛋白CKpan圖5(C)和Glypican-3圖巧D)的染色均 為陽性。Glypican-3在肝細胞和膽管細胞中表達，CKpan在上皮細胞中表達，CK19只在膽 管細胞中表達，肝細胞不表達。結(jié)合Η種抗原在LIPF155C中的表達情況判斷，該細胞為膽 管來源的細胞。
[007。g.細胞的成瘤性
[0072] 體外大規(guī)模培養(yǎng)和收集LIPF155C細胞，皮下接種BALB/c裸小鼠（每只動物接種 1. 0X1〇7個細胞），接種后約3周，腫瘤形成并開始生長，選取5只成瘤小鼠調(diào)查腫瘤體積， 繪制腫瘤生長曲線，LIPF155C細胞的成瘤性如圖6所示。圖6(A)為LIPF155C細胞在裸 小鼠體內(nèi)生長曲線（腫瘤體積）；圖6度）為LIPF155C細胞移植瘤對小鼠體重影響結(jié)果圖。 其中腫瘤體積=(長X寬X寬）^2。腫瘤生長較快，接種后80天腫瘤體積平均值達到 700皿3,如圖6 (A)所示，上述結(jié)果表明該膽管癌細胞系細胞能在裸小鼠體內(nèi)形成腫瘤，具有 致瘤性。
[0073] h.荷瘤裸小鼠的體重變化
[0074] 對上述g步驟成瘤性實驗的小鼠每周進行稱重，繪制體重變化曲線，其結(jié)果表明 荷瘤小鼠體重在后期會隨著腫瘤體積變大而減輕，說明腫瘤對小鼠體重的增長有一定的抑 制作用，上述結(jié)果如圖6度）所示。
[00巧]i.腫瘤的病理學(xué)鑒定
[0076] 將實施例1所述從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院獲得新鮮的臨床膽管癌切 除標(biāo)本、穿刺接種于裸小鼠背部皮下長出的腫瘤、和上述g步驟中LIPF155C細胞在裸小鼠 皮下接種后形成的腫瘤，進行石蠟包埋切片和H&E染色，結(jié)果如圖7所示，其中圖7 (A)臨床 手術(shù)標(biāo)本；圖7度）；裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤；圖7(C) ;LIPF155C細胞在裸小鼠體內(nèi)所成 腫瘤。病理診斷結(jié)果見表3所示，從病理診斷結(jié)果可見臨床標(biāo)本、裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤 和LIPF155C細胞系細胞在裸小鼠體內(nèi)所成腫瘤的結(jié)構(gòu)類似，形成對應(yīng)關(guān)系。裸小鼠體內(nèi)所 成腫瘤癌組織細胞異型明顯，血管生長豐富，排列致密，染色質(zhì)增加，核內(nèi)常有多個核仁，核 大深染，嗜蘇木素。
[0077] 表3各腫瘤標(biāo)本的病理診斷結(jié)果
[0078]
[007引IS理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對本發(fā)明作各種 改動或修改，送些等價形式同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種人膽管癌細胞系，其特征在于，所述的人膽管癌細胞系保藏在中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:C201452。2. 如權(quán)利要求1所述的人膽管癌細胞系的子代細胞系。3. 如權(quán)利要求1或2所述的人膽管癌細胞系的用途，其特征在于，所述的人膽管癌細胞 系用于制備在免疫缺陷哺乳動物中產(chǎn)生膽管癌的試劑。4. 如權(quán)利要求3所述的人膽管癌細胞系的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷哺乳動 物為免疫缺陷小鼠。5. 如權(quán)利要求4所述的人膽管癌細胞系的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠為 裸小鼠。6. 如權(quán)利要求3所述的人膽管癌細胞系的用途，其特征在于，所述的膽管癌為低分化 或中分化膽管癌。7. -種藥物的抑制膽管癌的活性的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步 驟：將待測藥物施用于細胞模型中，施用后抑制細胞增殖或?qū)е录毎蛲龅乃幬餅榫哂幸?制膽管癌活性的藥物，其中所述的細胞模型是權(quán)利要求1~2任一項所述的人膽管癌細胞 系。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人膽管癌細胞系及其應(yīng)用，所述的人膽管癌細胞系保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC？NO：C201452。所述人膽管癌細胞的應(yīng)用為：該人膽管癌細胞系用于制備在免疫缺陷哺乳動物中產(chǎn)生膽管癌的試劑。該人膽管癌細胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，在動物體內(nèi)具有成瘤性，可以成功制備膽管癌動物模型，可以用來分析體外對藥物的敏感性和耐藥性、體內(nèi)動物實驗對藥物的敏感性和耐藥性，進而建立體外、體內(nèi)兩個相關(guān)聯(lián)的抗腫瘤藥物活性檢測平臺，是應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想人原發(fā)性膽管癌細胞系，為進一步研究腫瘤的發(fā)生機制和藥物檢測提供了理想的材料。CCTCC NO：C20145220140622
【IPC分類】C12N5/09, C12Q1/02, A61K49/00, A01K67/027, C12R1/91
【公開號】CN105255832
【申請?zhí)枴緾N201410341872
【發(fā)明人】王科, 歐陽可棟, 秦宵然, 趙剛, 聞丹憶, 張偉, 朱純超
【申請人】上海立迪生物技術(shù)有限公司, 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2014年7月17日