原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓生物標志物及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的標志物，以5,6?二氫尿嘧啶、D?天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸五個指標聯合時的靈敏度和特異度均較單指標診斷時有效，分別達到了99.06％和0％。
【專利說明】
原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓生物標志物及其用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓標志物，特別地，進一步具體涉及G01N33/ 68 〇
【背景技術】
[0002] 原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓(BDTT)以肝細胞癌向膽道系統(tǒng)內轉移致梗阻性黃疸為特 點，是膽道系統(tǒng)最常見的繼發(fā)性腫瘤。但是，其除了會與原發(fā)性肝癌伴膽管壓迫所混淆外， 其最容易發(fā)生誤診的疾病為膽道的惡性疾病，同時，也會與膽道系統(tǒng)的良性疾病，如膽管結 石，膽管囊腫等疾病混淆。據統(tǒng)計，總體術前臨床誤診率為16.6% (65/392)，后期術前臨床 誤診率(9.8%，26/264)低于前期(30.5%，39/128)。常易誤診的疾病包括:肝癌伴肝門部膽 管壓迫，肝門部肝管腺瘤/癌伴膽管癌栓，膽管結石。前、后期誤診為肝癌伴肝門部膽管壓迫 分別為9.4%和1.5%，誤診為膽管結石分別為7.8%和1.9%，差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)。
[0003] 針對上述問題，本發(fā)明提供了以人體樣本的方法來篩查并鑒定BDTT與膽管癌、膽 管結石、膽管囊腫鑒別診斷的標志物及其應用。

【發(fā)明內容】

[0004] 用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的標志物，其包括:D-天冬氨酸、 5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸、二十四酸和硬脂酸中的一種或多種組合物。
[0005] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的標志物的p值小于0.05。
[0006] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述膽道系統(tǒng)疾病為肝外膽管癌、原發(fā)性膽管結石、 先天性膽管囊腫中的一種或多種。
[0007] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述標志物用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和原發(fā) 性肝癌伴膽管壓迫。
[0008] 獲取上述的標志物的方法，其步驟在于，
[0009] 獲取受試者樣品，并進行前處理；
[0010] 采用GC-MS/LC-MS進行檢測；
[0011] 進行多元變量統(tǒng)計分析，獲取標志物。
[0012] 用上述標志物區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包 括：
[0013] 在受試者的組織樣本中測定上述一種或兩種標志物的水平；
[0014] 將受試者樣品中的一種或兩種標志物與對照樣品中的一種或多種標志物的水平 相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多種 標志物的水平的差異指示所述受試者具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓。
[0015] 用于確定具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者是否將對療法有反應的方法，所述 方法包括:在受試者的樣品中測定上述的一種或多種標志物的水平;將受試者樣品中的一 種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比較，其中與對照樣品 中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多種標志物的水平的差異指示 所述受試者將對所述療法有反應。
[0016] 用于在具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者中監(jiān)測治療功效的方法，所述方法包 括:在開始所述治療之前，在來自受試者的第一樣品中測定上述一種或多種標志物的水平； 在已給予所述治療的至少一部分之后，在來自受試者的第二樣品中測定上述一種或多種標 志物的水平;將第一樣品中的一種或多種標志物的水平與第二樣品中的一種或多種標志物 的水平相比較，其中與第二樣品中的一種或多種標志物的水平相比，第一樣品中的一種或 多種標志物的水平的差異指示所述受試者將對所述治療有反應。
[0017] 作為本發(fā)明的一種實施方式，其中受試者樣品是流體樣品或組織樣品。
[0018] 用于確定受試者是否具有或將發(fā)展原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的試劑盒，所述試劑盒 包括用于在受試者樣品中測定上述的一種或多種標志物的水平的試劑。
[0019] 說明書附圖
[0020] 圖1:實施例1，以5,6-二氫尿嘧啶為標志物時的R0C圖；圖2:實施例20,以硬脂酸、 二十四酸為標志物時的R0C圖；圖3:實施例40,以蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸為標志物 時的R0C圖；圖4:實施例60,以5，6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四 酸為標志物時的R0C圖；
【具體實施方式】
[0021] 參選以下本發(fā)明的優(yōu)選實施方法的詳述以及包括的實施例可更容易地理解本發(fā) 明的內容。除非另有限定，本文使用的所有技術以及科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通 技術人員通常理解的相同的含義。當存在矛盾時，以本說明書中的定義為準。當量、濃度、或 者其它值或參數以范圍、優(yōu)選范圍、或一系列上限優(yōu)選值和下限優(yōu)選值限定的范圍表示時， 這應當被理解為具體公開了由任何范圍上限或優(yōu)選值與任何范圍下限或優(yōu)選值的任一配 對所形成的所有范圍，而不論該范圍是否單獨公開了。例如，當公開了范圍"1至5"時，所描 述的范圍應被解釋為包括范圍"1至4"、"1至3"、"1至2"、"1至2和4至5"、"1至3和5"等。當數 值范圍在本文中被描述時，除非另外說明，否則該范圍意圖包括其端值和在該范圍內的所 有整數和分數。單數形式包括復數討論對象，除非上下文中另外清楚地指明。"任選的"或者 "任意一種"是指其后描述的事項或事件可以發(fā)生或不發(fā)生，而且該描述包括事件發(fā)生的情 形和事件不發(fā)生的情形。
[0022] 說明書和權利要求書中的近似用語用來修飾數量，表示本發(fā)明并不限定于該具體 數量，還包括與該數量接近的可接受的而不會導致相關基本功能的改變的修正的部分。相 應的，用"大約"、"約"等修飾一個數值，意為本發(fā)明不限于該精確數值。在某些例子中，近似 用語可能對應于測量數值的儀器的精度。在本申請說明書和權利要求書中，范圍限定可以 組合和/或互換，如果沒有另外說明這些范圍包括其間所含有的所有子范圍。
[0023] 此外，本發(fā)明要素或組分前的不定冠詞"一種"和"一個"對要素或組分的數量要求 (即出現次數)無限制性。因此"一個"或"一種"應被解讀為包括一個或至少一個，并且單數 形式的要素或組分也包括復數形式，除非所述數量明顯旨指單數形式。
[0024] 本發(fā)明的各個方面更詳細地描述于以下節(jié)段中：
[0025] 如本文所用，以下術語的每一個具有與其在本部分中相關的含義。冠詞"一個"和" 一種"在本文用于指該冠詞的一個或超過一個（即至少一個)的語法對象。例如，"要素"意指 一個要素或超過一個要素。
[0026] "標志物"或"生物標志物"是與另一種表型狀態(tài)(例如未患有疾病)相比，在取自一 種表型狀態(tài)(例如患有疾?。┑氖茉囌叩臉悠分胁顒e存在的有機生物分子。如果在不同組中 生物標志物的平均或中位水平、例如表達水平經計算為統(tǒng)計學顯著的，則生物標志物在不 同的表型狀態(tài)中差別存在。統(tǒng)計學顯著性的常見檢驗特別包括t- Wallis、Wilcoxon、Mann_Whitney和優(yōu)勢比。單獨或組合的生物標志物提供受試者屬于一種 表型狀態(tài)或另一種表型狀態(tài)的相對風險的度量。因此，它們用作標志物，例如，用于疾病(預 后和診斷）、藥物的治療功效(治療診斷學)和藥物毒性的標志物。
[0027] 在一些實施方案中，用于本發(fā)明的組合物和方法的標志物的準確性可通過接收器 工作特征曲線（"R0C曲線"）來表征。R0C是對于診斷標志物的不同可能的割點的真陽性率相 對假陽性率的曲線。R0C曲線顯示靈敏性和特異性之間的關系。即是說，靈敏性的增加將伴 隨特異性的降低。曲線越靠近R0C空間的左軸，然后頂緣，標志物越準確。相反地，曲線越靠 近R0C圖的45度對角線，標志物越不準確。R0C下的面積是標志物準確性的度量。標志物的準 確性取決于標志物如何適當地將待測試的組分成具有所述疾病的組和不具有所述疾病的 組。曲線下面積(稱為"AUC"）為1表示完美的標志物，而面積為0.5表示有用性較差的標志 物。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的生物標志物和方法的AUC大于約0.50、大于約0.60或 大于約0.70。
[0028] "原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓"在本文中亦稱為"BDTT"，主要臨床表現:可同時有原發(fā) 性肝癌和梗阻性黃疸兩種表現。
[0029] 原發(fā)性肝癌:包括肝細胞癌與肝內膽管細胞癌，是相對繼發(fā)性肝癌而言的。原發(fā)性 肝細胞癌常易侵犯門靜脈和肝靜脈，形成癌栓。
[0030] 癌栓是腫瘤常見并發(fā)癥之一，是指癌細胞在生長、繁殖、轉移過程中，侵襲或堆集 血管和淋巴系統(tǒng)，或引起血液的凝血異常，導致血管功能和血液運行障礙、異常凝血、血栓 形成，產生一系列病理生理改變的腫瘤并發(fā)癥。原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓形成機制復雜，與多 種病理過程有關，一般認為形成途徑為：1、肝癌細胞直接通過膽管壁侵入膽管，并形成癌栓 持續(xù)向下生長而阻塞膽道;2、癌細胞先侵入淋巴管或門靜脈，再通過侵犯膽管壁而進入膽 管;3、原發(fā)性肝癌形成的門靜脈癌栓直接侵入鄰近的膽管;4、HCC通過神經鞘間隙侵入膽管 形成癌栓;5、癌細胞通過侵入膽管壁上的滋養(yǎng)血管，進入膽管腔內。
[0031] 常用的原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓診斷主要依靠:影像學診斷和術中診斷。
[0032] 常見的原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的治療方式主要是外科手術治療、膽管引流術、肝 動脈栓塞化療、經皮肝穿刺膽管內酒精注射、局部外放射治療及保守治療等。
[0033]受試者，例如具有發(fā)展原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓風險的受試者。
[0034] "標志物的水平"或"生物標志物的水平"是指在待測試的樣品中存在的標志物的 量。標志物的水平可以是絕對水平或量(例如μg/ml)或相對水平或量(例如相對信號強度）。 標志物的"更高水平"或"水平增加"是指大于用于評估標志物水平的測定法的標準誤差的 試驗樣品中的標志物水平，和優(yōu)選為對照樣品中標志物水平。標志物的"更低水平"或"水平 降低"是指小于用于評估標志物水平的測定法的標準誤差的試驗樣品中的標志物的水平， 和優(yōu)選為對照樣品中標志物水平。術語"已知的標準水平"或"對照水平"是指標志物的公認 的或預定的水平，其用于比較源自受試者的樣品中的標志物的水平。在一個實施方案中，標 志物的對照水平基于來自具有正常健康的受試者的樣品中的標志物的水平。在另一實施方 案中，標志物的對照水平基于來自具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的一個或多個受試者的樣品 中的標志物的水平。在另一實施方案中，標志物的對照水平基于來自在過去18個月內已經 診斷為原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的樣品中的標志物的水平。在一個實施方案中，來自受試者 的樣品中的標志物的對照水平是之前在受試者的樣品中已確定的標志物的水平。
[0035] 在又一個實施方案中，標志物的對照水平基于在給予對原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的 療法之前來自受試者的樣品中的標志物的水平。在另一實施方案中，標志物的對照水平基 于來自未與試驗化合物接觸的具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者的樣品中的標志物的 水平。在另一實施方案中，標志物的對照水平基于來自與試驗化合物接觸的具有正常健康 的受試者的樣品中的標志物的水平。在一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自原發(fā) 性肝癌伴膽管癌栓的動物模型的樣品中的標志物的表達水平;源自原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓 的動物模型的細胞或細胞系的樣品中的標志物的表達水平。
[0036] 或者，和特別是當因為本文所述方法的常規(guī)實施所致進一步的信息成為可用時， 可使用標志物表達的"對照"水平的群體平均值。在其它實施方案中，標志物的"對照"水平 可通過測定獲自在受試者中懷疑原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓發(fā)作之前的受試者的受試者樣品、 獲自存檔的受試者樣品等的標志物的水平來確定。
[0037] 如本文所用的，術語〃患者〃或"受試者"是指人和非人動物，例如獸醫(yī)學患者。術語 "非人動物"包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、小鼠、 兔、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物和爬行動物。在一個實施方案中，所述受試者是人。 [0038] 在一些實施方案中，受試者的體重指數(BMI)為小于約40kg/m2(例如約40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或約181^/111 2)。在其它實 施方案中，受試者的體重指數(BMI)為大于約40kg/m2(例如約41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或約801^/111 2)。
[0039] 本文所用的術語"樣品"是指自受試者分離的類似細胞或組織的收集物，以及在受 試者內存在的組織、細胞和流體。術語"樣品"包括來自受試者的任何體液(例如血液、淋巴、 婦科流體、囊液、尿液、眼淚和通過支氣管灌洗和/或腹膜沖洗收集的流體)或細胞。在一個 實施方案中，從受試者取出所述組織或細胞。在另一實施方案中，所述或細胞存在于所述受 試者內。其它受試者樣品包括淚滴、血清、腦脊液、糞便、痰和細胞提取物。在一個實施方案 中，生物學樣品包含來自測試受試者的蛋白分子。在另一實施方案中，生物學樣品可包含來 自測試受試者的mRNA分子或來自測試受試者的基因組DNA分子。
[0040] 術語〃測定〃意指包括檢測樣品中標志物的存在或不存在、定量測定樣品中標志物 的量、和/或確定生物標志物的類型的方法。測量可通過本領域已知的方法和本文進一步描 述的那些方法實現。
[0041] 如本文所用的，術語"調節(jié)"的各種形式意圖包括刺激(例如增加或增量調節(jié)特定 的反應或活性)和抑制(例如降低或減量調節(jié)特定的反應或活性）。
[0042]試劑盒是包含特異性檢測本發(fā)明的標志物的至少一種試劑例如探針、引物或抗體 的任何制品（例如包裝或容器），所述制品作為用于進行本發(fā)明的方法的一個單位來推銷、 分配或銷售。在某些實施方案中，試劑盒可包括基質，例如包含本發(fā)明的一種或多種標志物 的捕獲試劑和/或與本發(fā)明的一種或多種標志物結合的捕獲試劑的基質。在一些實施方案 中，這樣的試劑盒包含用于使用質譜測定標志物的水平的使用說明書。
[0043] 第一方面:標志物
[0044] 本發(fā)明的第一個方面，提供一種用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病 的標志物，其包括:D-天冬氨酸、5，6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸、二十四酸和硬脂酸 中的一種或多種組合物。
[0045] 蘇糖酸(Threonic acid):即2,3,4_三羥基丁酸，其廣泛存在于自然界中和動物體 內。蘇糖酸和其他一些有機酸在人尿中的含量隨著年齡、飲食、身體健康的不同而不同。蘇 糖酸也是維生素(L-抗壞血酸）的降解產物之一，并能夠促進維生素C的吸收和利用，而且使 金屬離子易于與氨基酸或蛋白質結合而吸收。維生素C是一種強力自由基清除劑，能夠抑制 腫瘤細胞生長或者降低腫瘤細胞增殖能力。維生素C在腦下垂體、腎臟中含量最高，其次為 眼球、腦、肝臟等部位。維生素C在肝硬化患者血漿中的含量明顯低于正常組，與肝功能損傷 和活性氧代謝紊亂密切相關。而且，肝癌患者體內維生素C含量均低于其它肝病和正常人， 說明維生素C含量低與肝癌發(fā)生密切相關。BDTT患者血漿內蘇糖酸較膽道疾病各組患者以 及正常人均明顯增高，肝癌及肝硬化患者體內維生素C含量顯著降低，而蘇糖酸是維生素C 的降解產物，不難推理BDTT肝癌患者體內維生素C降解速度可能顯著增快，進而導致其降解 產物蘇糖酸顯著增加，這可能與BDTT肝癌患者整體機體的維生素C降解加快相關，也可能與 BDTT肝癌腫瘤細胞本身的維生素C代謝異常有關，其具體機制尚有待進一步通過實驗研究 證實。
[0046] 硬脂酸(Stearic acid):即十八烷酸，由油脂水解產生。硬脂酸是人體肝細胞內的 正常重要成分，在正常肝和肝癌中均含有硬脂酸，但是在腫瘤細胞中的脂肪酸合成酶的活 性升高，進而導致脂肪酸的合成增加。因此在肝癌中硬脂酸的含量會比正常肝內的含量增 加。硬脂酸的積累可以破壞內質網導致肝細胞的凋亡。其在肝癌及肝硬化患者中的含量與 正常組相比具有顯著性差異。肝臟中脂肪酸主要通過兩種形式進行代謝，一種是通過酯化 作用生成甘油三酯、磷脂等脂類物質，第二種是通過e-氧化生成C0 2或酮體。
[0047] D-天冬氛酸（D-aspartic acid)、5，6_二氛尿啼啶（5，6-dihydrouracil)二十二燒 酸(behenic acid)、二十四酉愛（lignoceric acid)。
[0048] 在本發(fā)明的某些方面，單個標志物可用于本發(fā)明的方法和組合物。例如，在一個實 施方案中，用于本發(fā)明的方法和組合物的標志物是D-天冬氨酸。在一個實施方案中，標志物 是5，6_二氫尿嘧啶。在一個實施方案中，標志物是二十二烷酸。在一個實施方案中，標志物 是蘇糖酸。在一個實施方案中，標志物是二十四酸。在一個實施方案中，標志物是硬脂酸。在 本發(fā)明的其它方面，超過一種標志物，例如多種標志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更 多種標志物，可用于本發(fā)明的方法和組合物。例如，在一個實施方案中，用于本發(fā)明的方法 和組合物的標志物包括D-天冬氨酸和5,6-二氫尿嘧啶。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸和二十二烷酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸和蘇糖酸。在一個實施 方案中，標志物包括D-天冬氨酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸和 硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括5，6-二氫尿嘧啶和二十二烷酸。在一個實施方案 中，標志物包括5,6_二氫尿嘧啶和蘇糖酸。在一個實施方案中，標志物包括5,6_二氫尿嘧啶 和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括5，6-二氫尿啼啶和硬脂酸。在一個實施方案 中，標志物包括二十二烷酸和蘇糖酸。在一個實施方案中，標志物包括二十二烷酸和二十四 酸。在一個實施方案中，標志物包括二十二烷酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括 蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括蘇糖酸和硬脂酸。在一個實施方案中， 標志物包括二十四酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧 啶和二十二烷酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧啶和蘇糖酸。 在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧啶和二十四酸。在一個實施方案 中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6_二氫尿嘧啶和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、二十二烷酸和蘇糖酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、二十二烷酸 和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、二十二烷酸和硬脂酸。在一個實 施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、蘇糖酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、二十四酸和硬脂 酸。在一個實施方案中，標志物包括5,6-二氫尿啼啶、二十二燒酸和蘇糖酸。在一個實施方 案中，標志物包括5,6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包 括5,6-二氫尿啼啶、二十二燒酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物包括5,6-二氫尿啼 啶、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括5，6-二氫尿嘧啶、蘇糖酸和硬脂酸。 在一個實施方案中，標志物包括二十二烷酸、蘇糖酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標志物 包括二十二烷酸、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方案中，標志物包括硬脂酸、蘇糖酸和二 十四酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5,6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸和蘇糖 酸。在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸和二十四酸。 在一個實施方案中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸和硬脂酸。在一 個實施方案中，標志物包括5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施 方案中，標志物包括5，6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和硬脂酸。在一個實施方案中，標 志物包括D-天冬氨酸、5,6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方案 中，標志物包括D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和硬脂酸。在一個實施方 案中，標志物包括硬脂酸、5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和二十四酸。在一個實施方 案中，標志物包括D-天冬氨酸、硬脂酸、5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸和二十四酸。 [0049]肝臟是甘油三酯合成最好的場所，當肝臟受損時，甘油三酯不能正常合成，所以可 以導致硬脂酸的積累。因此，本申請的發(fā)明人推測BDTT患者血漿中硬脂酸含量的增高，一方 面與腫瘤細胞導致的脂肪酸酶活性增高相關，另一方面可能與肝臟的損傷導致的脂質代謝 降低有關，肝臟受損時，硬脂酸的含量升高，進一步加重了肝臟損傷和凋亡，形成惡性循環(huán)。 BDTT患者絕大多數既往均有慢性乙型肝炎或者其它肝炎的病史，BDTT導致的膽道阻塞進一 步加重了該類患者的肝臟損傷，這類患者具有雙重的病理因素，因此其血漿硬脂酸含量要 顯著高于僅受一種膽道梗阻損傷因素影響的肝外膽管癌(EHCC)患者(EHCC患者多數沒有肝 炎病毒感染病史）。本項研究亦提示EHCC患者血漿內硬脂酸水平要顯著高于膽道良性疾病 組與正常人，這樣的梯度也從一定程度反映了硬脂酸與肝臟受損程度密切相關。
[0050]標志物：即生物標志物，可以標記系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改 變或可能發(fā)生的改變的生化指標，具有非常廣泛的用途。生物標志物可用于疾病診斷、判斷 疾病分期或者用來評價新藥或新療法在目標人群中的安全性及有效性。生物標志物是生物 體受到嚴重損害之前，在不同生物學水平(分子、細胞、個體等)上因受環(huán)境污染物影響而異 ?；男盘栔笜?。它可以對嚴重毒性傷害提供早期警報。這種信號指標可以是細胞分子結 構和功能的變化、可以是某一生化代謝過程的變化或生成異常的代謝產物或其含量，可以 是某一生理活動或某一生理活性物質的異常表現，可以是個體表現出的異?，F象，可以是 種群或群落的異常變化，可以是生態(tài)系統(tǒng)的異常變化。
[0051 ]膽道系統(tǒng)疾病:膽道系統(tǒng)起源于肝內毛細膽管，沿著肝臟的解剖分葉，逐步匯合為 各級肝內分支，至肝門部成為左、右肝管，分別引流左、右半肝，最后在肝外匯總為肝總管。 膽囊經膽囊管與肝總管相通，自膽囊管進入肝總管以下，即成為膽總管。通常，將左右肝管 以上的膽管稱為肝內膽管，自肝總管以下稱為肝外膽管。膽道系統(tǒng)疾病種類很多，主要分為 4大類、35種疾病。第一類為膽囊炎性病變，包括急性膽囊炎、慢性膽囊炎、膽囊結石、黃色肉 芽腫性膽囊炎、膽囊穿孔、急性氣腫性膽囊炎。第二類為膽管炎性病變，包括硬化性膽管炎、 嗜酸性膽管炎、化膿性膽管炎。第三類為膽系腫瘤，其種類繁多，包括囊腫、肝內膽汁瘤、膽 管周圍囊腫、膽總管腺肌瘤、膽管微小錯構瘤、膽囊息肉樣病變、膽管乳頭狀瘤病、膽管顆粒 性細胞瘤、膽總管絨毛狀腺瘤、膽管內乳頭狀腺瘤、膽管類癌和膽囊腺內分泌細胞癌、肝膽 管原發(fā)性黑色素瘤、膽囊癌、膽囊惡性纖維組織細胞瘤、膽囊平滑肌瘤、膽囊平滑肌肉瘤、膽 囊癌肉瘤、肝門部膽管癌、肝外膽管癌。第四類包括膽道出血、膽囊切除術后綜合癥、膽囊軟 化斑癥、膽道變化、膽管外傷性神經瘤、醫(yī)院性膽道損傷。
[0052]本發(fā)明中，所述膽道系統(tǒng)疾病優(yōu)選為原發(fā)性膽管結石、先天性膽管囊腫、肝外膽管 癌中的一種或多種。
[0053] 第二方面:篩查并鑒定標志物
[0054]本發(fā)明中采用血漿學代謝組學的方法來篩查并鑒定標志物。
[0055] 代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之后迅速崛起的一門新興學科，已 成為系統(tǒng)生物學的重要組成部分。代謝組學是研究生物體系受外部刺激或擾動后所產生的 內源性代謝物整體及其變化規(guī)律的科學，是探明生物體系代謝途徑的研究方法細胞內許多 生命活動發(fā)生于代謝層面，如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等，機體內任何生理或 病理改變都離不開代謝過程及其組分的變化。
[0056] 代謝組學的研究樣本可以是生物體液(如血漿、尿液、唾液等）、細胞提取物、細胞 培養(yǎng)液和組織等。其中心任務包括檢測、量化和編錄生物內源性代謝物質的整體及其變化 規(guī)律，并且通過這種變化規(guī)律探究所發(fā)生的生物學事件或過程的本質。代謝組學的研究對 象是相對分子質量l〇〇〇Da以下的小分子物質，包括:糖類、氨基酸、脂類、有機酸、肉堿等。代 謝組學的研究，一般包括樣品的采集及制備、代謝物組數據的采集、預處理、多變量統(tǒng)計分 析和代謝途徑分析等步驟:獲取生物樣本、樣品前處理、進行分析測試技術的分析處理、靶 向或非靶向分析、數據預處理、多元變量分析和可能的生物標志物的確定。
[0057]樣品的采集和制備是代謝組學研宄中的最初始的步驟，也是最重要的步驟之一。 可應用于代謝組學研宄的體液除常見的血液(血清、血漿)和尿液外，還包括:腦脊液，腹水， 羊水，精液，消化液，肺吸氣等。
[0058]目前，常用的分析測試技術為以核磁共振譜(NMR)、質譜(MS)為核心的分析技術以 及色譜與波譜聯用技術，包括:NMR、LC-NMR或LC-NMR-MS、LC-MS和GC-MS等。NMR技術具有無 偏向性、無損傷樣品等特點，但該技術靈敏度低、檢測動態(tài)范圍窄。MS及MS/MS技術具有較高 的靈敏度和專屬性，可以實現多個化合物的同時快速檢測和定量分析。
[0059] 數據預處理與分析:在代謝組學研究中，海量數據的預處理、分析和管理需要專門 的數學、統(tǒng)計學和生物信息學工具。其中，匪R譜數據需要首先把譜信號分成很多小單元 (bins)，然后進行基線校正和整合，降低水抑制效應帶來的變異和尿素的交叉馳豫效應;基 于MS的分析方法，是對一定質荷比（zw/z)范圍進行全掃描的基礎上，將獲得的數據分成若 干小窗，方便計算機分區(qū)域進行峰匹配。
[0060] 由于生物樣品中代謝物組分復雜、含量差異大，高含量化合物容易掩蓋低含量化 合物的變化，往往使一些含量較低但具有重要生物學意義的代謝物組分不能被識別。因此， 需要對數據進行標度化，以消除不同代謝物的尺度差異。
[0061] 多元變量分析:也稱多變量分析或者多元統(tǒng)計分析，主要研究多個變量的集合之 間的關系以及具有這些變量的個體之間的關系。簡單地說，就是研究n個觀測對象集合之間 特征的方法，其中對每個對象觀測P個因素(變量）。觀測對象的集合可以是整個集合，也可 以是取自較大集合的一個或多個子集;可以是固定的，也可以是隨機的；可以是類型變量， 也可以是數量變量;數量變量可以是連續(xù)的，也可以是離散的；并且變量集本身可以是取自 較大變量集合的一個或多個子集。
[0062] 本發(fā)明的第二方面提供獲取所述標志物的方法，其具體步驟在于：
[0063] 1、獲取受試者樣品，并進行前處理；2、將前處理過的受試者樣品進行GC-MS或者 LC-MS進行檢測，收集數據;3、進行數據分析，獲取可行的標志物。
[0064] 上述步驟中，所述受試者樣品可以是固體、液體，也可以是細胞、微生物等。
[0065] 作為一種實施方式，當所述受試者樣品為固體時，所述具體前處理的方法為：將 100mg固體溶于400此提取試劑，加入鋼珠進行研磨，所述研磨的條件為30Hz，5分鐘;然后進 行離心，取上清。若要進行GC-MS測試，可進行濃縮干燥。所述濃縮干燥的步驟為將上清中加 入20mg/ml的甲氧胺，在80°C下干燥20min，然后加入試劑BSTFA下進行衍生化處理1小時后， 進行測試。若要進行LC-MS測試，則只需將上清液進行濃縮干燥，加入100此乙腈進行復溶， 經過濾塞，可直接進行LC-MS測試。作為一種實施方式，所述受試者樣品為液體時，例如血 清、尿液等。所述具體前處理的方法為：1 〇〇此液體加入350yL甲醇中，進行斡旋混勻，高速離 心，取上清液，進行測試。若要進行GC-MS測試，可進行濃縮干燥。所述濃縮干燥的步驟為將 上清中加入20mg/ml的甲氧胺，在80°C下干燥20min，然后加入試劑BSTFA下進行衍生化處理 1小時后，進行測試。若要進行LC-MS測試，則只需將上清液進行濃縮干燥，加入lOOiiL乙腈進 行復溶，經過濾塞，可直接進行LC-MS測試。
[0066]作為一種實施方式，所述受試者樣品為微生物時，所述處理方式與細胞的處理方 式一樣。
[0067]閾值(P值）：統(tǒng)計學上的量，代表結果顯著性。P值〈0.05代表隨機誤差產生這種結 果的概率小于0.05。
[0068] 第三方面:區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的方法
[0069]在某些方面，本發(fā)明提供區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病方法。例如， 在一個方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的方法。所述方 法包括測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與在對照樣品中的所述 一種或多種標志物的水平。與對照樣品中一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的 一種或多種標志物的水平差異指示所述受試者具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓。
[0070] 用所述標志物區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包 括：
[0071] 在受試者的組織樣本中測定本發(fā)明中所述一種或兩種標志物的水平；
[0072] 將受試者樣品中的一種或兩種標志物與對照樣品中的一種或多種標志物的水平 相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多種 標志物的水平的差異指示所述受試者具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓。
[0073] 所述對照樣品可以是健康受試者的樣品。
[0074] 第四方面:確定受試者是否對療法有反應的方法
[0075] 用于確定具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者是否將對療法有反應的方法。
[0076] 所述方法包括測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與在對 照樣品中的所述一種或多種標志物的水平。在與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相 比，受試者樣品中的一種或多種標志物的水平差異指示所述受試者將對治療有反應。
[0077] 第五方面:監(jiān)測治療功效的方法
[0078] 用于在具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者中監(jiān)測治療功效的方法。
[0079] 本發(fā)明還提供用于檢測可用于在受試者中抑制原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的發(fā)展;降 低或減慢正常人至原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的發(fā)展;和/或降低或抑制與所述疾病相關的并 發(fā)癥的發(fā)展的療法或治療方案或任何其他治療方法的功效的方法。在這些方法中，評估在 一對樣品（不經過治療方案的第一樣品和經過治療方案的至少一部分的第二樣品）中的本 發(fā)明的一種或多種標志物的水平。相對于第二樣品，第一樣品中一種或多種標志物的表達 水平的調節(jié)表面所述療法有效在受試者中抑制原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓;降低或減慢正常人 體至原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的發(fā)展;和/或降低或抑制與所示疾病相關的并發(fā)癥的發(fā)展。
[0080] 第六方面:
[0081 ]用于確定受試者是否具有或將發(fā)展原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的試劑盒。
[0082]在本發(fā)明的任何方法和試劑盒中，獲自受試者的樣品中本發(fā)明的標志物的水平可 通過各種眾所周知的技術和方法中任一種來測定，其將樣品中的本發(fā)明的標志物轉化成可 檢測和定量的部分。這樣的方法的非限制性實例包括使用用于檢測蛋白質的免疫學方法、 蛋白質純化方法、蛋白質功能或活性測定法、核酸雜交方法、核酸逆轉錄方法和核酸擴增方 法、免疫印跡法、但報紙印跡法、RNA印跡法、電子顯微術、質譜法、免疫沉淀、免疫熒光、免疫 組織化學、酶聯免疫吸附測定法、基于血液的定量測定法、基于尿液的定量測定法、流式細 胞術、DNA雜交、陳列分析等和其組合或亞組合分析樣品。
[0083]如本文可互換使用的術語"標志物活性"和"標志物的生物活性"包括標志物蛋白 對標志物反應細胞或組織所施加的活性，或對標志物核酸分子或蛋白祀分子所施加的活 性，如按照標準技術在體內和/或體外所測定。標志物活性可以是直接活性，例如與標志物-靶分子締合?；蛘?，標志物活性是間接活性，例如通過標志物蛋白與標志物-靶分子或涉及 所述標志物的信號轉導通路中的其它分子相互作用而介導的下游生物事件。
[0084]本發(fā)明的又一方面涉及在細胞中調節(jié)標志物的表達和/或活性的方法。本發(fā)明的 調節(jié)方法包括使細胞與調節(jié)標志物的表達和/或活性的試劑接觸，使得細胞中的標志物的 表達和/或活性受到調節(jié)。為了使在細胞中標志物的表達和/或活性受到調節(jié)，所述細胞與 足以調節(jié)標志物的表達和/或活性的量的調節(jié)劑接觸。
[0085] "調節(jié)物"或"調節(jié)劑"是起化調節(jié)作用的合物或分子，和可以是例如激動劑、拮抗 劑、激活劑、刺激劑、阻抑劑或抑制劑。如本文所用的術語"調節(jié)劑"是指調節(jié)標志物的活性 的任何部分，包括調節(jié)標志物表達或調節(jié)標志物功能的部分。調節(jié)劑可通過調節(jié)在細胞中 標志物多肽的活性起作用，例如通過使細胞與試劑接觸，所述試劑例如干擾標志物與其相 互作用的分子的結合，改變標志物的結合特異性，或翻譯后修飾標志物或標志物的表達(例 如通過調節(jié)標志物基因的轉錄或標志物mRNA的翻譯）。因此，本發(fā)明的特征在于用于調節(jié)受 標志物調節(jié)的一種或多種生物反應的方法，即，通過使細胞與標志物的表達和/或活性的調 節(jié)劑接觸，使得生物反應受到調節(jié)。
[0086] 代表性的調節(jié)劑在下文描述，包括但不限于蛋白、核酸分子、抗體、核酸(例如反義 分子，例如核酶和RNA干擾劑）、免疫綴合物(例如與治療劑綴合的抗體）、小分子、融合蛋白、 適體、脂籠蛋白（1 ipocalin)和標志物-衍生的肽化合物。
[0087] 如本文所用的術語"接觸"（例如使細胞與調節(jié)劑接觸）意欲包括一起體外孵育調 節(jié)劑和細胞(例如添加調節(jié)劑至培養(yǎng)的細胞中）或將調節(jié)劑給予受試者使得調節(jié)劑和受試 者的細胞在體內接觸。術語"接觸"不意欲包括將細胞暴露于可天然存在于受試者中的試劑 (即，因為天然生理過程而可能發(fā)生的暴露）。
[0088] 如本文所用的術語〃患者〃或"受試者"意欲包括人和獸醫(yī)學患者。在具體的實施方 案中，受試者是人。術語"非人動物"包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如 非人靈長類動物、小鼠、兔、綿羊、狗、奶牛、雞、兩棲動物和爬行動物。
[0089] 本發(fā)明還提供用于確定受試者是否具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的試劑盒。
[0090] 這些試劑盒包括測定本發(fā)明的一種或多種標志物的水平的工具和試劑盒使用說 明書。本發(fā)明的試劑盒可任選包含用于進行本發(fā)明方法的另外組分。例如，試劑盒可包含用 于從受試者獲得生物樣品的試劑、對照樣品、一個或多個樣品區(qū)室、原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓 治療劑、描述進行本發(fā)明方法的指導材料和組織特異性對照/標準品。用于測定一種或多種 標志物的水平的試劑可包括例如緩沖液或用于評價一種或多種標志物的水平(例如表達水 平(例如在mRNA或蛋白水平上））的測定法的其它試劑。說明書可以是例如用于進行評價本 發(fā)明的一種或多種標志物的水平的測定法的印刷的說明書。用于自受試者分離生物樣品的 試劑可包括可用于從受試者獲得流體或組織的一種或多種試劑，例如用于獲得唾液或血液 的工具。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括用于培養(yǎng)獲自受試者的樣品的試劑。優(yōu)選，試劑盒經 設計用于人類受試者。
[0091 ]本發(fā)明通過以下實施例作進一步說明，實施例不應解釋為進一步限制。本申請全 文所引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容，以及附圖，明確地通過引用以其 整體結合到本文中。
[0092]分組:分為正常組、原發(fā)性膽管結石組、先天性膽管囊腫組、肝外膽管癌組和原發(fā) 性肝癌伴膽管癌栓組；
[0093]選取1250個受試者，其中正常健康人220人;原發(fā)性膽管結石200人;先天性膽管囊 腫230人;肝外膽管癌300人，原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓300人。
[0094] 一、獲取標志物
[0095] 步驟：1、獲取受試者血液，并進行前處理：100此液體加入350此甲醇中，進行斡旋 混勻，高速離心，取上清液，進行濃縮干燥，加入l〇〇yL乙腈進行復溶，經過濾塞，可直接進行 UHPLC-QQQ-MS測試;收集UHPLC-QQQ-MS數據，進行多元變量統(tǒng)計分析。
[0096] 采用UHPLC-QQQ-MS定量驗證后發(fā)現BDTT組，與正常人組、肝外膽管癌、原發(fā)性膽管 結石組以及先天性膽管囊腫組相比，特異高表達物質有:D-天冬氨酸、5，6-二氫尿嘧啶、二 十二烷酸、蘇糖酸、二十四酸和硬脂酸。對數據進行t檢驗，以T-test的p值(閾值〈0.05)來確 定差異性表達代謝物，結果如表1所示：
[0097] 表1 BDTT組對比其他組(包括正常組、原發(fā)性膽管結石組、先天性膽管囊腫組和肝 外膽管癌組)特異高表達物質
[0099] 二、以篩選到的單標志物診斷BDTT
[0100] 實施例1以5,6-二氫尿嘧啶為單標志物診斷BDTT
[0101]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，可知AUC(R0C曲線下的面積)為0.8536， 診斷靈敏度為69.81 %，特異度為0%。
[0102]實施例2以D-天冬氨酸為單標志物診斷BDTT
[0103]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，可知AUC (ROC曲線下的面積)為0.9669， 診斷靈敏度為95.28%，特異度為10.81 %。
[0104]實施例3以蘇糖酸為單標志物診斷BDTT
[0105]經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，可知AUC(R0C曲線下的面積)為0.4598， 診斷靈敏度為39.62%，特異度為29.73%。
[0106]實施例4以硬脂酸為單標志物診斷BDTT
[0107]經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，可知AUC(R0C曲線下的面積)為0.1466， 診斷靈敏度為100%，特異度為100%。
[0108] 實施例5以二十二烷酸為單標志物診斷BDTT
[0109]經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，可知AUC(R0C曲線下的面積)為0.8252， 診斷靈敏度為70.75%，特異度為13.51 %。
[0110] 實施例6以二十四酸為單標志物診斷BDTT
[0111] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，可知AUC (R0C曲線下的面積)為0.216， 診斷靈敏度為4.717%，特異度為2.703%。
[0112] 三、以兩種標志物診斷BDTT
[0113] 實施例7以5,6-二氫尿嘧啶和D-天冬氨酸聯合診斷BDTT
[0114] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶和D-天冬氨酸聯合診 斷80!7時41](：(1?0(：曲線下的面積)為0.9824;診斷靈敏度為97.17%，特異度為10.81%。
[0115] 實施例8以5,6-二氫尿嘧啶和蘇糖酸聯合診斷BDTT
[0116] 經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，5，6_二氫尿嘧啶和蘇糖酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.86;診斷靈敏度為72.64%，特異度為2.703%。
[0117] 實施例9以5,6-二氫尿嘧啶和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0118] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，5，6_二氫尿嘧啶和硬脂酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9592;診斷靈敏度為87.74%，特異度為0%。
[0119] 實施例10以5,6_二氫尿嘧啶和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0120] 經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶和二十二烷酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9587;診斷靈敏度為91.51%，特異度為5.405%。
[0121] 實施例11以5,6_二氫尿嘧啶和二十四酸聯合診斷BDTT
[0122] 經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶和二十二烷酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9737;診斷靈敏度為92.45%，特異度為0%。
[0123] 實施例12以D-天冬氨酸和蘇糖酸聯合診斷BDTT
[0124] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸和蘇糖酸聯合診斷BDTT時， AUC(R0C曲線下的面積)為0.9669;診斷靈敏度為95.28%，特異度為10.81 %。
[0125] 實施例13以D-天冬氨酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0126] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸和蘇糖酸聯合診斷BDTT時， AUC(R0C曲線下的面積)為0.9878;診斷靈敏度為96.23%，特異度為5.405%。
[0127] 實施例14以D-天冬氨酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0128] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸和二十二烷酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9878;診斷靈敏度為97.76%，特異度為5.405%。
[0129] 實施例15以D-天冬氨酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0130]經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸和二十四酸聯合診斷BDTT 時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9913;診斷靈敏度為96.23%，特異度為2.703%。
[0131] 實施例16以蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0132] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷BDTT時，AUC (R0C曲線下的面積)為0.8534;診斷靈敏度為76.42%，特異度為16.22%。
[0133] 實施例17以蘇糖酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0134] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，蘇糖酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT時， AUC(R0C曲線下的面積)為0.8457;診斷靈敏度為78.30%，特異度為18.92%。
[0135] 實施例18以蘇糖酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0136] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，蘇糖酸和二十四酸聯合診斷BDTT時， AUC(R0C曲線下的面積)為0.8386;診斷靈敏度為64.15%，特異度為0%。
[0137] 實施例19以硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0138] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT時， AUC(R0C曲線下的面積)為0.8962;診斷靈敏度為80.19%，特異度為8.108%。
[0139] 實施例20以硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0140]經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT時， AUC(ROC曲線下的面積)為0.8677;診斷靈敏度為72.64%，特異度為5.405%。
[0141] 實施例21以二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0142] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT 時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.8651;診斷靈敏度為77.36%，特異度為5.405%。
[0143] 四、以三種標志物診斷BDTT
[0144] 實施例22以5,6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和蘇糖酸聯合診斷BDTT
[0145]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和蘇糖酸 聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9827 ;診斷靈敏度為97.17 %，特異度為 10.81%〇
[0146] 實施例23以5,6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0147] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和硬脂酸 聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9929 ;診斷靈敏度為94.34%，特異度為 2.703%〇
[0148] 實施例24以5,6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0149] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和二十二 烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9893;診斷靈敏度為98.11 %，特異度為 5.405%〇
[0150] 實施例25以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0151 ]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸和二十四 酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9982 ;診斷靈敏度為98.11 %，特異度為 2.703%〇
[0152] 實施例26以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0153] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸和硬脂酸聯合 診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9605;診斷靈敏度為87.74%，特異度為0%。
[0154] 實施例27以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0155] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、蘇糖酸和二十二烷酸 聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9587 ;診斷靈敏度為91.51 %，特異度為 5.405%〇
[0156] 實施例28以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0157] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、蘇糖酸和二十四酸聯 合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9755;診斷靈敏度為92.45%，特異度為0%。
[0158] 實施例29以5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0159] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸和二十二烷酸 聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.987 ;診斷靈敏度為97.17 %，特異度為 5.405%〇
[0160] 實施例30以5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0161] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸和二十四酸聯 合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9855;診斷靈敏度為93.4%，特異度為0%。
[0162] 實施例31以5,6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0163] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、二十二烷酸和二十四 酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9842 ;診斷靈敏度為96.23 %，特異度為 2.703%〇
[0164] 實施例32以D-天冬氨酸、蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0165] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9895;診斷靈敏度為97.17%，特異度為5.405%。
[0166] 實施例33以D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0167] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十二烷酸聯合 診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9776;診斷靈敏度為96.23%，特異度為5.405%。
[0168] 實施例34以D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0169] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十四酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9913;診斷靈敏度為96.23%，特異度為2.703%。 [0170]實施例35以D-天冬氨酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0171]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合 診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9921;診斷靈敏度為94.34%，特異度為2.703%。 [0172]實施例36以D-天冬氨酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0173] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、硬脂酸和二十四酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9944;診斷靈敏度為99.06%，特異度為2.703%。
[0174] 實施例37以D-天冬氨酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0175] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、二十二烷酸和二十四酸聯 合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9926 ;診斷靈敏度為97. 17%，特異度為 2.703%〇
[0176]實施例38以蘇糖酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0177]經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，蘇糖酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.898;診斷靈敏度為80.19%，特異度為8.108%。
[0178]實施例39以蘇糖酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0179]經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，蘇糖酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷 BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.8756;診斷靈敏度為69.81%，特異度為5.405%。
[0180]實施例40以蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0181] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.8929;診斷靈敏度為79.25%，特異度為10.81 %。
[0182] 實施例41以硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0183] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診 斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9044;診斷靈敏度為83.96%，特異度為8.108%。
[0184] 五、以四種標志物診斷BDTT
[0185] 實施例42以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸和硬脂酸聯合診斷BDTT
[0186] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸 和硬脂酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9946;診斷靈敏度為96.23%，特異 度為 2.703%。
[0187] 實施例43以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0188] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸 和二十二烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9898;診斷靈敏度為98.11 %， 特異度為5.405 %。
[0189] 實施例44以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0190]經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸 和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9985;診斷靈敏度為99.06%，特 異度為2.703%。
[0191] 實施例45以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0192] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸 和二十二烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9977;診斷靈敏度為97.17%， 特異度為〇 %。
[0193] 實施例46以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0194] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸 和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9985;診斷靈敏度為100%，特異 度為 2.703%。
[0195] 實施例47以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0196] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、二十二 烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9982;診斷靈敏度為 98.11%，特異度為 2.703%。
[0197] 實施例48以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0198] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸和二 十二烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9867;診斷靈敏度為96.23%，特異 度為 2.703%。
[0199] 實施例49以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0200]經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸和二 十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9847;診斷靈敏度為93.40%，特異度 為0% 〇
[0201] 實施例50以5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0202] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5，6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、二十二烷酸 和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9852;診斷靈敏度為96.23 %，特 異度為2.703%。
[0203] 實施例51以5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT [0204] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線）測試，5,6_二氫尿嘧啶、硬脂酸、二十二烷酸 和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9916;診斷靈敏度為97.17%，特 異度為2.703%。
[0205]實施例52以D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT
[0206]經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十二 烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9916;診斷靈敏度為95.28%，特異度為 2.703%〇
[0207] 實施例53以D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0208] 經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十四 酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9944;診斷靈敏度為99.06 %，特異度為 2.703%〇
[0209] 實施例54以D-天冬氨酸、蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0210] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸、二十二烷酸和二 十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9926;診斷靈敏度為97.17%，特異度 為 2.703%〇
[0211]實施例55以D-天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT [0212]經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，D-天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二 十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9944;診斷靈敏度為99.06%，特異度 為 2.703%〇
[0213]實施例56以蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0214] 經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試，蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四 酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9097 ;診斷靈敏度為82.08 %，特異度為 8.108%〇
[0215] 六、以五種標志物診斷BDTT
[0216] 實施例57以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十二烷酸聯合診 斷 BDIT
[0217] 經過R0C曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、 硬脂酸和二十二烷酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9521;診斷靈敏度為 93.4%，特異度為0%。
[0218]實施例58以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸和二十四酸聯合診斷 BDTT
[0219]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、 硬脂酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.999;診斷靈敏度為100%， 特異度為2.703%。
[0220]實施例59以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、二十二烷酸和二十四酸聯合 診斷BDTT
[0221 ]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、 二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9516;診斷靈敏度為 95.28%，特異度為 2.703%。
[0222]實施例60以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合 診斷BDTT
[0223] 經過R0C曲線（受試者工作特征曲線）測試5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸、 二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9995;診斷靈敏度為 99.06%，特異度為0 %。
[0224] 實施例61以5，6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷 BDTT
[0225]經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，5,6_二氫尿嘧啶、蘇糖酸、硬脂酸、二十 二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積）為0.9913;診斷靈敏度為 97.17%，特異度為 2.703%。
[0226]實施例62以D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT
[0227] 經過ROC曲線(受試者工作特征曲線)測試，D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷 酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.9944;診斷靈敏度為99.06%， 特異度為2.703%。
[0228] 七、以六種標志物診斷BDTT
[0229]實施例63以5,6_二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四 酸聯合診斷BDTT
[0230]經過ROC曲線（受試者工作特征曲線）測試5，6-二氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、蘇糖酸、 硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸聯合診斷BDTT時，AUC(R0C曲線下的面積)為0.04118;診斷 靈敏度為〇%，特異度為〇%?？傮w情況見下表2 [0231]表2



[0236] 對比例1:
[0237] 以甲胎蛋白為診斷指標時，其靈敏度為100%，但是其特異度為54.3%。
[0238] 對比例2:
[0239] 以CA19-9(腫瘤標志物）為診斷指標時，均可以明顯增高，無法將BDTT與EHCC進行 良好的鑒別，因此未計算其診斷特異度及敏感度。
[0240] 腫瘤標志物的臨床價值在于腫瘤的診斷與監(jiān)測，在減少腫瘤的漏診方面，腫瘤標 志物的高靈敏度尤為重要。臨床提倡多種腫瘤標志物聯合檢測以提高腫瘤的檢出率，因此 本研究對腫瘤標志物聯合檢測BDTT、原發(fā)性膽管結石、先天性膽管囊腫、肝外膽管癌患者進 行了方法學評價，并綜合評價了靈敏度、特異度。結合R0C曲線得出，診斷BDTT時，以5,6_二 氫尿嘧啶、D-天冬氨酸、硬脂酸、二十二烷酸和二十四酸五個指標聯合時的靈敏度和特異度 均較單指標診斷時明顯提高，分別達到了 99.06%和0%，可以有效彌補甲胎蛋白診斷敏感 度不足的缺陷。綜上所述，在鑒別BDTT與原發(fā)性膽管結石、先天性膽管囊腫、肝外膽管癌時， 硬脂酸和蘇糖酸兩個指標聯合檢測有重要的臨床應用價值。
【主權項】
1. 用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的標志物，其包括:D-天冬氨酸、5， 6_二氫尿嘧啶、二十二烷酸、蘇糖酸、二十四酸和硬脂酸中的一種或多種組合物。2. 權利要求1所述的標志物，其p值小于0.05。3. 權利要求1所述的標志物，所述膽道系統(tǒng)疾病為肝外膽管癌、原發(fā)性膽管結石、先天 性膽管囊腫中的一種或多種。4. 權利要求1所述的標志物，用于區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和原發(fā)性肝癌伴膽管壓 迫。5. 獲取權利要求1所述的標志物的方法，其步驟在于， 獲取受試者樣品，并進行前處理； 采用GC-MS或LC-MS進行檢測； 進行數據分析，獲取所述標志物。6. 用權利要求1所述的標志物區(qū)分原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓和膽道系統(tǒng)疾病的方法，所 述方法包括： 在受試者的組織樣本中測定權利要求1所述一種或兩種標志物的水平； 將受試者樣品中的一種或兩種標志物與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比 較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多種標志 物的水平的差異指示所述受試者具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓。7. 用于確定具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者是否將對療法有反應的方法，所述方 法包括： 在受試者的樣品中測定權利要求1所述的一種或多種標志物的水平； 將受試者樣品中的一種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物的水 平相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多 種標志物的水平的差異指示所述受試者將對所述療法有反應。8. 用于在具有原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的受試者中監(jiān)測治療功效的方法，所述方法包 括： 在開始所述治療之前，在來自受試者的第一樣品中測定權利要求1中所述一種或多種 標志物的水平； 在已給予所述治療的至少一部分之后，在來自受試者的第二樣品中測定權利要求1中 所述一種或多種標志物的水平； 將第一樣品中的一種或多種標志物的水平與第二樣品中的一種或多種標志物的水平 相比較，其中與第二樣品中的一種或多種標志物的水平相比，第一樣品中的一種或多種標 志物的水平的差異指示所述受試者將對所述治療有反應。9. 上述權利要求5-8中任一項的方法，其中受試者樣品是流體樣品或組織樣品。10. 用于確定受試者是否具有或將發(fā)展原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓的試劑盒，所述試劑盒 包括用于在受試者樣品中測定權利要求1所述的一種或多種標志物的水平的試劑。
【文檔編號】G01N30/02GK105891372SQ201610406751
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】鄧軍亮, 樓格爾, 吳洪強
【申請人】上海阿趣生物科技有限公司