通過去除顯性表位b8r重組痘苗病毒的方法及其病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因工程及免疫領(lǐng)域，具體設(shè)及一種通過去除顯性表位B8R重組 痘苗病毒的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫優(yōu)勢指機(jī)體對抗原表位的呈遞的不一致性。病原體通常能夠表達(dá)成百上千種 抗原，感染病原體后機(jī)體對運(yùn)些抗原表位的呈遞并非均一，某些抗原表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn) 生非常強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，有些只能引起中等免疫應(yīng)答，而有些只能引起輕微免疫應(yīng)答甚或 不引起免疫應(yīng)答。我們將那些能誘導(dǎo)強(qiáng)烈應(yīng)答的表位稱為顯性表位（dominantepitope)， 其他表位稱為次要表位（sub-dominantepitope)。免疫優(yōu)勢通常用免疫系統(tǒng)對一系列表位 應(yīng)答強(qiáng)度的等級梯度（dominanthierarchy)來描述。當(dāng)原本占優(yōu)勢的顯性表位被去除后， 一些次要表位往往會代替原來的顯性表位，產(chǎn)生新的免疫優(yōu)勢。目前疫苗研發(fā)中的一個突 出問題，就是載體自身的免疫優(yōu)勢對外源目的性抗原的有效表達(dá)和免疫原性產(chǎn)生顯著的抑 審IJ，載體的免疫優(yōu)勢效應(yīng)成為制約疫苗有效性的主要因素之一。
[0003] 痘苗病毒（vacciniavirus,VACV)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因治療和疫苗的載 體之一。在痘苗病毒誘導(dǎo)的巧7BL/6小鼠殺傷性T細(xì)胞（殺傷性T細(xì)胞）應(yīng)答中，B8R表 位居免疫梯度的首位，去除B8R可望有效降低痘苗病毒載體的免疫優(yōu)勢，提高重組疫苗中 外源目的抗原的表達(dá)和功能。B8R基因編碼蛋白是一種干擾素丫（IFN-丫）的特異性受體， IFN-丫作為重要的免疫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子在一系列免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用；B8R的缺失 可能對痘苗病毒的毒力和機(jī)體的抗病毒免疫造成影響。本發(fā)明將包含H-2Kb限制性CD8 +表 位（0VA257 2M)的OVA作為外源基因替換痘苗病毒的B8R，構(gòu)建了含外源目的抗原OVA的重 組痘苗病毒。B8R基因缺失對于病毒的感染復(fù)制不產(chǎn)生顯著影響；將外源基因OVA導(dǎo)入B8R 基因缺失的痘苗病毒后，OVA誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力較之在野生型痘苗病毒中顯著改善，并躍 居免疫優(yōu)勢梯度的首位。在今后的應(yīng)用中可用各種外源基因取代0VA，構(gòu)建高效表達(dá)目的抗 原的重組活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決作為疫苗載體的痘苗病毒的免疫優(yōu)勢問題，提高重組痘苗病毒疫苗的安全 性和有效性，本發(fā)明提供了一種通過去除顯性表位B8R重組痘苗病毒的方法。去除B8R對 外源抗原免疫原性的抑制，可有效降低痘苗病毒的免疫優(yōu)勢效應(yīng)，增加外源性抗原的免疫 原性。去除痘苗病毒本身的顯性表位，可為疫苗和基因治療提供更為有效的載體。 陽0化]本發(fā)明的目的是提供一種通過去除顯性表位B8R從而降低痘苗病毒自身免疫優(yōu) 勢并提高安全性的方法，及用該方法構(gòu)建的重組痘苗病毒。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述重組痘苗病毒作為疫苗和基因治療載體的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的重組痘苗病毒，是將野生痘苗病毒的B8R基因替換為帶有LacZ標(biāo)記 的OVA基因得到的重組痘苗病毒。
[0008] 在本發(fā)明的實例中，所述野生痘苗病毒為野生型WR株痘苗病毒，所述的野生型WR 株痘苗病毒的基因組DM序列為GenBank號為AY243312. 1的序列（V化14-MAR-2006)。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0010] 通過去除顯性表位B8R重組痘苗病毒的方法，包括如下步驟： W11] S1、構(gòu)建質(zhì)粒PSB8R-0VA;
[0012] S2、在CV-1細(xì)胞中與野生型痘苗病毒重組； 陽01引 S3、篩選純化獲得重組病毒（VACV-0VA+B8R)。
[0014] 其中，所述步驟S1的具體步驟為：
[0015]S11、根據(jù)野生型痘苗病毒的B8R基因及其側(cè)翼序列，設(shè)計引物，W病毒基因組為 模板，PCR獲得B8R基因的左右臂同源序列B8化和B8RR。
[0016] S12、將獲得的B8化和B8RR分別替代pSCl1質(zhì)粒的T化和TKR，獲得中間質(zhì)粒 pSC-Bo
[0017]S13、根據(jù)OVA基因序列，設(shè)計引物，WVACV-0VA+病毒基因組為模板，PCR獲得 OVA基因，將獲得的OVA基因插入pSC-B質(zhì)粒的P7. 5啟動子后，得到痘苗病毒重組工具 PSB8R-0VA。
[0018] 其中，所述步驟S2的具體步驟為：
[0019] S21、在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CV-1單層細(xì)胞，至80%覆蓋。
[0020]S22、用野生型痘苗病毒感染CV-1細(xì)胞。 W21] S23、采用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒PSB8R-0VA轉(zhuǎn)染至感染細(xì)胞，野生型痘苗病毒與 PSB8R-0VA在B8R基因左右側(cè)位置發(fā)生同源重組。
[0022] S24、48小時后，收集病毒。
[0023] 其中，所述步驟S3的具體步驟為：
[0024] S31、在6孔板中培養(yǎng)CV-1細(xì)胞，至80%覆蓋。 陽0巧]S32、采用步驟S24中的病毒感染CV-1細(xì)胞，并覆蓋瓊脂培養(yǎng)基。 陽0%] S33、2天后加入含X-gal的上層培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；
[0027]S34、挑取孤立藍(lán)斑，進(jìn)行進(jìn)一步篩選，步驟如S32至S34。連續(xù)單斑篩選5代。
[0028] S35、經(jīng)PCR、基因測序和WesternBlot進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定無誤后，進(jìn)行重組病 毒的體外增殖，并將最終收獲的病毒采用密度梯度離屯、純化，保存于-80°C。
[0029] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0030] 去除B8R對外源抗原免疫原性的影響，可有效降低痘苗病毒的免疫優(yōu)勢效應(yīng)，增 加外源性抗原的免疫原性，為W痘苗病毒為載體的活疫苗的研發(fā)提供工具。去除痘苗病毒 本身的顯性表位，可為疫苗和基因治療提供更為有效的載體。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實施例中質(zhì)粒PSB8R-0VA的構(gòu)建步驟。
[0032] 圖2為本發(fā)明實施例中質(zhì)粒PSB8R-0VA的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1為OVA基因 正確連接的酶切結(jié)果，泳道2為基因錯誤連接的酶切結(jié)果，均與使用VectorNTI分析的酶 切結(jié)果（右側(cè)）一致。分子量標(biāo)記DSOOOmarker。
[0033] 圖3為本發(fā)明實施例中重組病毒形成的藍(lán)斑。
[0034] 圖4為本發(fā)明實施例中重組病毒的密度梯度離屯、純化。
[0035] 圖5為本發(fā)明實施例中重組病毒中B8R基因擴(kuò)增。分子量標(biāo)記Markerlll，泳道1 和2分別為野生型痘苗病毒和VACV-0VA+產(chǎn)生的B8R條帶，泳道3顯示VACV-0VA+B8R無特 異條帶產(chǎn)生。
[0036] 圖6為本發(fā)明實施例中重組病毒中OVA基因擴(kuò)增。分子量標(biāo)記D2000marker，泳道 1和2分別為VACV-0VA+和VACV-0VA+B8R產(chǎn)生的OVA條帶，泳道3顯示野生型痘苗病毒無 特異條帶產(chǎn)生。
[0037] 圖7為本發(fā)明實施例中OVA蛋白的表達(dá)。泳道1、2、3分別為VACV-〇VA\ VACV-0VA+B8R和野生型痘苗病毒感染后細(xì)胞中OVA蛋白的表達(dá)。
[0038] 圖8為本發(fā)明實施例中野生型痘苗病毒在巧7BL/6小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞 應(yīng)答的免疫優(yōu)勢等級梯度。
[0039] 圖9為本發(fā)明實施例中重組病毒在CV-1細(xì)胞中的生長曲線。
[0040] 圖10為本發(fā)明實施例中重組病毒在BSC-1細(xì)胞中的生長曲線。
[0041] 圖11為本發(fā)明實施例中重組病毒感染CV-1細(xì)胞3天后的隧斑特性。
[0042] 圖12為本發(fā)明實施例中重組病毒誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0043] 圖13為本發(fā)明實施例中小鼠感染重組病毒后的體重變化曲線。 W44] 圖14為本發(fā)明實施例中小鼠感染重組病毒后的體征及神經(jīng)行為評分變化曲線。
【具體實施方式】
[0045] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實施例中所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。 陽〇4引實施例
[0049] 本實施例中的野生型痘苗病毒W(wǎng)R株在西安醫(yī)學(xué)院分子病毒與病毒免疫學(xué)實驗室 (本實驗室，下同）保藏，內(nèi)嵌OVA基因的重組痘苗病毒（VACV-0VA+)由申請人構(gòu)建并在本 實驗室保藏。質(zhì)粒pSCll由美國NIH的BernardMoss教授惠贈，細(xì)胞系CV-1和BSC-1購 自中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、。所使用的小鼠為雌性6周齡巧7BL/6小鼠，體重18-22g，購自 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物繁育中屯、，飼養(yǎng)于恒溫恒濕的SPF級鼠房。
[0050] 主要試劑和材料：
[0051] DMEM，胎牛血清，脂質(zhì)體（lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑均購自Invitrogen公 司，Taq酶、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自肥B公司，病毒基因組提取試劑盒購自 Biomiga公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。 陽05引 1、質(zhì)粒PSB8R-0VA的構(gòu)建和鑒定 陽05引將野生痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列的第169650-170606位（對應(yīng)序列1的 1-957位，命名為上游同源左臂B8化）和第171345