-172146位（對應序列2的1-802位，命 名為下游同源右臂B8RR)，分別克隆替換pSCll質(zhì)粒的T化和TKR，進而將OVA基因連接到 pSCll質(zhì)粒的啟動子P7. 5之后，得到重組質(zhì)粒PSB8R-0VA。
[0054] 具體操作如下： 陽化5] 1)野生型痘苗病毒W(wǎng)R株基因組DNA和VACV-0VA+病毒基因組DNA提取
[0056] (1)取-80°C凍存的野生型痘苗病毒和VACV-0VA+病毒各200μ1，4°C解凍。
[0057] (2)加入等體積的PLYbuffer,縱滿混勻，室溫放置15分鐘。 陽化引做加入0. 5倍體積的無水乙醇，移液器混勻。
[0059] (4)轉(zhuǎn)移裂解液至吸附柱中，13000rpm離屯、1分鐘，將過濾柱轉(zhuǎn)移至一個新的收集 管中。 W60]巧）向過濾柱中加入650μ1Washbuffer, 13000巧m離屯、1分鐘，棄廢液。
[0061] (6)重復洗一次，棄廢液。 陽06引 （7)將過濾柱放入收集管中1300化pm離屯、2分鐘W去除殘留的乙醇。
[0063] (8)過濾柱放入新的收集管中，向過濾柱中加入30-50μ1DEPC水，室溫靜置3分 鐘。
[0064] (9) 13000巧m離屯、1分鐘，洗脫DNA。 W65] (10)野生型痘苗病毒基因組DNA和VACV-OVA+基因組DNA放置于-20°C備用。
[0066]。引物設計與合成
[0067] 根據(jù)野生型痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列設計并合成如下兩對引物：
[0068] 擴增B8R上游同源臂的引物對：
[0069] BS化-F1:5'-cccMGCTTatgtttctgtaagcgttggc-3^ (下劃線之前部分為保護 堿基，下劃線部分為Hindlll酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 169650-169669位，即序列1的第1-20位）
[0070] BS化-R1:5'-ggGGTACCaatgaacaaaactgcgag-3^ (下劃線之前部分為保護堿 基，下劃線部分為化nl酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 170589-170606位的反向互補序列，即序列1的第940-957位的反向互補序列）；
[0071] 擴增B8R下游同源臂的引物對：
[0072] B8RR-F1 ：5' -tcccCCCGGGgttaccacttttcttagcatgc-3'(下劃線之前部分為保 護堿基，下劃線部分為Xmal酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 171345-171366位，即序列2的第1-22位）
[0073] B8RR-R1 :5' -tatGGCGCCttatagcggggagacgatc-3^ (下劃線之前部分為保護 堿基，下劃線部分為KasI酶切位點識別序列，其后序列為GenBank:AY243312. 1的第 172128-172146位的反向互補序列，即序列2的第784-802位的反向互補序列）。
[0074] 根據(jù)OVA基因序列設計并合成引物：
[00"7日]0VA-F1 ：5' -catRCCATGGatRRRctccatcRRCRcaR-3'(下劃線之前部分為保護堿基， 下劃線部分為化〇1酶切位點識別序列，其后為序列3的第1-19位）
[0076] 0VA-F2 ：5' -tcccCCCG^ttaaggggaaacacatctgc-3'(下劃線之前部分為保護堿 基，下劃線部分為Xmal酶切位點識別序列，其后為序列3的第1161-1180位的反向互補序 列）。
[0077]3)重組質(zhì)粒PSB8R的構(gòu)建及鑒定
[007引 （1)W步驟1中野生型痘苗病毒基因組DNA為模板，W步驟2中合成的B8R上下游 同源臂引物對分別進行PCR，獲得帶有相應酶切位點的B8R的上下游同源臂B8化和B8RR， W步驟1中VACV-OVA+基因組DM為模板，w步驟2中合成的OVA引物對進行PCR，獲得帶 有相應酶切位點的OVA基因片段。
[0079]PCR擴增體系為：DNA1μ1，(1ΝΤΡmix(2. 5πιΜ)5μ1，正向引物Ρ(10μΜ)1μ1，反向 引物R(10μΜ) 1μ1，10XTaqbuffer5μ1，Taq酶 1μ1，加DEPC水至總體積 50μ1。
[0080] PCR擴增條件為：95 °C預變性5分鐘；95 °C變性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸80 秒，循環(huán)30次；72°C延伸10分鐘，最后置于4°C;
[0081]PCR擴增結(jié)果：PCR產(chǎn)物上樣電泳，B8化為974bp，B8RR為82化P，OVA為1200bp， 切膠回收目的條帶。
[0082] (2)首先用限制性內(nèi)切酶化ndin和化nl對上游同源臂B8化進行雙酶切，與經(jīng)同 樣雙酶切的pSCl1質(zhì)粒的大片段進行連接，得到中間質(zhì)粒pSC-A，接著用限制性內(nèi)切酶Xmal 和KasI對下游同源臂B8RR進行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pSC-A的大片段進行 連接，得到中間質(zhì)粒pSC-B，最后用限制性內(nèi)切酶化〇1和Xmal對OVA基因片段進行雙酶切， 與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pSC-B的大片段進行連接，獲得重組質(zhì)粒，酶切和測序鑒定無 誤后，得到質(zhì)粒PSB8R-0VA。
[0083] 2、痘苗病毒的重組和篩選
[0084] 1)痘苗病毒重組
[0085] (1)^了25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)〇^-1細胞至80%單層；
[0086] 似W0. 05M0I感染野生型痘苗病毒，37°C培養(yǎng)2小時；
[0087] (3)去除病毒液，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書轉(zhuǎn)染pSBSR-OVA至感 染細胞中，培養(yǎng)48小時；
[0088] (4)收集細胞，反復凍融Ξ次，進行超聲破碎后，保存于-80°C。
[0089]2)重組痘苗病毒的篩選
[0090] (1)用6孔板培養(yǎng)CV-1細胞至80 %單層； 陽0川 似取經(jīng)超聲破碎后的病毒懸液，做倍比稀釋，感染CV-1細胞，37°C培養(yǎng)2小時；
[0092](3)每孔覆蓋3ml瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天；
[0093] (4)每孔加入2ml含X-gal的上層瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；
[0094](5)觀察藍斑產(chǎn)生情況，挑取孤立藍斑進行進一步篩選，連續(xù)單斑純化5代，至病 毒純化。 陽0巧]3、重組痘苗病毒的鑒定
[0096] 將經(jīng)多次單斑純化的重組病毒進行小量增殖，然后進行PCR、基因測序和Western Blot等分子生物學鑒定。
[0097] 1)PCR和基因測序鑒定
[0098] (1)提取經(jīng)小量增殖的重組痘苗病毒的基因組DNA;
[0099] 似鑒定引物設計： 陽100]B8R鑒定引物：
[0101] B8R-JDF1 :5, -CATGCCATTATGATAAGTAC-3,（VACV-WR第 170296-170215 位）
[0102] B8R-JDR1 :5' -TTGTTCGGTAACGGATAGAC-3'（VACV-WR第 171919-171938 位的反向 互補序列） 陽103]OVA鑒定引物：
[0104]OVA-Fl:5'-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3' 陽105] OVA-Rl: 5'-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3' 陽106] (3)W純化的重組痘苗病毒的基因組DM為模板，用上述3對鑒定引物進行PCR檢 測反應，同時分別設置野生型VACV-WR和/或VACV-0VA+的DNA為模板的對照。
[0107] PCR擴增體系為： 陽10引 DNA 1μΙ dNTPmix (2. 5mM) 5μΙ 正向引物F (10μΜ) 1μΙ 反向引物R (10μΜ) ΙμΙ lOXTaqbuffer 5μ1 Taq酶 1μI 加化PC水 至總體積50μΙ
[0109]PCR擴增條件為：95°C預變性5分鐘；95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸 100秒，循環(huán)30次；72°C延伸10分鐘，最后置于4°C;
[0110] (4)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察結(jié)果并回收目的片段，將回收的目 的片段送測序。 陽111] 2)目的蛋白鑒定
[0112] (1)小量增殖經(jīng)純化的重組痘苗病毒，至70%細胞病變時，收取細胞；
[0113] (2)離屯、，將上清轉(zhuǎn)移至15ml離屯、管內(nèi)，加入等體積飽和硫酸錠溶液，置于旋轉(zhuǎn)搖 床4°C過夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀；
[0114] 0)細胞用PBS洗兩次后，加1mlRIPA裂解液混勻，搖床冰上震蕩1小時， 4°C/1200化pm離屯、10分鐘，取上清置于新的1.5ml離屯、管中，-20°C過夜后，將上清液 4°C/1200化pm離屯、10分鐘，棄上清保留沉淀；
[0115] (4)將上述兩步收獲的混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0116] (5)按照改良的BCA蛋白定量分析試劑盒提供的蛋白定量方法，進行蛋白的定量 分析。一抗采用兔抗OVA抗體，二抗采用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，暗室中進行曝 光檢測重組痘苗病毒的OVA蛋白表達。
[0117] 4、重組