一種腺病毒滴度的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及生物細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及一種腺病毒滴度的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒載體作為極具潛力的哺乳動物基因轉(zhuǎn)移載體而得到廣泛應(yīng)用，尤其是在基 因治療相關(guān)領(lǐng)域。噬斑法是測定病毒滴度最經(jīng)典的方法，噬斑法方法操作繁瑣，并且要求 操作者有一定的操作經(jīng)驗。一般而言，1個噬斑是由一個病毒粒子產(chǎn)生的，以噬斑形成單位 (PFU)表示。以水痘病毒為例，培養(yǎng)瓶內(nèi)生長狀態(tài)良好的2BS或MRC-5細(xì)胞傳代到6孔細(xì) 胞培養(yǎng)板，37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)到細(xì)胞形成單層進(jìn)行試驗，棄去培養(yǎng)液，加入合適稀釋 的水痘病毒，IOOul/孔；37°C，5% C02培養(yǎng)箱吸附，每20min搖勻一次，吸附40min，補(bǔ)加病 毒培養(yǎng)液，3ml/孔，37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)8~10天；棄去病毒培養(yǎng)液，加入考馬斯亮藍(lán) 染液，Iml/孔，染色I(xiàn)Omin ;棄去染液，計噬斑數(shù)，病毒滴度=噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X 10 (PFU/ ml)。該方法存在幾個方面的缺陷：a、檢測時間長，一般需要8~10天；b、準(zhǔn)確性不高，病毒 感染細(xì)胞培養(yǎng)到8~10天，相鄰的噬斑可能聯(lián)合到一起，降低了病毒滴度，也可能母斑病毒 產(chǎn)生子斑，增加了病毒滴度，即導(dǎo)致試驗重復(fù)性差；c、噬斑只有數(shù)目多少，沒有特異性表征， 因而不能反映噬斑是否由水痘病毒感染細(xì)胞引發(fā)的病毒所致。傳統(tǒng)的終點稀釋法是以50% 組織培養(yǎng)感染劑量（TCIDJ表示，TCID5。是指能使半數(shù)單層細(xì)胞孔（管）出現(xiàn)病變的病毒 稀釋度。以水痘病毒為例，培養(yǎng)瓶內(nèi)生長狀態(tài)良好的2BS或MRC-5細(xì)胞傳代到96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板，37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞形成單層進(jìn)行試驗。取水痘病毒懸液，用病毒稀釋液按 10被系列稀釋（10-1-10-4);稀釋的病毒懸液加入到形成單層的組織培養(yǎng)細(xì)胞中，每稀釋 度感染4-12孔細(xì)胞，50uL/孔，37°C，5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-10天；顯微鏡觀察并記錄每稀 釋度每孔細(xì)胞有無病變，記錄的數(shù)據(jù)按Reed-Muench法或Karber法計算病毒TCID5。值。
[0003] 比色指示劑法是通過檢測細(xì)胞活性、間接判斷各孔是否感染。比色指示劑法實質(zhì) 也是一種終點稀釋法，在結(jié)果判定步驟中引入比色指示劑操作，通過顏色變化判斷各孔細(xì) 胞是否感染病毒。噻唑藍(lán)（MTT)是常用試劑之一，使用MTT作為比色劑的病毒滴度測定的 方法俗稱MTT法。熒光定量PCR方法通過測定病毒核酸而定量病毒，不能區(qū)分病毒死活。
[0004] 終點稀釋法測定病毒滴度俗稱TCID5。測定，是使用最廣泛的一種病毒含量測定方 法。如前所述，將傳統(tǒng)的終點稀釋法測定腺病毒滴度有一定不足，主要是低濃度腺病毒感 染細(xì)胞引起的細(xì)胞病變不明顯，且精確度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的檢測病毒滴度 的方法，該方法精確，穩(wěn)定性好。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0007] -種檢驗腺病毒滴度的方法，包括：
[0008] 1.實驗準(zhǔn)備
[0009] (第一天）開啟生物安全柜紫外燈照射臺面30分鐘并將實驗所用溶液預(yù)溫至室 溫。
[0010] 2.制備細(xì)胞懸液
[0011] 取足量293細(xì)胞培養(yǎng)物按常規(guī)傳代方法將細(xì)胞收集，倒置顯微鏡下計數(shù)后，用完 全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO5個/mL。
[0012] 3.接種細(xì)胞懸液
[0013] 取適量96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做好相應(yīng)標(biāo)記，各孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)為 2Χ104個，37°C，5% C02培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)過夜。
[0014] (第二天） _5] 4.制備供試品溶液
[0016] 取待測供試品用不含血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋范圍可根據(jù)VP調(diào)整， 稀釋倍數(shù)最大不超過10倍。可參照表1操作，接種的樣品之間稀釋倍數(shù)以2倍為宜。
[0017] 表1 TCID50 操作表
[0019]
[0020] 5.接種供試品
[0021] 培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸出各孔中的培養(yǎng)基吸出棄去（注意不要攪擾孔內(nèi)已 貼壁的細(xì)胞），向個孔內(nèi)加入最后8個稀釋度供試品，200 μ L/孔，每個稀釋度接種10個平 行孔，第一列及第十二列的8個孔接種DMEM培養(yǎng)液，37°C，5 % C02培養(yǎng)箱溫育60分鐘。
[0022] 6. 60分鐘后，小心吸出各孔培養(yǎng)液，加入200 μ L維持培養(yǎng)液，操作時從低濃度孔 向高濃度孔操作，并且每個稀釋度均需更換槍頭，37°C，5% C02培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)10天。
[0023] (第8天~第10天）
[0024] 7.實驗結(jié)果觀察
[0025] 從接種供試品即日起第8天始至第10天，逐天觀察每排細(xì)胞發(fā)生CPE情況，只要 有一小點或是一些細(xì)胞出現(xiàn)CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較。
[0026] 如果陰性對照無任何CPE且細(xì)胞生長良好，低稀釋度100%陽性而最高稀釋度 100%陰性，則本測試即為有效。
[0027] 8.實驗結(jié)果記錄
[0028] 發(fā)生CPE則表示結(jié)果為陽性用（+)記錄，無 CPE產(chǎn)生則結(jié)果為陰性用（一）記錄。
[0029] 9.實驗結(jié)果計算
[0030] 將接種供試品第十天發(fā)生CPE孔的比率為20%~80% (即在同一稀釋度所發(fā)生 CPE陽性孔為2~10個）的稀釋度代入下式進(jìn)行計算：
[0031] V = - [ (In (I- (Pw/n)) XD) ] / [AwX CwX I X t1/2]
[0032] 備注：Pw/n :陽性孔比率；D :f布釋度；Aw :96孔板每孔面積；Cw :接種供試品Iu細(xì)胞 匯合度；I :擴(kuò)展息數(shù)2. 38X 10 4 ;t :病毒感染時間（秒）。
[0033] 10.結(jié)果取平均值，即為供試品檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0034] 實施例1腺病毒滴度的檢測方法
[0035] 一、所用材料
[0036] 1.試劑
[0037] DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖） Gibcol公司；
[0038] 小牛血清 Hyclone公司；
[0039] HEK293 細(xì)胞 Invitrogen 公司；
[0040] 2.所用耗材
[0041] 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 corning;
[0042] 各種規(guī)格移液槍頭 Axygen ;
[0043] 離心管 Axygen ;
[0044] 3.所用主要設(shè)備
[0045] 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；
[0046] CO2 培養(yǎng)箱 Thermo ;
[0047] 二、實驗方法
[0048] 1.實驗準(zhǔn)備
[0049] (第一天）
[0050] 開啟生物安全柜紫外燈照射臺面30分鐘并將實驗所用溶液預(yù)溫至室溫。
[0051] 2.制備細(xì)胞懸液
[0052] 取足量293細(xì)胞培養(yǎng)物按常規(guī)傳代方法將細(xì)胞收集，倒置顯微鏡下計數(shù)后，用完 全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO5個/mL。
[0053] 3.接種細(xì)胞懸液
[0054] 取適量96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做好相應(yīng)標(biāo)記，各孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)為 2Χ104個，37°C，5% C02培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)過夜。
[0055] (第二天）
[0056] 4.制備供試品溶液
[0057] 取待測供試品用不含血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋范圍可根據(jù)VP調(diào)整， 稀釋倍數(shù)最大不超過10倍。可參照表2操作，接種的樣品之間稀釋倍數(shù)以2倍為宜。
[0058] 表2 TCIDm操作表
[0059] CN 105177176 A 說明書 4/8 頁
[0060]
[0061] 5.接種供試品
[0062] 培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸出各孔中的培養(yǎng)基吸出棄去（注意不要攪擾孔內(nèi)已 貼壁的細(xì)胞），向個孔內(nèi)加入最后8個稀釋度供試品，200 μ L/孔，每個稀釋度接種10個平 行孔，第一列及第十二列的8個孔接種DMEM培養(yǎng)液，37°C，5 % C02培養(yǎng)箱溫育60分鐘。
[0063] 表3 TCID5Q96孔板加樣操作表
[0065] 6. i首養(yǎng)
[0066] 60分鐘后，小心吸出各孔培養(yǎng)液，加入200 μ L維持培養(yǎng)液，操作時從低濃度孔向 高濃度孔操作，并且每個稀釋度均需更換槍頭，37°C，5% C02培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)10天。