專(zhuān)利名稱(chēng)：：用附著或非附著鳥(niǎo)細(xì)胞系生產(chǎn)痘病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用鳥(niǎo)細(xì)胞系尤其是鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)活的或減毒痘病毒的方法，尤其是牛痘病毒，天然的或修飾的，該方法包括用病毒顆粒感染所述細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：在歷史上，已知牛痘病毒被成功用于免疫對(duì)抗天花，根據(jù)WHO在1980年將其滅絕。從那時(shí)起，已經(jīng)暫停牛痘接種。目前，認(rèn)為該病毒的復(fù)活是潛在的威脅，對(duì)于未受保護(hù)的人群是毀滅性的。問(wèn)題是在USA僅有1.5億劑量天花疫苗可獲得，F(xiàn)DA已經(jīng)作出方針并簽定合同來(lái)生產(chǎn)大量對(duì)抗天花的疫苗單元藥劑。更多信息在http//www.bt.cdc.gov/Agent/Smallpox/SmallpoxConsensus.pdf.可獲得。然而，加快生產(chǎn)需要新的生產(chǎn)方法和合適的細(xì)胞系。本發(fā)明中，我們描述了來(lái)自鳥(niǎo)物種的新細(xì)胞系(附著或非附著的)，可以用作醫(yī)藥公司生產(chǎn)疫苗的基質(zhì)。這些新的細(xì)胞源自鳥(niǎo)胚胎，并可以替換目前所用的蛋或原代胚胎成纖維細(xì)胞。傳統(tǒng)上，通過(guò)使用減弱或滅活形式的傳染劑，疫苗誘導(dǎo)對(duì)疾病的免疫性。目前減毒的痘病毒特征如在人細(xì)胞中不存在復(fù)制和免疫響應(yīng)的良好誘導(dǎo)，使得使用例如MVA(修飾的病毒安卡拉)作為載體的新疫苗策略得到發(fā)展。MVA是牛痘病毒(VV)的高度減毒株，最初在該疾病滅絕之前作為天花的安全疫苗來(lái)開(kāi)發(fā)。MVA源自Ankara株，通過(guò)原代雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)超過(guò)570連續(xù)傳代，且作為該適應(yīng)的結(jié)果，和親本株相比較，含有幾個(gè)大的基因組缺失。MVA在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中不再?gòu)?fù)制且在動(dòng)物中是非致病性的。更重要地，當(dāng)MVA作為天花疫苗對(duì)多于100,000人包括免疫降低的個(gè)體給藥時(shí)，沒(méi)有報(bào)道過(guò)嚴(yán)重并發(fā)癥。通過(guò)分子生物學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，可以獲得含有編碼所關(guān)心治療的特定肽或蛋白質(zhì)的外源DNA的重組MVA。這些重組病毒注射后，在體內(nèi)能夠刺激免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗特定抗原如腫瘤抗原。目前，發(fā)展了這些疫苗載體的新世代，或可以發(fā)展來(lái)對(duì)抗人或動(dòng)物的傳染病和對(duì)抗各種腫瘤類(lèi)型(黑素瘤、前列腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、肝癌……)。DrexlerI等(1998J.GenVirol.79347-352)已經(jīng)觀察到高度減毒的修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)在幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(病毒繁殖的潛在宿主)中復(fù)制，但在各種人轉(zhuǎn)化的和原代細(xì)胞中沒(méi)有復(fù)制；因此，MVA的宿主范圍受到限制。此外，該高度減毒的痘病毒株沒(méi)有產(chǎn)生生產(chǎn)性的感染(MossB，DevBiolStand199455-63)。例如，BlanchardTJ等(1998J.Gen.Virol.791159-1167)已經(jīng)報(bào)道了修飾的牛痘病毒安卡拉在人細(xì)胞中進(jìn)行有限的復(fù)制并缺少幾個(gè)免疫調(diào)節(jié)蛋白。此外，產(chǎn)量必須與天花疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)能力相適應(yīng)。MVA強(qiáng)有力的安全記錄以及在接種個(gè)體中引起的有效細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)在MVA用作重組載體來(lái)免疫對(duì)抗人和動(dòng)物傳染病中已經(jīng)產(chǎn)生了相當(dāng)大的科學(xué)和工業(yè)興趣，尤其是對(duì)抗HIV和癌癥。假設(shè)MVA適應(yīng)CEF，則可以在在這樣的細(xì)胞中生長(zhǎng)成高滴定度，且目前的臨床批量重組MVA疫苗候選者是在原代CEF上生產(chǎn)的。然而，CEF的建立需要制備原代組織培養(yǎng)物的經(jīng)驗(yàn)并依賴(lài)保持于特定無(wú)病原體條件下的雞的雞蛋。此外，生產(chǎn)方法是工作量巨大的且難以標(biāo)準(zhǔn)化，由于原代細(xì)胞僅存活有限的代數(shù)一些傳代并因此連續(xù)從胚胎化的蛋制得。雖然疫苗生產(chǎn)者可以解決生產(chǎn)用于I期和II期臨床試驗(yàn)的批量MVA原料這樣的局限性，按比例擴(kuò)大用于III期臨床試驗(yàn)的基于CEF的生產(chǎn)方法和最終用于后期產(chǎn)品商業(yè)化仍然存在嚴(yán)重的障礙。本發(fā)明解決的問(wèn)題是提供用于復(fù)制牛痘病毒的細(xì)胞系，其避免了上述問(wèn)題且其可以滿(mǎn)足管理機(jī)構(gòu)的需要。這就是本發(fā)明的目的。理想地，這樣的細(xì)胞系是完全管理順從的；全部用已知的歷史來(lái)表征細(xì)胞。此外，細(xì)胞系是非致瘤的，遺傳未改變的，且在長(zhǎng)期培養(yǎng)中是穩(wěn)定的。細(xì)胞系能夠復(fù)制病毒并適于在無(wú)血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定附著和懸浮生長(zhǎng)。在這點(diǎn)上，發(fā)明者研究了用于復(fù)制病毒用途的鳥(niǎo)細(xì)胞。本發(fā)明報(bào)道了建立的新的鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞，其詳述于我們的共同未決申請(qǐng)PCT/FR03/00735(WO03/076601)中，對(duì)于復(fù)制痘病毒特別穩(wěn)定，尤其是正痘病毒如牛痘病毒。因?yàn)橐呙绱笠?guī)模生產(chǎn)的過(guò)程需要無(wú)限的細(xì)胞增殖，發(fā)明者選定檢測(cè)鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞復(fù)制病毒的能力。然而，為了將鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞在體外維持長(zhǎng)的時(shí)間段，需要觀察特定培養(yǎng)和維持條件，如Pain等(1996，Development1222339-2348)；US6,114,168和EP787180中所述的，且這些培養(yǎng)條件是高成本的。問(wèn)題是能夠在經(jīng)濟(jì)培養(yǎng)基中維持鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞的培養(yǎng)而避免障礙如細(xì)胞分化和衰老。本發(fā)明的內(nèi)容中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子、血清和/或滋養(yǎng)層的撤除導(dǎo)致鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞群的分離，該細(xì)胞可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限生長(zhǎng)。此外，除了大部分是非附著細(xì)胞的造血干細(xì)胞，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得的細(xì)胞呈現(xiàn)表型。然而，對(duì)于病毒疫苗的工業(yè)生產(chǎn)，非附著細(xì)胞是優(yōu)選的。該表型是有利的，因?yàn)槠浼热菀滋幚?，避免了使用用于分離的蛋白水解酶，又因?yàn)橥ㄟ^(guò)非粘著細(xì)胞的體外培養(yǎng)而獲得高細(xì)胞密度。本發(fā)明描述了鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞的生產(chǎn)，其變成自發(fā)地非附著的或通過(guò)撤出滋養(yǎng)層而獲得非附著性。由于懸浮生長(zhǎng)，這些細(xì)胞系完全適于生物反應(yīng)器中疫苗的工業(yè)生產(chǎn)。除了它們?cè)诨A(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系可以復(fù)制特定病毒，產(chǎn)量等于或甚至高于現(xiàn)有方法獲得的產(chǎn)量，其使得這些細(xì)胞系尤其適于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容因此，第一方面，本發(fā)明涉及在鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞中復(fù)制病毒的方法，更具體地為牛痘病毒，如天然或重組牛痘病毒。本發(fā)明的方法包括步驟將病毒顆粒接種到所述鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞，在無(wú)生長(zhǎng)因子、滋養(yǎng)細(xì)胞和/或動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。本發(fā)明鳥(niǎo)干細(xì)胞的接種用0.001至0.5的m.o.i.(多次感染)來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選實(shí)施方案中為0.01至0.5，最優(yōu)選實(shí)施方案中為0.01至0.1。該方法用于生產(chǎn)疫苗，尤其是對(duì)抗痘病毒科的疫苗，特別是抗天花的疫苗。所述鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞系是通過(guò)以下方法可獲得的，該方法包括a)在含有使其生長(zhǎng)的所有因子和滋養(yǎng)層，優(yōu)選滅活的，以及補(bǔ)體失活的血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)鳥(niǎo)細(xì)胞，優(yōu)選鳥(niǎo)胚胎的；b)通過(guò)改變培養(yǎng)基來(lái)傳代，以致獲得所述因子、血清和/或滋養(yǎng)層漸進(jìn)性的或完全的清除，c)建立能夠在不存在外源生長(zhǎng)因子，和/或滅活滋養(yǎng)層和/或低含量血清或無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繁殖的附著或非附著的鳥(niǎo)細(xì)胞系；結(jié)果，步驟c)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基仍然含有低含量血清(即，約2％或更少)，所述方法可以任選的包括另外的步驟d)用選自以下的培養(yǎng)基改變不再含有外源生長(zhǎng)因子、不再含有滅活滋養(yǎng)層和低含量血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，-補(bǔ)充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)并用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)缓笈囵B(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)中連續(xù)傳代的所述鳥(niǎo)細(xì)胞，其中無(wú)血清培養(yǎng)基的比例逐漸提高直到所述不含有外源生長(zhǎng)因子、不含有滅活滋養(yǎng)層和低含量血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全消失；-補(bǔ)充血清的無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)(ii)，然后培養(yǎng)在所述培養(yǎng)基(ii)中的連續(xù)傳代過(guò)程中的所述鳥(niǎo)細(xì)胞，其中血清的比例逐漸降低至獲得無(wú)血清培養(yǎng)基；-無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)(iii)，然后在培養(yǎng)基(iii)中培養(yǎng)所述鳥(niǎo)細(xì)胞；然后在將適應(yīng)培養(yǎng)基改變的所述鳥(niǎo)細(xì)胞維持于無(wú)血清培養(yǎng)基中。如在此所用的術(shù)語(yǔ)《鳥(niǎo)》指的是生物分類(lèi)學(xué)《ava》分類(lèi)的任何種、亞種或?qū)?，如但不限于，這樣的生物如雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀類(lèi)、鷹、烏鴉、鴕鳥(niǎo)、鴯鹋和食火雞。術(shù)語(yǔ)包括原雞(gallusgallus)的各種株，或雞(例如白來(lái)杭雞(WhiteLeghorn)、米奴加雞(BrownLeghorn)、BarredRock、Sussex、NewHampshire、RhodeIsland、Ausstralorp、Minorca、Amrox、CaliforniaCray、ItalianPartidge-colored)，以及火雞、雉、鵪鶉、鴨、鴕鳥(niǎo)和其它常規(guī)喂養(yǎng)家禽的株。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的鳥(niǎo)細(xì)胞是雞細(xì)胞。如在此所用的術(shù)語(yǔ)“使其生長(zhǎng)的因子”意思是鳥(niǎo)細(xì)胞在培養(yǎng)物中存活和生長(zhǎng)必需的生長(zhǎng)因子。根據(jù)本發(fā)明，生長(zhǎng)因子包括營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子。營(yíng)養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。細(xì)胞因子主要是通過(guò)與gp130蛋白質(zhì)相關(guān)的受體而作用的細(xì)胞因子，如LIF、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素6受體、CNTF、制瘤素和促心激素(cardiotrophin)。步驟a)的鳥(niǎo)細(xì)胞選自鳥(niǎo)胚胎細(xì)胞，更優(yōu)選選自鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞和鳥(niǎo)原代細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是從分離的X期胎盤(pán)細(xì)胞的懸浮群分離的全能性或多能性鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞，胎盤(pán)細(xì)胞是從鳥(niǎo)胚胎獲得的，更優(yōu)選為雞胚胎(參見(jiàn)EYAL-GILADI’sclassificationEYAL-GILADI和KOCHAN，1976，《Fromcleavagetoprimitivestreackformationacomplementarynormaltableandanewlookatthefirststagesofthedevelopmentinthechick》.“GeneralMorphology”Dev.Biol.49321-337)。鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞的特征是在39℃培養(yǎng)時(shí)包括48至72小時(shí)的慢的倍增時(shí)間來(lái)表征這些。為了獲得漸進(jìn)性的或完全的生長(zhǎng)因子、血清和/或滋養(yǎng)層的清除，可以同時(shí)、連續(xù)或分開(kāi)進(jìn)行本發(fā)明方法步驟b)中的培養(yǎng)基改變。培養(yǎng)基清除的次序可以選自-滋養(yǎng)層/血清/生長(zhǎng)因子；-滋養(yǎng)層/生長(zhǎng)因子/血清；-血清/生長(zhǎng)因子/滋養(yǎng)層；-血清/滋養(yǎng)層/生長(zhǎng)因子；-生長(zhǎng)因子/血清/滋養(yǎng)層；-生長(zhǎng)因子/滋養(yǎng)層/血清；優(yōu)選實(shí)施方案中，清除的次序是生長(zhǎng)因子/滋養(yǎng)層/血清。特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細(xì)胞系是附著干細(xì)胞，其在不存在滅活滋養(yǎng)層下增殖。在這點(diǎn)上，上述方法中，步驟b)包括培養(yǎng)基成分的清除(生長(zhǎng)因子單獨(dú)或血清單獨(dú)或生長(zhǎng)因子然后血清或血清然后生長(zhǎng)因子)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細(xì)胞系是非附著干細(xì)胞，其在無(wú)外源生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中懸浮增殖。在這點(diǎn)上，上述方法中，步驟b)包括滋養(yǎng)層漸進(jìn)性的或全部的清除和然后任選的培養(yǎng)基其它成分(生長(zhǎng)因子和血清)的清除。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中建立的細(xì)胞系是非附著干細(xì)胞，其在沒(méi)有血清的培養(yǎng)基(無(wú)血清培養(yǎng)基)中懸浮增殖。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細(xì)胞系是非附著干細(xì)胞，其在無(wú)外源生長(zhǎng)因子和血清的培養(yǎng)基中懸浮增殖。另一可替換的方案中，步驟b)包括生長(zhǎng)因子漸進(jìn)性的或完全的清除之后，任選的為血清漸進(jìn)性的清除。另一可替換的方案中，步驟b)包括生長(zhǎng)因子和/或血清漸進(jìn)性的或完全的清除之后，任選的為滋養(yǎng)層的清除。此外，建立的細(xì)胞系是在血清耗盡的培養(yǎng)基中尤其在無(wú)血清培養(yǎng)基中增殖的細(xì)胞。表述血清耗盡理解為意思是血清濃度隨著時(shí)間逐漸降低。該方法使得可以選擇克隆，該克隆適于這些新的，愈加劇烈的條件直至獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，其能夠在血清耗盡的培養(yǎng)基中或完全無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。更準(zhǔn)確地，方法的步驟a)包括在完全培養(yǎng)基中的約7×104/cm2至8×104/cm2鳥(niǎo)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。優(yōu)選，用約7.3×104/cm2(4×106細(xì)胞/55cm2或4×106細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿)來(lái)接種?！巴耆囵B(yǎng)基”，意思是補(bǔ)充生長(zhǎng)因子和動(dòng)物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基的實(shí)例描述于Pain等(1996，Development1222339-2348)，EP787,180和US6,114,168、US5,340,740、US6,656,479和US5,830,510中。根據(jù)本發(fā)明，“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”意思是有傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方的培養(yǎng)基，其自身至少使細(xì)胞存活，甚至更好，使細(xì)胞生長(zhǎng)?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例是BME(基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)、MEM(最小Eagle培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基199、DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-F10、Iscove’s改良Dulbecco’s培養(yǎng)基、MacCoy’s5A培養(yǎng)基、RPMI1640。基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4，……)、氨基酸、維生素(硫胺素、核黃素、葉酸、D-泛酸鈣，……)和其它成分如葡萄糖、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉?？梢允疽獾貐^(qū)分兩類(lèi)生長(zhǎng)因子細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子。細(xì)胞因子主要是通過(guò)與gp130蛋白相關(guān)的受體而作用的細(xì)胞因子。因此，LIF、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素6受體、CNTF、制瘤素和促心激素具有相似的作用模式，在特定鏈?zhǔn)荏w的水平募集，后者與單體或有時(shí)雜二聚形式的gp130蛋白結(jié)合。營(yíng)養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。更優(yōu)選，完全培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，任選的白細(xì)胞介素11(IL-11)和動(dòng)物血清。步驟a)的鳥(niǎo)細(xì)胞，優(yōu)選鳥(niǎo)胚胎細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中的幾次傳代過(guò)程中培養(yǎng)。培養(yǎng)基補(bǔ)充至少一種選自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、IL-11、制瘤素或促心激素的生長(zhǎng)因子。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，完全培養(yǎng)基是補(bǔ)充IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、任選的IL-11的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基中含有的生長(zhǎng)因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、任選的IL-11的濃度約為0.01至10ng/ml，優(yōu)選0.1至5ng/ml，更優(yōu)選約為1ng/ml。約傳代3至10次后，清除完全培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子(步驟b)。優(yōu)選，對(duì)于每種生長(zhǎng)因子，從一個(gè)傳代至另一個(gè)傳代，在一個(gè)步驟中直接進(jìn)行清除。或者，逐漸進(jìn)行生長(zhǎng)因子的清除，通過(guò)漸進(jìn)性降低完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子的濃度。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行至少兩種生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子清除。優(yōu)選的實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子的清除是以?xún)奢喦宄M(jìn)行的首先，直接從完全培養(yǎng)基中除去SCF、IL6、IL6R，任選的IL11；然后在含有IGF1和CNTF，任選的IL-11并補(bǔ)充動(dòng)物血清的完全培養(yǎng)基中維持鳥(niǎo)細(xì)胞培養(yǎng)至少一個(gè)傳代。其次，從培養(yǎng)基中直接除去IGF1和CNTF，任選的IL11，其最終含有僅補(bǔ)充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通常，在約傳代20至30次時(shí)全部清除生長(zhǎng)因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，在生長(zhǎng)因子去除后進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞的去除。滋養(yǎng)細(xì)胞的去除是漸進(jìn)性的并進(jìn)行數(shù)個(gè)傳代。現(xiàn)在以低于步驟a)的濃度將鳥(niǎo)細(xì)胞接種于燒瓶中，約4×104細(xì)胞/cm2至5×104細(xì)胞/cm2。以約4.2×104細(xì)胞/cm2將滋養(yǎng)細(xì)胞接種于瓶中。瓶中滋養(yǎng)細(xì)胞的濃度逐漸降低。實(shí)際上，相同濃度的滋養(yǎng)細(xì)胞用于2至4次傳代，然后較低濃度的滋養(yǎng)細(xì)胞用于另外的2至4次傳代，同樣繼續(xù)。然后，瓶接種約4.2×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約2.2×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約1.8×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約1.4×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約1.1×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約0.9×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后約0.5×104滋養(yǎng)細(xì)胞/cm2。然后燒瓶接種6.5×104鳥(niǎo)細(xì)胞/cm2至7.5×104鳥(niǎo)細(xì)胞/cm2且無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞。假定中，鳥(niǎo)細(xì)胞隨著燒瓶中滋養(yǎng)細(xì)胞濃度的降低沒(méi)有良好的形狀，然后在繼續(xù)滋養(yǎng)細(xì)胞清除之前用相同的滋養(yǎng)細(xì)胞濃度培養(yǎng)鳥(niǎo)細(xì)胞額外的代數(shù)。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在生長(zhǎng)因子和滋養(yǎng)細(xì)胞清除后進(jìn)行血清清除。通過(guò)選自以下的培養(yǎng)基來(lái)改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基-補(bǔ)充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)并用新的無(wú)血清培養(yǎng)基(ii)稀釋。然后鳥(niǎo)細(xì)胞培養(yǎng)基(i)中通過(guò)連續(xù)傳代來(lái)培養(yǎng)，其中無(wú)血清培養(yǎng)基的比例逐漸提高至補(bǔ)充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全消失(漸進(jìn)性稀釋)。-補(bǔ)充血清的新的無(wú)血清培養(yǎng)基(ii)。然后在培養(yǎng)基(ii)中通過(guò)連續(xù)傳代來(lái)培養(yǎng)鳥(niǎo)細(xì)胞，其中血清比例逐漸降低至獲得無(wú)血清培養(yǎng)基(漸進(jìn)性隔絕排除)。-沒(méi)有補(bǔ)充血清的新的無(wú)血清培養(yǎng)基(ii)。然后將鳥(niǎo)細(xì)胞直接在無(wú)血清培養(yǎng)基(ii)中培養(yǎng)(直接排除)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)漸進(jìn)性排除除去血清。第一個(gè)實(shí)施方案中，血清清除的方法(themethodofserumdeprivationproce)根據(jù)本發(fā)明，“無(wú)血清培養(yǎng)基”(SEM)意思是立即使用的細(xì)胞培養(yǎng)基，即不需要添加血清使細(xì)胞存活和細(xì)胞生長(zhǎng)。該培養(yǎng)基沒(méi)有必需的化學(xué)限定，可以含有各種來(lái)源的水解物，例如來(lái)自植物。優(yōu)選，所述SFM是“非動(dòng)物來(lái)源”限定的，即不含有動(dòng)物或人來(lái)源的成分(FAO狀態(tài)“無(wú)動(dòng)物來(lái)源”)。SFM中，由重組蛋白替代天然血清蛋白?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的SFM培養(yǎng)基不含有蛋白質(zhì)(PF培養(yǎng)基“無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基”)和/或化學(xué)限定的(CDM培養(yǎng)基“化學(xué)限定培養(yǎng)基”)。SFM培養(yǎng)基存在數(shù)個(gè)優(yōu)勢(shì)(i)首先，這樣的培養(yǎng)基是管理順應(yīng)性的(實(shí)際上，沒(méi)有偶發(fā)物質(zhì)如BSE、病毒污染的風(fēng)險(xiǎn))；(ii)純化過(guò)程的最佳化；(iii)由于更好限定的培養(yǎng)基，過(guò)程中更好的再現(xiàn)性。可購(gòu)得的SFM培養(yǎng)基實(shí)例是VPSFM(InVitrogen參考11681-020，2003目錄)，OptiPro((InVitrogen參考12309-019，2003目錄)，Episerf(InVitrogen參考10732-022，2003目錄)，Pro293S-CDM(Cambrex參考12765Q，2003目錄)，LC17(Cambrex參考BESP302Q)，ProCHO5-CDM(Cambrex參考12-766Q，2003目錄)，HyQSFM4CHO(Hyclone參考SH30515-02)，HyQSFM4CHO-Utility(Hyclone參考SH30516.02)，HyQPF293(Hyclone參考SH30356.02)，HyQPFVero(Hyclone參考SH30352.02)，Ex細(xì)胞293培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14570-1000M)，Excell325PFCHO無(wú)蛋白培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14335-1000M)，Ex細(xì)胞VPRO培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14560-1000M)，Ex細(xì)胞302無(wú)血清培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14312-1000M)。本發(fā)明還涉及獲得鳥(niǎo)細(xì)胞系的方法，優(yōu)選非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；那些細(xì)胞系在任選的含有滋養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述方法包括步驟-在完全培養(yǎng)基和任選的用滋養(yǎng)層培養(yǎng)鳥(niǎo)細(xì)胞，優(yōu)選非轉(zhuǎn)化的。鳥(niǎo)細(xì)胞可以是上述步驟a)中的鳥(niǎo)細(xì)胞，本發(fā)明方法建立的鳥(niǎo)細(xì)胞系，如EB1、EB14或S86N45(也稱(chēng)為EB45)，或其它鳥(niǎo)源自胚胎的細(xì)胞系如DF1(US5,672,485和US6,207,415)；-通過(guò)改變或變化培養(yǎng)基至少培養(yǎng)一個(gè)傳代，為了獲得血清的完全清除，通過(guò)漸進(jìn)性的或直接清除血清。-建立能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的附著或非附著鳥(niǎo)細(xì)胞系。本發(fā)明依賴(lài)于這樣的發(fā)現(xiàn)通過(guò)從基礎(chǔ)培養(yǎng)基中簡(jiǎn)單除去血清不能進(jìn)行從補(bǔ)充動(dòng)物血清的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基到無(wú)血清培養(yǎng)基的傳代，而是需要改變培養(yǎng)基的類(lèi)型，應(yīng)該是無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)。此外，當(dāng)鳥(niǎo)細(xì)胞系生長(zhǎng)需要生長(zhǎng)因子或滋養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選在清除生長(zhǎng)因子和/或滋養(yǎng)細(xì)胞后清除血清。滋養(yǎng)細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，其優(yōu)選通過(guò)照射或用絲裂霉素化學(xué)處理而滅活的。可以在遺傳上修飾滋養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)生長(zhǎng)因子如SCF。優(yōu)選，滋養(yǎng)細(xì)胞是小鼠成纖維細(xì)胞系如STO(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCCN°CRL-1503)。上述方法可以另外包括步驟，其中步驟c)中獲得的細(xì)胞接受大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)基的選擇或適應(yīng)，以致獲得適于確定用于人類(lèi)或動(dòng)物治療的疫苗生產(chǎn)的克隆。該方法導(dǎo)致新的鳥(niǎo)源自胚胎的細(xì)胞系的建立，其維持體外培養(yǎng)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。有利地，源自步驟c)中所獲得細(xì)胞系的細(xì)胞能夠增殖至少50天、100天、150天、300天或優(yōu)選至少600天。600天不構(gòu)成時(shí)間限制，因?yàn)楦L(zhǎng)時(shí)間段后獲得的細(xì)胞系仍然是活的。因此，認(rèn)為這些細(xì)胞系能夠在無(wú)外源生長(zhǎng)因子、血清和/或滅活滋養(yǎng)層的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限生長(zhǎng)。表述“細(xì)胞系”理解為意思是能夠在體外培養(yǎng)中無(wú)限增殖而保持或多或少相同程度形態(tài)學(xué)和表型特征的任何細(xì)胞群。當(dāng)然，上述方法可以獲得源自建立細(xì)胞系所獲得細(xì)胞的細(xì)胞克隆。這些克隆在遺傳上與通過(guò)分裂衍生的細(xì)胞是相同的。建立的細(xì)胞系和源自其(步驟c或d)的細(xì)胞優(yōu)選是源自胚胎的鳥(niǎo)干細(xì)胞系，更確切地那些細(xì)胞是多能性的鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明方法可獲得的鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞是小的、圓的、單個(gè)的細(xì)胞，在39℃具有約24小時(shí)或更短的倍增時(shí)間。通過(guò)本發(fā)明方法可獲得的細(xì)胞至少是傳代p60的、至少p70、至少p80、至少p90、至少p100、至少p110、至少p120或至少p1300或更后的。根據(jù)本發(fā)明的鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞具有至少一個(gè)以下特征-高的核-細(xì)胞質(zhì)比例，-內(nèi)源堿性磷酸酶活性，-內(nèi)源端粒酶活性，-與選自抗體SSEA-1(TEC01)、SSEA-3或EMA-1的特異性抗體的反應(yīng)性。-短于本發(fā)明方法步驟a)鳥(niǎo)細(xì)胞倍增時(shí)間(39℃48至72h)的倍增時(shí)間，相同培養(yǎng)條件下約24小時(shí)或更短。-這些細(xì)胞系和源自其的細(xì)胞能夠在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖至少50天、100天、150天、300天，或優(yōu)選至少600天，尤其是在補(bǔ)充各種本領(lǐng)域技術(shù)人員常用添加劑的培養(yǎng)基中如DMEM、GMEM、HamF12或McCoy。添加劑中，包括非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉。然而，細(xì)胞能夠在無(wú)谷氨酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖。-這些細(xì)胞系和源自其的細(xì)胞具有作為附著細(xì)胞或作為懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的特征。優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)胞系具有全部上述特征。本發(fā)明建立的鳥(niǎo)細(xì)胞系和源自其的細(xì)胞用于生物制劑如重組肽和蛋白質(zhì)(即，抗體、激素、細(xì)胞因子，……)、病毒、病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗的生產(chǎn)。更確切地，本發(fā)明建立的鳥(niǎo)細(xì)胞系和源自其的細(xì)胞用于病毒和/或相關(guān)載體和顆粒的復(fù)制，用于生產(chǎn)活的或減毒的、重組的或未重組的、對(duì)抗疾病如癌癥和傳染病的疫苗。病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗優(yōu)選選自腺病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、痘病毒、呼腸孤病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗屬于痘病毒科，更優(yōu)選屬于脊索痘病毒科(chordopoxviridae)。更優(yōu)選，病毒或相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗是禽痘病毒，選自雞痘病毒、金絲雀痘病毒(即ALVAC)、燈芯草雀痘病毒、八哥痘病毒(mynahpoxvirus)、鴿子痘病毒、鸚鵡痘病毒(psittacinepoxvirus)、鵪鶉痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒、火雞痘病毒。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，病毒是牛痘病毒。另一實(shí)施方案中，病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于正粘病毒科，尤其是流行性感冒病毒，和屬于副粘病毒族，尤其是麻疹病毒、腮腺炎病毒和風(fēng)疹病毒。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明建立的鳥(niǎo)細(xì)胞系中表達(dá)和/或產(chǎn)生的生物制劑，尤其是蛋白質(zhì)和疫苗。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明建立的附著或非附著鳥(niǎo)干細(xì)胞系的用途，該細(xì)胞系是遺傳、生物或化學(xué)未修飾的，能夠在培養(yǎng)物中無(wú)限增殖，并具有上述特征，用于復(fù)制活的或減毒的正痘病毒科的病毒，更特別的是的或減毒的牛痘病毒或重組牛痘病毒。本發(fā)明的目的在于用如上所限定的附著或非附著細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)活的或減毒疫苗的用途，包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法在步驟c)或d)中建立的附著或非附著細(xì)胞系，將病毒顆粒接種所述細(xì)胞，并在上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒顆粒。本發(fā)明對(duì)于生產(chǎn)屬于正痘病毒科的減毒病毒尤其有用，尤其是牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修飾的牛痘病毒如可以從ATCC(ATCC編號(hào)VR-1508)獲得的修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(Tartaglia等，1992Virology188217-232)，LC16m8(SugimotoetYamanouchi1994Vaccine12675-681)，CV178(Kempe等，1968Pediatrics42980-985)和其它重組病毒。有利地，感染源自建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，以生產(chǎn)活的牛痘病毒或減毒病毒，其是修飾的牛痘病毒和/或重組牛痘?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何技術(shù)感染所述細(xì)胞。或者，轉(zhuǎn)染或修飾源自建立細(xì)胞系的細(xì)胞，以生產(chǎn)活的牛痘病毒或減毒病毒，其是修飾的牛痘病毒和/或重組牛痘。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何技術(shù)來(lái)修飾所述細(xì)胞，尤其是通過(guò)非同源的或同源的，直接和/或條件重組(Cre-Lox或FLP-FRT系統(tǒng))，通過(guò)任何載體、質(zhì)粒、病毒或重組病毒尤其是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒幫助的來(lái)轉(zhuǎn)化。一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)活的或減毒疫苗的方法如抗天花的疫苗，包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法的步驟c)或d)中建立的附著或非附著細(xì)胞系，將病毒顆粒接種所述細(xì)胞，并在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒顆粒。本發(fā)明對(duì)于生產(chǎn)屬于痘病毒科的減毒病毒特別有用，尤其是牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修飾的牛痘病毒如可以從ATCC(ATCC編號(hào)VR-1508)獲得的修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(Tartaglia等，1992Virology188217-232)，LC16m8(SugimotoetYamanouchi1994Vaccine12675-681)，CV178(Kempe等，1968Pediatrics42980-985)和其它重組牛痘病毒。例如，可以使用MVA如抗天花的疫苗。第二個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)活的或減毒疫苗的方法，如抗疾病的疫苗，更優(yōu)選后天的或傳染病，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法的步驟c)或d)中建立的附著或非附著細(xì)胞系，將病毒重組顆粒接種所述細(xì)胞，并在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒重組顆粒。例如，可以使用重組MVA來(lái)表達(dá)對(duì)抗以下疾病的抗原-后天性疾病，如但無(wú)限制，前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳癌、黑素瘤；-傳染病，如但無(wú)限制，AIDS(HIV病毒)、甲肝、乙肝、丙肝、瘧疾、狂犬病、黃熱病、日本腦炎、腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹。通過(guò)上述方法生產(chǎn)的疫苗是本發(fā)明的一部分。對(duì)于說(shuō)明書(shū)的剩余部分，將參考以下的圖例。圖1本發(fā)明一細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線，顯示細(xì)胞的長(zhǎng)期復(fù)制。圖2S86N45(EB45)(附著)和EB14(懸浮)細(xì)胞的群倍增時(shí)間。圖3溫度對(duì)S86N45(EB45)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響。圖4本發(fā)明一細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線，顯示細(xì)胞隨著血清清除(達(dá)2％血清)的長(zhǎng)期復(fù)制。圖5S86N45(EB45)和EB14細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中生長(zhǎng)的適應(yīng)。圖6EB14懸浮細(xì)胞在2L生物反應(yīng)器中無(wú)血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。圖7本發(fā)明一細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線(S86N16)，顯示細(xì)胞隨著滋養(yǎng)層撤除的長(zhǎng)期復(fù)制。圖8顯示鳥(niǎo)干細(xì)胞形態(tài)特征的照片。N核，n核仁，C細(xì)胞質(zhì)(分離的S86N99，40倍放大，用SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī)拍攝)圖9顯示附著或懸浮鳥(niǎo)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的照片。固定后(0.1％甲醛/0.5％戊二醛，4℃30分鐘)，將細(xì)胞在1×PBS中漂洗兩次，并在NBT/BCIP溶液中(硝基藍(lán)四唑氯0.375mg/ml，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽0.188mg/ml，0.1MTrispH9.5，0.05MMgCl2，0.1MNaCl)37℃孵育10至30分鐘。通過(guò)兩次1×PBS洗滌來(lái)停止反應(yīng)，并拍攝照片。A-說(shuō)明了在無(wú)滋養(yǎng)層或因子的條件下培養(yǎng)的附著細(xì)胞系S86N45p87獲得的內(nèi)源堿性磷酸酶的特征性紫羅蘭染色，(40倍放大，SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī))。B-說(shuō)明了從8次傳代維持懸浮的EB14細(xì)胞系獲得的內(nèi)源堿性磷酸酶的特征性紫羅蘭染色，該細(xì)胞系源自S86N45細(xì)胞，在無(wú)滋養(yǎng)層或因子的條件下懸浮培養(yǎng)(20倍放大，SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī))。C-S86N45(EB45)細(xì)胞特異性標(biāo)記。圖10CEF和附著S86N45(EB45)細(xì)胞的病毒敏感性(感染后72小時(shí)-MOI0.1)。圖11CEF和附著S86N45(EB45)細(xì)胞在各種多次感染(MOI)的病毒敏感性(感染后48小時(shí))圖12附著S86N45(EB45)細(xì)胞上MVA-GFP的增殖動(dòng)力學(xué)。圖13懸浮EB14細(xì)胞上MVA-GFP的增殖動(dòng)力學(xué)。圖14DMEM-F12培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的S86N45(EB45)細(xì)胞上MVA-GFP復(fù)制。圖15DMEM-F12培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的S86N45(EB45)細(xì)胞上野生型MVA病毒的復(fù)制(MOI0.1)圖16含有血清培養(yǎng)上懸浮EB14細(xì)胞上的MVA復(fù)制(MOI0.2)圖17無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細(xì)胞上的MVA復(fù)制(MOI0.01)圖18無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細(xì)胞上的MVA產(chǎn)量(MOI0.01)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1附著細(xì)胞的產(chǎn)生和建立打開(kāi)蛋，在打開(kāi)過(guò)程中從蛋白中分離出蛋黃。直接或借助Pasteur移液管，或借助小的吸附濾紙(Whatmann3M紙)從蛋黃中取出胚胎，紙片預(yù)先用打孔機(jī)裁出穿孔環(huán)的形式。孔的直徑約為5mm。將這些小環(huán)在烤爐中使用干熱滅菌約30分鐘。將這小紙環(huán)放置于蛋黃表面，并居中于胚胎上，因此使紙環(huán)圍繞胚胎。然后用小剪刀剪裁后者，并整個(gè)取出放置于裝滿(mǎn)PBS或生理鹽水的培養(yǎng)皿中。因此清洗掉環(huán)帶出胚胎的介質(zhì)中過(guò)多的蛋黃和胎盤(pán)，因此用Pasteur移液管收集無(wú)過(guò)量的卵黃磷蛋白。兩種情況中，將胚胎放置于含有生理介質(zhì)(1×PBS，Tris葡萄糖、培養(yǎng)基等等)的管中。然后將胚胎機(jī)械分離并接種于“滋養(yǎng)”放入限定的培養(yǎng)基中。用于培養(yǎng)的優(yōu)選條件中，優(yōu)選將包括MacCoy或DF12的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充初始濃度12至8％的胎牛血清，1％的非必需氨基酸，1％商業(yè)來(lái)源的維生素混合物，終濃度1mM的丙酮酸鈉，終濃度0.2mM的β-巰基乙醇，終濃度2.9mM的谷氨酰胺，抗生素的初始混合物，含有10ng/ml終濃度的慶大霉素，100U/ml終濃度的青霉素和100μg/ml終濃度的鏈霉素。細(xì)胞頭幾次傳代后不久，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。表述不久理解為意思是通常開(kāi)始3至5次傳代后。還可以加入核苷混合物，該混合物如上制得(Pain等，1996)。在這些相同條件下測(cè)試的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，給予了相似結(jié)果的是HamF12、GlasgowMEM和DMEM培養(yǎng)基，后者補(bǔ)充終濃度8mg/l的生物素。通過(guò)比較，生物素濃度為MacCoy培養(yǎng)基中0.2mg/ml，HamF12中0.0073mg/l，商業(yè)DMEM和GMEM培養(yǎng)基中為0。加入培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子優(yōu)選是重組的因子和細(xì)胞因子，包括終濃度1ng/ml的小鼠SCF，終濃度1至5ng/ml的IGF-1，終濃度1ng/ml的CNTF，終濃度1ng/ml的IL-6，和終濃度0.5ng/ml至1ng/ml的可溶IL-6受體。一些實(shí)驗(yàn)中，可以在頭幾次傳代過(guò)程中加入一些其它因子。例如達(dá)3或10次傳代，可以將終濃度1ng/ml的bFGF和終濃度1ng/ml的IL-11加入培養(yǎng)基中。進(jìn)行該培養(yǎng)基中滅活“滋養(yǎng)層”上的接種，滋養(yǎng)層由建立的小鼠成纖維細(xì)胞系構(gòu)成，如STO細(xì)胞。一些情況中，用簡(jiǎn)單表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，載體可以在STO細(xì)胞中組成型表達(dá)如鳥(niǎo)SCF的生長(zhǎng)因子。因此，該“滋養(yǎng)層”產(chǎn)生了在細(xì)胞膜中可溶和/或附著形式的因子。將細(xì)胞初次直接接種于該培養(yǎng)基后，根據(jù)觀察到的原代細(xì)胞的附著速率，可以加入新鮮培養(yǎng)基或第二天部分改變培養(yǎng)基，然后在隨后的日子中部分或全部改變。根據(jù)情況約4至7后，分離初始培養(yǎng)物并轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)皿中滅活滋養(yǎng)層上的相同初始培養(yǎng)基中。三至五次傳代后，在滅活STO細(xì)胞滋養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞，STO細(xì)胞是非轉(zhuǎn)染的或用編碼抗生素抗性如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素抗性基因等等表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的。約二十次傳代后，將細(xì)胞漸進(jìn)性清除生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。表述“逐漸清除”理解為意思是從培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子接著生長(zhǎng)因子去除，或生長(zhǎng)因子組接著生長(zhǎng)因子組去除。第一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)傳代，首先除去全部SCF，然后在兩個(gè)或三個(gè)傳代后，例如除去另一種生長(zhǎng)因子如IGF-1。如果細(xì)胞沒(méi)有呈現(xiàn)形態(tài)改變或平均增殖速率的改變，然后除去其它因子，如CNTF和IL-6。第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，以生長(zhǎng)因子組接著生長(zhǎng)因子組來(lái)進(jìn)行生長(zhǎng)因子的清除。除去包括SCF、IL6、IL6R和IL11的第一組生長(zhǎng)因子，然后除去包括IGF1和CNTF的第二組。第三個(gè)實(shí)施方案中，該清除還可以是劇烈的。在這種情況中一次除去所有的因子。然后觀察細(xì)胞，如果僅傳代數(shù)天后其增殖速率改變了。較后面的溶液通常是被實(shí)踐過(guò)的。因此獲得各種分離物并維持非常長(zhǎng)的時(shí)間段。表述非常長(zhǎng)的時(shí)間段理解為意思是大約數(shù)周次的時(shí)間段，最小為50天，優(yōu)選長(zhǎng)于200至400天的時(shí)間段，在時(shí)間上無(wú)限制。觀察到長(zhǎng)于600天的時(shí)間段。與所用的支持物無(wú)關(guān)，用蛋白水解分離酶分離所有附著細(xì)胞，如鏈霉蛋白酶、膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等等。優(yōu)選，為了避免任何可能的動(dòng)物來(lái)源的污染，使用細(xì)菌來(lái)源的蛋白水解酶。這些細(xì)胞具有所示特定形態(tài)的胚胎干細(xì)胞的特征，例如，通過(guò)圖8的照片，即大小小、大的核-細(xì)胞質(zhì)比例，具有至少一個(gè)清楚可見(jiàn)核仁的核，和非常小的細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)以或多或少緊密實(shí)體形式物質(zhì)生長(zhǎng)來(lái)表征這些細(xì)胞。附著和非附著細(xì)胞呈現(xiàn)與許多抗體的交叉反應(yīng)性，如上Pain等(1996)以及專(zhuān)利US6,114,168和EP787,180中所述的。還存在內(nèi)源端粒酶活性成份，且是這些細(xì)胞“干”性能中的重要因素。獲得不同的細(xì)胞分離物，并維持長(zhǎng)時(shí)間段。表1說(shuō)明了這些分離物的一些特征。表1注意到術(shù)語(yǔ)“停止”不對(duì)應(yīng)于細(xì)胞增殖的結(jié)束，而是實(shí)驗(yàn)者故意停止細(xì)胞培養(yǎng)物的。世代數(shù)n通過(guò)公式X＝2n獲得或X是理論的細(xì)胞累積數(shù)目。該數(shù)字是可獲得的，因?yàn)槊看蝹鞔兔看谓臃N中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。培養(yǎng)的完整記載因此是可獲得的。S86N45細(xì)胞也稱(chēng)為EB45。實(shí)施例2細(xì)胞的傳代干細(xì)胞尤其是體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的特征之一是它們?cè)隗w外增殖相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間段的能力。為了繁殖和傳代細(xì)胞，在傳代數(shù)小時(shí)之前用新鮮培養(yǎng)基來(lái)改變和替換培養(yǎng)基。圖1中所示的曲線說(shuō)明了細(xì)胞生長(zhǎng)和建立的特征。實(shí)施例3倍增時(shí)間和平均分化時(shí)間3.1用培養(yǎng)中建立的細(xì)胞和之前實(shí)施例中所示的細(xì)胞開(kāi)始，計(jì)算平均分裂時(shí)間。對(duì)于獲得的所有獨(dú)立分離物，在連續(xù)傳代過(guò)程中增殖速率略有提高，因此導(dǎo)致在細(xì)胞建立過(guò)程中的平均分裂時(shí)間改變。附著階段中，最初將細(xì)胞接種于滅活滋養(yǎng)層上并以1至2×106細(xì)胞每100mm培養(yǎng)皿(55cmm2培養(yǎng)皿)的恒定起始接種密度有規(guī)律地傳代。表2說(shuō)明了3個(gè)建立的細(xì)胞類(lèi)型倍增時(shí)間(d)和平均分裂時(shí)間(以小時(shí)計(jì)的MDT)為培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)。觀察到在建立過(guò)程中平均倍增時(shí)間縮短。表2用以下公式d＝(1/Log2×(LogX2/X1))×1(T2-T1)建立以天數(shù)表示時(shí)間段的平均倍增時(shí)間d，其中X2和X1是時(shí)間T2和T1的細(xì)胞總數(shù)。該公式是實(shí)施例1中所示公式X＝2n計(jì)算世代數(shù)N的直接結(jié)果。然后通過(guò)將d除以24小時(shí)獲得以小時(shí)計(jì)的平均分裂時(shí)間(MDT)。*在該建立過(guò)程中Valo細(xì)胞在不存在滋養(yǎng)層的塑料支持物上傳代。當(dāng)細(xì)胞對(duì)該新環(huán)境重新適應(yīng)時(shí)，倍增時(shí)間縮短，然后再增加。3.2-雞具有39℃的體溫。因此S86N45(EB45)和EB14細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的分析開(kāi)始在39℃進(jìn)行。在這些條件下，細(xì)胞表征為非常短的世代時(shí)間，通常15至20小時(shí)(圖2)。實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)溫度S86N45(EB45)和EB14細(xì)胞在39℃非?？斓闹芷趯?duì)于有效的MVA病毒生產(chǎn)是次優(yōu)的。因此還分析了37℃和35℃的細(xì)胞生長(zhǎng)(圖3)。如所期望的，細(xì)胞周期在37℃降低。這樣的條件原則上更適于病毒增殖并因此在以下所述的MVA實(shí)驗(yàn)中選用。相關(guān)地注意到S86N45(EB45)細(xì)胞和EB14細(xì)胞還可以在35℃生長(zhǎng)，雖然具有更短的動(dòng)力學(xué)。S86N45和EB14細(xì)胞對(duì)低溫(35℃甚至33℃)的適應(yīng)對(duì)于活的減毒的熱敏感性病毒疫苗的生產(chǎn)尤其有用。實(shí)施例5細(xì)胞系增殖血清含量的控制5.1-低血清濃度的培養(yǎng)基獲得這些細(xì)胞系的過(guò)程中，所用的培養(yǎng)基是常規(guī)培養(yǎng)基，含有補(bǔ)充各種添加劑如非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM、GMEM、HamF12、McCoy等等)。該復(fù)合培養(yǎng)基包括胎牛血清，其仍然是培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分，盡管可以逐漸使用不同來(lái)源的成分，包括植物成分。提出了控制并使細(xì)胞習(xí)慣相對(duì)低比例胎牛血清的方法。因此可以用低百分比的血清維持細(xì)胞的高增殖(分裂時(shí)間＞1)(例如S86N16細(xì)胞的情況中為2％)。圖4所示的曲線說(shuō)明了所給細(xì)胞類(lèi)型S86N16細(xì)胞的血清相對(duì)減少。還計(jì)算了倍增時(shí)間和平均分裂時(shí)間，并列于表3中。注意到平均分裂時(shí)間隨著血清相對(duì)減少的函數(shù)而提高。盡管在上述條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察到恢復(fù)期。盡管該時(shí)間保持低于24h(d＞1)，其已經(jīng)代表了就工業(yè)化而言非常有利的增殖，甚至在2％血清濃度，其已經(jīng)是相對(duì)低的了。為了提高該時(shí)間和再進(jìn)一步最佳化培養(yǎng)條件，可以觀察關(guān)于使用不同代謝物的改進(jìn)。表3S86N16細(xì)胞的倍增時(shí)間和平均分裂時(shí)間對(duì)于10％的條件取傳代p204和p179之間的樣本，對(duì)于7.5％的取p198至p176之間的，對(duì)于3.75％的取p224至p201之間的，對(duì)于2％的取p216和p199之間的。5.2-對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)&在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)通過(guò)S86N45(EB45)和EB14細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)獲得了主要的進(jìn)一步提高。測(cè)試了幾種配方并鑒定了使S86N45(EB45)和EB14細(xì)胞有效生長(zhǎng)的一對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基配方(圖5)。此外，可以進(jìn)一步擴(kuò)大EB14細(xì)胞在含有血清的和無(wú)血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，因?yàn)樵?L生物反應(yīng)器中重復(fù)證明了有效生長(zhǎng)(圖6)。此外，EB14細(xì)胞還可以在3L攪拌罐生物反應(yīng)器中有效生長(zhǎng)并達(dá)到超過(guò)2百萬(wàn)細(xì)胞/ml的密度。實(shí)施例6滋養(yǎng)層細(xì)胞的清除為了獲得如上所述的胚胎干細(xì)胞，在初始培養(yǎng)條件下，滅活細(xì)胞層是必需的。在多次傳代后，不再有該滋養(yǎng)層是必需的。只有“培養(yǎng)處理的”塑料是重要的。實(shí)際上，一些真核干細(xì)胞的特征之一是以附著形式增殖。為了有助于細(xì)胞的附著，所用的各種塑料材料是“培養(yǎng)”處理的。在其制造過(guò)程中它們經(jīng)受了處理，在塑料表面添加了電荷，該電荷促進(jìn)了細(xì)胞胞外基質(zhì)的附著。相反，細(xì)胞培養(yǎng)未處理的塑料，通常稱(chēng)為細(xì)菌學(xué)性質(zhì)的塑料，沒(méi)有通過(guò)添加特定滋養(yǎng)層來(lái)處理表面。細(xì)胞附著于此是非常困難的，甚至不可能，或然后誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)改變，和通常劇烈的行為。根據(jù)其中進(jìn)行的接種兩種塑料性質(zhì)之間的區(qū)別使其可以獲得具有不同行為的細(xì)胞。滅活“滋養(yǎng)層”的逐漸清除使其可以在一些傳代后獲得直接接種于“培養(yǎng)處理的”塑料上的干細(xì)胞同源培養(yǎng)物。S86N16細(xì)胞維持于存在和不存在滅活“滋養(yǎng)層”的細(xì)胞的比較生長(zhǎng)曲線列于圖7中。細(xì)胞的這種適應(yīng)是漸進(jìn)性的，以致沒(méi)有失去初始維持于“滋養(yǎng)層”上細(xì)胞的干細(xì)胞特征。因此完成漸進(jìn)性清除。獲得在塑料上增殖的細(xì)胞是清除方法的完成。表4中，分裂時(shí)間顯示細(xì)胞對(duì)其環(huán)境的敏感性。如在血清漸進(jìn)性清除的情況中，在限定條件下的一些傳代后獲得適應(yīng)，伴隨對(duì)細(xì)胞的恢復(fù)效果。表4對(duì)于1.2×106、0.5×106和0.3×106滋養(yǎng)細(xì)胞的3個(gè)條件，取傳代p154和p131之間的樣本，對(duì)于單獨(dú)在塑料上的條件，取p161和p139之間的樣本。實(shí)施例7細(xì)胞生長(zhǎng)因子的清除在初始培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)因子的存在是必需的。可以示意地區(qū)分兩類(lèi)因子細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子。細(xì)胞因子主要是通過(guò)與gp130蛋白相關(guān)的受體作用的細(xì)胞因子。因此，LIF、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素6、CNTF、制瘤素和促心激素具有相似的作用模式，在特定鏈?zhǔn)荏w的水平募集，后者與單體或有時(shí)雜二聚形式中的gp130蛋白結(jié)合。一些情況中，可溶形式受體的組合，所述形式中特別是白細(xì)胞介素6和CNTF的受體，可以提高所觀察到的增殖效果。之前已經(jīng)顯示加入這些細(xì)胞因子中的至少一種對(duì)于獲得胚胎干細(xì)胞是必需的。營(yíng)養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF，如上所述，其也用于培養(yǎng)的開(kāi)始。它們的存在對(duì)于獲得和擴(kuò)增細(xì)胞也是必需的。通過(guò)漸進(jìn)性減少這些生長(zhǎng)因子，一些傳代后在沒(méi)有添加外源生長(zhǎng)因子而可以獲得使胚胎或體干細(xì)胞增殖的培養(yǎng)條件。用于表征這些細(xì)胞的不同標(biāo)記通常對(duì)于沒(méi)有因子維持的細(xì)胞是陽(yáng)性的。實(shí)施例8所用培養(yǎng)基的比較接種于不同培養(yǎng)基，沒(méi)有獲得相同頻率的細(xì)胞。培養(yǎng)基組成的比較使一種成分的鑒定尤其困難。更可能的是整個(gè)組合物使得細(xì)胞的生理學(xué)得到提高。優(yōu)選培養(yǎng)基中，注意到HamF12培養(yǎng)基、MacCoy培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基和富含生物素的DMEM培養(yǎng)基。用這樣的分離物開(kāi)始，在這些不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)試驗(yàn)。實(shí)施例9非附著細(xì)胞的建立在干細(xì)胞連續(xù)傳代的過(guò)程中，直接接種于細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿的高密度接種可以在一些傳代后獲得胚胎細(xì)胞，其從其基質(zhì)上脫離并以小的規(guī)則聚合體的形式懸浮增殖。在幾次傳代中通過(guò)更多稀釋?zhuān)瑱C(jī)械分離且沒(méi)有使用蛋白水解酶來(lái)促進(jìn)該增殖。通常進(jìn)行培養(yǎng)物的攪拌，但并不表示是獲得非附著細(xì)胞的特征因素。和附著細(xì)胞一樣，這些細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征性形態(tài)，即，大小小，大的核-細(xì)胞質(zhì)比例，具有至少一個(gè)清楚可見(jiàn)核仁的核和小的細(xì)胞質(zhì)。這些細(xì)胞通過(guò)或多或少緊密的小聚合體生長(zhǎng)來(lái)表征(圖8)。這些非附著細(xì)胞呈現(xiàn)與多種抗體的交叉反應(yīng)性，如上Pain等(1996)中所述的。這些細(xì)胞對(duì)于內(nèi)源端粒酶活性也是陽(yáng)性的(如實(shí)施例10中所列的，對(duì)于EB1、EB4和EB5細(xì)胞)。非附著階段中，細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中呈現(xiàn)高度增殖。初始接種密度和新鮮培養(yǎng)基非常規(guī)律的供給提供了高密度，約高于1×106細(xì)胞每ml。表5總結(jié)了一些分離物的主要特征(親本細(xì)胞、形成懸浮的初始傳代、懸浮培養(yǎng)維持的天數(shù)、維持自動(dòng)停止之前獲得的傳代數(shù)和世代)。因此可以注意到一種分離物與另一種分離物之間形成懸浮的傳代(參見(jiàn)分離物EB1和EB14)以及增殖速率(參見(jiàn)分離物EB3和EB14)可以不同。表5注意到術(shù)語(yǔ)“開(kāi)始”對(duì)應(yīng)于非附著下放置的細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)數(shù)次傳代后在任何時(shí)刻可以從用或不用滋養(yǎng)層增殖的附著干細(xì)胞獲得非附著細(xì)胞。實(shí)施例10所建立細(xì)胞的表征用如上所述(Pain等，1996)的相同標(biāo)準(zhǔn)來(lái)表征維持長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間的干細(xì)胞。因此可以有規(guī)律地檢測(cè)內(nèi)源堿性磷酸酶活性，通過(guò)圖9a-9b的照片來(lái)說(shuō)明，內(nèi)源端粒酶活性(圖9c)以及與特定抗體如抗體SSEA-1(TEC-01)和EMA-1的反應(yīng)性。細(xì)胞系建立過(guò)程中重要標(biāo)準(zhǔn)之一是端粒酶的存在。在細(xì)胞維持培養(yǎng)的過(guò)程中，使用TRAP檢測(cè)試劑盒(端粒酶PCR酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，Roche)來(lái)進(jìn)行各種測(cè)試，經(jīng)過(guò)不同的培養(yǎng)傳代后，細(xì)胞檢測(cè)為陽(yáng)性。因此，對(duì)于S86N16細(xì)胞、S86N45(EB45)細(xì)胞，以及對(duì)于源自其的非附著形式的EB1、EB4和EB5細(xì)胞，端粒酶活性是可檢測(cè)的(參見(jiàn)表6)。認(rèn)為維持于原代培養(yǎng)中的CEFs(雞胚胎成纖維細(xì)胞)是陰性的。OD＜0.2的閾值是試劑盒推薦的作為陰性極限的閾值。所有分析都以相等的2000個(gè)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。表6不同傳代中各種細(xì)胞端粒酶活性的測(cè)定*CEF雞胚胎成纖維細(xì)胞特別重要，本發(fā)明的細(xì)胞保存一些實(shí)質(zhì)性的“干細(xì)胞”特征。它們表達(dá)已知在小鼠、雞和人胚胎干細(xì)胞中存在的一系列干細(xì)胞特異性標(biāo)記(例如，堿性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、端粒酶)(圖9)。如所期望的，在加入視黃酸(RA)或DMSO誘導(dǎo)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)中失去這些標(biāo)記的表達(dá)(表7和圖9c)。它們?cè)隗w外無(wú)限復(fù)制(圖1)；數(shù)個(gè)候選細(xì)胞系培養(yǎng)已經(jīng)超過(guò)一年而沒(méi)有特定障礙，如分化。表7ES細(xì)胞特異性標(biāo)記“在用視黃酸分化時(shí)，標(biāo)記表達(dá)減少”以標(biāo)記細(xì)胞的百分比來(lái)表示標(biāo)記SSEA1和EMA1。實(shí)施例11細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)用各種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染維持長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)的干細(xì)胞。已經(jīng)顯示鳥(niǎo)干細(xì)胞是可以轉(zhuǎn)染的(Pain等，1996)。尤其是，非附著細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染，各種分選系統(tǒng)使其可以鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(細(xì)胞分選、極限稀釋等等)?？梢栽诟杉?xì)胞未分化階段進(jìn)行這些遺傳修飾。一旦獲得該修飾，然后誘導(dǎo)細(xì)胞自然分化或通過(guò)加入分化誘導(dǎo)劑。這種情況下，可以使用濃度10-8M至10-6M的視黃酸，或終濃度1至2％的二甲亞砜或濃度為10-4至10-8M的丁酸鈉，或終濃度1至5μg/ml的佛波醇酯(TPA、PMA等等)或脂多糖(LPS)。另一實(shí)施例中，在懸浮液中細(xì)胞可以形成胚狀體，在組成它們的細(xì)胞分離或非分離后，可以使該胚狀體粘著塑料。然后這些分化的細(xì)胞增殖，但對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間增殖具有更有限的能力。通過(guò)針對(duì)影響細(xì)胞增殖的基因的遺傳修飾，可以使這些分化的細(xì)胞能夠長(zhǎng)時(shí)間增殖。實(shí)施例12用病毒感染非附著鳥(niǎo)細(xì)胞系(EB1)的實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞的擴(kuò)增以0.2×106細(xì)胞/ml的濃度將EB1或EB4細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，優(yōu)選MacCyo’s5A、HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何所關(guān)心的培養(yǎng)基，含有5％血清，通常50ml的初始體積。在39℃和7.5％CO2的條件下維持培養(yǎng)，伴隨攪拌。為了達(dá)到100至250ml終培養(yǎng)體積的1至3×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度，每天加入新鮮培養(yǎng)基3至4天，使其擴(kuò)增持續(xù)。收集懸浮細(xì)胞并在約1000rpm離心10分鐘。將沉淀重懸浮于20至50ml的1×PBS(磷酸鹽緩沖鹽)中。然后將細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心并將沉淀的細(xì)胞以3至5×106細(xì)胞/ml的終濃度放入無(wú)血清培養(yǎng)基中。然后在這些條件下制得幾個(gè)管子，每管含有3至5×106細(xì)胞。病毒的制備和感染將具有已知滴定度的病毒儲(chǔ)備在37℃快速解凍并以10×至1000×最終感染所需濃度的滴定度稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中。根據(jù)病毒的類(lèi)型用所關(guān)心病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))感染細(xì)胞，其包括將0.1至10％體積/體積的病毒懸浮液加入細(xì)胞沉淀中。在通常為33℃至37℃的病毒最佳溫度孵育1小時(shí)后，將細(xì)胞再次離心并小心除去培養(yǎng)基。為了限制初始病毒對(duì)隨后過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)該步驟通常是必需的。一種可能性是用含有血清的培養(yǎng)基(5％血清)直接稀釋細(xì)胞至終濃度0.2至1×106細(xì)胞/ml而沒(méi)有再次離心，并再次孵育。上清液和細(xì)胞的收集孵育2至4天后，根據(jù)特定病毒的病毒動(dòng)力學(xué)和潛在的致細(xì)胞病變作用，收集含有細(xì)胞或細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基。根據(jù)病毒，只有沉淀或上清液是所關(guān)心的并含有病毒顆粒。收集細(xì)胞并離心。將收集的上清液在2500rpm再次離心5至10分鐘，并在顆粒純化之前保存于-80℃。為了進(jìn)行滴定，收集等份試樣。將細(xì)胞沉淀放入5ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，超聲處理并在2500rpm離心5至10分鐘。將獲得的上清液保存于-80℃直至等份試樣的純化和滴定。比較各種所進(jìn)行條件之間的病毒感染和生產(chǎn)效率。對(duì)于具有致細(xì)胞病變作用的病毒，通常通過(guò)溶菌斑技術(shù)來(lái)進(jìn)行滴定。實(shí)施例13用病毒感染附著鳥(niǎo)細(xì)胞系(S86N45)的實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞的擴(kuò)增在感染48小時(shí)之前將細(xì)胞以0.03至0.06×106細(xì)胞/cm2的濃度接種于T150瓶中的培養(yǎng)基中，優(yōu)選，MacCyo’s5A、HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何其他所關(guān)心的培養(yǎng)基，含有5％血清。將它們維持于39℃和7.5％CO2。感染將具有已知滴定度的病毒儲(chǔ)備在37℃快速解凍并以10×至1000×最終感染所需濃度的滴定度稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中。根據(jù)病毒的類(lèi)型，用所關(guān)心的病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))感染細(xì)胞，其包括將0.1至10％體積/體積的病毒懸浮液加入細(xì)胞單層中。感染通常在含有0％血清的最小培養(yǎng)基(對(duì)于75cm2瓶5至10ml)中進(jìn)行。在通常為33至37℃的病毒最佳溫度孵育1小時(shí)后，將20ml5％培養(yǎng)基加入瓶中。特定情況中，用PBS洗滌細(xì)胞，以便除去可能粘著在細(xì)胞上的顆粒。在致細(xì)胞病變病毒的情況中，為了監(jiān)控表明感染良好進(jìn)程的細(xì)胞裂解的出現(xiàn)，感染后每天觀察細(xì)胞。上清液和細(xì)胞的收集孵育2至4天后，根據(jù)特定病毒的病毒動(dòng)力學(xué)和潛在的致細(xì)胞病變作用，收集含有上清細(xì)胞或細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基。根據(jù)病毒，只有沉淀或上清液是所關(guān)心的并含有病毒顆粒。收集細(xì)胞并離心。將收集的上清液在2500rpm再次離心5至10分鐘，并在顆粒純化之前保存于-80℃。為了進(jìn)行滴定，收集等份試樣。將細(xì)胞沉淀放入5ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，超聲處理并在2500rpm離心5至10分鐘。將獲得的上清液保存于-80℃直至純化等份試樣的和滴定。比較各種所進(jìn)行條件之間的病毒感染和生產(chǎn)效率。對(duì)于具有致細(xì)胞病變作用的病毒，通常通過(guò)溶菌斑技術(shù)來(lái)進(jìn)行滴定。實(shí)施例14修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)在EB45細(xì)胞系和EB14細(xì)胞系的附著和非附著鳥(niǎo)干細(xì)胞上的復(fù)制在EB45(S86N45)和EB14細(xì)胞上進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定它們各自對(duì)MVA感染的敏感性、MVA增殖的動(dòng)力學(xué)和病毒產(chǎn)量。用于這些研究中的MVA是表達(dá)受體GFP蛋白(MVA-GFP)的重組MVA載體或非重組MVA病毒。在所有實(shí)驗(yàn)中包括新鮮制得的雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)作為對(duì)照細(xì)胞。14.1-安全性考慮在冰凍條件下接受MVA病毒(滴定度為0.5ml指管中2.5×107TCID50/ml)。出于安全性原因，在控制條件下(-80℃冰箱中)保存MVA病毒和感染的細(xì)胞，將污染的塑料材料放入次氯酸溶液中超過(guò)1小時(shí)，然后放入袋子中用于全部和完全的高壓鍋滅活。14.2-病毒生產(chǎn)14.2.1-附著S86N45(EB45)細(xì)胞在感染前一天將1×106附著細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，20mL培養(yǎng)基。24小時(shí)后，丟棄培養(yǎng)基，在37℃用接種物與細(xì)胞孵育(2mL無(wú)血清培養(yǎng)基，0.01或0.1TCID/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù))。1小時(shí)后，丟棄接種物，將20mL預(yù)先溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基加入細(xì)胞中，在37℃5％CO2中保持孵育。為了病毒制備，用刮刀收集感染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移進(jìn)50mLFalconTM管中并在室溫1200RPM下旋轉(zhuǎn)。收集上清液(胞外病毒，EV)，并將細(xì)胞沉淀物(胞內(nèi)病毒，IV)稀釋于1或2mL培養(yǎng)基中。將EV和IV兩個(gè)樣品接受三次融-凍循環(huán)，然后將它們超聲處理。在室溫2500rpm離心10分鐘后，將EV和IV樣品等分并保存于-80℃直至滴定。14.2.2-懸浮EB14細(xì)胞在加入以培養(yǎng)基中0.01或0.1TCID/細(xì)胞的moi病毒接種物前一天，將0.4×106/mLEB14細(xì)胞接種于125mL旋轉(zhuǎn)瓶中的40mL培養(yǎng)基中(16×106細(xì)胞)，。病毒孵育一小時(shí)后，加入80mL預(yù)熱的培養(yǎng)基。在期望的旋轉(zhuǎn)條件下在37℃和5％CO2保持孵育。然后在感染后各個(gè)時(shí)間收集感染細(xì)胞，轉(zhuǎn)入50mLFalconTM管中并在室溫1200RPM下旋轉(zhuǎn)。收集上清液(胞外病毒，EV)，并將細(xì)胞沉淀物(胞內(nèi)病毒，IV)稀釋于5或10mL培養(yǎng)基中。將EV和IV兩個(gè)樣品接受三次融-凍循環(huán)，然后將它們超聲處理。在室溫2500rpm離心10分鐘后，將EV和IV樣品等分并保存于-80℃直至滴定。14.3-病毒滴定14.3.1-通過(guò)TCID50終點(diǎn)稀釋方法滴定MVA通過(guò)TCID50終點(diǎn)稀釋方法在CEF或DF-1細(xì)胞上進(jìn)行MVA病毒的滴定。試驗(yàn)測(cè)定了樣品含有足夠劑量的傳染病毒來(lái)產(chǎn)生感染。TCID50測(cè)定為細(xì)胞培養(yǎng)物累積數(shù)的一半產(chǎn)生了致細(xì)胞病變作用(CPE)。一個(gè)病毒樣品滴定需要一個(gè)平底P96。簡(jiǎn)短地，每孔接種15000CEF細(xì)胞/100μL。接種十一孔的八排。八排表示病毒樣品的高度系列10倍的稀釋度(即，10-2至10-9)。對(duì)于每個(gè)系列稀釋度，在無(wú)血清培養(yǎng)基中形成1mL混合物，將100μL混合物分配于10個(gè)相應(yīng)的稀釋孔中，第十一排是對(duì)照的非感染孔。將P96板在37℃，5％CO2孵育。5至10天后，通過(guò)Reed-Muench方法通過(guò)記錄陽(yáng)性CPE孔來(lái)計(jì)算病毒滴定度。14.4-對(duì)MVA感染的易感性和滴定度的結(jié)果14.4.1-首先使用重組MVA-GFP載體研究了EB45(S86N45)和EB14細(xì)胞對(duì)MVA感染的固有易感性。選擇該特異性載體用于這些研究來(lái)簡(jiǎn)化感染細(xì)胞的監(jiān)控和定量。因此用不同感染復(fù)數(shù)(moi)處理EBx和CEF細(xì)胞，且在感染后數(shù)天通過(guò)熒光顯微鏡和熒光計(jì)數(shù)法(fluorocytometry)來(lái)分析細(xì)胞。如圖10和11所示，所有在感染后48小時(shí)仍然是活著的附著EB45細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)了受體GFP蛋白，甚至當(dāng)使用低至0.1TCID50/細(xì)胞的moi時(shí)。重要的，圖10還說(shuō)明了當(dāng)和CEF細(xì)胞相比較時(shí)，EB45和EB14細(xì)胞更小的大小?？偠灾@些結(jié)果清楚地證明了附著EB45和EB14細(xì)胞對(duì)MVA感染的高度敏感性。14.4.2-以下的表8列出了所進(jìn)行的各種MVA-GFP感染實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果。所有樣品均滴定2次。表8滴定度的結(jié)果14.3-EB14和EB45細(xì)胞上的MVA增殖通過(guò)MVA-GFP復(fù)制的動(dòng)力學(xué)定量分析來(lái)測(cè)定懸浮EB14和附著EB45細(xì)胞上的MVA增殖。EB45細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的DMEM-F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并用0.1的moi感染，而EB14細(xì)胞在用0.2的moi感染之前，在120ml旋轉(zhuǎn)瓶中的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。然后在感染后的各個(gè)時(shí)間通過(guò)FACS分析定量感染細(xì)胞的百分比。如圖12和13中所示的，在感染后48小時(shí)(EB45)或72小時(shí)(EB14)，所有仍然存活的細(xì)胞表達(dá)GFP。14.4-生長(zhǎng)于含有血清培養(yǎng)基中的附著EB45細(xì)胞上的病毒產(chǎn)量14.4.1-使用生長(zhǎng)于DMEM-F12中的細(xì)胞來(lái)分析附著EB45細(xì)胞的病毒生產(chǎn)力。發(fā)現(xiàn)MVA在DMEM-F12中的EB45中非常有效地復(fù)制來(lái)獲得高于對(duì)照CEF細(xì)胞所獲得的產(chǎn)量(圖14)。14.4.2-更多系列的實(shí)驗(yàn)中，非重組MVA病毒(來(lái)自ATCC)用于CEF細(xì)胞和EB45細(xì)胞上的比較復(fù)制證實(shí)之前使用MVA-GFP載體的結(jié)果，用該MVA病毒再次獲得較高的產(chǎn)量(圖15)?？偠灾?，這些結(jié)果證明附著EB45細(xì)胞對(duì)MVA感染的高度敏感性和有效的病毒生產(chǎn)，其高于雞胚胎成纖維細(xì)胞。此外，所有這些實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。因此有理由表明在最佳化的實(shí)驗(yàn)條件下可以獲得更高的病毒產(chǎn)量，尤其是通過(guò)使用最佳細(xì)胞培養(yǎng)基。14.5-含有血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細(xì)胞上的病毒產(chǎn)量使用生長(zhǎng)于DMEM-F12培養(yǎng)基中的細(xì)胞測(cè)定了旋轉(zhuǎn)瓶中EB14細(xì)胞的病毒生產(chǎn)力。使用0.1感染復(fù)數(shù)的第一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖16中。這些數(shù)據(jù)支持之前用附著細(xì)胞獲得的結(jié)果并證實(shí)了懸浮EB14細(xì)胞有效生產(chǎn)重組MVA病毒的能力，產(chǎn)量接近于100TCID50/細(xì)胞，高于雞胚胎成纖維細(xì)胞所獲得的兩倍。14.6-生長(zhǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基的懸浮EB14細(xì)胞上的病毒產(chǎn)量理想地，在生物反應(yīng)器中的無(wú)血清培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞上進(jìn)行病毒疫苗生產(chǎn)。為了研究MVA在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生產(chǎn)，開(kāi)始了一系列實(shí)驗(yàn)，其中EB14懸浮細(xì)胞已經(jīng)用旋轉(zhuǎn)瓶中無(wú)血清培養(yǎng)基中兩種不同感染復(fù)數(shù)(0.01&0.1)的MVA-GFP載體感染。細(xì)胞的FACS分析證實(shí)了EB14細(xì)胞在兩種實(shí)驗(yàn)條件下的有效感染(圖17)。此外，并如所期望的，這些實(shí)驗(yàn)顯示了當(dāng)使用0.1的moi時(shí)感染更快，而0.01的moi的細(xì)胞存活更長(zhǎng)并能夠在較長(zhǎng)的時(shí)間段生產(chǎn)病毒后代(數(shù)據(jù)未顯示)。病毒產(chǎn)量的分析證實(shí)了通過(guò)無(wú)血清和無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的懸浮EB14細(xì)胞獲得了有效的MVA生產(chǎn)(圖18)。高于罕有的用CEF細(xì)胞獲得的病毒產(chǎn)量是常規(guī)獲得的。此外，感染顆粒分布的分析表明大多數(shù)病毒粒子保留于細(xì)胞中，僅有部分分泌于上清液中(圖18)。EB14和S86N45細(xì)胞很好地表征為在無(wú)血清培養(yǎng)基中可以懸浮或作為附著細(xì)胞有效生長(zhǎng)的非遺傳修飾鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞。發(fā)明者證明細(xì)胞對(duì)感染是高度敏感的以及重組和非重組修飾牛痘病毒安卡拉的增殖，且結(jié)果表明病毒生產(chǎn)至少高于對(duì)照CEF細(xì)胞兩到三倍?？偠灾@些特征構(gòu)成了本發(fā)明的細(xì)胞，主要是EB14和EB45，為替代現(xiàn)有的用于基于MVA載體的生產(chǎn)基于蛋的或基于CEF的生產(chǎn)系統(tǒng)的非常有前景的細(xì)胞。參考文獻(xiàn)BabaTW，HumphriesEIL(1985).轉(zhuǎn)化濾泡的形成對(duì)于鳥(niǎo)造白細(xì)胞組織增生病毒誘導(dǎo)的淋巴瘤是必要的但不是充分的(Formationofatransformedfollicleisnecessarybutnotsufficientfordevelopmentofanavianleukosisvirus-inducedlymphoma.)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82213-216.BeugH，vonKirchbachA，DoderleinG，ConscienceJF，GrafT.(1979).通過(guò)七株缺陷鳥(niǎo)白血病病毒轉(zhuǎn)化的雞造血細(xì)胞顯示出三種截然不同的分化表型(Chickenhematopoieticcellstransformedbysevenstrainsofdefectiveavianleukemiavirusesdisplaythreedistinctphenotypesofdifferentiation.)Cell18375-390.GuilhotC，BenchaibiM，F(xiàn)lechonJE，SamarutJ.(1993).12S腺病毒E1A蛋白使鳥(niǎo)細(xì)胞永生化并與鳥(niǎo)RB產(chǎn)物相互作用(The12SadenoviralE1AproteinimmortalizesaviancellsandinteractswiththeavianRBproduct.)Oncogene8619-624KawaguchiT，NomuraK，HirayamaY，KitagawaT.(1987).雞干細(xì)胞癌細(xì)胞系LMH的建立和表征(Establishmentandcharacterizationofachickenhepatocellularcarcinomacellline，LMH.)CancerRes1987474460-4464.KimH，YouS，F(xiàn)arrisJ.FosterLK，F(xiàn)osterDN.(2001).p53在永生化雞胚胎成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄后滅活(Post-transcriptionalinactivationofp53inimmortalizedchickenembryofibroblastcells.)Oncogene203306-3310.KimH，YouS，KimIJ，F(xiàn)osterLK，F(xiàn)arrisJ，AmbadyS，PoncedeLeonFA，F(xiàn)osterDN.(2001).常見(jiàn)永生化雞胚胎成纖維細(xì)胞的p53和E2F-1功能的改變(Alterationsinp53andE2F-1functioncommontoimmortalizedchickenembryofibroblasts.)Oncogene202671-2682.LiuJL，KleinPA，MoscoviciMG，MoscoviciC.(1992).識(shí)別正常和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化的雞造血細(xì)胞的單克隆抗體(Monoclonalantibodiesrecognizingnormalandretrovirus-transformedchickenhematopoieticcells.)Virology189583-591.MoscoviciC，MoscoviciMG，JimenezH，LaiMM，HaymanMJ，VogtPK.(1977).源自日本鵪鶉化學(xué)誘導(dǎo)腫瘤的連續(xù)組織培養(yǎng)細(xì)胞系(ContinuoustissueculturecelllinesderivedfromchemicallyinducedtumorsofJapanesequail.)Cell1195-103.MossB.(1994)用于疫苗發(fā)展的復(fù)制和宿主限制非復(fù)制疫苗病毒載體(Replicatingandhost-restrictednon-replicatingvacciniavirusvectorsforvaccinedevelopment.)DevBiolStand.8255-63.PainB.，ClarkM.E.，ShenM.，NakazawaH.，SakuraiM.，SamarutJ.，EtchesRJ.(1996).具有多形態(tài)發(fā)生潛能的鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和表征(Long-terminvitrocultureandcharacterisationofavianembryonicstemcellswithmultiplemorphogeneticpotentialities.)Development1222339-2348.PainB.，ChenevierP.，SamarutJ.(1999).雞胚胎干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因策略(Chickenembryonicstemcellsandtransgenicstrategies.)CellsTissuesOrgans165212-219.SamarutJ，GazzoloL.(1982).鳥(niǎo)成紅細(xì)胞增多癥病毒感染的靶細(xì)胞分化并變成轉(zhuǎn)化的(Targetcellsinfectedbyavianerythroblastosisvirusdifferentiateandbecometransformed.)Cell28921-929.SmithJRandPereira-SmithOM(1996).復(fù)制衰退暗示體內(nèi)老化和腫瘤抑制(Replicativesenescenceimplicationsforinvivoagingandtumorsuppression.)Science273，63-67.權(quán)利要求1.復(fù)制痘病毒和重組衍生物如天然或重組牛痘病毒的方法，包括步驟將病毒顆粒接種鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))來(lái)進(jìn)行接種。3.根據(jù)權(quán)利要求1至2之一的方法，其中所述牛痘病毒是修飾的牛痘病毒如修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)或重組牛痘病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，用于生產(chǎn)抗天花的疫苗。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的方法，其中所述的鳥(niǎo)源自胚胎的干細(xì)胞系是通過(guò)由以下步驟組成的方法可獲得的a)在含有所有使其生長(zhǎng)的因子和滅活滋養(yǎng)層的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鳥(niǎo)胚胎細(xì)胞，b)通過(guò)改變培養(yǎng)基傳代，以致獲得所述因子、血清和/或滋養(yǎng)層漸進(jìn)性的或全部的清除，c)建立能夠在不存在外源生長(zhǎng)因子、血清和/或滅活滋養(yǎng)層的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的附著或非附著細(xì)胞系。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟c)中獲得的所述鳥(niǎo)干細(xì)胞能夠增殖至少600天。7.根據(jù)權(quán)利要求5至6之一的方法，其中所述鳥(niǎo)干細(xì)胞是鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞或鳥(niǎo)體干細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求5至7之一的方法，其中步驟b)包括培養(yǎng)基成分(生長(zhǎng)因子單獨(dú)或血清單獨(dú)或生長(zhǎng)因子然后血清或血清然后生長(zhǎng)因子)的清除。9.根據(jù)權(quán)利要求5至7之一的方法，其中步驟b)包括滋養(yǎng)層漸進(jìn)性的或全部的清除，然后任選的培養(yǎng)基其它成分(生長(zhǎng)因子和血清)的清除。10.根據(jù)權(quán)利要求5至9之一的方法，其中所述鳥(niǎo)細(xì)胞系是在無(wú)外源生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中懸浮增殖的非附著干細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求5至9之一的方法，其中所述鳥(niǎo)細(xì)胞系是在無(wú)血清培養(yǎng)基(無(wú)血清培養(yǎng)基)中懸浮增殖的非附著干細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求1至9之一的方法，其中所述鳥(niǎo)細(xì)胞系是在無(wú)外源生長(zhǎng)因子和血清的培養(yǎng)基中懸浮增殖的非附著干細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12之一的方法，其中所述鳥(niǎo)細(xì)胞系具有至少一個(gè)以下的特征-高的核-細(xì)胞質(zhì)比例，-內(nèi)源堿性磷酸酶活性，-內(nèi)源端粒酶活性，-與選自SSEA-1(TEC01)、SSEA-3和EMA-1抗體的特異性抗體的反應(yīng)性。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13之一的方法，其中所述鳥(niǎo)細(xì)胞系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，尤其在補(bǔ)充有添加劑如非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉的DMEM、GMEM、HamF12或McCoy的培養(yǎng)基。15.生產(chǎn)活的或減毒的疫苗如抗天花疫苗的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至14之一限定方法步驟c)中建立的附著或非附著細(xì)胞系，將病毒顆粒接種所述細(xì)胞并在如上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。16.如權(quán)利要求10至12之一限定的非附著細(xì)胞的用途，用于生產(chǎn)活的或減毒的屬于正痘病毒科的疫苗，尤其是牛痘病毒，修飾的牛痘病毒如修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)和重組牛痘病毒。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，用于生產(chǎn)抗天花的疫苗。18.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，用于生產(chǎn)抗癌癥的疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及復(fù)制痘病毒如牛痘病毒的方法，包括步驟將病毒顆粒接種鳥(niǎo)胚胎干細(xì)胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞直至發(fā)生細(xì)胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。文檔編號(hào)C12N15/863GK1826406SQ200480021167公開(kāi)日2006年8月30日申請(qǐng)日期2004年7月22日優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日發(fā)明者F·格埃納克斯,B·潘申請(qǐng)人:維渦里斯公司