專利名稱：抗生素化合物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種具有抗菌活性的新天然產(chǎn)物。
由于許多細(xì)菌對各種常見抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此對這類病原體所引起的感染的關(guān)注不斷增加。所述細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、銅綠假單胞菌、乙酸鈣不動桿菌、大腸桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。本發(fā)明的抗生素是對治療那些對各種已知抗生素產(chǎn)生了抗藥性的感染的一項重要貢獻(xiàn)。綜述參見F.D.LowyThe Journal of Clinical Investigation 2003，111(9)，1265。
本發(fā)明中公開了一類從鏈球菌的真細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來地新型天然產(chǎn)物。此類化合物對多種病菌顯示出抗菌活性，其中許多病菌對現(xiàn)用的抗生素顯示抗藥性。
發(fā)明概述
本發(fā)明公開了式I所示的新天然產(chǎn)物和其作為抗菌劑的應(yīng)用:
或一種其藥學(xué)上可接受的鹽，該鹽可有效地治療細(xì)菌感染。
本發(fā)明也涉及通過發(fā)酵鏈球菌屬的真細(xì)菌制備化合物I的方法。本發(fā)明也涉及從發(fā)酵液培基中分離式I化合物的方法。
附圖的簡要說明


圖1是化合物I在C5D5N中的13CNMR光譜。
圖2是化合物I在C5D5N中的1HCNMR光譜。
發(fā)明詳述
本發(fā)明公開了如結(jié)構(gòu)式I的化合物
或一種其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括由非毒性的無機堿或有機堿生成的平常的非毒性鹽。例如，所述的平常的非毒性鹽包括那些來源于無機堿的鹽(無機堿指堿金屬或堿土金屬如鉀、鈉、鋰、鈣或鎂之類的氫氧化物)以及由有機堿制備的鹽，有機堿指二芐乙烯-二胺、三甲胺、哌啶、吡咯烷、芐胺等胺類，或季銨的氫氧化物如氫氧化四甲銨之類。
這些藥學(xué)上可接受的鹽可從本發(fā)明化合物通過常規(guī)化學(xué)方法合成。這些鹽通?？捎门c化學(xué)計算量的游離酸反應(yīng)制備，或用過量的所需鹽形式的無機堿或有機堿在適當(dāng)?shù)娜軇┗蛘吒鞣N組合溶劑中制備。
本發(fā)明的化合物I顯示的抗生素活性在治療細(xì)菌感染中是有用的。它對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、枯草桿菌、大腸桿菌等各種菌株具有抗菌活性，包括對許多已知的抗生素有抗藥性的菌株，如抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，抗萬古霉素的腸球菌(VRE)、抗多種藥物的糞腸球菌、抗大環(huán)內(nèi)酯類藥物的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，以及抗利耐唑酮類藥物的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌。
本發(fā)明的化合物可通過將化合物I與一種藥學(xué)上可接受的載體混合而配制成藥物成分。上述載體可說明如下。
化合物可以粉末、晶體、溶液或懸液形式使用。可通過各種方式給藥；主要包括局部給藥、口服和通過注射(靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)的非腸道途徑給藥。
做為一種給藥途徑的注射用組分可制成單一劑量的安瓿，或制成多次劑量的瓶裝藥。注射用組分可制成懸浮液、溶液、油乳劑或水乳劑，可以包含各種配制藥劑。或者，活性成分可以是粉末(親水性的或非親水性的)形式，能夠在給藥時與一種適當(dāng)?shù)妮d體重新配制，典型的載體包括無菌水、鹽水或其它可用于注射的液體，如用于肌肉注射的花生油。同樣，也包括各種緩沖劑、防腐劑等。
局部給藥可用載體配制，如用疏水堿或親水堿制成的藥膏、軟膏、藥水，或用水、油或酒精配成的涂劑，或用干燥稀釋劑制成的粉末。
口服組分可以采取下述形式，如片劑、膠囊、口服懸浮液和口服溶液?？诜M分的可用載體，如常規(guī)配伍劑載體，也包括有緩釋性能的和速釋形式的載體。
給藥劑量在很大程度上依賴于治療對象的狀態(tài)和規(guī)模、給藥途徑和給藥次數(shù)、細(xì)菌對化合物的敏感度、病原體的毒力大小及其他因素。然而，這些問題可以由醫(yī)師依據(jù)醫(yī)務(wù)界眾所周知的治療原則，按常規(guī)甄酌處理即可。
用于人體的每單位劑量組分，無論液體或固體，可包含從約0.01％到高達(dá)約99％的化合物I，一種實際的范圍為約10-60％。組分通常包含從約15毫克到約2.5克的化合物I，一種實際的范圍約為250毫克到1000毫克。非腸胃給藥時，典型的單位劑量包括在無菌水中的純化合物I或可配制成溶液的可溶性粉劑形式，其可調(diào)節(jié)成中性的pH和等滲溶液。
本發(fā)明同樣包括一種在需要時治療哺乳動物細(xì)菌感染的方法，該方法包括給動物投以有效量的化合物I以治療感染。
用化合物I給藥方法的實例包括口服和非腸道途徑給藥，如靜脈點滴，靜脈灌注和肌肉注射。
對于成人，最好按每公斤體重約5-50毫克的化合物I，每日一到四次給藥。優(yōu)選劑量是250毫克到1000毫克的抗菌藥，每天給藥一到四次。更具體地說，對于輕度感染，推薦劑量為約250毫克，每日二或三次給藥。對于中度感染，抗高敏感性革蘭氏陽性菌的推薦劑量為約500毫克，每日三或四次給藥。對于危及生命的重度感染，以對該抗菌素的敏感性為上限，推薦劑量為約1000-2000毫克，每日三到四次給藥。
對于兒童，優(yōu)選以約5-25毫克/公斤體重的劑量給藥，每天2、3或4次；一般推薦10毫克/公斤劑量。
本發(fā)明的另一個方面是生產(chǎn)化合物I的流程，包括在適宜的營養(yǎng)培基中培養(yǎng)一種鏈球菌屬的細(xì)菌，然后從該發(fā)酵液體培基中分離出本發(fā)明的化合物。此處所說的包括兩種細(xì)ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)依分類學(xué)研究將其鑒定為鏈球菌屬的真細(xì)菌，存放在Merck菌種庫中。
這兩種細(xì)菌隨后被永久保存在美國模式種菌種庫中(ATCC)，(12301Parklawn Drive，Rockville，馬里蘭，20852)，登錄號為ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)。
隨著專利的公布，任何限制公眾接觸這些微生物的規(guī)定都該完全取消。雖然本發(fā)明公開了這些特定菌種的應(yīng)用，但用其它種和變種的細(xì)菌也可能生產(chǎn)化合物I，可以期待用這些細(xì)菌來進行本發(fā)明的工藝流程。
結(jié)構(gòu)式I的化合物是在控制條件下，通過將鏈球菌屬的真細(xì)菌接種到一種適當(dāng)?shù)呐嗷线M行需氧發(fā)酵產(chǎn)生的。優(yōu)選含有可吸收的碳、氮和無機鹽等營養(yǎng)成分的液態(tài)培基。
用于發(fā)酵鏈球菌屬細(xì)菌的培基主要是眾所周知的Difco胰蛋白酶大豆肉湯培基，可以單用這種培基，也可讓技術(shù)人員在其中添加通常所用的營養(yǎng)成分。
應(yīng)當(dāng)注意，可用的培基范圍很廣，此處所說的培基僅是說明性的，并不意味著以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。
發(fā)酵在從約10℃到40℃的溫度下進行；優(yōu)選28℃下發(fā)酵可得到最佳效果。在發(fā)酵期間，該營養(yǎng)培基的pH值可以是約5.5到約7.5。
應(yīng)當(dāng)理解，對于本發(fā)明化合物的發(fā)酵制備，本發(fā)明不局限于使用ATCC登錄號為ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)的特定的鏈球菌屬細(xì)菌。在本發(fā)明范圍內(nèi)特別需要和想要包括使用由所述培養(yǎng)物產(chǎn)生或衍生出的其他的天然或人工突變株，或鏈球菌屬中可產(chǎn)生本發(fā)明化合物的其它種或變種的細(xì)菌。登記號為ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)的鏈球菌突變種或突變株的人工制備可通過常規(guī)的、物理的或化學(xué)誘變劑來進行，例如用紫外線照射所述的培養(yǎng)物或用亞硝基胍處理等。重組DNA技術(shù)，如細(xì)胞融合、質(zhì)粒結(jié)合、染色體片段聯(lián)接等，也證明是有用的。
實施例1
化合物I的制備-對ATC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)使用相同的方法
培養(yǎng)基組分
接種培基 g/L
可溶性淀粉 20.0
葡萄糖 10.0
E型NZ胺 5.0
牛肉提取物 3.0
酵母提取物 5.0
蛋白胨 5.0
(pH調(diào)節(jié)至7.0)
碳酸鈣 1.0
CLA(玉米粉乳糖ardamine)(生產(chǎn)培基，每L)
Amberx pH 5.0克
黃玉米粉40.0克
乳糖40.0克
P-2000(消泡劑) 1.0毫升
將2.0mLATCC#PTA-5316(MA7327)鏈球菌的冷凍懸液接種到含50ml接種培基的250ml導(dǎo)流燒瓶中。燒瓶在28.0℃下以每分鐘220轉(zhuǎn)的攪速培養(yǎng)48小時。第二階段，將10mL的第一階段的培養(yǎng)物接種到裝有500毫升接種培基的非導(dǎo)流搖瓶中。燒瓶在28.0℃下以每分鐘180轉(zhuǎn)的攪速培養(yǎng)48小時。將1.5升第二階段的培養(yǎng)物接種到裝有50升CLA生產(chǎn)培基的75升大小的Chemap發(fā)酵器中。該發(fā)酵器的工作參數(shù)是溫度＝28.0℃，攪速＝300r/min，氣流＝30slpm，壓力＝5psig。經(jīng)9天培養(yǎng)從發(fā)酵器中可獲得43升液體培養(yǎng)物。
化合物I的分離43升發(fā)酵液體培養(yǎng)物加入29升甲醇并且酸化到pH3.0，最終容積為72升。過濾提取，濾液直接裝入1.5升的琥珀色色譜柱，并用40-100％的含水甲醇洗脫，以每600毫升為單位梯度收集。合并主要含化合物I的11-13部分，并濃縮至200毫升，其中大部分是水，用300毫升水稀釋至最終容積500ml。加入固體碳酸氫鈉，以提高pH值至9.0。該溶液用等體積二氯甲烷提取三次。水層用6N HCl(鹽酸)酸化至pH 2.0，用等體積二氯甲烷提取四次，合并后的提取液(1900cc)濃縮成2.6克半純化的化合物I。
將半純化的原料溶于少量乙酸乙酯，以80∶20的比例裝入500cc硅膠柱；己烷-乙酸乙酯。該柱以四倍柱體積的己烷-乙酸乙酯(8∶2)洗脫，繼之以四倍柱體積的80∶20∶0.5∶0.5∶0.5的乙酸乙酯∶己烷水冰醋酸∶甲醇洗脫，每200毫升為單位收集一次。將6-10部分合并，減壓濃縮，得到1.24g的化合物I。
大量分離化合物I的方法用4N HCl酸化5升發(fā)酵液體培基，再用2.5升乙酸異丙酯提取，乙酸異丙酯是以300毫升的5％碳酸氫鈉水溶液提取的。將碳酸氫鈉層裝入150毫升的琥珀色色譜柱，以水洗脫至洗脫液pH為中性。該柱以一倍柱體積的0.1N HCl洗脫，再用水洗脫至洗脫液的pH變成中性。該柱再以兩倍柱體積的20％，40％，60％，80％，90％和100％的甲醇溶液洗脫?；衔颕在90％和100％甲醇溶液部分中被洗脫下來。合并的部分減壓濃縮至主要是水，以等量的二氯甲烷(乙酸異丙酯和乙酸乙酯同樣有效)提取。有機層濃縮至干，生成193毫克無定形粉末狀的化合物I，該化合物可從熱的硝基甲烷、乙酸異丙酯、乙酸乙酯或乙腈-水中結(jié)晶。
化合物I的物理學(xué)數(shù)據(jù)從硝基甲烷中結(jié)晶，呈米色針狀體，熔點220-223℃(分解溫度230℃)，UV(CH3OH)λmax227(ε28，167)，296(4，825)nm，[α]23D-51.1°(c0.135，CH3OH)，
FTIR(ZnSe)3400，2964，1713(W)，1650，(br，強)，1535，1446，1378，1296，1240，1153，1105，1091，1024，953，828，791，608厘米4，
HEESIFTMSFound442.1853；calcd for C24H27NO7+H442.1866，
1HNMR(500MHz)C5D5NδH1.14(3H，s)，1.40(3H，s)，1.48(3H，d，J＝11Hz)，1.57(1H，dd，J＝11.5，6.511z)，1.73(1H，dd，J＝10.5，3Hz)，1.81(2H，brd，J＝11.5Hz)，1.90(1H，m)，2.0(1H，m)，2.20(1H，t，J＝6.5-Hz)，2.45(1H，brs)，2.68(1H，m)，2.75(1H，ddd，J＝14.5，11.5，5)，2.83(1H，ddd，J＝14.5，11.5，5.5Hz)，4.49(1H，t，J＝3.5Hz)，5.94(1H，d，J＝10Hz)，6.37(1H，d，J＝10Hz)，6.87(1H，d，J＝9Hz)，8.12(1H，d，J＝9Hz)，10.5(1H，s)；
13CNMR(125MHz)C5D5NδC23.9，25.1，32.4，32.8，41.4，43.7，45.7，46.8，47.2，47.4，55.6，77.1，87.5，107.8，110.5，115.9，127.9，130.1，154.6，158.5，159.1，175.0，175.2，203.8
培養(yǎng)物特性
依據(jù)Shirling和Gottlieb(Int.J.Syst.Bacteriol，(1996)16313-340)的方法，對培養(yǎng)物的生長、一般培養(yǎng)特點和碳的利用情況進行觀察。培養(yǎng)物的染色用Mtehud色彩手冊(A.Kornerup和J.H.Wauscher，第三版，1978)中的顏色標(biāo)準(zhǔn)對照確定。
細(xì)胞的化學(xué)組分用Lechebalier和Lechebalier(1980)方法測定。
脂肪酸成分用修改的樣例制備法(Sasser，1990)測定。
甲基脂肪酸酯(FAMEs)的分析，通過使用Hewlett Packard Model 6890N氣相色譜/微生物鑒定系統(tǒng)軟件(MIDI，Inc.，Newar，Del)的毛細(xì)管氣相色譜進行，用苯基甲基硅酮柱(0.2毫米x 25米)裝柱。單體脂肪酸的鑒定通過微生物識別系統(tǒng)軟件確定。
用27f和1525r引物(Lane，1991)擴增，從1500bp PCR擴增片段測定完整的16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物作模板，用ABT PRISMTM染料終止劑循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer)測序。部分序列用GCG片段拼接系統(tǒng)(WisconsinPackage，第8版)拼接，序列以CLUSTALW程序(Intelligenetics公司)排序。用4.0版簡化程序的系統(tǒng)分析(PAUP)拆分-歸納算法(Swofford，1993)，以最大化-簡化分析法對排序的序列進行系統(tǒng)分析。
來源
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)株采自南非東海角的土壤中。在海岸地帶的硬葉灌木叢和沙丘地帶，采集粘連在倒杯長腋草(Manulea obovbata)根源上的土壤。土樣連續(xù)稀釋后分離菌株，置于含有20微克/毫升的茶啶酮酸的淀粉酪蛋白瓊脂上。
菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)從采自西班牙巴利阿里群島的馬略卡島的土壤中分離得到。將土壤用0.01％氯化芐乙胺預(yù)處理后分離菌株，置于添加了20微克/毫升新生霉素的腐殖酸瓊脂上。
一般生長特征。
菌株ATCC PTA-5316(MA7327)在28℃下在諸如酵母麥芽提取物、燕麥片、甘油天冬素、無機鹽淀粉和胰蛋白酶大豆瓊脂等瓊脂培基上生長良好。其菌落形態(tài)肉眼觀察為典型鏈霉菌，表1記錄了它們在不同的瓊脂培基上的生長特征，包括孢子團的顏色，底物中菌絲體的著色，以及產(chǎn)生的不同色素。
菌落形態(tài)學(xué)(在酵母麥芽提取物瓊脂上，ISP2)培育21天后，底物中菌絲體由最初的黃白色變?yōu)榻埸S色(5C6)。最初的白色氣生菌絲體在培育21天中逐漸變成黃灰色，最終變成灰色(5D2)，帶褐色微滴滲出物。
微觀形態(tài)用放大400倍和1000倍的光學(xué)顯微鏡直接觀察放在玻片上的孢子鏈形態(tài)。在酵母麥芽提取物瓊脂上培養(yǎng)7、14和21天后觀測。從底物中大量的分支菌絲生出氣生菌絲體。稀疏的分支氣生菌絲最初分化為短而不規(guī)則的致密的螺旋狀孢子鏈。在陳舊的培養(yǎng)物中，隨著時間的推移，暗色的粘稠孢子團漸趨聯(lián)合，由10-20個孢子形成了子實體。在大多數(shù)其它試驗培基中也觀察到類似的形態(tài)學(xué)變化，但孢子聯(lián)合的程度不同。相反，在甘油天冬素瓊脂培基中，菌株生長成不育的營養(yǎng)型菌絲體。
菌株ATCC#PTA-5317(MA7327)在試驗的瓊脂培基上于28℃下生長良好，瓊脂培基包括酵母麥芽提取物、燕麥片、甘油天冬素、無機鹽淀粉和胰蛋白酶大豆瓊脂等瓊脂培基。其菌落形態(tài)肉眼觀察為典型鏈霉菌，其在不同瓊脂培基上的生長特征如表1所示。
菌落形態(tài)(在酵母麥芽提取物瓊脂上，ISP2)培養(yǎng)21天后，底物中的菌絲體由最初發(fā)的黃白色變化為棕黃色(SE7)。最初的黃白色氣生菌絲體逐漸變成均勻灰色(5E1)。
微觀形態(tài)用放大400倍和1000倍的光學(xué)顯微鏡直接檢驗放在玻片上的孢子鏈形態(tài)。在酵母麥芽提取物瓊脂上培養(yǎng)7、14和21天后觀測。從底物中大量的分支菌絲中生出氣生菌絲體。在氣生菌絲頂尖部或二次分枝菌絲中生出子實體。它們形成圓環(huán)狀短而致密的不規(guī)則孢子鏈，此后經(jīng)較長時間的培養(yǎng)聯(lián)合起來。在其他試驗培基中可觀察到不同結(jié)合程度的類似形態(tài)學(xué)變化，但在甘油天冬素瓊脂中菌株生長為不育的營養(yǎng)型菌絲體。
化學(xué)分類學(xué)分析。
對細(xì)胞壁組分的分析表明，在全-有機水解物中，菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)的全部有機水解物中含有LL-A2pm，這是鏈霉菌屬的特征。菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)的主要細(xì)胞壁糖為葡萄糖，而葡萄糖和半乳糖是菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)的特征糖。兩個菌株都富含飽和的直鏈的、異和反異脂肪酸，但存在完全不同的脂肪酸模式。表2中列出了全部脂肪酸組分。菌體的全部甲醇分解物中主要的脂肪酸相當(dāng)于15:0的反異脂肪酸和16:0的異脂肪酸，這也是典型的鏈霉菌屬特征。所有這些化學(xué)分類分析表明，這兩個菌株都屬于鏈霉菌屬的種。
生理特性。
這些菌株在碳的利用方式上存在著微小不同(表3)
ATCC#PTA-5316(MA7327)可很好利用D-葡萄糖、蔗糖、I-肌醇、D-甘露糖醇、D-果糖和棉子糖；中度利用D-木糖；利用L-阿拉伯糖和纖維素的能力較差，不能利用鼠李糖。
ATCC#PTA-5317(MA7331)可很好地利用蔗糖、D-木糖、I-肌醇、D-果糖和棉子糖；中度利用D-葡萄糖和D-甘露糖醇；利用L-阿拉伯糖的能力較差，不能利用纖維素和鼠李糖。
16S rDNA序列和系統(tǒng)分析。
測定了兩個菌株的16S rDNA全序列(圖2)。與基因庫(AB045882)的鏈霉菌屬核苷酸序列核對，兩個菌株的分類學(xué)位置經(jīng)與126種確認(rèn)的鏈菌屬細(xì)菌的16SrDNA序列比對用系統(tǒng)分析法確定。以這些16S rDNA序列為基礎(chǔ)，用最大簡化法建立屬于同一支序系統(tǒng)樹。用每次分組的交叉反饋法確定統(tǒng)計學(xué)上的可信限。一次分組的交叉反饋值達(dá)到95％則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)似與扁平鏈霉菌ATCC 13865屬于同一支序。交叉反饋值(92％)高度支持這一密切關(guān)系，表明兩者可通過扁平鏈霉菌的不同菌株來鑒定。
表1.
鏈霉菌ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA733(21天，28℃)的培養(yǎng)特征
ATCC#PTA-5316(MA7327)菌株
ATCC#PTA-5317(MA7331)菌株
表2存在于菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)中的主要脂肪酸
表3.菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)利用碳水化合物的方式
用表中所列化合物作為碳源監(jiān)控培養(yǎng)物的生長28℃下，在7、14和21天進行觀察，利用各種碳源的情況列表如下。增長水平3＝利用良好；2＝中度利用；1＝利用較差；0＝不能利用。
圖2.菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)及數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)16S rDNA區(qū)域(從1到1449)-SEQ.ID.-No.1
1 CCGTCAGGAC GGACGCTGGC GGCGTGCTTA ACACATGCAA GTTCCAACGA
51TGAACCTCCT TCGGGAGGGG AATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG
101 GGCAATCTGC CCTTCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC
151 CGGATACGAC CACCGACCGC ATGGTCGTGG TGGTGGAAAG CTCCGGCGGT
201 GAAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC
251 AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC
301 TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC
351 AATGGGCGAA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC
401 GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGAGAGTGA CGGTACCTGC
451 AGAAGAAGCG CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG
501 CGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG
551 TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA
601 CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT
651 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG
701 GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA
751 TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT
801 TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG
851 TACGGCCGCA AGGcTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC
901 AGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC
951 TTGACATACA CCGGAAACGT CTGGAGACAG GCGCCCCCTT GTGGTCGGTG
1001 TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA
1051 AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCCTTCG
1101 GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG
1151 GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC
1201 TACAATGGCC GGTACAATGA GCTGCGATAC CGCGAGGTGG AGCGAATCTC
1251 AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG
1301 TCGGAGTTGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC
1351 CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA
1401 AGCCGGTGGC CACAACGCCC TCTGTGCGAG GCAATCTGTC CGAAGGTCG
菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)16S rDNA區(qū)域(從1到1496)-SEQ.ID.No.2
1 TCCTGGCTCA GGACGAACGC TGGCGGCGTG CTTAAACACA TGCAAGTCGA
51ACGATGAACC TCCTTCGGGA GGGGATTACT GGCGAACGGG TGAGTAACAC
101 GTGGGCAATC TGCCCTTCAC TCTGGGACAA GCCCTGGAAA CGGGGTCTAA
151 TACCGGATAC GACACACGAC CGCATGGTCT GTGTGTGGAA AGCTCCGGCG
201 GTGAAGGATG AGCCCGCGGC CTATCAGCTT GTTGGTGGGG TGATGGCCTA
251 CCAAGGCGAC GACGGGTAGC CGGCCTGAGA GGGCGACCGG CCACACTGGG
301 ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGC
351 ACAATGGGCG AAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT
401 TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG AAGCGAGAGT GACGGTACCT
451 GCAGAAGAAG CGCCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAAATAACGT
501 AGGGCGCAAG CGTTGTCCGG AATTATTGGG CGTAAAGAGC TCGTAGGCGG
551 CTTGTCACGT CGGATGTGAA AGCCCGGGGC TTAACCCCGG GTCTGCATTC
601 GATACGGGCA GGCTAGAGTT CGGTAGGGGA GATCGGAATT CCTGGTGTAG
651 CGGTGAAATG CGCAGATATC AGGAGGAACA CCGGTGGCGA AGGCGGATCT
701 CTGGGCCGAT ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCGTGGGGAG CGAACAGGAT
751 TAGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACG TTGGGAACTA GGTGTGGGCG
801 ACATTCCACG TCGTCCGTGC CGCAGCTAAC GCATTAAGTT CCCCGCCTGG
851 GGAGTACGGC CGCAAGGCTA AAACTCAAAG GAATTGACGG GGGCCCGCAC
901 AAGCAGCGGA GCATGTGGCT TAATTCGACG CAACGCGAAG AACCTTACCA
951 AGGCTTGACA TACACCGGAA ACGTCTGGAG ACAGGCGCCC CCTTGTGGTC
1001 GGTGTACAGG TGGTGCATGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG
1051 GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGT TCTGTGTTGC CAGCATGCCC
1101 TTCGGGGTGA TGGGGACTCA CAGGAGACTG CCGGGGTCAA CTCGGAGGAA
1151 GGTGGGGACG ACGTCAAGTC ACATGCCCCT TTATGTCTTG GGCTGCACAC
1201 GTGCTACAAT GGCCGGTACA ATGAGCTGCG ATACCGCGAG GTGGAGCGAA
1251 TCTCAAAAAG CCGGTCTCAG TTCGGATTGG GGTCTGCAAC TCGACCCCAT
1301 GAAGTCGGAG TTGCTAGTAA TCGCAGATCA GCATTGCTGC GGTGAATACG
1351 TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC GTCACGAAAG TCGGTAACAC
1401 CCGAAGCCGG TGGCCCAACC CCTTGTGGGA GGGAATCGTC GAAGGTGGGA
1451 CTGGCGATTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTACCG GAAGGT
用于測定化合物I抗菌活性的原始記錄如下所述。
原料
陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基(MH；BBL)
50％溶解馬血(LHB；BBL)(冷凍貯藏)
RPMI 1640(Bio Whittaker)
人血清(Pel-Freez)
RPMI 1640(Bio Whittaker)
嗜血菌屬試驗培基(HTM，Remel)
胰蛋白酶大豆肉湯培基(TSB，5mL/tube；BBL)
0.9％氯化鈉(鹽水；Baxter)
胰蛋白酶大豆+5％羊血瓊脂平板(TSA；BBL)
Sabouraud葡萄糖瓊脂平板(BBL)
巧克力瓊脂平板(BBL)
2X脫脂乳(Remel)
微玻珠(Kramer Scientific)
MIC 2000微量滴定板注液器.
2X胰酶大豆肉湯培基(TSB，BBL)+15％甘油/50％馬血清.
96-孔微量滴定板，蓋子，接種碟(Dynex Laboratories)
0.5-10μL容量的8-通道芬蘭多道移液器
方法
培基制備
陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基(BBL)按廠家說明書制備(22克溶于1000mL水；高壓滅菌22分鐘).冷凍貯藏。用前使用0.45Tm乙酸纖維素濾紙過濾消毒。
50％溶解馬血脫纖維蛋白的馬血以滅菌蒸餾水1∶1稀釋；冷凍、解凍、再冷凍(至少7次)，隨后離心。在-20℃冷凍貯藏。
陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基+2.5％溶解馬血以無菌操作將5毫升50％溶解馬血加入100毫升陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基中。使用之前用0.45Tm乙酸纖維素濾紙過濾滅菌。
陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基+50％人血清以無菌操作將50毫升人血清于50毫升2X陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯培基中。使用之前用0.45Tm乙酸纖維素濾紙過濾滅菌。
嗜血桿菌屬試驗培基(Remel)按生產(chǎn)者說明制備。使用之前用0.45Tm乙酸纖維素濾紙過濾滅菌。
0.9％氯化鈉(鹽水；Abbott研究室)已由制造商制備。
2X脫脂乳(Remel)已由制造商制備。
所有的瓊脂板已由制造商制備。
測試的最高抗菌濃度＝64μg/mL(從50％DMSO中以1mg/mL sol′n開始時)
每凹孔DMSO的最終濃度＝3.2％
分離物的篩選和保存
使用的菌株由Merck菌種庫、Merck臨床菌庫或臨床檢驗室分離得到。流感嗜血桿菌的菌株是一種小鼠病原菌，在Merck作體內(nèi)實驗用。大腸桿菌的菌株是具可透性細(xì)胞壁的菌株。白色念珠菌的菌株用作對照。這些培養(yǎng)物于-80℃下冷凍保存在a.)微玻珠；b.)2X脫脂乳；c.)2X胰蛋白酶大豆肉湯+15％甘油/50％馬血清(嗜血桿菌和肺炎鏈球菌)。
種菌制備
在巧克力瓊脂平板上(流感嗜血桿菌)、在胰蛋白酶大豆肉湯+5％羊血瓊脂平板上(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、芽胞桿菌)或者在Sabouraud葡萄糖瓊脂(念珠菌)上，35℃下對選出的分離物傳代培養(yǎng)。嗜血桿菌和肺炎鏈球菌在5％二氧化碳中培育；其他所有的分離物在大氣中培育。試驗之前將分離物傳代培養(yǎng)2次。
從平板上選取的接種物菌落，用以制備相當(dāng)于在胰蛋白酶大豆肉湯培基中0.5McFarland標(biāo)準(zhǔn)的接種物。為肺炎鏈球菌制備一個密度相當(dāng)于1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)的接種物。所有培養(yǎng)物的接種物密度均為TSB～108CFU/mL.TSB接種物用滅菌鹽水做1∶10稀釋(4mL接種物+36mL鹽水，相當(dāng)于～107CFU/mL)，保存在冰上，直至用來接種微量滴定板。
隨機選擇分離物進行菌落計數(shù)以確定CFU/槽(TSB接種物以10-5，10-6涂板在TSAII+5％SB或巧克力瓊脂平板上培養(yǎng)過液，35℃，CO2)
裝板
在96-槽微量滴定板(Dynex)的各凹槽中滴加100TL培基。制備嗜血菌屬試驗培基板測試流感嗜血菌；制備陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯+5％溶解馬血培基板測試肺炎鏈球菌；制備陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯腸球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草桿菌。用RPMI 1640測試念珠菌?？菇瘘S色鏈球菌的MICs用陽離子可調(diào)的Mueller Hinton肉湯和陽離子可調(diào)的MuellerHinton肉湯+50％人血清培基測定，以確定化合物是否會由于血清中的一些成分失活(通過在MIC的增加指示)。填充好的平板包在塑料袋中(以使蒸發(fā)減到最小)冷凍貯藏，使用之前解凍。
化合物的制備
化合物以重量為基礎(chǔ)制備。在100％DMSO中制備2mg/mL化合物，然后以DMSO/2x CAMHB(最后濃度＝50％DMSO/50％CAMHB)作1∶1稀釋至1mg/mL。用96槽BD生物深槽聚丙烯，以50％DMSO/50％CAMHB對化合物做1∶1連載稀釋(起始濃度1mgl/mL)。
微量肉湯培基稀釋測定
用芬蘭自動多道移液管，(容量0.5-10uL)將64TLs的抗菌工作液加入到已填充好的微量滴定板各槽中(第一個槽中的抗菌劑濃度＝64mg/mL；DMSO濃度＝3.2％)?？咕鷦┯眠@樣的方式添加，以使每個槽中DMSO的量保持不變(以保持化合物呈溶解狀態(tài)并說明被DMSO非特異性破壞的可能原因)。最后一排槽為3.2％DMSO的生長對照。
每個試驗都設(shè)對照。對照為青霉素G和氯霉素，以與化合物同樣的方法制備。血清蛋白結(jié)合試驗的對照也包括厄他培南(Ertapenem)。
平板培養(yǎng)
用MIC 2000系統(tǒng)(一種自動的接種平板的儀器，可在滴定板的每個槽中滴加1.5TL接種物)給微量滴定板的所有各槽中接種用鹽水稀釋的培養(yǎng)物。將滴定板在35℃下空氣中培養(yǎng)。將一塊未接種培養(yǎng)物的平板也作為無菌來培養(yǎng)。培育22-24小時后記錄結(jié)果。平板上沒有培養(yǎng)物生長。經(jīng)22-24小時培育后沒有培養(yǎng)物生長的MIC定義為最低抗菌劑水平。
化合物I對金黃色鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、枯草桿菌、肺炎鏈球菌和大腸桿菌的各種菌株顯示出抗菌活性?；衔颕也顯示出對那些對多種已知抗生素有抗藥性的各種菌種的抗菌活性如抗甲氧西林金黃色鏈球菌(MRSA)、抗萬古霉素鏈球菌(VRE)、抗多種藥物的屎腸球菌、抗大環(huán)內(nèi)酯的金黃色鏈球菌和表皮葡萄球菌以及抗利耐唑酮的金黃色鏈球菌和屎腸球菌。這些實驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)值為0.1到32ug/mL。所得到的MICs值與NCCLS指標(biāo)一致。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式I的化合物
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.制備結(jié)構(gòu)式I化合物的方法
包括在一種營養(yǎng)培基中用ATCC#PTA-5316(MA7327)或ATCC#PTA-5317(MA7331)或其天然或人工突變株培養(yǎng)鏈霉菌，并且從發(fā)酵的液體培基中再分離出化合物I。
3.權(quán)利要求2的方法，其中發(fā)酵在約10℃到40℃的溫度下進行。
4.權(quán)利要求3的方法，其中發(fā)酵在約28℃的溫度下進行。
5.具有ATCC登記號碼ATCC#PTA-5316(MA7327)的鏈霉菌。
6.具有ATCC登記號碼ATCC#PTA-5317(MA7331)的鏈霉菌。
7.一種藥物組分，包括一種藥學(xué)上可接受的載體和有效量的權(quán)利要求1的式I化合物。
8.一種在宿主需要上述治療時治療細(xì)菌感染的方法，包括給宿主施用有效劑量的式I化合物。
全文摘要
用一種營養(yǎng)培養(yǎng)基與一種鏈霉菌屬的真細(xì)菌發(fā)酵，生產(chǎn)一種結(jié)構(gòu)式I的新型抗菌化合物。
文檔編號C12P17/08GK1849313SQ20048002108
公開日2006年10月18日 申請日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者S·B·辛, J·王, A·巴西利奧, O·格尼羅德, P·埃爾南德斯, J·R·托爾莫 申請人:默克公司, 默沙東西班牙股份有限公司