專(zhuān)利名稱(chēng)：氮限制條件下生長(zhǎng)得以改善的植物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在氮限制條件下改善植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
近代的集約農(nóng)業(yè)中所見(jiàn)到的以供給氮為目的的大量施用復(fù)合肥料，在實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量顯著增加的同時(shí)也使氮以過(guò)剩的硝酸鹽形式向周邊環(huán)境釋放，造成由于江河、湖沼富營(yíng)養(yǎng)化而產(chǎn)生的環(huán)境污染，或隨著硝酸在農(nóng)作物中的累積造成對(duì)健康的威脅，再有，殘留在土壤中的氮產(chǎn)生溫室效應(yīng)氣體等環(huán)境方面的問(wèn)題。此外，在氮肥的制造階段中需要大量的電力，這也成為農(nóng)業(yè)環(huán)境負(fù)擔(dān)的原因。也就是說(shuō)，為了確保持續(xù)性發(fā)展，需要較少使用化肥，尤其是氮肥的農(nóng)業(yè)方法。
但是，除了豆科等例外，植物無(wú)法固定空氣中的氮，這種氮營(yíng)養(yǎng)完全依賴(lài)于由外部供給的硝酸或氨。因而，氮對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育而言是最大的限制因子。今后的農(nóng)業(yè)需要面對(duì)在維持、增加現(xiàn)行產(chǎn)量之外，同時(shí)還要考慮減少上述環(huán)境負(fù)擔(dān)的持續(xù)性這樣看似矛盾的問(wèn)題。致力于這些問(wèn)題的努力，即尤其是致力于減少氮源的條件下可以獲得充分的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的植物開(kāi)發(fā)和栽培的工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。例如，對(duì)于近代的集約農(nóng)業(yè)，還提倡有利于環(huán)境的所謂持續(xù)型、有機(jī)農(nóng)業(yè)法，而這種考慮環(huán)境型的有機(jī)農(nóng)業(yè)方法中控制氮肥施用的另一方面，在其產(chǎn)量方面又有很多問(wèn)題。
植物的品種改良的觀點(diǎn)出發(fā)，也沒(méi)有能夠解決這些問(wèn)題的育種實(shí)例，即，還沒(méi)有在減少氮肥施用的氮限制條件下獲得足夠的生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的成功的植物育種的例子。因此，需要開(kāi)發(fā)出在較少施加氮肥的情況下，通過(guò)改變/改善植物的氮利用率，使產(chǎn)量得以維持/改善的品種，以及用于培育上述植物品種的技術(shù)。
已知的是，在植物中將無(wú)機(jī)氮同化成有機(jī)形式的第一階段主要是將氨吸收到谷氨酸中用于生成谷氨酰胺。這是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的反應(yīng)，該反應(yīng)中作為這兩種酶反應(yīng)的總合，將1分子的氨同化成1分子2-OG產(chǎn)生1分子谷氨酸。這種GS/GOGAT循環(huán)被認(rèn)為是植物中同化氮的主要途徑(文獻(xiàn)Miflin andLea1976，Phytochemistry，15873-885)。
另一方面，在微生物中，據(jù)利用藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)和大腸桿菌的研究報(bào)道了2-OG和谷氨酰胺的數(shù)量的平衡調(diào)節(jié)與硝酸的吸收和同化相關(guān)的酶基因的表達(dá)(文獻(xiàn)Forchammer and Tandeau-marsac，1995，JBacterial 1772033-2040；Jiang等，1998，biochemistry 3712795-12801)。然而，由擬南芥(Arabidopsis)中分離出與同這種調(diào)節(jié)相關(guān)的PII蛋白質(zhì)高度同源的基因，然而將這種基因?qū)霟煵葜胁⑦^(guò)量表達(dá)，并沒(méi)有觀察到硝酸含量的增加，因此認(rèn)為高等植物中氮的累積與微生物中的不同(文獻(xiàn)Hsieh等，1998，Proc Natl Acad Sci Usa 9513965-13970)。另一方面，據(jù)報(bào)道利用在反義方向?qū)肓髓F氧化還原蛋白依賴(lài)型谷氨酸合酶基因而使谷氨酸合酶基因表達(dá)降低的煙草，對(duì)硝酸還原酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為NR)的表達(dá)進(jìn)行了研究，其結(jié)果顯示添加了硝酸以及蔗糖、2-OG時(shí)，NR的轉(zhuǎn)錄水平升高，而添加谷氨酰胺時(shí)NR的轉(zhuǎn)錄水平降低(文獻(xiàn)Ferrario-Mery等，2001，Planta 213265-271)，該文獻(xiàn)中還指出在高等植物中，2-OG和谷氨酰胺的數(shù)量也與NR的調(diào)節(jié)相關(guān)。然而，這些發(fā)現(xiàn)僅僅涉及NR，而對(duì)于2-OG對(duì)氮限制條件下的植物的生長(zhǎng)發(fā)育中的影響卻沒(méi)有提及。此外，由于2-OG是一種比較不穩(wěn)定的化合物，因此認(rèn)為以撒布等為目的的使用是不實(shí)際的。
此外，還制備出了導(dǎo)入了GDH基因的轉(zhuǎn)基因植物，據(jù)報(bào)道，為賦予植物對(duì)除草劑草丁膦(phosphinothricin)抗性為目的在煙草和玉米中導(dǎo)入來(lái)源于大腸桿菌的NADP依賴(lài)型GDH基因(gdhA)，干燥重量、氨基酸總含量和水溶性碳水化合物含量都有顯著增加(Lightfoot等，CA2180786，1996)。同樣，Tian等人(CN00109779.2)報(bào)道，與沒(méi)有導(dǎo)入基因的煙草相比，向煙草中導(dǎo)入來(lái)自鏈孢霉屬(Neurospora)的NADP依賴(lài)型GDH基因，其生長(zhǎng)發(fā)育良好。而且，據(jù)報(bào)道，向番茄中導(dǎo)入來(lái)自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NADP依賴(lài)型GDH基因，果實(shí)中的游離氨基酸含量增加(文獻(xiàn)kisaka等JP11-376710)，并且在馬鈴薯中導(dǎo)入相同的基因，塊莖的重量和塊莖數(shù)量增加(kisaka等，JP2000-404322)。然而，這些報(bào)道均沒(méi)有闡明導(dǎo)入基因的功能，導(dǎo)入的基因如何發(fā)揮作用，或由怎樣的效果產(chǎn)生這些性質(zhì)。而且，也沒(méi)有涉及氮限制條件下的植物的生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的改善。
另一方面，至今為止還沒(méi)有在植物中導(dǎo)入天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的報(bào)道。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明旨在提供一種植物培育方法，所述植物的氮吸收和代謝活性增強(qiáng)，且在減少氮，即在在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善。此外提供一種在氮限制條件下栽培這種植物的方法。
本發(fā)明人假設(shè)植物細(xì)胞存在著用于感知氮營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的信號(hào)分子，并且將2-酮戊二酸(2-OG)認(rèn)作此種信號(hào)分子。也就是說(shuō)，2-OG是全面控制植物細(xì)胞的氮吸收、代謝的信號(hào)分子，認(rèn)為如果人為地增減這種物質(zhì)的含量，能夠維持植物細(xì)胞的氮吸收、代謝的亢進(jìn)狀態(tài)。此外，由于考慮到這種亢進(jìn)狀態(tài)的植物能夠活躍地吸收外部的氮，因而認(rèn)為在限制氮的條件下，氮營(yíng)養(yǎng)也是充足的，從而使生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量得以改善。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上經(jīng)由過(guò)表達(dá)谷氨酸脫氫酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為GDH)活性或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為ASPC)活性，使植物細(xì)胞中的2-OG含量得以增加，2-OG含量增加的植物在氮限制條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得到改善，由此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明就是一種植物的制備方法，其特征在于通過(guò)提高所述植物中的2-OG含量，使所述植物在與在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得到改善。
此外，本發(fā)明涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物及其種子，其特征在于通過(guò)導(dǎo)入GDH基因或ASPC基因，使這些基因在植物體內(nèi)表達(dá)，由此增加2-OG的含量。此外，本發(fā)明還涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的制備方法，其特征在于導(dǎo)入GDH基因或ASPC基因，使這些基因在植物體內(nèi)表達(dá)，結(jié)果使所述植物的2-OG含量得以增加。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的制備方法，其中在上述方法中，在對(duì)于各種植物建立的標(biāo)準(zhǔn)氮肥量的下限至下限的1/10的氮量范圍內(nèi)獲得與標(biāo)準(zhǔn)氮肥量栽培條件相等或更高的生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量。
本發(fā)明涉及栽培由上述方法制備的植物的方法，其特征在于在限制氮的條件下栽培。尤其是，本發(fā)明還涉及在對(duì)各種植物建立的標(biāo)準(zhǔn)氮肥量的下限至下限的1/10的氮肥量范圍條件下栽培由上述方法制備的植物的方法。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及改善在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量的方法，其包括葉面撒布脯氨酸。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是構(gòu)建的質(zhì)粒載體模式圖。Nos-Pro胭脂堿合酶啟動(dòng)子；NPTII是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；Nos-Ter胭脂堿合酶終止子；35S-Pro是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；Mtd-AN-GDH是添加了線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的源于構(gòu)巢曲霉的谷氨酸脫氫酶基因(GDH)；HPT潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；H是Hind III，BBamH I，XXba I，SPApe I，EEcoR I；LB左邊緣，RB右邊緣。
圖2表示的是轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的PCR分析結(jié)果。AAn-GDH基因的特異引物的使用，BNPT II基因特異性引物的使用。泳道1100bp分子量標(biāo)記，泳道2未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯、泳道3轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd1、泳道4轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd2、泳道5轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd3、泳道6轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd5、泳道7轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd8。
圖3表示的是轉(zhuǎn)化的擬南芥PCR分析結(jié)果。AAn-GDH基因的特異引物的使用，BNPT II基因特異性引物的使用。泳道1100bp的分子量標(biāo)記，泳道2未轉(zhuǎn)化的擬南芥、泳道3轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd2、泳道4轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd3、泳道5轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd4。
圖4表示的是轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的Northern分析結(jié)果。A從葉組織中提取的RNA、B從塊莖中提取的RNA。對(duì)10μg總RNA進(jìn)行電泳、用溴化乙錠染色的圖像(A，B中均為下側(cè)的圖像)。以全長(zhǎng)An-GDH基因作為探針。泳道1未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯、泳道2轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd1、泳道3轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd2、泳道4轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd3、泳道5轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd5、泳道6轉(zhuǎn)化的馬鈴薯Mtd8。
圖5表示的是轉(zhuǎn)化的擬南芥的Northern分析結(jié)果。采用了從葉組織中提取的RNA。對(duì)10μg總RNA進(jìn)行電泳、用溴化乙錠染色的圖像(下側(cè)的圖像)。以全長(zhǎng)An-GDH基因作為探針。泳道1未轉(zhuǎn)化的擬南芥，泳道2轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd2、泳道3轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd3、泳道4轉(zhuǎn)化的擬南芥Mtd4。
圖6A-C是表示GDH轉(zhuǎn)化植物(擬南芥)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的圖?？v軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。Mtd3-10GDH轉(zhuǎn)化擬南芥(no.3系統(tǒng))、哥倫比亞(Columbia)未轉(zhuǎn)化的擬南芥。(n＝3)。
圖6D-F是表示GDH轉(zhuǎn)化植物(馬鈴薯)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的圖。縱軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。Mtd8GDH轉(zhuǎn)化馬鈴薯、對(duì)照未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯。(n＝3)。
圖7是表示在含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥葉組織的2-OG含量的圖。縱軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。C未轉(zhuǎn)化的擬南芥、M轉(zhuǎn)化的擬南芥(Mtd3系統(tǒng))。(n＝3)。
圖8是表示在含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥葉組織的硝酸含量的圖。縱軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。C未轉(zhuǎn)化的擬南芥、M轉(zhuǎn)化的擬南芥(Mtd3系統(tǒng))。(n＝3)。
圖9是高等植物谷氨酸脫氫酶氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。AtGDH1擬南芥GDH1、AtGDH2擬南芥GDH2、LeGDH番茄(Lycopersiconesculentum)GDH、NtGDH煙草(Nicotiana tabacum)GDH、ZmGDH玉米(Zea mays)GDH圖10是霉菌GDH和植物(番茄)GDH氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。AaGDH泡盛曲霉(Aspergillus awamori)GDH、ANGDH構(gòu)巢曲霉GDH、LeGDH番茄GDH圖11是表示在馬鈴薯葉面撒布展布劑、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小時(shí)后以及5小時(shí)后葉組織內(nèi)的游離脯氨酸含量的圖(n＝6)。A撒布1小時(shí)后、B撒布5小時(shí)后圖12是表示在馬鈴薯葉面撒布展布劑、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小時(shí)后以及24小時(shí)后葉組織內(nèi)的2-OG含量的圖(n＝6)。A撒布1小時(shí)后、B撒布24小時(shí)后圖13表示MtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥的基因組PCR分析結(jié)果。用ECASPC特異的引物進(jìn)行PCR分析。進(jìn)行以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一個(gè)循環(huán)的30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以1％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色。泳道11∶1kbp分子量標(biāo)記，泳道2mtdECASPC質(zhì)粒DNA、泳道3mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC2-2、泳道4mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC6-2、泳道5mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC8-1、泳道6mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC9-1。
圖14表示MtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥的RT-PCR分析結(jié)果。用QIAGEN公司的Plant RNeasy mini-kit試劑盒從擬南芥的葉組織中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR試劑盒，用ECASPC特異引物進(jìn)行的。進(jìn)行94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一個(gè)循環(huán)的的30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，用溴化乙錠染色。泳道11∶1kbp分子量標(biāo)記，泳道2mtdECASPC質(zhì)粒DNA、泳道3沒(méi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的RNA、泳道4-5未轉(zhuǎn)化的擬南芥、泳道6mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC2-2、泳道7mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC6-2、泳道8mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC8-1、泳道9mtdECASPC轉(zhuǎn)化的擬南芥，mtdECASPC9-1。
用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式如上所述，本申請(qǐng)發(fā)明人假定植物細(xì)胞存在用于感知氮營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的信號(hào)分子。也就是說(shuō)，存在著全面控制植物細(xì)胞的氮吸收、代謝的信號(hào)分子，認(rèn)為如果人為增減這種物質(zhì)的含量，就能夠維持植物細(xì)胞的氮吸收以及代謝的亢進(jìn)狀態(tài)。此外，由于考慮到這種亢進(jìn)狀態(tài)的植物能夠活躍地吸收外部的氮，因而認(rèn)為在限制氮的條件下，氮營(yíng)養(yǎng)也是充足的，可見(jiàn)生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量改善。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明人將這種信號(hào)分子假定為2-酮戊二酸(2-OG)。
植物將無(wú)機(jī)氮同化成有機(jī)形式的第一階段主要是谷氨酸摻入進(jìn)氨以生成谷氨酰胺，這是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的，就像已經(jīng)提到的那樣一般認(rèn)為這種GS/GOGAT循環(huán)是植物中氮同化的主要途徑。因而，認(rèn)為植物細(xì)胞中氮的同化程度或氮的缺乏程度由2-OG的量反應(yīng)。
本發(fā)明人設(shè)計(jì)出以過(guò)量表達(dá)谷氨酸脫氫酶(GDH)活性或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ASPC)活性作為增加植物細(xì)胞的2-OG含量的一種手段。GDH催化將氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸以及從谷氨酸分解出氨以反向生成2-OG的可逆反應(yīng)。但是，一般認(rèn)為由于GDH一般對(duì)氨有高Km值，與在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)將氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸的生成谷氨酸的反應(yīng)相比，GDH更傾向于在將谷氨酸分解成2-OG和氨的方向起作用，預(yù)計(jì)該反應(yīng)的結(jié)果是2-OG含量增加。另一方面，由于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是催化轉(zhuǎn)移草酰乙酸的氨基的反應(yīng)的酶，該反應(yīng)的結(jié)果是生成天冬氨酸和2-OG，預(yù)計(jì)2-OG的含量增加。
本發(fā)明人制備出導(dǎo)入有GDH基因或ASPC基因的轉(zhuǎn)化植物，確認(rèn)2-OG含量確實(shí)增加，進(jìn)而確認(rèn)在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下這些植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量發(fā)生改善。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在植物中導(dǎo)入含有谷氨酸脫氫酶(為GDH)基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ASPC)基因的核酸構(gòu)建體，通過(guò)谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ASPC)基因的表達(dá)使2-OG含量增加，獲得在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量獲得改善的植物。
此外，本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，通過(guò)增加內(nèi)源性GDH基因或內(nèi)源性ASPC基因的拷貝數(shù)和/或轉(zhuǎn)錄量增強(qiáng)GDH或ASPC的活性，增大植物體中的2-OG含量，獲得在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量獲得改善的植物。為了增大轉(zhuǎn)錄量，例如可以導(dǎo)入表達(dá)轉(zhuǎn)錄活性因子的基因構(gòu)建體，和/或可以導(dǎo)入增強(qiáng)子這樣的cis作用元件。這種轉(zhuǎn)錄活性因子和cis作用元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明中利用的谷氨酸脫氫酶其來(lái)源沒(méi)有特別的限定，但較為優(yōu)選的是采用源于曲霉屬的微生物的谷氨酸脫氫酶。更為優(yōu)選的是，采用源自構(gòu)巢曲霉和泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶。進(jìn)而，本發(fā)明還可以利用其酶蛋白質(zhì)中有1個(gè)以上的氨基酸缺失、取代、添加的谷氨酸脫氫酶，只要其具有上述谷氨酸脫氫酶活性、具有在生物體內(nèi)生理?xiàng)l件下優(yōu)先催化由谷氨酸生成2-OG和氨的反應(yīng)活性即可。
此外，本發(fā)明所用的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶其來(lái)源也沒(méi)有特別的限定，但優(yōu)選的是采用源于大腸桿菌(Escherichia ecoli)的微生物的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。進(jìn)而，本發(fā)明還可以利用其酶蛋白質(zhì)中有1個(gè)以上的氨基酸缺失、取代、添加的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，只要其具有上述天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性即可。
此外，就與谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶在植物細(xì)胞的細(xì)胞器的定位而言，不僅可以采用位于細(xì)胞質(zhì)的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，也可以采用位于線粒體、葉綠體、過(guò)氧化物酶體等處的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。因此，本發(fā)明中還可以利用在其N(xiāo)端或C端添加了用于將這些酶蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至這些細(xì)胞器內(nèi)的信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因。
基于已經(jīng)公開(kāi)的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠較為容易地制得上述谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因或其cDNA。例如，就構(gòu)巢曲霉的谷氨酸脫氫酶而言，其基因組基因的核苷酸序列公開(kāi)為Genbank的登錄號(hào)X16121中的序列。其核苷酸序列如序列號(hào)1中所示，其氨基酸序列如序列號(hào)2中所示。如果根據(jù)這些序列合成出擴(kuò)增包括編碼蛋白質(zhì)的部分的DNA片段的PCR引物、以從構(gòu)巢曲霉中提取的RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，就能夠容易地獲得谷氨酸脫氫酶的cDNA。構(gòu)巢曲霉的谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列如序列號(hào)17中所示。構(gòu)巢曲霉可以由例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的ATCC10074或ATCC11267獲得。此外，就泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶基因而言，其基因組基因公開(kāi)為GENBANK中的登錄號(hào)Y15784。其核苷酸序列如序列號(hào)3中所示，氨基酸序列如序列號(hào)4中所示。此外，泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列如序列號(hào)18中所示。泡盛曲霉本身可以由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的ATCC10548或ATCC11358獲得?？梢愿鶕?jù)這些菌株及序列信息以與上述方法相似的方法獲得谷氨酸脫氫酶cDNA。
構(gòu)巢曲霉的GDH和泡盛曲霉的GDH的同源性在氨基酸序列方面約為84％(圖10)。
此外，構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、馬鈴薯(Lycopersicon esculentum)的GDH氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果表示于圖10中，擬南芥GDH1、擬南芥GDH2、馬鈴薯GDH、煙草(Nicotiana tabacum)GDH、玉米(Zeamays)GDH的氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果示于圖9中。
進(jìn)而，本發(fā)明中，利用谷氨酸脫氫酶基因和其它的編碼從谷氨酸產(chǎn)生2-OG的各種酶的基因，可以獲得植物中2-OG含量提高的、在與通常栽培條件相比更加限制氮條件的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量得到改善的植物。這種酶包括例如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
例如，就大腸桿菌K-12菌株的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶而言，其基因組DNA的堿基序列登錄為GENBANK登錄號(hào)X03629。如果根據(jù)這些序列合成出擴(kuò)增包括編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域的DNA片段的PCR引物、用這種引物以從大腸桿菌K-12菌株中提取的染色體DNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，就能夠容易地獲得谷氨酸脫氫酶基因。
此外，根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)葉面撒布脯氨酸作為提高植物內(nèi)的2-OG含量的方法改善在與通常栽培條件相比更加限制氮條件的栽培條件下的植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。葉面撒布的脯氨酸被吸收到葉組織中，代謝到谷氨酸中。進(jìn)而，這種谷氨酸經(jīng)內(nèi)源性谷氨酸脫氫酶代謝成2-OG，能夠提高組織內(nèi)的2-OG。通過(guò)葉面撒布這種脯氨酸2-OG含量提高的植物，在與通常栽培條件相比更加限制栽培期間的氮施用量的條件下其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量得到改善。
本發(fā)明中使用的核酸構(gòu)建體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制成。就包括分離核酸構(gòu)建體，確定其序列的方法的分子生物學(xué)方法而言，可以參照例如Sambrook等人，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecularcloning-Laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress等文獻(xiàn)。或者，以PCR方法為代表的基因擴(kuò)增對(duì)于用于制備本發(fā)明中使用的核酸構(gòu)建體是必要的，對(duì)于這種方法可以參照F.M.Ausubel等人(eds)，Current Procotols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.(1994)等文獻(xiàn)。
本發(fā)明中使用的核酸構(gòu)建體一般可以含有在植物細(xì)胞內(nèi)起作用的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，例如胭脂堿合酶基因、花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)、胭脂堿合酶基因的終止子等適當(dāng)?shù)慕K止子、其它對(duì)于表達(dá)必要的或有利的序列、以及用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因，例如卡那霉素的抗性、G418抗性、潮霉素抗性等抗藥性基因。這種構(gòu)建體所使用的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或器官特異的或是生長(zhǎng)發(fā)育階段特異的啟動(dòng)子，可以根據(jù)使用的宿主、必要的表達(dá)量、特定表達(dá)的器官或生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)行選擇。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用器官和生長(zhǎng)發(fā)育階段中非特異表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，例如使用CaMV35S啟動(dòng)子這樣的啟動(dòng)子。作為器官特異性啟動(dòng)子，采用菜豆球蛋白基因啟動(dòng)子或馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子等。本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方式中，使用以CaMV35S啟動(dòng)子這樣的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的構(gòu)建體。
本發(fā)明中使用的基因?qū)敕椒](méi)有特別的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的方法根據(jù)相應(yīng)的宿主選擇向植物細(xì)胞或植物體導(dǎo)入基因的方法。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，利用使用農(nóng)桿菌的基因?qū)敕椒?。這種轉(zhuǎn)化體系中，優(yōu)選的是使用二元載體。利用農(nóng)桿菌時(shí)，在轉(zhuǎn)化時(shí)使用的核酸構(gòu)建體進(jìn)而包括與必須導(dǎo)入到植物細(xì)胞中的DNA序列鄰接的T-DNA區(qū)域。優(yōu)選實(shí)施方式中，移入的序列是插入在左右的T-DNA邊界序列之間?；谶@種T-DNA的轉(zhuǎn)化載體的合適的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。此外，用于在植物中感染具有這種核酸構(gòu)建體的農(nóng)桿菌的條件也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。對(duì)于這些技術(shù)和條件，可以參照例如秀潤(rùn)社、細(xì)胞工學(xué)冊(cè)增刊“模式植物的實(shí)驗(yàn)方法大米和擬南芥”(1996)。
本發(fā)明中，還可以利用其它的基因?qū)敕椒āＷ鳛槭褂玫幕驅(qū)敕椒ǖ膶?shí)例，可以例舉為使用聚乙二醇或鈣的DNA原生質(zhì)體導(dǎo)入法、根據(jù)電穿孔的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、根據(jù)基因槍的導(dǎo)入法等。
進(jìn)行像上述這樣的基因的操作的植物種類(lèi)沒(méi)有特別的限定，除了利用植物自身進(jìn)行轉(zhuǎn)化的情況之外，優(yōu)選容易轉(zhuǎn)化且植物體中建立了再生系統(tǒng)的植物種類(lèi)。本發(fā)明中合適的植物除了具有前述特性的植物之外，從減少農(nóng)業(yè)的環(huán)境負(fù)荷的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選建立了大量栽培技術(shù)的植物種類(lèi)。作為用于實(shí)施本發(fā)明的植物，可以例舉為，例如所有蕓苔科植物之外、還有番茄、馬鈴薯、玉米、小麥、大米、甘蔗、大豆、高梁等。此外，作為難以給予大量氮的植物，有樹(shù)木和果樹(shù)等，可以例舉為白楊，桉樹(shù)和蘋(píng)果樹(shù)等。這些植物中的GDH或ASPC活性和特性與本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的源自于構(gòu)巢曲霉的GDH(序列號(hào)1和2)或源自于大腸桿菌K-12菌株的ASPC(序列號(hào)19和20)等同。因此，通過(guò)導(dǎo)入源自于構(gòu)巢曲霉的GDH(序列號(hào)1)或源自于大腸桿菌K-12菌株的ASPC(序列號(hào)19)可以增大這些植物中的2-OG含量。此外，本發(fā)明中也可以以相同方式使用源自這些植物中任一種的GDH基因或ASPC基因。進(jìn)行像上述這樣的遺傳操作的器官、細(xì)胞沒(méi)有特別的限定，可以根據(jù)使用的宿主、基因?qū)敕ǖ冗M(jìn)行選擇。作為例子，可以列舉為器官外植體、花粉、培養(yǎng)細(xì)胞、胚、植物體等，但不僅限于此。
接下來(lái)，選擇出進(jìn)行像上述這樣操作的植物細(xì)胞用以轉(zhuǎn)化。這種選擇，例如可以基于轉(zhuǎn)化中使用的核酸構(gòu)建體上存在的標(biāo)記基因的表達(dá)。例如，標(biāo)記基因是抗藥性基因時(shí)，可以通過(guò)含有適當(dāng)濃度的抗生素或除草劑等培養(yǎng)基上培養(yǎng)操作的植物細(xì)胞或使其生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行選擇?；蛘撸瑯?biāo)記基因是β-葡糖醛酸糖苷酶基因、螢光素酶基因等基因時(shí)，可以通過(guò)對(duì)其活性進(jìn)行篩選來(lái)選擇。這樣鑒定出的轉(zhuǎn)化體如果不是植物體，例如原生質(zhì)體、愈傷組織、外植體等時(shí)，可進(jìn)行向植物體的再生。對(duì)于這種再生可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的、基于使用的宿主細(xì)胞的方法。
這樣獲得植物體能用通常的方法也就是與非轉(zhuǎn)化體同樣的條件栽培，為了鑒定出含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化植物，除了基于前述標(biāo)記基因進(jìn)行選擇之外，還可以利用各種分子生物學(xué)方法。例如，可以利用用于檢測(cè)出重組DNA插入片段的有無(wú)和其結(jié)構(gòu)的Southern印跡或PCR。為了檢出和測(cè)定源于導(dǎo)入的核酸構(gòu)建體的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以利用Northern印跡或RT-PCR等。
接著，對(duì)于獲得的轉(zhuǎn)化體的谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)，通過(guò)該谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白質(zhì)量、mRNA量或酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，谷氨酸脫氫酶蛋白質(zhì)或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白質(zhì)量可以通過(guò)Western印跡等方法評(píng)價(jià)，mRNA量可以通過(guò)Northern印跡、定量的RT-PCR法評(píng)價(jià)。此外，植物提取液中的谷氨酸脫氫酶活性的測(cè)定可以根據(jù)Ameziane等的方法(AmezianeR.，Bernhard K.，and Lightfood D.，Plant and Soil，22147-57，2000)進(jìn)行。植物提取液中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性可以按照chao等的方法進(jìn)行測(cè)定(Chao YP，Lai ZI，Chen P，Chen JT.，Biotechnology Progress，15-453-458，1999)。
進(jìn)而，評(píng)價(jià)確認(rèn)了谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)或表達(dá)的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化植物的2-OG含量。2-OG含量可以例如破碎轉(zhuǎn)化植物全部或其中一部分，制備其抽提液，通過(guò)例如酶法定量。對(duì)于植物抽提液的制備及2-OG的定量，可以通過(guò)Usuda的方法進(jìn)行(UsudaH.，Plant Physiol，78859-864，1985)。
對(duì)于2-OG含量的增加，在通常的栽培條件及與通常的栽培條件相比更加限制氮的條件下，其地上部分(例如，葉部、莖部或這二者，或花器、果實(shí)部分)或其地下部分(例如，根、塊莖)中的2-OG含量與導(dǎo)入基因的原株系相比，增大1.2倍以上時(shí)，就判定為其含量增加。
這樣一來(lái)，對(duì)于確認(rèn)2-OG含量的增加的轉(zhuǎn)化植物，在栽培期間可以在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下栽培，可以評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)發(fā)育或產(chǎn)量。這里所稱(chēng)的與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件，是指各種植物的栽培時(shí)施加比通常使用的標(biāo)準(zhǔn)氮量、也就是標(biāo)準(zhǔn)的氮肥量更少的氮量的條件，例如70％以下，優(yōu)選50％以下的量。尤其是，如果按照本發(fā)明，給予減少到標(biāo)準(zhǔn)氮量的下限至下限的1/10量程度的范圍的氮量的栽培條件下達(dá)到與給予標(biāo)準(zhǔn)氮量的栽培條件同等以上的生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量。例如，就農(nóng)作物而言，對(duì)于各種農(nóng)作物建立標(biāo)準(zhǔn)的氮肥量。例如，對(duì)于馬鈴薯，一般認(rèn)為每10a的氮肥量標(biāo)準(zhǔn)的是7kg(JRT日本馬鈴薯研究會(huì)主頁(yè)http//www.jrt.gr.jp/mini/pm_index.html；吉田 著，享受所有關(guān)于馬鈴薯的百科(まるごと楽しむジヤガイモ百科)，農(nóng)文協(xié)，1988)，對(duì)于大米，一般認(rèn)為是每10a 5-15kg(日向康吉、羽柴輝良編，植物生產(chǎn)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，softscience公司，1995；奈良縣農(nóng)業(yè)技術(shù)中心主頁(yè)，http//www.naranougi.jp/sehi-kijyun/sehikijyun-index.html)。此外，擬南芥等實(shí)驗(yàn)植物中，含有5mM以上的硝酸鹽的培養(yǎng)基是適于生長(zhǎng)發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(Matinez-Zapater J.M.，and Salinas J.ed.，Methods inMolecular Biology Arabidopsis Protocols，Humana Press，NewJersey，1998)。這樣的標(biāo)準(zhǔn)氮肥量或標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的氮量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在與通常栽培條件相比限制氮的條件下也就是在上述這樣的減少了標(biāo)準(zhǔn)氮量的下限至下限的1/10量程度的范圍的氮量下栽培轉(zhuǎn)化植物，評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量。生長(zhǎng)發(fā)育可以通過(guò)測(cè)定地上部分或植物體全部的草的高度、葉數(shù)、鮮重或干燥重量來(lái)評(píng)價(jià)。本說(shuō)明書(shū)中所謂生長(zhǎng)發(fā)育的改善，定義為至少1個(gè)與這樣的植物體的部分或全部相關(guān)的參數(shù)(例如草的高度、葉數(shù)、鮮重或干燥重量)，與同時(shí)期在標(biāo)準(zhǔn)的氮肥量下開(kāi)始栽培的對(duì)照植物相比，超過(guò)1.2倍以上的狀態(tài)。
這樣，如果鑒定出與通常栽培條件相比限制施加氮量的條件下的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量與作為對(duì)照的非轉(zhuǎn)化體相比得到改善的轉(zhuǎn)化體，調(diào)查這種轉(zhuǎn)化是否能保持穩(wěn)定遺傳。為此，可以在通常條件下隨之培育，栽培和采種，解析其后代的性狀、其分離?？梢砸耘c初代(T1)轉(zhuǎn)化體同樣方式解析后代中導(dǎo)入的核酸構(gòu)建體的有無(wú)，其位置、其表達(dá)等。
在與通常栽培條件相比限制氮的條件下的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量得到改善的轉(zhuǎn)化植物，也就是解除了氮限制條件下的生長(zhǎng)抑制的轉(zhuǎn)化植物，就其源于整合于導(dǎo)入基因組的核酸構(gòu)建體的序列而言可以是半合條件下或純合條件下獲得，半合子或純合子可以通過(guò)必要的交配等，在后代中得到。從整合到基因組中的核酸構(gòu)建體中獲得序列通過(guò)孟德?tīng)枌W(xué)說(shuō)在后代中分離。因此，從轉(zhuǎn)化體的特征的穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)為了獲得子代植物和種子，希望使用純合子植物。
此外，轉(zhuǎn)化體在許多情況下，作為基因座，外來(lái)基因插入于1處，但是插入于多個(gè)基因座中的多拷貝轉(zhuǎn)化體并不鮮見(jiàn)。由于導(dǎo)入基因的安全性等原由，本發(fā)明中更優(yōu)選單拷貝轉(zhuǎn)化體。例如，通過(guò)核對(duì)T2(第2世代)中的卡那霉素抗性的分離比，可以選擇出導(dǎo)入基因是1個(gè)基因座也就是單拷貝轉(zhuǎn)化體。T1是半合子、導(dǎo)入基因?yàn)?個(gè)基因座時(shí)，按照孟德?tīng)柗▌t，T2中，卡那霉素抗性和敏感型以3∶1的比例分離。此外，導(dǎo)入的基因以多拷貝存在時(shí)，抗性轉(zhuǎn)化體的出現(xiàn)頻率就高。因此，獲得的T2種子再次播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，選擇顯示3∶1的分離比的系統(tǒng)，通過(guò)選擇出認(rèn)為導(dǎo)入基因存在于1個(gè)基因座中的轉(zhuǎn)化體，可以獲得單拷貝轉(zhuǎn)化體。
這樣獲得的轉(zhuǎn)化植物可以按照與天然存在的同種植物相同的栽培條件進(jìn)行栽培，在與通常栽培條件相比限制施用氮量的條件下栽培，可以獲得等同或優(yōu)于非轉(zhuǎn)化體植物的產(chǎn)物。此外，通過(guò)與同種的非轉(zhuǎn)化植物同樣的方法可以容易地獲得種子。如果有必要，獲得種子的保存、殺菌、害蟲(chóng)驅(qū)除等可以按照本領(lǐng)域熟知的通常的方法進(jìn)行。
這樣，可以增加導(dǎo)入如了基因的植物的2-OG含量，除這些方法之外，還可以通過(guò)葉面撒布氨基酸的一種脯氨酸增加植物的2-OG含量。具體的說(shuō)，可以將20mg/l-500mg/l范圍的脯氨酸水溶液與適當(dāng)?shù)恼共紕┮黄鹜ㄟ^(guò)噴灑等方式撒布于植物的葉面。此外，對(duì)于氮的限制條件中生長(zhǎng)發(fā)育，以與上述同樣的條件和方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
通過(guò)對(duì)由NADP-GDH基因或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的過(guò)量表達(dá)操作獲得的植物進(jìn)行制備、產(chǎn)量調(diào)查，以及成分分析的以下的實(shí)施例，或者關(guān)于受到脯氨酸葉面撒布的植物的產(chǎn)量調(diào)查，成分分析的以下的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1由構(gòu)巢曲霉獲得的NADP依賴(lài)型GDH基因的分離和Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建(1)構(gòu)巢曲霉獲得的NADP依賴(lài)型GDH基因的分離在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中接種構(gòu)巢曲霉，30℃下培養(yǎng)一夜，進(jìn)而將所獲得的菌落在葡萄糖液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天。從增殖的菌中提取總RNA。
采用poly(A)Qucik mRNA Isolation Kit(stratagene公司)純化mRNA后，用第一鏈cDNA合成試劑盒(Amersham Bioscience公司)制成第一鏈cDNA。以制成的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件是94℃-3分鐘；94℃-45秒、59℃-30秒、72℃-90秒、35個(gè)循環(huán)；72℃-10分鐘，采用Perkin-Elmer公司的PCR系統(tǒng)24000進(jìn)行。所用的引物有5’-TCT AGA ATG TCT AAC CCC CTT GTT GAG-3’(序列號(hào)5)和5’-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3’(序列號(hào)6)。其結(jié)果是，確定出約1.4kbp的條帶，與預(yù)測(cè)的基因大小一致。用TA-Cloning-Kit對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。用測(cè)序儀(ABI公司377A)確定所得克隆的堿基序列。與已知的從構(gòu)巢曲霉獲得的NADP依賴(lài)型GDH基因相一致，表示為An-GDH(序列號(hào)17)。
(2)Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建進(jìn)而，將編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的堿基序列添加到獲得的基因上。這是源于番茄的NADP依賴(lài)型GDH基因的5’側(cè)的序列，其通過(guò)采用引物5’-CTG CAG ATG AAT GCT TTA GCA GCAAC-3’(序列號(hào)7)和5’-TCT AGA TAA ACC AAG AAG CCT AGC TG-3’(序列號(hào)8)的PCR獲得。這樣獲得的An-GDH基因與編碼向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的堿基序列的連結(jié)是用以下4種引物進(jìn)行的5’-TCT AGA ATG AAT GCT TTAGCA GCA AC-3’(序列號(hào)9)，5’-GGG AAG GTT TAG ACA TTA AACCAA GAA GCC T-3’(序列號(hào)10)，5’-AGG CTT CTT GGT TTA ATGTCT AAC CTT CCC-3’(序列號(hào)11)和5’-GAG CTC TTA CGC CTCCCA TCC TCG AA-3’(序列號(hào)12)。添加了向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的GDH基因作為Mtd-An-GDH。這種Mtd-An-GDH基因與由農(nóng)桿菌產(chǎn)生的用于轉(zhuǎn)化的載體、Ti質(zhì)粒，pIG121-Hm的GUS區(qū)域置換(圖1)。所得Ti-質(zhì)粒導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium Tumefaciens)，EHA101中，用于擬南芥和馬鈴薯的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例2.馬鈴薯轉(zhuǎn)化體的制備馬鈴薯(品種為May Queen)的轉(zhuǎn)化是按照Gordon等人(文獻(xiàn)PlantCell Reports，1993，12324-327)的方法進(jìn)行的。切下無(wú)菌誘導(dǎo)的微型塊莖，制成塊莖切片、栽培在添加了2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS瓊脂培養(yǎng)基上，25℃下24小時(shí)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)16天。含有構(gòu)建的基因的農(nóng)桿菌接種在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨，10g/酵母提取物，1g/l葡萄糖)中，28℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。在24小時(shí)培養(yǎng)的塊莖切片中加入農(nóng)桿菌液感染。10分鐘后，用經(jīng)滅菌的濾紙，去除剩余的農(nóng)桿菌液，移載到先前使用的皿中，相同條件下培養(yǎng)24小時(shí)。之后，將塊莖切片移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l鹽酸氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime hydrochloride)，2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS瓊脂培養(yǎng)基中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的選擇。將再分化的根再次移到前述選擇培養(yǎng)基中，進(jìn)行抗性的鑒定。將清楚地呈現(xiàn)卡那霉素抗性的根移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l鹽酸氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime hydrochloride)的MS瓊脂生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根的分化。至少切取三次生根的再分化植物的莖頂部，移栽到選擇生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行卡那霉素抗性的鑒定，排除嵌合個(gè)體。使這樣獲得的5個(gè)個(gè)體與土壤相適應(yīng)，獲得塊莖。
實(shí)施例3.擬南芥轉(zhuǎn)化體的制備向擬南芥導(dǎo)入基因是按照Bechtold等人(文獻(xiàn)C.R.Acad.Sci.Paris，Life Science 3161194-1199，1993)的方法進(jìn)行的。將擬南芥的種子播種在培養(yǎng)土中，將24℃下日長(zhǎng)為16小時(shí)栽培10天的幼苗每次移栽一株到一塊石棉上，在相同條件下繼續(xù)栽培2周時(shí)間。植物一抽苔就打尖，繼續(xù)栽培一周。在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的的YEP培養(yǎng)基中28℃下振動(dòng)培養(yǎng)農(nóng)桿菌24小時(shí)，通過(guò)離心(7,000rpm，10分鐘)收集菌體。將菌體懸浮于用于滲透的懸浮培養(yǎng)液(1/2ms鹽，1/2B5維生素，5％蔗糖，0.5g/lMES，0.044μM苯甲酸嘌呤，pH5.7)中。去掉已經(jīng)開(kāi)花、結(jié)果的花器后浸漬于農(nóng)桿菌懸液中，進(jìn)入干燥器，進(jìn)行15分鐘的減壓(40mmHg)處理。在1個(gè)月栽培后，采集處理的植物的種子。將種子播種于含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime)的MS瓊脂培養(yǎng)基中，進(jìn)行選擇。這樣獲得的3株轉(zhuǎn)化體被更新至T3世代，不產(chǎn)生卡那霉素抗性的分離系統(tǒng)用于分析。
實(shí)施例4.導(dǎo)入基因的確認(rèn)從選出的顯示卡那霉素抗性的個(gè)體，即5個(gè)馬鈴薯，3個(gè)擬南芥和非感染植物中提取DNA。DNA的提取是按照Honda等人(文獻(xiàn)Hondaand Hirai，1990，Jpn J Breed 40339-348)的方法進(jìn)行的。進(jìn)行用提取的DNA，采用An-GDH基因特異的引物5’-TCT AGA ATG TCT AACCCC CTT GTT GAG-3’(序列號(hào)13)和5’-GAG CTC TCA CCA CCAGTC ACC CTG GTC-3’(序列號(hào)14)，和用于擴(kuò)增載體內(nèi)的NPT II基因的引物5’-CCC CTC GGT ATC CAA TTA GAG-3’(序列號(hào)15)和5’-CGG GGG GTG GGC GAA GAA CTC CAG-3’(序列號(hào)16)的PCR分析。反應(yīng)以94℃-3分鐘；94℃-45秒、55℃-30秒、72℃-90秒、35個(gè)循環(huán)；72℃-10分鐘，采用Perkin-Elmer公司的PCR系統(tǒng)2400進(jìn)行。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行采用0.1％瓊脂糖凝膠的電泳，用溴化乙錠染色。
其結(jié)果是，由于在選出的轉(zhuǎn)化馬鈴薯(圖2)和轉(zhuǎn)化擬南芥(圖3)中，證實(shí)了An-GDH基因特異的條帶(約1.5kbp)和NPT II基因特異的條帶(約1.1kbp)，非感染植物中，沒(méi)有這些條帶，表明含有An-GDH基因的T-DHA區(qū)域?qū)朐谵D(zhuǎn)化馬鈴薯和轉(zhuǎn)化擬南芥中。
實(shí)施例5.導(dǎo)入基因的表達(dá)的確認(rèn)(NORTHERN分析)為了證實(shí)導(dǎo)入基因的表達(dá)，采用經(jīng)證實(shí)導(dǎo)入了An-GDH基因的轉(zhuǎn)化馬鈴薯和轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)行NORTHERN分析。
根據(jù)SDS-苯酚法從轉(zhuǎn)化馬鈴薯的葉組織、塊莖和轉(zhuǎn)化擬南芥的葉組織中提取RNA。提取出的RNA在含18％甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色。點(diǎn)樣在尼龍膜(HybondN+)上后，用UV固定，進(jìn)行雜交。以全長(zhǎng)An-GDH基因用作探針。Northern blot和探針的制備采用的是Roche Diagnostics公司的Dig-High Prime DNALabeling And Detection Starter Kit II和PCR Dig Probe SynthesisKit。
其結(jié)果是，在轉(zhuǎn)化馬鈴薯的葉組織和塊莖中，確認(rèn)出An-GDH基因特異的條帶(圖4)。從而判明導(dǎo)入的基因在轉(zhuǎn)化馬鈴薯的葉組織和塊莖中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。另一方面，轉(zhuǎn)化擬南芥葉組織中，確認(rèn)出An-GDH基因特異的條帶(圖5)。這提示導(dǎo)入的基因在轉(zhuǎn)化擬南芥的葉組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。非轉(zhuǎn)化馬鈴薯和非轉(zhuǎn)化擬南芥中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)An-GDH基因特異的條帶。
實(shí)施例6.導(dǎo)入基因的表達(dá)(NADP-GDH活性)為了證實(shí)導(dǎo)入基因的表達(dá)，用經(jīng)證實(shí)已經(jīng)導(dǎo)入An-GDH基因的轉(zhuǎn)化馬鈴薯和轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)行NADP-GDH活性的測(cè)定。
活性的測(cè)定是采用Ameziane等人(文獻(xiàn)Plant and Soil，2000，22147-57)的方法進(jìn)行的。用液氮冰凍轉(zhuǎn)化馬鈴薯(約0.2g)和轉(zhuǎn)化擬南芥的葉組織(約0.2g)，用乳缽破碎后，加入5倍重量的提取緩沖液{200mM Tris(pH8.0)，14mMβ-巰基乙醇，10mML-半胱氨酸-HCl，0.5mMPMSF}。移到離心管中，4℃下，以12,000rpm離心30分鐘后，超濾(Millipore，Ultrafree 0.5filter unit，Biomax-10)上清，進(jìn)而用提取緩沖液清洗3次。
在含有100mM Tris(pH8.5)，20mM 2-酮戊二酸，10mMCaCl2，0.2mM NADPH，200MmNH4Cl的反應(yīng)液中加入先前提取的粗酶液，測(cè)定340nm處的吸收度的減少。用Bradford法以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)提取的粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度。
其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化馬鈴薯的活性比非轉(zhuǎn)化馬鈴薯高約20-50倍(表1)。轉(zhuǎn)化擬南芥中也發(fā)現(xiàn)其活性比非轉(zhuǎn)化擬南芥高約5-12倍(表2)。由于未發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體有任何NADP-GDH活性，因此認(rèn)為這種活性就是由導(dǎo)入的An-GDH基因的表達(dá)產(chǎn)生的活性。
表1.轉(zhuǎn)化馬鈴薯和轉(zhuǎn)化馬鈴薯的NADP-GDH活性

表2.轉(zhuǎn)化擬南芥和轉(zhuǎn)化擬南芥的NADP-GDH活性

實(shí)施例7.導(dǎo)入了GDH基因的擬南芥和馬鈴薯的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素和硝酸含量測(cè)定轉(zhuǎn)化馬鈴薯(Mtd8)和轉(zhuǎn)化擬南芥(Mtd3)的葉組織中的2-OG，尿素和硝酸含量。馬鈴薯是將在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1個(gè)月的生長(zhǎng)旺盛植物體的葉組織用作材料。擬南芥是用在PNS培養(yǎng)基(含5mM KNO3)中生長(zhǎng)發(fā)育3周的植物體的葉組織作為材料。提取的方法是按照Agarie等人(文獻(xiàn)Plant Science，2002，162257-265)的方法進(jìn)行的。用液氮破碎葉組織(約0.1g)后，加入200μl的3％HCO4充分混合。以12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到其它的管中。在殘留的沉淀中再次加入200μl的3％HCO4，充分混合。以12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到上次的那支管中。在回收的上清中加入50-70μl的5M的K2CO3，使溶液中和。用石蕊試紙，確認(rèn)液體的pH為中性后，用滅菌水將液體體積調(diào)制成600μl，制成測(cè)定用的試樣。硝酸和尿素的測(cè)定中各自采用的是Roche Diagnostics公司的硝酸和尿素/氨F-試劑盒。對(duì)Ameziane等人(文獻(xiàn)前述)的方法進(jìn)行了改變以測(cè)定2-OG含量。在475μl的反應(yīng)液{0.1M Tris-HCl(pH8.5)，1.0mMCaCl2，0.2mM NADPH，0.2M NH4Cl}中加入20μl提取的試樣，測(cè)定340nm波長(zhǎng)處的吸光度后，加入5μl(10個(gè)單位)的谷氨酸脫氫酶(GDH)，在37℃下反應(yīng)10分鐘。再次測(cè)定340nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)加入酶液后的吸光度與加酶之前的吸光度值之差，計(jì)算出2-OG酸含量。
其結(jié)果是，轉(zhuǎn)化擬南芥的2-OG含量增加至非轉(zhuǎn)化擬南芥的2.6倍，尿素含量增加至非轉(zhuǎn)化擬南芥的2倍，硝酸含量增加至非轉(zhuǎn)化擬南芥的1.2倍。另一方面，轉(zhuǎn)化馬鈴薯中的2-OG含量也增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.7倍，尿素含量增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.5倍，硝酸含量增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.3倍(圖6A-F)。
進(jìn)而，在培養(yǎng)擬南芥時(shí)，采用在培養(yǎng)基中的氮濃度調(diào)整為10，5，3，0.3，0.1mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥的葉組織，測(cè)定2-OG含量和硝酸含量。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化擬南芥的2-OG含量與非轉(zhuǎn)化擬南芥的2-OG含量的差異隨著培養(yǎng)基中的氮含量的減少而增加(圖7)。根據(jù)該結(jié)果，認(rèn)為導(dǎo)入的GDH具有分解谷氨酸，合成2-OG和氨的功能。此外，在含有3mM以上的氮時(shí)，轉(zhuǎn)化擬南芥和非轉(zhuǎn)化擬南芥的硝酸含量的累積量均保持大致穩(wěn)定，經(jīng)證實(shí)在這種條件下轉(zhuǎn)化擬南芥的累積量最大增加至非轉(zhuǎn)化擬南芥的1.3倍。經(jīng)證實(shí)在0.3和0.1mM的氮條件下也有2.5-4.5倍的增加(圖8)。根據(jù)這些結(jié)果，表示在轉(zhuǎn)化擬南芥的葉組織中，與非轉(zhuǎn)化擬南芥相比累積了更多的硝酸，這反映氮的吸收效率增加了。
實(shí)施例8.導(dǎo)入了GDH基因的擬南芥和馬鈴薯的葉組織的氮同化相關(guān)酶的活性測(cè)定轉(zhuǎn)化擬南芥和轉(zhuǎn)化馬鈴薯的葉組織(約0.1g)中的NADH依賴(lài)型谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)、硝酸還原酶(NR)和谷氨酸合酶(GS)的酶活性。馬鈴薯是將在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1個(gè)月的生長(zhǎng)旺盛植物體的葉組織用作材料。擬南芥是用在PNS培養(yǎng)基(含5mM KNO3)中生長(zhǎng)發(fā)育3周的植物體的葉組織作為材料。粗酶液的提取是按照Groat等人(文獻(xiàn)Plant Physiol，1981，671198-1203)的方法進(jìn)行的。用液氮破碎葉組織后，加入500μl的冰冷的提取緩沖液{100mM Mes-NaOH(pH7.5)，100mM蔗糖，2％(v/v)硫基乙醇，15％乙二醇，0.1％PMSF}，輕輕地混合。0℃下以12,000rpm離心20分鐘后，用Ultrafree(Biomax-10k，Millipore公司)提純上清。用相同的緩沖液清洗3次后，溶解于100μl的緩沖液制成酶液。
同樣，NADH-GOGAT活性的測(cè)定也是按照Groat等人(文獻(xiàn)前述)的方法進(jìn)行。制備500μl的反應(yīng)液{100mM K-磷酸鹽(pH8.2)，100μMNADH，2.5mM 2-酮戊二酸，10mM L-谷氨酰胺，1mMaminooxyacetate}后，加入10μl酶液混合。測(cè)定340nm的吸光度3分鐘，測(cè)定伴隨NADH的消耗吸光度值的減少。
NR的活性是按照Ferrario-Mery等人(文獻(xiàn)Planta，197，202510-521)的方法進(jìn)行的。制備490μl的反應(yīng)液{50mM Mops-KOH(pH7.8)，1mM NaF，10mM KNO3，0.17mM NADH，10mM MgCl2或5mMEDTA}，各自加入10μl的酶液混合。16分鐘后，加入500μl 1％的磺酰胺(3N HCl中的)，進(jìn)而加入10μl 2％的N-萘基-1-二氯水合乙二胺(N-naphthyl-1-ethylene diamine dicholorhydrate)。以12,000rpm離心5分鐘后，測(cè)定540nm的吸光度。從加入MgCl2的反應(yīng)的值中減去加入EDTA的反應(yīng)時(shí)的值以獲得NR活性。
GS的活性是按照Ferrario-Mery等人(文獻(xiàn)前述)的方法進(jìn)行的。在480μl的反應(yīng)液{80mM谷氨酸，20mM MgSO4，1mM EDTA，100mMtricine，6mM羥胺，8mM ATP}中加入20μl的酶液，30℃下反應(yīng)15分鐘。加入500μl的0.37MFeCl3，0.2M三氯乙酸，0.67N HCl液，停止反應(yīng)后，測(cè)定540nm的吸光度。
以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)用Bradford法測(cè)定提取的酶液中的蛋白質(zhì)濃度。其結(jié)果是，轉(zhuǎn)化擬南芥的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性各自增加至非轉(zhuǎn)化擬南芥的1.38倍、1.40倍、1.25倍(表3)。另一方面，在轉(zhuǎn)化馬鈴薯中的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性也各自增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.33倍、1.36倍、1.01倍(表4)。通過(guò)以上結(jié)果，表示轉(zhuǎn)化擬南芥和轉(zhuǎn)化馬鈴薯與非轉(zhuǎn)化體相比，不僅氮的吸收效率提高了，而且與氮代謝相關(guān)的酶的活化，氮的代謝效率也提高了。
表3.轉(zhuǎn)化擬南芥的酶(Mtd3)活性

(單位/mg蛋白質(zhì))表4.轉(zhuǎn)化馬鈴薯的酶(Mtd8)活性

(單位/mg蛋白質(zhì))實(shí)施例9.轉(zhuǎn)化馬鈴薯的產(chǎn)量調(diào)查用轉(zhuǎn)化馬鈴薯進(jìn)行產(chǎn)量調(diào)查。產(chǎn)量調(diào)查中，采用從轉(zhuǎn)化馬鈴薯和非轉(zhuǎn)化馬鈴薯獲得的種子馬鈴薯。在改變氮濃度的條件下栽培時(shí)，就生長(zhǎng)發(fā)育和塊莖重量、塊莖數(shù)等進(jìn)行調(diào)查。設(shè)立作為標(biāo)準(zhǔn)條件的在8.5升的罐中加入3kg的Power Soil(氮總量為1.2kg)的情況和作為低氮標(biāo)準(zhǔn)的在7號(hào)罐中加入300g的Power Soil(氮總量為0.12kg)的情況的2組，土壤的剩余部分由蛭石(無(wú)養(yǎng)分)填補(bǔ)。播種3個(gè)月后就產(chǎn)量、地上部分、塊莖重量、塊莖數(shù)進(jìn)行調(diào)查。
其結(jié)果是，在氮為1.2g的組中，轉(zhuǎn)化馬鈴薯的塊莖重量和塊莖數(shù)各自增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.12-1.13倍和1.09-1.23倍(表5)。氮為0.12g組(氮限制條件)中，轉(zhuǎn)化馬鈴薯的塊莖重量和塊莖數(shù)，各自增加至非轉(zhuǎn)化馬鈴薯的1.29-1.35倍和1.24-1.56倍(表6)。
表5.在氮為1.2g的組中轉(zhuǎn)化馬鈴薯的產(chǎn)量調(diào)查(n≥8)

表6.在氮為0.12g的組中轉(zhuǎn)化馬鈴薯的產(chǎn)量調(diào)查(n≥8)

實(shí)施例10.轉(zhuǎn)化擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)查用轉(zhuǎn)化擬南芥(Mtd3)進(jìn)行生長(zhǎng)量的調(diào)查。播種在PNS培養(yǎng)基(氮源僅為硝態(tài)氮)的KNO3濃度改變?yōu)?.1，0.3，3，5mM，加入了1％蔗糖的培養(yǎng)基(使用Thermo8cm皿)中，每個(gè)皿中培養(yǎng)8株。播種3周后測(cè)定地上部分重量。數(shù)據(jù)以每組中3個(gè)皿中的平均值和誤差表示所有8株的地上部分重量。其結(jié)果是，轉(zhuǎn)化擬南芥在低氮條件下生長(zhǎng)發(fā)育比非轉(zhuǎn)化擬南芥更為良好，呈現(xiàn)為生長(zhǎng)量為非轉(zhuǎn)化擬南芥鮮重的1.1-1.14倍(表7)。
表7.含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基(含1％蔗糖)中生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)化發(fā)育擬南芥和非轉(zhuǎn)化擬南芥的鮮重(g)

實(shí)施例11.脯氨酸水溶液向馬鈴薯植物的葉面撒布采用馬鈴薯(品種為May Queen)，就在葉面撒布脯氨酸時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的效果調(diào)查。將馬鈴薯塊莖播種在裝入了1.5kg的PowerSoil(吳羽化學(xué))的7號(hào)罐中。Power Soil中所含氮肥如表8所示。在通常的栽培中，使用5g氮肥作為基肥，而本栽培試驗(yàn)在低氮條件下進(jìn)行栽培。
葉面撒布設(shè)立展布劑組(Approach B1，花王)、尿素組(展布劑+0.87mM尿素)、脯氨酸組(展布劑+1.75Mm脯氨酸)這三組，自播種后一個(gè)月時(shí)(開(kāi)花前立即)起每周對(duì)每株噴灑約20ml。撒布合計(jì)進(jìn)行6次(6周)，播種3周后進(jìn)行收獲。
表8.馬鈴薯栽培試驗(yàn)的氮施肥條件

實(shí)施例12.脯氨酸葉面撒布馬鈴薯葉組織的游離脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量的測(cè)定在馬鈴薯葉面撒布擴(kuò)展劑和尿素、脯氨酸各水溶液后，隨時(shí)間變化測(cè)定游離脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量。葉面撒布后，1，3，5，8小時(shí)時(shí)從植物的莖頂部取樣三份葉組織，充分水洗作為試樣。用液氮冰凍破碎后，加入5倍鮮重的80℃下加溫的80％乙醇，進(jìn)而在80℃下培養(yǎng)20分鐘。12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到其它管中。再次，加入80％乙醇在80℃下培養(yǎng)20分鐘，離心，回收上清，總共進(jìn)行3次同樣的提取。乙醇提取物在冷凍干燥后，加入300μl滅菌水和200μl乙醚，充分混合后，12,000rpm下離心10分鐘。去除上層的乙醚層后，將水層轉(zhuǎn)移到200μl的其它管中，再次冷凍干燥。溶解于200μl的0.02N鹽酸后，用0.22μm濾膜過(guò)濾。用日立高速氨基酸分析裝置(L8800)分析如此獲得的提取液。用同樣的植物試樣，進(jìn)行2-OG含量的測(cè)定。2-OG的提取和含量的測(cè)定用與實(shí)施例7中所述的方法相同的方法進(jìn)行。
其結(jié)果是，葉面撒布1小時(shí)后的葉組織中的脯氨酸含量在3組間沒(méi)有觀察到有顯著差別，撒布5小時(shí)后脯氨酸撒布組的葉組織中的游離脯氨酸含量顯著增加(圖11)。認(rèn)為葉面撒布的脯氨酸被吸收到葉組織中。同樣地，葉組織中的2-OG含量的測(cè)定結(jié)果是，葉面撒布1小時(shí)后的葉組織中的2-OG含量在3組間沒(méi)有觀察到有顯著差別，發(fā)現(xiàn)在撒布24小時(shí)后脯氨酸撒布組的葉組織中的游離2-OG含量顯著增加(圖12)。認(rèn)為葉面撒布的脯氨酸在被吸收到葉組織中后，代謝為2-OG，吸收到TCA循環(huán)中。
實(shí)施例13.脯氨酸葉面撒布馬鈴薯的產(chǎn)量調(diào)查對(duì)播種1個(gè)月時(shí)的馬鈴薯植物每周葉面撒布6次展布劑和尿素、脯氨酸水溶液。對(duì)每組6個(gè)罐的各組進(jìn)行栽培，莖數(shù)統(tǒng)一為1根，自播種起進(jìn)行3個(gè)月的栽培。收獲各罐中的塊莖，求出每個(gè)罐中的塊莖重量和塊莖數(shù)。
其結(jié)果是，在塊莖重量方面，展布劑組每罐中的塊莖重量為145.8g，尿素組為140.1g、脯氨酸組為158.4g，脯氨酸組的塊莖重量增加為展布劑的1.1倍。另一方面，塊莖數(shù)量方面，展布劑組為8.2個(gè)，尿素組為6.8個(gè)、脯氨酸組為8.2個(gè)，認(rèn)為就塊莖數(shù)而言沒(méi)有差異(表9)。根據(jù)以上結(jié)果，表明塊莖產(chǎn)量增加了。
表9.脯氨酸撒布的馬鈴薯產(chǎn)量 (n＝6)

實(shí)施例14.導(dǎo)入了從大腸桿菌獲得的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ECASPC)基因的轉(zhuǎn)化擬南芥的制備基于大腸桿菌中已經(jīng)報(bào)道的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ECASPC)基因的序列信息(GENBANK登錄號(hào)X03629)，分離ECASPC基因(核苷酸序列序列號(hào)19，氨基酸序列序列號(hào)20)。在相同的基因上，如實(shí)施例1中所述，添加了向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(mtdECASPC)。以植物轉(zhuǎn)化用的Ti-質(zhì)粒載體pBI121的GUS區(qū)域置換該基因后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。用這種農(nóng)桿菌以與實(shí)施例3同樣方法將mtdECASPC基因?qū)氲綌M南芥中。播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，選擇出抗性個(gè)體(T1世代)，在下個(gè)世代中獲得卡那霉素抗性和感受性以3∶1分離的系統(tǒng)(T2世代)。進(jìn)而在下個(gè)世代中，選擇所有個(gè)體顯示出抗性的系統(tǒng)(T3世代)的4個(gè)系統(tǒng)(mtdECASPC2-2，mtdECASPC6-2，mtdECASPC8-1和mtdECASPC9-1)。所得轉(zhuǎn)化體中導(dǎo)入基因的確認(rèn)通過(guò)基因組PCR按與實(shí)施例4相同方式進(jìn)行。此外，按照RT-PCR法解析導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。用Plant Rneasy Mini-Kit從擬南芥葉組織中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR試劑盒，用ECASPC特異引物進(jìn)行的。進(jìn)行94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘的30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，用溴化乙錠染色。
其結(jié)果是，顯示出卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化擬南芥中，確認(rèn)出與用作陽(yáng)性對(duì)照的mtdECASPC質(zhì)粒載體DNA作為模板時(shí)相同大小的條帶(圖13)。該結(jié)果提示，顯示出卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化擬南芥的基因組內(nèi)導(dǎo)入了mtdECASPC基因。
實(shí)施例15.ECASPC基因轉(zhuǎn)化擬南芥的氮限制條件下的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)查用所得擬南芥，根據(jù)實(shí)施例10的主要內(nèi)容進(jìn)行生長(zhǎng)量的調(diào)查。采用氮源僅為硝態(tài)氮的PNS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的KNO3濃度為5mM和10mM，各加入1％蔗糖。無(wú)菌播種種子，一周后，留下生長(zhǎng)發(fā)育一致的10株。進(jìn)而2周(自播種3周后)后，測(cè)定這10株的地上部分重量。2組植株的平均值和誤差表示于表10中。其結(jié)果顯示，導(dǎo)入了mtdECASPC基因的擬南芥與沒(méi)有導(dǎo)入基因的非轉(zhuǎn)化擬南芥相比，其地上部分鮮重顯著增加，氮為5mM的組中顯示為1.18-1.28倍，氮為10mM的組中顯示為1.12-1.38倍。
表10.

(mg，n＝2)實(shí)施例16.導(dǎo)入了mtdECASPC基因的擬南芥的2-OG含量的測(cè)定采用實(shí)施例14中選擇出的4個(gè)系統(tǒng)的導(dǎo)入了mtdECASPC基因的擬南芥進(jìn)行2-OG含量的測(cè)定。無(wú)菌播種在KNO3濃度為5mM，含有1％蔗糖的PNS培養(yǎng)基中，采用24℃下日長(zhǎng)為16小時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育2周的植物的地上部分。2-OG的提取和含量測(cè)定以與實(shí)施例7所述的方法相同的方法進(jìn)行。
其結(jié)果表明，導(dǎo)入了mtdECASPC基因的轉(zhuǎn)化擬南芥的地上部分組織中的2-OG含量顯著增加為沒(méi)有導(dǎo)入相同基因的非轉(zhuǎn)化擬南芥的1.27-1.93倍。該結(jié)果與導(dǎo)入GDH基因的轉(zhuǎn)化植物中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果極為相似。
表11.導(dǎo)入了mtdECASPC基因的擬南芥的2-OG含量

(n＞3)
序列表<110>味之素公司<120>氮限制條件下生長(zhǎng)得以改善的植物的制備方法<130>OP05262<150>JP 2003-198559<151>2003-07-17<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2334<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<220>
<221>CDS<222>(400)..(445)<220>
<221>CDS<222>(499)..(774)<220>
<221>CDS<222>(828)..(1882)<400>1ttagccctcc ctttccgatc ctatggttcc tccgatcctg accctggttg accagtgatc 60cggggccttc gagcctttcc accgtgccag ccgactttcc cgccagattt tagtcgcctc 120ccgtggccgc acccagggat cttctcgtcc gactccgggc agtatactca ttcgccggcc 180tccgccaggc cgccgtccgc ctctccccac cacccgtctc ctctgtcata cttaaacccg 240gtcgtgtgcc tctcttggac ggtctctttt tttttcttat ccatcagagc cctttgcttc 300
tctgctgctt caagtgcttc aattgtcttc tcgcgggctc agcgcattct tattaccttt 360gccacattac cttatcagca ataagcttct cgcgcaaaa atg tct aac ctt ccc414Met Ser Asn Leu Pro1 5gtt gag ccc gag ttc gag cag gcc tac aag g gtacgaccac cgttaatgaa 465Val Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr Lys10 15tggccaatga tcacagctaa tgttggcgcg cag ag ctt gcg tcg acc ctc gag 518Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu20aac tcc acc ctc ttt gag cag cac cct gaa tac cga cgg gct ctc cag 566Asn Ser Thr Leu Phe Glu Gln His Pro Glu Tyr Arg Arg Ala Leu Gln25 30 35gtc gtc tcc gtt ccc gag cgc gtt atc cag ttc cgt gtc gtt tgg gag 614Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Glu40 45 50aac gac aag ggc gag gtt cag atc aac cgc ggt tac cgt gtt cag ttc 662Asn Asp Lys Gly Glu Val Gln Ile Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gln Phe55 60 65 70aac tcc gct ctc ggt ccc tac aag ggt ggt ctc cgt ttc cac ccc tcc 710Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser75 80 85gtc aac ctt tct atc ctg aag ttc ctt ggc ttc gag cag atc ttc aaa 758Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys90 95 100aat gct ctc aca gga c gtgcgtaacc gttacttcat tggatgtttg ccaagagtac 814Asn Ala Leu Thr Gly105taattggtat tag ta aac atg ggt ggt ggc aag ggt ggt tcc gac ttc862Leu Asn Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe110 115gac ccc aag ggc aag tct gac tct gaa att cgt cgc ttc tgt acc gct 910Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ser Glu Ile Arg Arg Phe Cys Thr Ala
120 125 130 135ttc atg act gag ctc tgc aag cac atc ggc gcg gac act gac ctt ccc 958Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys His Ile Gly Ala Asp Thr Asp Leu Pro140 145 150gct ggt gat atc ggt gtt act ggc cgt gag gtt ggt ttc ctt ttc ggc1006Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Gly Phe Leu Phe Gly155 160 165cag tac cgc agg atc cgc aac cag tgg gag ggt gtt ctc act ggc aag1054Gln Tyr Arg Arg Ile Arg Asn Gln Trp Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys170 175 180ggt ggc agc tgg ggt ggt agc ttg atc cgc cct gaa gcc act gga tac1102Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr185 190 195ggt gtt gtc tac tac gtt cag cac atg atc aag cac gtt acc ggt gga1150Gly Val Val Tyr Tyr Val Gln His Met Ile Lys His Val Thr Gly Gly200 205 210 215aag gag tcc ttc gca ggc aag cgt gtc gcc atc tcc ggc tcc ggt aac1198Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn220 225 230gtt gcc cag tac gcc gct ctc aag gtc atc gag ctc ggt ggt tcc gtt1246Val Ala Gln Tyr Ala Ala Leu Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val235 240 245gtc tcc ctt tcc gac tcc aag ggc tct ctc att gtc aag gat gag tcc1294Val Ser Leu Ser Asp Ser Lys Gly Ser Leu Ile Val Lys Asp Glu Ser250 255 260gct tct ttc acc cct gaa gag atc gcc ctc att gcc gac ctc aag gtt1342Ala Ser Phe Thr Pro Glu Glu Ile Ala Leu Ile Ala Asp Leu Lys Val265 270 275gcc cgc aag caa ctc tcc gag ctc gcc acc tcc tcc gct ttc gcc ggc1390Ala Arg Lys Gln Leu Ser Glu Leu Ala Thr Ser Ser Ala Phe Ala Gly280 285 290 295aag ttc acc tac atc ccc gat gct cgc cct tgg acc aac att ccc ggc1438Lys Phe Thr Tyr Ile Pro Asp Ala Arg Pro Trp Thr Asn Ile Pro Gly
300 305 310aag ttc gag gtt gct ctc cct tct gcc act cag aac gaa gtc tcc ggc1486Lys Phe Glu Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly315 320 325gag gaa gcc gag cac ctc atc aag tcc ggt gtc cgc tat att gct gag1534Glu Glu Ala Glu His Leu Ile Lys Ser Gly Val Arg Tyr Ile Ala Glu330 335 340ggt tcc aac atg ggt tgc acc cag gcc gcc atc gac atc ttt gag gct1582Gly Ser Asn Met Gly Cys Thr Gln Ala Ala Ile Asp Ile Phe Glu Ala345 350 355cac cgc aac gcc aac ccc ggc gat gcc atc tgg tac gcc cct ggt aaa1630His Arg Asn Ala Asn Pro Gly Asp Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys360 365 370 375gcc gcc aac gct ggt ggt gtc gcc gtc tct ggt ctt gag atg gct cag1678Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln380 385 390aac tct gct cgt ctc tcc tgg aca tcc gag gag gtc gat gct cgc ctc1726Asn Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu395 400 405aag ggc atc atg gag gac tgc ttc aag aac ggt ctc gag act gct cag1774Lys Gly Ile Met Glu Asp Cys Phe Lys Asn Gly Leu Glu Thr Ala Gln410 415 420aag ttc gct act cct gcc aag ggc gtc ctg cct tcc ctc gtc acc ggt1822Lys Phe Ala Thr Pro Ala Lys Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Thr Gly425 430 435tcc aac att gcc ggt ttc acc aag gtc gcc gag gcc atg aag gac cag1870Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Glu Ala Met Lys Asp Gln440 445 450 455ggt gac tgg tgg tgaattagcc ccgtctccta attttgatgt tgcatgatga1922Gly Asp Trp Trptgattcctac gtttgttcca gcctttcggg ttttggtctt gttatgatct taccattctt 1982
agcgtggata gaggcgctgg attcgtttct actatgcttt tacctgtaga tagacctttt 2042ttgcatagtt atagtatatt ataccataga cgactttatt cttacccttt tccttagtaa 2102tgtgcaagca ctatccacat tctgaatagc ccagtatgag atttgtactc aaaaaaactt 2162aatgcccaga aaacactcgc aataagcacg gccgtgtcgc gttgtgttcc ttgagcctca 2222acagttcgaa ttaattatcg tggttggctc aggcctttat catgtgacta gactaaggat 2282tcacgtgatt agctcttgct tccacgcttc ggaatctaca tgaatgaagc tt 2334<210>2<211>459<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>2Met Ser Asn Leu Pro Val Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr Lys Glu1 5 10 15Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Glu Gln His Pro Glu20 25 30Tyr Arg Arg Ala Leu Gln Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln35 40 45Phe Arg Val Val Trp Glu Asn Asp Lys Gly Glu Val Gln Ile Asn Arg50 55 60Gly Tyr Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly65 70 75 80Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly85 90 95
Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Leu Thr Gly Leu Asn Met Gly Gly100 105 110Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ser Glu115 120 125Ile Arg Arg Phe Cys Thr Ala Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys His Ile130 135 140Gly Ala Asp Thr Asp Leu Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr Gly Arg145 150 155 160Glu Val Gly Phe Leu Phe Gly Gln Tyr Arg Arg Ile Arg Asn Gln Trp165 170 175Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu Ile180 185 190Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Gln His Met195 200 205Ile Lys His Val Thr Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val210 215 220Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ala Leu Lys Val225 230 235 240Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Val Ser Leu Ser Asp Ser Lys Gly Ser245 250 255Leu Ile Val Lys Asp Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Glu Glu Ile Ala260 265 270
Leu Ile Ala Asp Leu Lys Val Ala Arg Lys Gln Leu Ser Glu Leu Ala275 280 285Thr Ser Ser Ala Phe Ala Gly Lys Phe Thr Tyr Ile Pro Asp Ala Arg290 295 300Pro Trp Thr Asn Ile Pro Gly Lys Phe Glu Val Ala Leu Pro Ser Ala305 310 315 320Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Glu Glu Ala Glu His Leu Ile Lys Ser325 330 335Gly Val Arg Tyr Ile Ala Glu Gly Ser Asn Met Gly Cys Thr Gln Ala340 345 350Ala Ile Asp Ile Phe Glu Ala His Arg Asn Ala Asn Pro Gly Asp Ala355 360 365Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val370 375 380Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln Asn Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ser385 390 395 400Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu Lys Gly Ile Met Glu Asp Cys Phe Lys405 410 415Asn Gly Leu Glu Thr Ala Gln Lys Phe Ala Thr Pro Ala Lys Gly Val420 425 430Leu Pro Ser Leu Val Thr Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val435 440 445
Ala Glu Ala Met Lys Asp Gln Gly Asp Trp Trp450 455<210>3<211>2571<212>DNA<213>泡盛曲霉<220>
<221>CDS<222>(741)..(785)<220>
<221>CDS<222>(850)..(1142)<220>
<221>CDS<222>(1472)..(2243)<400>3tctagattgc gacggcgtat tgcttatcct tagtaggact ccctaatgga ttccgagcaa 60gaaaagactg tttggcgtgt accaatggct catagtacca gcaagagaag aattttctct120ctcgcttcga gaaagcaatc aaaaaaaaat cctatcctac cctaccctac cctaatactt180ccattgccac ccgattcctc ccgatagtag agcgggcgac tgccatttgg cgggcgggcc240agcggattcc cgccgataga taacgggcag attctgtgac ctcaaactat cgactaacag300cccgaacttc ggcggccacc gccaaacccg ccccggaagc cggcctcatt tgccgtttgg360gcgtgccagg aaatgccgcc tgcagcggag actccctagt gtggtctgtg ttgcctgtgt420cgtctgtgta gtatactagt tactagtcta ctactgtaca gtggatggcc tgaggggggg480actttatgtc cgactccggc tgttctcctc cctctatcca ctctaccctc ttccctctct540tctgtctttc tccccgctct cgcccctccc ctcctcgaaa acataaatcg gcctttcccc600ctcgccatct tcttcttctt ctccctctcc tttctctttc ttcttcagac tacttctctt660
tctttcatct tttctctata ttcctgtttt cctagatacc ccagttaaaa aagttctctc720aatcaatcct ccccttcaga atg tct aac ctt cct cac gag ccc gag ttc gag773Met Ser Asn Leu Pro His Glu Pro Glu Phe Glu1 5 10cag gcc tac aag ggtatgttcc attgcccctc cgaaattgat gatggaaaaa 825Gln Ala Tyr Lys15aaattctaac aacatcctct taca gag ctt gcc tcg acc ctt gag aac tcc 876Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser20acc ctc ttc cag aag aac ccc gaa tac cgc aag gcc ctt gct gtc gtc 924Thr Leu Phe Gln Lys Asn Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Ala Val Val25 30 35 40tcc gtc ccc gag cgt gtc atc cag ttc cgt gtc gtc tgg gag gat gat 972Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp45 50 55gcc ggc aac gtc cag gtc aac cgc ggt ttc cgt gtc cag ttc aac agc 1020Ala Gly Asn Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Phe Asn Ser60 65 70gcc ctc ggt ccc tac aag ggt ggt ctt cgt ttc cac ccc tcc gtc aac 1068Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn75 80 85ttg tcc atc ctc caa gtt cct tgg ttt cga gca gat ctt caa gaa tgc 1116Leu Ser Ile Leu Gln Val Pro Trp Phe Arg Ala Asp Leu Gln Glu Cys90 95 100tct cac tgg cct gaa cat ggg tgg tg gtaagggtgg ttccgacttc1162Ser His Trp Pro Glu His Gly Trp Trp105 110gaccccaagg gcaagtccga caacgagatc cgtcgcttct gtgtttcctt catgaccgag 1222ctctgcaagc acatcggtgc cgacactgat gttcccgctg gtgacatcgg tgtcaccggt 1282cgtgaggtcg gtttcctctt cggccagtac cgcaagatcc gcaaccagtg ggagggtgtt 1342
ctcaccggta agggtggcag ctggggtggt tccctcatcc gccctgaggc caccggttac1402ggtgttgtct acgtatgtca attcctcttc ttatgattat ctatgtataa cagcgactaa1462cgcgtaaca g tac gtc gag cac atg att gct cac gcc acc aac ggc cag 1511Tyr Val Glu His Met Ile Ala His Ala Thr Asn Gly Gln115 120 125gag tcc ttc aag ggc aag cgc gtt gcc atc tcc ggt tcc ggt aac gtt 1559Glu Ser Phe Lys Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val130 135 140gcc cag tac gcc gcc ctc aag gtc att gag ctc ggc ggt tcc gtc gtc 1607Ala Gln Tyr Ala Ala Leu Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Val145 150 155tcc ctg agc gac acg cag ggc tcc ctc atc atc aac ggc gag ggt agc 1655Ser Leu Ser Asp Thr Gln Gly Ser Leu Ile Ile Asn Gly Glu Gly Ser160 165 170ttc acc ccc gag gag atc gag ctc atc gct cag acc aag gtc gag cgc 1703Phe Thr Pro Glu Glu Ile Glu Leu Ile Ala Gln Thr Lys Val Glu Arg175 180 185 190aac gag ctc gcc agc atc gtc ggt gct gct ccc ttc agc gac gcc aac 1751Asn Glu Leu Ala Ser Ile Val Gly Ala Ala Pro Phe Ser Asp Ala Asn195 200 205aag ttc aag tac att gct ggt gcc cgc ccc tgg gtt cac gtc ggc aag 1799Lys Phe Lys Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Pro Trp Val His Val Gly Lys210 215 220gtc gac gtc gct ctc ccc tcc gct acc cag aac gaa gtt tcc ggc gag 1847Val Asp Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Glu225 230 235gag gcc cag gtc ctc atc aac gct ggc tgc aag ttc atc gcc gag ggt 1895Glu Ala Gln Val Leu Ile Asn Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly240 245 250tcc aac atg ggt tgc acc cag gag gcc atc gac acc ttc gag gcc cac 1943Ser Asn Met Gly Cys Thr Gln Glu Ala Ile Asp Thr Phe Glu Ala His255 260 265 270
cgt acc gcc aac gct ggc gcg gct gcc atc tgg tac gcc ccc ggt aag1991Arg Thr Ala Asn Ala Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys275 280 285gcc gcc aac gcc ggt ggt gtc gct gtc tcc ggt ctg gag atg gct cag2039Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln290 295 300aac tct gcc cgc ctc agc tgg act tct gag gag gtt gat gcc cgt ctt2087Asn Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu305 310 315aag gac atc atg cgc gac tgc ttc aag aac ggt ctt gag act gct cag2135Lys Asp Ile Met Arg Asp Cys Phe Lys Asn Gly Leu Glu Thr Ala Gln320 325 330gag tac gcc acc ccc gct gag ggt gtc ctg cct tcc ctg gtg acc gga2183Glu Tyr Ala Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Thr Gly335 340 345 350tcc aac att gcc ggt ttc acc aag gtg gct gcc gcc atg aag gac cag2231Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Ala Ala Met Lys Asp Gln355 360 365ggt gac tgg tgg taaatgcgga aagccgcaaa cccccgcggc ttatgtcatg2283Gly Asp Trp Trp370acgattatgt agtttgatgt tccctttcag cgcggatgga tagaggcgcc ggtgttttct 2343tgctagttta gatggatgca taatgatatc cttttcttaa tcctcaaatt cttgtaattt 2403gttgtatcaa tagtagataa tacaactgta gtcaactacc cttgcatctt cactatttgc 2463agatgcattc atctctattc cgagcacatg cacaaaccca tgggaccgca gttcactagt 2523acttagcctg ttatcttccc tctatcgcat cttaaacaac tatctaga 2571<210>4<211>370<212>PRT<213>泡盛曲霉
<400>4Met Ser Asn Leu Pro His Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr Lys Glu1 5 10 15Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys Asn Pro Glu20 25 30Tyr Arg Lys Ala Leu Ala Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln35 40 45Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Ala Gly Asn Val Gln Val Asn Arg50 55 60Gly Phe Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly65 70 75 80Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Gln Val Pro Trp85 90 95Phe Arg Ala Asp Leu Gln Glu Cys Ser His Trp Pro Glu His Gly Trp100 105 110Trp Tyr Val Glu His Met Ile Ala His Ala Thr Asn Gly Gln Glu Ser115 120 125Phe Lys Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln130 135 140Tyr Ala Ala Leu Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Val Ser Leu145 150 155 160Ser Asp Thr Gln Gly Ser Leu Ile Ile Asn Gly Glu Gly Ser Phe Thr
165 170 175Pro Glu Glu Ile Glu Leu Ile Ala Gln Thr Lys Val Glu Arg Asn Glu180 185 190Leu Ala Ser Ile Val Gly Ala Ala Pro Phe Ser Asp Ala Asn Lys Phe195 200 205Lys Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Pro Trp Val His Val Gly Lys Val Asp210 215 220Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Glu Glu Ala225 230 235 240Gln Val Leu Ile Asn Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly Ser Asn245 250 255Met Gly Cys Thr Gln Glu Ala Ile Asp Thr Phe Glu Ala His Arg Thr260 265 270Ala Asn Ala Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala275 280 285Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln Asn Ser290 295 300Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu Lys Asp305 310 315 320Ile Met Arg Asp Cys Phe Lys Asn Gly Leu Glu Thr Ala Gln Glu Tyr325 330 335Ala Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Thr Gly Ser Asn
340 345 350Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Ala Ala Met Lys Asp Gln Gly Asp355 360 365Trp Trp370<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>5tctagaatgt ctaaccccct tgttgag 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>6gagctctcac caccagtcac cctggtc 27<210>7<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>7
ctgcagatga atgctttagc agcaac 26<210>8<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>8tctagataaa ccaagaagcc tagctg 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>9tctagaatga atgctttagc agcaac 26<210>10<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>10gggaaggttt agacattaaa ccaagaagcc t31<210>11<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>11aggcttcttg gtttaatgtc taaccttccc 30<210>12<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>12gagctcttac gcctcccatc ctcgaa 26<210>13<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>13tctagaatgt ctaaccccct tgttgag 27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>14gagctctcac caccagtcac cctggtc 27<210>15
<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>15cccctcggta tccaat taga g 21<210>16<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>16cggggggtgg gcgaagaact ccag24<210>17<211>1380<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<400>17atgtctaacc ttcccgttga gcccgagttc gagcaggcct acaaggagct tgcgtcgacc 60ctcgagaact ccaccctctt tgagcagcac cctgaatacc gacgggctct ccaggtcgtc120tccgttcccg agcgcgttat ccagttccgt gtcgtttggg agaacgacaa gggcgaggtt180cagatcaacc gcggttaccg tgttcagttc aactccgctc tcggtcccta caagggtggt240ctccgtttcc acccctccgt caacctttct atcctgaagt tccttggctt cgagcagatc300ttcaaaaatg ctctcacagg actaaacatg ggtggtggca agggtggttc cgacttcgac360cccaagggca agtctgactc tgaaattcgt cgcttctgta ccgctttcat gactgagctc420tgcaagcaca tcggcgcgga cactgacctt cccgctggtg atatcggtgt tactggccgt480
gaggttggtt tccttttcgg ccagtaccgc aggatccgca accagtggga gggtgttctc 540actggcaagg gtggcagctg gggtggtagc ttgatccgcc ctgaagccac tggatacggt 600gttgtctact acgttcagca catgatcaag cacgttaccg gtggaaagga gtccttcgca 660ggcaagcgtg tcgccatctc cggctccggt aacgttgccc agtacgccgc tctcaaggtc 720atcgagctcg gtggttccgt tgtctccctt tccgactcca agggctctct cattgtcaag 780gatgagtccg cttctttcac ccctgaagag atcgccctca ttgccgacct caaggttgcc 840cgcaagcaac tctccgagct cgccacctcc tccgctttcg ccggcaagtt cacctacatc 900cccgatgctc gcccttggac caacattccc ggcaagttcg aggttgctct cccttctgcc 960actcagaacg aagtctccgg cgaggaagcc gagcacctca tcaagtccgg tgtccgctat 1020attgctgagg gttccaacat gggttgcacc caggccgcca tcgacatctt tgaggctcac 1080cgcaacgcca accccggcga tgccatctgg tacgcccctg gtaaagccgc caacgctggt 1140ggtgtcgccg tctctggtct tgagatggct cagaactctg ctcgtctctc ctggacatcc 1200gaggaggtcg atgctcgcct caagggcatc atggaggact gcttcaagaa cggtctcgag 1260actgctcaga agttcgctac tcctgccaag ggcgtcctgc cttccctcgt caccggttcc 1320aacattgccg gtttcaccaa ggtcgccgag gccatgaagg accagggtga ctggtggtga 1380<210>18<211>1383<212>DNA<213>泡盛曲霉<400>18atgtctaacc ttcctcacga gcccgagttc gagcaggcct acaaggagct tgcctcgacc 60cttgagaact ccaccctctt ccagaagaac cccgaatacc gcaaggccct tgctgtcgtc 120tccgtccccg agcgtgtcat ccagttccgt gtcgtctggg aggatgatgc cggcaacgtc 180
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<211>1191<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1188)<400>19atg ttt gag aac att acc gcc gct cct gcc gac ccg att ctg ggc ctg 48Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu1 5 10 15gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ccc ggc aaa att aac ctc ggg 96Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly20 25 30att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta ctg acc agc144Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser35 40 45gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa acc acc aaa aat192Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn50 55 60tac ctc ggc att gac ggc atc cct gaa ttt ggt cgc tgc act cag gaa240Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80ctg ctg ttt ggt aaa ggt agc gcc ctg atc aat gac aaa cgt gct cgc288Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95acg gca cag act ccg ggg ggc act ggc gca cta cgc gtg gct gcc gat336Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp100 105 110ttc ctg gca aaa aat acc agc gtt aag cgt gtg tgg gtg agc aac cca384Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro115 120 125agc tgg ccg aac cat aag agc gtc ttt aac tct gca ggt ctg gaa gtt432Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
130 135 140cgt gaa tac gct tat tat gat gcg gaa aat cac act ctt gac ttc gat480Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp145 150 155 160gca ctg att aac agc ctg aat gaa gct cag gct ggc gac gta gtg ctg528Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu165 170 175ttc cat ggc tgc tgc cat aac cca acc ggt atc gac cct acg ctg gaa576Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu180 185 190caa tgg caa aca ctg gca caa ctc tcc gtt gag aaa ggc tgg tta ccg624Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro195 200 205ctg ttt gac ttc gct tac cag ggt ttt gcc cgt ggt ctg gaa gaa gat672Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp210 215 220gct gaa gga ctg cgc gct ttc gcg gct atg cat aaa gag ctg att gtt720Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val225 230 235 240gcc agt tcc tac tct aaa aac ttt ggc ctg tac aac gag cgt gtt ggc768Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly245 250 255gct tgt act ctg gtt gct gcc gac agt gaa acc gtt gat cgc gca ttc816Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe260 265 270agc caa atg aaa gcg gcg att cgc gct aac tac tct aac cca cca gca864Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala275 280 285cac ggc gct tct gtt gtt gcc acc atc ctg agc aac gat gcg tta cgt912His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300gcg att tgg gaa caa gag ctg act gat atg cgc cag cgt att cag cgt960Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 315 320atg cgt cag ttg ttc gtc aat acg ctg cag gaa aaa ggc gca aac cgc1008Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335gac ttc agc ttt atc atc aaa cag aac ggc atg ttc tcc ttc agt ggc1056Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350ctg aca aaa gaa caa gtg ctg cgt ctg cgc gaa gag ttt ggc gta tat1104Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr355 360 365gcg gtt gct tct ggt cgc gta aat gtg gcc ggg atg aca cca gat aac1152Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380atg gct ccg ctg tgc gaa gcg att gtg gca gtg ctg taa1191Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu385 390 395<210>20<211>396<212>PRT<213>大腸桿菌<400>20Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly20 25 30Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser35 40 45Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp100 105 110Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro115 120 125Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val130 135 140Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp145 150 155 160Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu165 170 175Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu180 185 190Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro195 200 205Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp210 215 220Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly245 250 255Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe260 265 270Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala275 280 285His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg305 310 315 320Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr355 360 365Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu385 390 39權(quán)利要求
1.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于植物的2-酮戊二酸(2-OG)含量提高。
2.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于導(dǎo)入谷氨酸脫氫酶(GDH)基因，在植物體內(nèi)表達(dá)該基因，結(jié)果所述植物的2-OG含量提高。
3.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于在植物的葉面撒布脯氨酸，結(jié)果所述植物的2-OG含量提高。
4.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于導(dǎo)入ECASPC基因，在植物體內(nèi)表達(dá)該基因，結(jié)果所述植物的2-OG含量提高。
5.一種栽培2-OG含量增加了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
6.一種栽培導(dǎo)入了谷氨酸脫氫酶(GDH)基因使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
7.一種栽培葉面撒布了脯氨酸使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
8.一種栽培導(dǎo)入了ECASPC基因使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其中在施用標(biāo)準(zhǔn)氮肥量的下限至下限的1/10范圍的氮的條件下，獲得等同或優(yōu)于施用標(biāo)準(zhǔn)氮肥量的栽培條件下的生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8所述的方法，其中限制氮的栽培條件就是指在標(biāo)準(zhǔn)氮肥量的下限至下限的1/10范圍的氮肥施用量的條件。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過(guò)增加植物的2－OG含量，制備植物的氮吸收和代謝活性增加且在氮減少也就是在與通常栽培條件相比更加限制氮的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物方法。尤其是，本發(fā)明提供了通過(guò)導(dǎo)入GDH基因或ECASPC基因，在植物內(nèi)表達(dá)導(dǎo)入的GDH基因或ECASPC基因增加2－OG含量，或者通過(guò)在植物葉面撒布脯氨酸增加植物2－OG含量，提高植物的氮吸收和代謝活性，制備在與通常栽培條件相比更加限制氮的栽培條件下生長(zhǎng)發(fā)育和/或產(chǎn)量提高的植物的方法。此外，還提供了在氮限制條件下栽培這種植物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1822763SQ200480020600
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月17日
發(fā)明者木板廣明, 三輪哲也, 秋山愛(ài) 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社