專利名稱：水溶性四唑鎓化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四唑鎓化合物，特別是涉及適宜于定量分析脫氫酶或者酶基質(zhì)的新的水溶性四唑鎓化合物。
背景技術(shù)：
迄今四唑鎓化合物(四唑鎓鹽)一直被用于乳酸脫氫酶(以下簡稱LDH)、醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶等各種脫氫酶的定量分析。這是由于，四唑鎓化合物通過中間電子傳遞體接受由上述各種脫氫酶的作用游離出的氫而變成甲，因此，通過測定該甲(formazane)的吸光度，可以對脫氫酶或者它們的酶基質(zhì)進行定量。
這些脫氫酶中特別是LDH分布在所有的體細胞中，在心肌、肝臟、骨骼肌、肝臟中特別多，已經(jīng)知道在心肌梗塞、惡性腫瘤、肝疾病、進行性肌肉萎縮、血管內(nèi)溶血、巨成紅細胞性貧血等疾病的情況下，血清LDH活性會顯著地上升。從而，通過測定血液中的LDH活性，可以得到對臨床上、診斷極有意義的發(fā)現(xiàn)。在血液中的尿酸或者膽汁酸的測定中，也更期望使用難以受到生物體成分妨礙的脫氫酶的方法。
另外，近年來通過以培養(yǎng)細胞內(nèi)和從細胞漏出的脫氫酶活性作為指標，可以測定細胞繁殖能力和細胞毒性程度，并被廣泛用于簡便地知道化學(xué)物質(zhì)的毒性或者新治療藥物的效果等目的。
作為這種目的的氫受體，迄今通常使用3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4，-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-2H四唑鎓氯化物](以下簡稱為硝基TB)、[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物](以下簡稱為MTT)等。
但是，硝基TB和MTT接受氫而生成的甲不溶于水，使用上不方便。特別是在自動分析和微孔板分析中，存在生成的甲附著于室體(セル)、管和微孔板等測定系統(tǒng)上的難題，為了解決這些缺陷，需要使用生成水溶性甲的四唑鎓鹽。特別是測定生物體試樣時，為了避免包含在試樣中的生物體成分的色彩干擾，期望著可吸收長波長的紫色到藍色的甲。
本申請人的研究組首先提出了滿足這些要求的幾種四唑鎓化合物[日本特許第2592436號公報(專利文獻1)、日本特許第2819258號公報(專利文獻2)。和日本特許第2995880號公報(專利文獻3)]。這些專利中所公開的四唑鎓化合物在通過自動分析或者微孔板分析對脫氫酶或者其酶基質(zhì)進行分析時會構(gòu)成可供于實用的試劑，但是還要求進一步提高品質(zhì)。特別是，至此提出的生成長波長的甲的水溶性四唑鎓化合物在水溶液中不穩(wěn)定，因此作為試劑難以長期保存。
專利文獻1特許第2592436號公報專利文獻2特許第2819258號公報專利文獻3特許第2995880號公報發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供既可生成水溶性且呈現(xiàn)長波長的光吸收的甲，又在水溶液中長期穩(wěn)定、適宜于脫氫酶或者酶基質(zhì)的定量的水溶性四唑鎓化合物。
本發(fā)明人針對可生成溶解性良好的甲并且穩(wěn)定性高的化合物進行了反復(fù)研究，結(jié)果成功地合成出新的水溶性四唑鎓化合物，并發(fā)現(xiàn)該化合物是優(yōu)異的氫受體，并且由其生成的甲為水溶性、穩(wěn)定，可以不在分析裝置上附著或者沉淀地測定脫氫酶或者其酶基質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供下述通式(1)所表示的四唑鎓化合物。



R12、R13、R14、R16、R17、R18、R19為氫原子，R3為硝基，R6、R8、R15為磺酸基(化合物c)；R1、R2、R4、R5、R6、R7、R9、R10、R12、R13、R14、R16、R17、R18、R19為氫原子，R3、R8為硝基，R11、R15為磺酸基(化合物d)；R1、R2、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R12、R13、R14、R16、R17、R18、R19為氫原子，R3為硝基，R6、R11、R15為磺酸基(化合物e)；R1、R2、R4、R5、R7、R9、R10、R12、R13、R14、R16、R17、R19為氫原子，R3為硝基，R6、R8為磺烷氧基，R11、R18為甲氧基(化合物f)；R1、R2、R4、R5、R7、R9、R10、R12、R13、R14、R16、R17、R19為氫原子，R3為硝基，R6、R8、R11、R15為磺酸基(化合物g)。
由本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物生成的甲在長波長區(qū)域進行光吸收，并且對各四唑鎓化合物具有特有的極大吸收波長。例如，由上述的化合物a～g所生成的甲分別具有表1所示的極大吸收波長。并且，本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物在水溶液中極其穩(wěn)定，不會隨著時間而分解。
表1

以下為了使本發(fā)明的特征更明確，例舉出實施例，但是本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1示出本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物的合成例。實施例2示出本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物穩(wěn)定不隨著時間而分解。實施例3示出在作為脫氫酶反應(yīng)模式的1-甲氧基PMS/NADH體系中，由本發(fā)明的水溶性四唑鎓生成的甲的吸光度與NADN的濃度有關(guān)，本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物可以用于脫氫酶或者其酶基質(zhì)的定量分析。實施例4示出由本發(fā)明的四唑鎓化合物形成的甲的吸光度與1-甲氧基PMS/培養(yǎng)細胞體系中的細胞數(shù)有關(guān)，本發(fā)明的水溶性四唑鎓化合物可以用于實際的培養(yǎng)細胞中的脫氫酶或者酶基質(zhì)的定量。
實施例1(化合物a的合成)使10g(65.3mmol)對硝基苯肼和20.26g(65.3mmol)4-甲?；?1，3-苯二磺酸二鈉鹽一水合物懸濁在300ml甲醇中，加熱回流2小時。接著冷卻反應(yīng)懸濁液后，濾取反應(yīng)懸濁液的沉淀物，得到收率為86.9％的25.3g腙化合物。
將7.61g(17.1mmol)得到的腙化合物溶解在200ml四氫呋喃和200ml水的混合溶劑中，冷卻至3℃。向該腙水溶液中加入2,5-二甲氧基-4-(4-硝基苯基偶氮基)苯重氮鎓鹽1/2氯化鋅。一邊將該反應(yīng)溶液保持在O～3℃，一邊滴加2.08g氫氧化鈉溶解在40ml水中所形成的水溶液，滴加結(jié)束后攪拌6小時。向反應(yīng)混合液中加入鹽酸，形成弱酸性。接著減壓餾去溶劑四氫呋喃和水。得到的粗產(chǎn)物通過利用水/醇的再沉淀法精制，得到收率為11％的1.5g甲。
接著將得到的0.46g(0.61mmol)甲溶解在20ml甲醇中。向該甲溶液加入0.5ml(4.9mmol)鹽酸后，添加1g(9.1mmol)亞硝酸丁酯，在室溫攪拌1小時。接著減壓餾去溶劑甲醇后，粗產(chǎn)物通過利用水/醇的再沉淀法精制，得到收率為6.7％的30mg作為上述通式(1)的四唑鎓化合物的化合物a。
質(zhì)子核磁共振分光法(以下簡稱為1H-NMR)(重水、300MHz)δ3.64(3H，s，-OCH3)、4.18(3H，s，-OCH3)、7.89-8.05(4H，m，aromatic CH)、8.17-8.27(4H，m，aromatic CH)、8.27-8.37(2H，m，aromatic CH)、8.58-8.68(3H，m，aromaticCH)。
紅外分光法(以下簡稱為IR)(溴化鉀錠劑法、以下簡稱為KBr)3460、3100、1610、1525、1500、1345、1230、1118cm-1。
質(zhì)量分析法(質(zhì)譜、以下簡稱為MS)m/e＝735(M+1)。
(化合物b的合成)以與上述化合物a同樣的方法進行合成、進行同樣的測定。
1H-NMR(重氫甲醇、300MHz)δ7.63-7.78(3H，m，aromatic CH)、8.01-8.08(4H，s，aromatic CH)、8.18-8.28(4H，m，aromatic CH)、8.32-8.38(2H，d，aromaticCH)、8.44-8.54(3H，m，aromatic CH)。
IR(KBr)3450、3100、1620、1520、1455、1350、1220、1030、850cm-1。
MSm/e＝630(M+1)。
(化合物c的合成)以與上述化合物a同樣的方法進行合成。
1H-NMR(重氫甲醇、300MHz)δ7.98-8.12(5H，m，aromatic CH)、8.14-8.21(1H，m，aromatic CH)、8.23-8.37(3H，m，aromatic CH)、8.41-8.57(4H，m，aromaticCH)、8.71-8.75(1H，d，aromatic CH)。
IR(KBr)3480、3100、1638、1540、1355、1230、1140、855、610cm-1。
MSm/e＝834(M+1)。
(化合物d的合成)使14g(91.4mmol)對硝基苯肼和13.8g(91.4mmol)對硝基苯甲醛懸濁在400ml甲醇中，加熱回流2小時。接著冷卻反應(yīng)懸濁液后，濾取反應(yīng)懸濁液的沉淀物，從而得到收率為90.1％的23.6g腙化合物。
使31.2g 4-氨基-1，1’-偶氮苯-3，4-二磺酸鈉鹽懸濁在200ml水中，冷卻至5℃或其以下。向該懸濁液加入25.7ml濃鹽酸，接著加入5.67g溶解在50ml水中的亞硝酸鈉，然后在0-5℃下攪拌1小時，得到重氮鎓化合物水溶液。
將7.61g(17.1mmol)腙化合物溶解在300ml四氫呋喃和50ml水的混合溶劑中，冷卻至3℃。向該腙水溶液中加入合成的重氮鎓化合物水溶液。一邊將該反應(yīng)溶液保持在0～3℃，一邊滴加溶解在160ml水中的13.2g氫氧化鈉，滴加結(jié)束后攪拌3小時。向反應(yīng)混合液中加入鹽酸，形成弱酸性。接著減壓餾去溶劑四氫呋喃和水。用二甲基甲酰胺和醚對濃縮物進行再沉淀精制，得到收率為90.6％的52g重氮鎓鹽。
接著將得到的3g(4.3mmol)甲溶解在200ml甲醇和50ml二甲基甲酰胺的混合溶液中。向該甲溶液加入9ml(0.11mol)鹽酸后，添加20ml次氯酸鈉水溶液，在室溫攪拌1小時。反應(yīng)后，減壓餾去作為該反應(yīng)溶液的溶劑的甲醇和二甲基甲酰胺，然后對粗產(chǎn)物通過利用水/醇的再沉淀法精制，得到收率為27.6％的0.8g作為上述通式(1)的四唑鎓化合物的化合物d。
1H-NMR(重水、300MHz)δ8.12-8.19(3H，m，aromatic CH)、8.20-8.23(1H，d，aromatic CH)、8.23-8.26(1H，d，aromatic CH)、8.27(1H，s，aromatic CH)、8.35-8.40(2H，m，aromatic CH)、8.60-8.68(5H，m，aromatic CH)、8.71(1H，d，aromatic CH)、8.74(1H，s，aromatic CH)。
IR(KBr)3500、3110、1630、1550、1475、1365、1240、1050、870cm-1。
MSm/e＝675(M+1)。
(化合物e的合成)以與上述化合物a、d同樣的方法進行合成。
1H-NMR(重水、300MHz)δ7.83-7.97(2H，m，aromatic CH)、7.97-8.09(5H，m，aromatic CH)、8.09-8.18(1H，m，aromatic CH)、8.20-8.26(1H，m，aromaticCH)、8.27-8.33(1H，m，aromatic CH)、8.33-8.41(1H，m，aromatic CH)、8.43-8.53(1H，m，aromatic CH)。
IR(KBr)3450、3080、1630、1530、1410、1340、1220、1030、850、745、610、560cm-1。
MSm/e＝731(M+1)。
(化合物f的合成)以與上述化合物a、d同樣的方法進行合成。
1H-NMR(重水、300MHz)δ2.22-2.48(4H，m，-CH2-)、3.10-3.28(2H，m，-CH2-)、3.66(3H，s，-OCH3)、4.13(3H，s，-OCH3)、4.21-4.30(2H，m，-CH2-)、6.66-6.68(1H，m，aromatic CH)、6.89-6.93(1H，m，aromatic CH)、7.41(1H，s，aromatic CH)、7.70-7.75(1H，m，aromatic CH)、7.91(1H，s，aromatic CH)、8.12-8.22(4H，m，aromatic CH)、8.42-8.48(2H，m，aromatic CH)、8.52-8.58(2H，m，aromatic CH)。
IR(KBr)3475、2950、1620、1510、1350、1210、1050、860、610cm-1。
MSm/e＝851(M+1)。
(化合物g的合成)以與上述化合物a、d同樣的方法講行合成。
1H-NMR(重水、300MHz)δ7.53-7.63(1H，m，aromatic CH)、7.96-8.01(1H，m，aromatic CH)、8.09-8.26(6H，m，aromatic CH)、8.28-8.42(3H，m，aromaticCH)、8.52-8.64(3H，m，aromatic CH)。
IR(KBr)3450、3100、1600、1530、1350、1230、1200、1040、850、610、550cm-1。
MSm/e=705(M+1)。
實施例2用50mM三鹽酸緩沖液(pH7.4、pH8.0、pH9.0)將化合物a，b，c，d，e，f，g調(diào)制成1mM濃度。在4℃或者25℃保存溶液，針對各化合物測定上述表1所示的甲的極大吸收波長的吸光度。圖2和圖3表示化合物d的測定結(jié)果。針對其他化合物也得到同樣的結(jié)果，所有化合物在30天內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)吸光度的變化，可以確認本發(fā)明的化合物在水溶液中不會分解成甲，穩(wěn)定地存在。
另外，圖4表示比較用的日本特許第2995880號公報(專利文獻3)中公開的水溶性四唑鎓化合物在緩沖液中的吸光度變化，可以看出在隨時間的穩(wěn)定性方面存在一些困難。
實施例3向5ml含有1mm的化合物a，b，c，d，e或者f以及5μM的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(以下簡稱為1-甲氧基PMS)的50mM三鹽酸緩沖液(pH8.0)，分別加入0、10、20、30、40和50μl(各自的NADH最終濃度為0、10、20、30、40和50gmol/l)的5mM還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下簡稱為NADH)，在室溫反應(yīng)5分鐘后，測定吸光度。對每個化合物所得到的吸收光譜示于圖5(化合物a)、圖6(化合物b)、圖7(化合物c)、圖8(化合物d)、圖9(化合物e)、

圖10(化合物f)、圖11(化合物g)。隨著NADH濃度變化，化合物a的527nm、化合物b的493nm、化合物c的472nm、化合物d的530nm、化合物e的474nm、化合物f的530nm、化合物g的473nm的吸光度上升，可以確認生成甲。并且，也沒有發(fā)現(xiàn)甲于測定室體上的吸附。
另外，如圖12所示在NADH和吸光度之間得到良好的直線性標準曲線，可以確認本發(fā)明的化合物可以用于脫氫酶反應(yīng)的定量分析。
實施例4將化合物d和1-甲氧基PMS各5mM和0.2mM溶解在150mM食鹽水中，調(diào)制試劑溶液。從25000細胞/孔開始通過倍稀釋法對96孔微孔板以每孔100ul進行接種人體宮頸癌細胞，再于細胞培養(yǎng)用恒溫器中在37℃下孵育3小時。向各孔每孔添加10ul的試劑溶液，在恒溫器中在37℃下孵育1.5小時后，用微孔板讀數(shù)儀測定530nm的吸光度。沒有觀測到甲吸附在微孔板上，在細胞數(shù)(對應(yīng)于酶或者基質(zhì)的濃度)和吸光度之間得到良好的標準曲線(圖13)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明作為采用可長期使用的穩(wěn)定試劑進行的高靈敏度的臨床檢查法，通過定量分析以LDH為代表的生物體中的各種脫氫酶，可以得到對疾病的診斷或者治療極有意義的發(fā)現(xiàn)，進而通過測定培養(yǎng)細胞內(nèi)或者從培養(yǎng)細胞漏出的脫氫酶，在新化學(xué)物質(zhì)或者藥劑開發(fā)時可以有效地作為得知它們的毒性或者功效等的手段。
權(quán)利要求
1.水溶性四唑鎓化合物，其特征在于，用下述通式(1)表示， 式中，R1～R19各自獨立為氫原子，硝基，磺酸基，或者碳原子數(shù)1～4的烷基、烷氧基、磺烷基或磺烷氧基，其中，R1～R19中至少2個各自獨立為磺酸基，或者碳原子數(shù)1～4的磺烷基或磺烷氧基，M為堿金屬或者銨。
2.脫氫酶或者酶基質(zhì)的定量方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1的四唑鎓化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，測定培養(yǎng)細胞內(nèi)的脫氫酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，測定從培養(yǎng)細胞內(nèi)漏出的脫氫酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提供既可生成水溶性且呈現(xiàn)長波長的光吸收的甲，又在水溶液中長期穩(wěn)定、適宜于脫氫酶或者酶基質(zhì)的定量的水溶性四唑鎓化合物。所述水溶性四唑鎓化合物是用下述通式(1)表示的水溶性四唑鎓化合物。式中，R
文檔編號C12Q1/32GK1823049SQ20048002001
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者福岡由里子, 坂本亮, 石山宗孝 申請人:株式會社同仁化學(xué)研究所