專利名稱：用于治療疾病的b亞組腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的發(fā)明涉及使用人類B亞組腺病毒治療疾病的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
條件復(fù)制型病毒代表了一種新型的、有前途的抗癌劑。已開(kāi)發(fā)出人5型腺病毒(Ad5)衍生物，它們選擇性的在癌癥細(xì)胞中復(fù)制并將其殺死。這種病毒的原型，ONYX-015，一種C亞組腺病毒，已在I期和II期臨床試驗(yàn)中被證實(shí)對(duì)復(fù)發(fā)性頭頸癌患者和肝轉(zhuǎn)移性疾病患者具有令人鼓舞的效果。
為了使腺病毒在細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制，腺病毒的E1b基因產(chǎn)物p55與宿主細(xì)胞p53蛋白形成復(fù)合物，從而隔離和/或滅活p53并產(chǎn)生p53功能缺陷的細(xì)胞。這樣的p53功能缺陷的細(xì)胞可支持腺病毒的復(fù)制。以此方式，野生型腺病毒能在含p53的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，因?yàn)橄俨《緋55蛋白滅活和/或隔離了宿主細(xì)胞p53蛋白。Onyx-015是含有編碼突變p55蛋白的E1b位點(diǎn)的重組腺病毒，當(dāng)將它被施用于含有能被該重組腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞的個(gè)體或細(xì)胞群時(shí)，所述的突變p55蛋白基本上不能與感染細(xì)胞內(nèi)的p53蛋白形成功能性復(fù)合物。在被感染的非腫瘤細(xì)胞中重組腺病毒基本上不能有效地隔離p53蛋白導(dǎo)致所引入的重組腺病毒多核苷酸在非腫瘤細(xì)胞中不能表達(dá)復(fù)制表型。相反，缺乏功能性p53蛋白的腫瘤細(xì)胞可支持所引入的重組腺病毒的復(fù)制表型表達(dá)，所述的重組腺病毒通過(guò)腺病毒細(xì)胞病變效應(yīng)和/或與復(fù)制表型相關(guān)的負(fù)選擇基因的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的消除。
從正在進(jìn)行的Onyx-015臨床試驗(yàn)中得到的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)是，似乎效力比毒性更局限了它的治療效益。迄今為止，未觀察到劑量限制性的毒性。增強(qiáng)腫瘤消解性病毒臨床效力的一個(gè)策略是將它們與其它療法相結(jié)合，例如標(biāo)準(zhǔn)的化療，或者使它們具有抗癌基因，諸如抗血管形成因子、細(xì)胞毒性劑、前藥轉(zhuǎn)換酶或細(xì)胞因子等?？膳c化療和抗癌基因相結(jié)合的另一種方法是從遺傳學(xué)上改造病毒使其更有效，即復(fù)制更快，產(chǎn)生更多的病毒后代，以及增強(qiáng)組織和/或細(xì)胞類型特異性等。此處的目的是產(chǎn)生更迅速、更有選擇性殺死癌癥細(xì)胞、并最終根除癌癥的治療用病毒。
所述治療策略的關(guān)鍵點(diǎn)取決于腺病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的能力。此過(guò)程包括多個(gè)步驟，現(xiàn)認(rèn)為是從所述病毒通過(guò)腺病毒纖維絲-結(jié)節(jié)蛋白與其細(xì)胞受體CAR結(jié)合而附著于細(xì)胞上開(kāi)始的(Bergelson et al.(1997)Science 2751320-1323)。在第二步中，通過(guò)αvβ3和αvβ5整合素與腺病毒五鄰體基底的RGD-結(jié)構(gòu)域相互作用介導(dǎo)病毒的內(nèi)化(Wickham et al.(1993)Cell 73309-319；Mathiaset al.(1994)J.Virol.686811-6814)。內(nèi)化后，病毒顆粒向核膜轉(zhuǎn)移。在此過(guò)程中，衣殼被去除且病毒DNA最后釋放入病毒DNA起始復(fù)制的核中。細(xì)胞上CAR的存在看來(lái)是腺病毒感染效力的主要決定因素。相反，與包括avβ3和avβ5整合素在內(nèi)的二級(jí)腺病毒受體的表達(dá)無(wú)關(guān)(Hemmi等(1998)Hum Gene Ther.92363-2373)。
利用C亞組腺病毒治療癌癥的可能缺點(diǎn)有兩個(gè)。
首先，最近的實(shí)驗(yàn)工作已顯示，在患有某些形式癌癥的患者中，與體外和體內(nèi)的正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中的CAR表達(dá)都有所減少。RT-PCR和Western印跡分析發(fā)現(xiàn)，CAR表達(dá)水平和腺病毒轉(zhuǎn)染效力之間有良好的相關(guān)性。(Jee YS，Lee SG，Lee JC，Kim MJ，Lee JJ，KimDY，Park SW，Sung MW，Heo DS.Anticancer Res 2002 Sep-Oct；22(5)2629-34)。此外，將CAR轉(zhuǎn)染入無(wú)內(nèi)源性CAR表達(dá)的人膀胱癌細(xì)胞使這些細(xì)胞的感染能力顯著提高(Li et al.(1999)Cancer Res.59325-330)。
與利用C亞組腺病毒進(jìn)行癌癥治療相關(guān)的第二個(gè)缺點(diǎn)是在肝細(xì)胞中存在CAR，它具有促進(jìn)病毒在肝臟中積聚的不良副作用。屬于B體系和最佳串聯(lián)纖維體系的B亞組病毒顯示出肝轉(zhuǎn)導(dǎo)較Ad5纖維載體低兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上(Schoggins JW，Gall JG，F(xiàn)alck-PedersenE.JVirol 2003 Jan；77(2)1039-48)。
如上所述，腫瘤消解性腺病毒原型是Onyx 015，它是C亞組病毒。由于上述原因，從C亞組病毒構(gòu)建得到的腺病毒載體具有某些限制其腫瘤消解潛能的特性。為了給醫(yī)師提供另一種腫瘤消解病毒，生產(chǎn)具有Onyx 015特性和B亞組腺病毒特性的腺病毒將會(huì)是有益的。
科學(xué)和專利文獻(xiàn)方面均有報(bào)道描述了B亞組腺病毒的遺傳特性，包括這些病毒某些區(qū)域的核苷酸序列。
WO0240693A1顯示了腺病毒復(fù)制子，包含具有來(lái)自Ad5的DNA和B亞組腺病毒DNA之間的融合體的重組腺病毒。
WO0240665顯示了能夠與基于來(lái)自B亞組、優(yōu)選腺病毒第35型的血清型的重組腺病毒互補(bǔ)的包裝細(xì)胞系。
WO0227006顯示了用對(duì)骨骼肌細(xì)胞具有向性的衍生自腺病毒的基因投遞載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞的手段和方法。該基因投遞載體至少包含B亞組腺病毒纖維蛋白的向性決定部分。
WO0052186描述了對(duì)成纖維細(xì)胞樣或巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞具有組織向性的腺病毒B亞組核酸投遞載體。
WO0031285提供了對(duì)平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞具有組織向性的核酸投遞載體。在一個(gè)方面，核酸投遞載體是B亞組腺病毒的病毒衣殼。
WO8906282描述了具有經(jīng)修飾的自抑制功能結(jié)構(gòu)域的人類腺病毒B1亞組功能突變型E1A基因。
美國(guó)專利號(hào)6,492,169展現(xiàn)了與基于來(lái)自B亞組、優(yōu)選腺病毒第35型的血清型的重組腺病毒互補(bǔ)的包裝細(xì)胞系。
美國(guó)專利號(hào)5,770,442顯示了包含B亞組腺病毒嵌合纖維蛋白的重組腺病毒。
美國(guó)專利號(hào)4,920,211顯示了具有經(jīng)修飾的自抑制功能結(jié)構(gòu)域的人類腺病毒B1亞組的功能突變型E1A基因，它對(duì)表達(dá)可刺激而不凈抑制控制E1A突變基因的啟動(dòng)子的E1A產(chǎn)物是有效的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了人類B亞組腺病毒第3型的完整核苷酸序列以及編碼E1B 55K蛋白質(zhì)的區(qū)域。
圖2顯示了人類B亞組腺病毒第34型的完整核苷酸序列以及編碼E1B 55K蛋白質(zhì)的區(qū)域。
圖3顯示了人類B亞組腺病毒第3型的E1A區(qū)的cDNA核苷酸序列。
圖4顯示了人類B亞組腺病毒第3型的cDNA編碼的E1A區(qū)的氨基酸序列。
圖5顯示了人類B亞組腺病毒第34型E1A區(qū)的cDNA核苷酸序列。
圖6顯示了人類B亞組腺病毒第34型的cDNA所編碼的的E1A區(qū)的氨基酸序列。
圖7顯示了人類B亞組腺病毒第3型的開(kāi)放讀碼框6的DNA序列。
發(fā)明概述本發(fā)明的一項(xiàng)特色是對(duì)重組溶瘤人類B亞組腺病毒的描述。
本發(fā)明還展現(xiàn)了人類B亞組腺病毒第3型和第34型的全長(zhǎng)基因組序列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括重組人類B亞組腺病毒以及由它衍生的重組病毒載體用于表達(dá)異源DNA序列的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及基于B亞組第3型和第34型的人類腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，其中E1和E3基因區(qū)之一或二者的部分或全部被缺失。
本發(fā)明的一項(xiàng)特色是對(duì)重組溶瘤人類B亞組腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能夠結(jié)合功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物的病毒癌蛋白的表達(dá)，而且主要通過(guò)不依賴CAR的機(jī)制感染細(xì)胞。
本發(fā)明的另一項(xiàng)特色是對(duì)溶瘤人類B亞組腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能夠結(jié)合功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物的病毒癌蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人類B亞組腺病毒，所述腺病毒缺乏編碼功能性E1A或E1B 55K病毒癌蛋白的能力。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面是對(duì)使用重組人類B亞組腺病毒治療疾病的描述。
在充分考慮下文后，本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域熟練從業(yè)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。
發(fā)明詳述收錄本專利全文引用的所有出版物和專利申請(qǐng)書(shū)作為參考，其程度與專門和個(gè)別地指示完整收錄每一出版物或?qū)＠?專利申請(qǐng)書(shū)相同。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用常規(guī)微生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、和重組DNA技術(shù)，它們屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分說(shuō)明。參閱，例如，Maniatis等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(1982年)；《DNA克隆實(shí)用方法》(DNA CloningA PracticalApproach)，第1卷和第2卷(D.Glover編)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait編(1984年))；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins編(1985年))；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins編(1984))；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(AnimalCell Culture)(R.Freshney編(1986年))；Perbal，《分子克隆實(shí)用指導(dǎo)》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984年)；Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版)；第1卷、第2卷、和第3卷。還可參閱Hermiston T.等，《分子醫(yī)學(xué)方法腺病毒方法和方案》(Methodsin Molecular MedicineAdenovirus Methods and Protocols)，W.S.M.Wold編，Humana出版社，1999年。
A.定義除非另有說(shuō)明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，然而本文描述的方法和材料是優(yōu)選的。
美國(guó)專利號(hào)5,677,178和5,801,029中列出的定義可用于本文，而且包括下列術(shù)語(yǔ)。
“復(fù)制缺陷型病毒”指優(yōu)先抑制支持病毒復(fù)制表型表達(dá)的預(yù)定細(xì)胞群(例如本質(zhì)上缺乏p53和/或RB功能的細(xì)胞)中的細(xì)胞增殖且在包含非復(fù)制性未轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征性的正常p53或RB水平的細(xì)胞中本質(zhì)上不能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、或表達(dá)復(fù)制表型的病毒。通常，復(fù)制缺陷型病毒在包含正常p53或RB功能的細(xì)胞中展示噬斑形成效率實(shí)質(zhì)性降低。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“p53功能”指具有基本正常水平的p53基因所編碼多肽的特性(即，相對(duì)于同一組織類型的非腫瘤細(xì)胞而言)，其中p53多肽能夠結(jié)合C亞組野生型腺病毒第34型的E1b p55蛋白質(zhì)。例如，p53功能可通過(guò)生成無(wú)活性(即突變體)形式的p53或者通過(guò)p53多肽表達(dá)的大量降低或完全失去而喪失。此外，在含編碼野生型p53蛋白質(zhì)的p53等位基因的腫瘤細(xì)胞中，p53功能也可能基本上缺失，例如，在p53位點(diǎn)之外的遺傳變異，諸如導(dǎo)致p53異常亞細(xì)胞加工或定位的突變(例如，導(dǎo)致p53定位主要在細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核中的突變)，或者p53作用分子的喪失或失活，可導(dǎo)致p53功能的喪失。也就是說(shuō)，p53作用的生化途徑可能有所變化，也會(huì)引起p53功能的喪失。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制表型”指受到病毒(諸如復(fù)制缺陷型腺病毒)感染的細(xì)胞的下列表型特征中的一項(xiàng)或多項(xiàng)(1)實(shí)質(zhì)性表達(dá)由病毒晚期基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的晚期基因產(chǎn)物，諸如衣殼蛋白(例如腺病毒五鄰體基底多肽)或RNA轉(zhuǎn)錄本；(2)病毒基因組的復(fù)制或復(fù)制中間物的形成；(3)病毒衣殼的裝配或包裝好的病毒粒子；(4)受感染細(xì)胞中細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)；(5)病毒裂解周期的完成；和(6)在受到編碼功能性癌蛋白的野生型可復(fù)制DNA病毒感染的非腫瘤細(xì)胞中消除p53功能后常常偶發(fā)的其它表型變化。復(fù)制表型包括至少一種所列表型特征，優(yōu)選超過(guò)一種上述表型特征。
術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤復(fù)制缺陷型病毒”在用于本文時(shí)指具有在人體中通過(guò)相對(duì)于受感染的相同組織學(xué)細(xì)胞類型的非復(fù)制、非腫瘤細(xì)胞而言優(yōu)先殺死受感染的腫瘤細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤發(fā)展或進(jìn)展的功能特性的重組病毒。
在用于本文時(shí)，“癌”或“腫瘤”指展示相對(duì)自主生長(zhǎng)、因而展示異常生長(zhǎng)表型(其特征是顯著喪失對(duì)細(xì)胞增殖的控制)的細(xì)胞。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指處于功能關(guān)聯(lián)的多核苷酸的連接。在將核酸置于另一種核酸序列的功能關(guān)聯(lián)中時(shí)，它與后者是“可操作連接的”。例如，若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是可操作連接的?？刹僮鬟B接意味著相連的DNA序列通常是毗鄰的，而且，對(duì)于連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)應(yīng)該是毗鄰且處于同一讀碼框。然而，由于增強(qiáng)子通常在與啟動(dòng)子相隔數(shù)千堿基時(shí)仍發(fā)揮功能，而且內(nèi)含子序列的長(zhǎng)度可變，因此有些多核苷酸元件可以是可操作相連的、但并不毗鄰。
在用于本文時(shí)，“生理學(xué)條件”指具有與完整哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者存活哺乳動(dòng)物的組織間隙或器官中的條件基本相似的離子強(qiáng)度、pH、和溫度的水性環(huán)境。通常，生理學(xué)條件包括含有大約150mM NaCl(或可選地KCl)、pH 6.5-8.1、且溫度大約20-45℃的水性溶液。通常，生理學(xué)條件是適合于生物學(xué)大分子的分子間結(jié)合的結(jié)合條件。例如，150mM NaCl、pH 7.4、37℃的生理學(xué)條件通常是合適的。
DNA“編碼序列”指處于合適調(diào)控序列的控制下時(shí)在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的邊界是由位于5′(氨基)末端的起始密碼子和位于3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定的。編碼序列可以包括但不限于原核序列、來(lái)自真核mRNA的cDNA、來(lái)自真核生物(例如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、病毒DNA、甚至合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′端。
“轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列”指能夠在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了定義本發(fā)明，啟動(dòng)子序列在3′端連接編碼序列的翻譯起始密碼子(ATG)，并且向上游(5′方向)延伸至包括啟動(dòng)高于背景的可檢測(cè)水平轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目堿基或元件。
DNA“控制序列”是啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、剪接信號(hào)、多聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控結(jié)構(gòu)域、增強(qiáng)子、翻譯終止序列等的總稱，它們?cè)谒拗骷?xì)胞中共同提供編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
當(dāng)細(xì)胞中RNA聚合酶將結(jié)合啟動(dòng)子序列并將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA、后者繼而翻譯成由編碼序列編碼的多肽時(shí)，則編碼序列“可操作連接”控制序列或受其控制。
“宿主細(xì)胞”指已經(jīng)過(guò)外源DNA序列的轉(zhuǎn)化或者能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
當(dāng)兩種多肽序列在確定的長(zhǎng)度中至少大約80％(優(yōu)選至少大約90％，且最優(yōu)選至少大約95％)的氨基酸相匹配時(shí)，則兩種多肽序列是“本質(zhì)上同源的”。
若兩種DNA序列是相同的或不超過(guò)40％的核苷酸、優(yōu)選不超過(guò)大約30％的核苷酸(即至少大約70％同源)、更優(yōu)選大約20％的核苷酸、且最優(yōu)選大約10％的核苷酸是不同的，則它們是“本質(zhì)上同源的”。
可以在例如針對(duì)特定系統(tǒng)定義的嚴(yán)謹(jǐn)條件下在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定本質(zhì)上同源的DNA序列。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件將包括在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合在濾膜上的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃清洗(Ausubel，F(xiàn).M.等編，1989年，分子生物學(xué)通用方案Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates公司，和John Wiley & Sons公司，紐約，第2.10.3頁(yè))。確定合適的雜交條件屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。參閱，例如，Maniatis等，見(jiàn)上文；DNA Cloning，第1卷和第2卷，見(jiàn)上文；核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，見(jiàn)上文。
DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)指位于另一種DNA分子內(nèi)或附著于另一種DNA分子上且在自然界中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與該另一種分子相關(guān)聯(lián)的可識(shí)別DNA區(qū)段。
“融合蛋白”常常定義為包含編碼前導(dǎo)序列或穩(wěn)定多肽的第一區(qū)域和編碼異源蛋白質(zhì)的第二區(qū)域的基因的表達(dá)產(chǎn)物。它包括包含抗原性蛋白片段或全長(zhǎng)腺病毒蛋白序列以及異源序列的多肽，所述異源序列通常是前導(dǎo)序列，其功能是實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)多肽在重組宿主中的分泌。抗原性蛋白片段的長(zhǎng)度常常是大約5-7個(gè)氨基酸。
“重組”多肽指通過(guò)重組DNA技術(shù)生成的多肽。
“本質(zhì)上純的”蛋白質(zhì)將不含其它蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少10％均一，更優(yōu)選60％均一，且最優(yōu)選95％均一。
“傳染性”指具有將腺病毒基因組投遞到細(xì)胞中的能力。
“CAR”指感染和進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中C亞組腺病毒相結(jié)合的細(xì)胞上的受體。它是Coksakie腺病毒受體的首字母縮略詞。
“溶瘤”指本發(fā)明人類B亞組腺病毒以相對(duì)于正常細(xì)胞的實(shí)質(zhì)選擇性殺死腫瘤細(xì)胞、即同時(shí)基本上不傷害正常細(xì)胞的能力。
B.通用方法B亞組腺病毒基因組/編碼區(qū)人B亞組腺病毒基因組可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。病毒，優(yōu)選來(lái)自B亞組第3和34型的病毒，可用本領(lǐng)域眾所周知的材料和方法增殖，包括A549細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)的感染和培養(yǎng)技術(shù)。Hermiston，T.等，分子醫(yī)學(xué)方法腺病毒方法及流程(Methods in Molecular MedicineAdenovirus Methods andProtocols)，W.S.M.Wold編輯，Humana Press，1999。病毒可用一種或多種技術(shù)進(jìn)行純化，包括氯化銫梯度條帶離心。例如可參閱美國(guó)專利5,837,520和美國(guó)專利6,008,036。
通過(guò)在裂解溶液中裂解病毒顆?？梢灾苽涔y(cè)序的病毒DNA，該裂解溶液優(yōu)選包括10mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，0.6％SDS和1.5mg/ml鏈霉蛋白酶(Sigma Corporation)。該溶液優(yōu)選是37℃。
用酚/氯仿提取裂解的病毒顆粒，并用乙醇沉淀病毒DNA。將純化的病毒DNA溶于重蒸水中并用于DNA測(cè)序。
然后，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇?duì)來(lái)自B亞組腺病毒第3或34型的病毒DNA進(jìn)行限制性酶切，優(yōu)選用Sau 3AI，隨后用1％的瓊脂糖凝膠分離酶切后的DNA。用商品化的DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen Corporation)純化大小在0.8kb和1.2kb之間的片段，并隨后克隆入預(yù)先用相匹配的限制性酶消化的適當(dāng)載體中。如實(shí)施例中所進(jìn)一步描述的，可用BamHI消化載體pGem-7zf(+)(Promega Corporation)。
接著，用自動(dòng)測(cè)序儀CEQ20000XL(Beckman)和標(biāo)準(zhǔn)的T7和SP6測(cè)序引物對(duì)數(shù)百個(gè)單獨(dú)克隆進(jìn)行測(cè)序。用SeqMan軟件(DNAStar Inc.)建立毗連序列群(contigs)?；谝呀⒌男蛄校铣晒押塑账岵⒖蛇M(jìn)行引物步行法直至所有的毗連序列群都連接起來(lái)。如下所述，至少進(jìn)行兩次獨(dú)立的測(cè)序以覆蓋大部分區(qū)域。
本發(fā)明公布了人B亞組第3和34型的完整核苷酸基因組序列。分別參閱圖1和圖2。
此外，還顯示了這些病毒的某些區(qū)域的核苷酸序列，包括E1A(圖3和5分別對(duì)應(yīng)于第3和34型)以及E1A區(qū)域的氨基酸序列(圖4和6分別對(duì)應(yīng)于第3和34型)。對(duì)于腺病毒第3和34型而言，也對(duì)編碼55K蛋白的E1B區(qū)的核苷酸編碼序列以及它們的氨基酸序列分別如圖1和圖2所示。
除了人B亞組腺病毒第3和34型的基因組序列之外，也對(duì)這些病毒的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序并確定了氨基酸序列。如圖3。
重組子在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明確定并提供了一種缺失人B亞組腺病毒部分或全部核苷酸序列(包括E1區(qū)域，尤其是E1B區(qū)域和/或E3區(qū)域)的方式。如果需要，可插入編碼外源基因或其片段的異源或同源核苷酸序列以產(chǎn)生人腺病毒重組體。所謂“缺失部分核苷酸序列”是指利用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)缺失E1和/或E3區(qū)域部分的核苷酸序列。
利用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)完成插入，包括但不局限于，限制性酶切、核酸酶消化、連接、激酶和磷酸酶處理、DNA聚合酶處理、逆轉(zhuǎn)錄酶處理和化學(xué)寡核苷酸合成。將目的外源核酸序列克隆入質(zhì)粒載體，從而使外源序列兩側(cè)連接與其待定向插入的腺病毒基因組區(qū)域基本上同源的序列。然后將這些構(gòu)建體引入被目的B亞組病毒共感染的宿主細(xì)胞中。在感染期間，這些構(gòu)建體和腺病毒基因組之間將發(fā)生同源重組，從而產(chǎn)生重組腺病毒載體。如果插入發(fā)生在腺病毒基因組的必需區(qū)，則重組腺病毒載體將在補(bǔ)充由于該插入而喪失的病毒功能的輔助細(xì)胞系中增殖。
優(yōu)選的腺病毒缺失是編碼癌蛋白55K的E1B區(qū)域全部或部分被去除的缺失。此缺失導(dǎo)致產(chǎn)生復(fù)制缺陷的B亞組腺病毒。類似的，通過(guò)在E1B區(qū)進(jìn)行選擇突變，有可能產(chǎn)生復(fù)制缺陷的B亞組腺病毒。參閱美國(guó)專利6,080,578。所述的復(fù)制缺陷型B亞組腺病毒對(duì)于缺乏p53功能的腫瘤細(xì)胞而言將具有腫瘤消退的作用，且主要通過(guò)非CAR機(jī)制感染腫瘤細(xì)胞。因?yàn)镃AR高水平的存在于肝細(xì)胞中且在腫瘤細(xì)胞中常常有所減少，因此與例如C亞組腺病毒相比較而言，B亞組復(fù)制缺陷型腺病毒將具有增強(qiáng)的全身活性，不易被肝所攝取。因此，當(dāng)與C亞組腺病毒相比較時(shí)，它將同時(shí)呈現(xiàn)出較高水平的腫瘤消退活性。
在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，可以構(gòu)建這樣的重組B亞組腺病毒，其中包含在編碼E1a癌蛋白的E1a位點(diǎn)中的缺失或突變，這會(huì)造成E1a蛋白質(zhì)基本上不能與被感染細(xì)胞中的RB蛋白形成復(fù)合物。參閱，例如，美國(guó)專利5,801,029。
此類型重組B亞組病毒的優(yōu)勢(shì)在于它基本上不能有效隔離被感染的非腫瘤細(xì)胞中的RB蛋白，這導(dǎo)致所引入的重組腺病毒不能在非腫瘤細(xì)胞中表達(dá)復(fù)制表型。相反，缺乏功能性RB蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞則通過(guò)引入的重組腺病毒而支持復(fù)制表型的表達(dá)，從而通過(guò)腺病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的消融。
在這些實(shí)施方案的優(yōu)選變化方案中，重組B亞組腺病毒包含編碼突變E1a蛋白的E1a位點(diǎn)，此突變的E1a蛋白缺乏能結(jié)合pRB(和/或300kD多肽和/或107kD多肽)的結(jié)構(gòu)域，但包含能反式激活腺病毒早期基因的功能性E1a結(jié)構(gòu)域。有關(guān)這些實(shí)施方案的其它變化形式包括重組腺病毒包含基本上不能表達(dá)可結(jié)合并滅活pRB的蛋白質(zhì)的非功能性E1a位點(diǎn)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了高效構(gòu)建、分離和增殖E3缺陷型重組B亞組腺病毒(有或無(wú)異源序列插入)的組合物和方法。這包括在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中分離重組病毒，表達(dá)腺病毒E1功能或相應(yīng)的細(xì)胞系，以及在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過(guò)同源重組構(gòu)建重組基因組、將由此獲得的重組基因組轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中以及從被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離重組病毒的方法，參閱，例如，美國(guó)專利6,492,169。
在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，重組腺病毒B亞組表達(dá)盒可通過(guò)用一種或多種適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钜吧突蚪M產(chǎn)生病毒限制性片段而獲得，所述的病毒限制性片段分別包括，例如E1，優(yōu)選編碼結(jié)合pRB的癌蛋白的E1A、或者編碼結(jié)合p53的55K蛋白的E1B，或者E3區(qū)序列。病毒限制性酶切片段可插入諸如質(zhì)粒等克隆載體中，然后可將至少一種異源序列(可以編碼或不編碼外源蛋白質(zhì))插入攜帶或未攜帶可操作性連接的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的選定病毒區(qū)中。使重組表達(dá)盒與B亞組腺病毒基因組接觸，并通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行同源重組或其它常規(guī)遺傳工程方法獲得預(yù)期的重組體。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括會(huì)支持B亞組腺病毒基因組和含病毒序列的質(zhì)粒之間、或者各自包含病毒序列的兩個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒之間進(jìn)行重組的任何細(xì)胞。重組可在諸如大腸桿菌等原核細(xì)胞中進(jìn)行，而為了產(chǎn)生病毒顆粒而進(jìn)行的含病毒基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染則在真核細(xì)胞中完成，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選293細(xì)胞及它們的同等物。細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)以及真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的培養(yǎng)和維持方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
可將一種或多種異源序列插入腺病毒B亞組基因組的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域以產(chǎn)生重組病毒載體，這只受病毒基因組插入容量以及重組病毒載體表達(dá)所插入的異源序列的能力所限制。以此方式可產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。通常，腺病毒基因組可接受大約為5％基因組長(zhǎng)度的插入片段而仍能被包裝入病毒顆粒中。通過(guò)缺失非必需區(qū)和/或缺失其功能可由輔助細(xì)胞系提供的必需區(qū)，可增加插入的容量。
在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒完成插入，該質(zhì)粒中含有插入片段預(yù)期插入的B亞組腺病毒基因組區(qū)域。然后將所述質(zhì)粒用在質(zhì)粒的病毒部分具有識(shí)別序列的限制性酶消化，并將異源序列在該限制性酶消化位點(diǎn)插入。將含有攜帶已插入異源序列之病毒基因組部分的質(zhì)粒與腺病毒基因組或含腺病毒基因組的線性化質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化入細(xì)菌細(xì)胞(諸如，大腸桿菌)中，其中的腺病毒基因組可以是全長(zhǎng)的基因組或者可以含有一個(gè)或多個(gè)缺失。質(zhì)粒之間的同源重組產(chǎn)生了含有已插入的異源序列的重組腺病毒基因組。
為了提供異源序列插入的位點(diǎn)或者為了獲得在不同位點(diǎn)進(jìn)行插入的額外能力，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法完成腺病毒B亞組序列的缺失。例如，為了將序列克隆入質(zhì)粒中，可用一種或多種限制性酶(在病毒插入片段中具有至少一個(gè)識(shí)別序列)消化并隨后連接，在某些情況下這會(huì)導(dǎo)致限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間序列的缺失。
或者，在病毒插入片段內(nèi)單一限制酶識(shí)別位點(diǎn)處的消化，隨后用核酸外切酶處理后再連接，會(huì)導(dǎo)致鄰近限制位點(diǎn)的病毒序列被缺失。如上所述構(gòu)建的包含具有一個(gè)或多個(gè)缺失的一個(gè)或多個(gè)腺病毒基因組部分的質(zhì)?？膳c腺病毒B亞組基因組(全長(zhǎng)或缺失型)或含有全長(zhǎng)或部分缺失型病毒基因組的質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染入細(xì)菌細(xì)胞中，通過(guò)同源重組產(chǎn)生含有在一個(gè)或多個(gè)特異位點(diǎn)具有缺失的病毒基因組的質(zhì)粒。然后，通過(guò)用含有重組病毒基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以獲得包含缺失的B亞組病毒。
在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，插入位點(diǎn)可鄰近腺病毒啟動(dòng)子或在其下游(在轉(zhuǎn)錄意義上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易的從此處所提供的B亞組腺病毒核苷酸序列中確定啟動(dòng)子的位置和用作插入位點(diǎn)的限制性酶識(shí)別序列?；蛘?，可利用各種體外技術(shù)在特殊位點(diǎn)插入限制酶識(shí)別序列或者在不含限制酶識(shí)別序列的位點(diǎn)處插入異源序列。所述方法包括，但不局限于，用于插入一個(gè)或多個(gè)限制酶識(shí)別序列的寡核苷酸介導(dǎo)的異源雙鏈核酸分子形成(參閱，例如，Zoller等(1982)Nucleic Acids Res.106487-6500；Brennan等(1990)Roux′s Arch.Dev.Biol.19989-96；和Kunkel等(1987)Meth.Enzymology 154367-382)以及用于插入較長(zhǎng)序列的PCR-介導(dǎo)的方法。參閱，例如Zheng等，(1994)Virus Research 31163-186。
如果異源序列另外包含在真核細(xì)胞中有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，也可能獲得插入在并非腺病毒B亞組啟動(dòng)子下游的位點(diǎn)處的異源序列的表達(dá)。
本發(fā)明還提供了可用于調(diào)控異源基因表達(dá)的腺病毒B亞組調(diào)控序列。調(diào)控序列可以是，例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游調(diào)控結(jié)構(gòu)域、剪接信號(hào)、聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯調(diào)控序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯終止序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明鑒定并提供了B亞組腺病毒基因組(和其片段)的其它區(qū)域，其適于插入編碼外源基因或其片段的異源或同源核苷酸序列，以產(chǎn)生病毒重組體。在另一實(shí)施方案中，B亞組腺病毒基因組克隆可作為質(zhì)粒增殖，并且可從含質(zhì)粒的細(xì)胞中收獲傳染性病毒。
腺病毒核酸的存在可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢測(cè)，包括但不局限于，雜交試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及其它類型的擴(kuò)增反應(yīng)。類似的，蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括但不局限于，各種類型的免疫檢測(cè)法、ELISA、Western印跡、酶促檢測(cè)法、免疫組化等。各種外源基因或核苷酸序列或編碼序列(原核和真核的)可依照本發(fā)明插入腺病毒核苷酸序列中，例如DNA。
異源核苷酸序列可由一種或多種目的基因組成，優(yōu)選有治療效用的基因。在本發(fā)明的上下文中，目的基因可編碼諸如干擾素和白介素等細(xì)胞因子；淋巴因子；負(fù)選擇劑(例如，胸苷激酶)；諸如被致病生物體(病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng))所識(shí)別的受體等膜受體，優(yōu)選被HIV病毒(人免疫缺陷病毒)識(shí)別的受體；或編碼生長(zhǎng)因子的基因。此名單并非限制性的，其它目的基因也可用于本發(fā)明的上下文中。
目的基因可以是基因組形式、互補(bǔ)DNA(cDNA)形式或混合形式(微型基因，其中至少一個(gè)內(nèi)含子被缺失)。它可編碼成熟的蛋白質(zhì)、成熟蛋白質(zhì)的前體、特別是意圖被分泌并因此含有信號(hào)肽的前體、由多種來(lái)源的序列相融合所產(chǎn)生的嵌合蛋白質(zhì)或者展示改良或修飾的生物學(xué)特性的天然蛋白質(zhì)突變體。所述的突變體可通過(guò)天然蛋白質(zhì)編碼基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、取代和/或添加，或者諸如轉(zhuǎn)座或倒置等天然蛋白質(zhì)編碼序列中任何其它類型的變化來(lái)獲得。
可將目的基因置于適于其在宿主細(xì)胞中表達(dá)的元件(DNA調(diào)控序列)控制下。合適的DNA調(diào)控序列被認(rèn)為是指將基因轉(zhuǎn)錄成RNA(反義RNA或mRNA)以及mRNA翻譯成蛋白質(zhì)所需的一套元件。在轉(zhuǎn)錄所需的元件中，啟動(dòng)子被認(rèn)為特別重要。它可以是組成型啟動(dòng)子或調(diào)控型啟動(dòng)子，且可分離自真核、原核或病毒來(lái)源及甚至腺病毒來(lái)源的任何基因。或者，它可以是目的基因的天然啟動(dòng)子。通常，可對(duì)用于本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾以便包含調(diào)控序列?？梢允褂美缭试S在大量細(xì)胞類型中表達(dá)的各種啟動(dòng)子，包括HSV-1TK(1型皰疹病毒胸苷激酶)基因啟動(dòng)子、腺病毒MLP(主要的晚期啟動(dòng)子)、尤其是人2型腺病毒的啟動(dòng)子、RSV(勞氏肉瘤病毒)LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)片段)、CMV(巨細(xì)胞病毒)早期啟動(dòng)子和PGK(磷酸甘油酸激酶)基因啟動(dòng)子。
可有效用于調(diào)控B亞組腺病毒重組體復(fù)制或其基因表達(dá)的啟動(dòng)子是E2F啟動(dòng)子，如美國(guó)專利09/714,409或EPA 1230378中所述。
通過(guò)構(gòu)建重組六鄰體和/或纖維基因可將重組B亞組腺病毒載體定向于特定的細(xì)胞類型。這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物涉及宿主細(xì)胞的識(shí)別；因此，可將所述基因修飾成含有允許病毒識(shí)別備選宿主細(xì)胞的肽序列。
也可能只可使用基因核苷酸序列的片段(其中這些片段足以產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)或特異的生物學(xué)效應(yīng))而非在野生型生物體中所發(fā)現(xiàn)的完整序列。
如果有可能，可以使用合成的基因或其片段。無(wú)論如何，本發(fā)明可利用廣泛類型的基因、片段等，而并不局限于上文所提出的那些基因。
在某些情況下，特定抗原的基因可包含大量的內(nèi)含子，或者可來(lái)自RNA病毒，在這些情況下可使用互補(bǔ)DNA拷貝(cDNA)。
為了使基因能成功的表達(dá)，可將其與合適啟動(dòng)子(包括增強(qiáng)子元件和多聚腺苷酸化序列)一起插入表達(dá)載體中。使得外源基因得以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)的許多真核啟動(dòng)子和聚腺苷酸化序列以及如何構(gòu)建表達(dá)盒的方法都是本領(lǐng)域所已知的，例如在美國(guó)專利5,151,267中有所描述，其內(nèi)容在此收編作為參考。依照已知的標(biāo)準(zhǔn)選擇啟動(dòng)子，以使免疫原性蛋白質(zhì)得到最佳表達(dá)，并隨之成功的產(chǎn)生體液型、細(xì)胞介導(dǎo)型和粘膜型免疫反應(yīng)。
本發(fā)明還包括藥物組合物，其中含有治療有效量的重組人腺病毒B亞組病毒或依照本發(fā)明方法制備的來(lái)源于它的載體，并且與藥用可接受載體和/或佐劑相聯(lián)合?？梢勒毡绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備所述的藥物組合物并確定劑量。本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)任何已知的施用途徑施用，包括但不局限于，全身性的(例如，靜脈內(nèi)、氣管內(nèi)、血管內(nèi)、肺內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外的、經(jīng)腸道、肌肉內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)或顱內(nèi))施用或氣霧化施用或肺內(nèi)灌輸?？蓡蝿┝渴┯没蛟谀承r(shí)間間隔后一次或多次重復(fù)施藥。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩胶蛣┝繉㈦S條件而變化(例如，被處理的個(gè)體、待治療的病癥或者目的基因或多肽)，但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，通過(guò)用表達(dá)所述載體所缺乏的功能的病毒共感染細(xì)胞，可補(bǔ)充(提供互補(bǔ)細(xì)胞系)E1功能(或在任一具體病毒載體中可能突變或缺失的其它病毒區(qū)域的功能)。
本發(fā)明還包括含有B亞組腺病毒表達(dá)載體的表達(dá)體系，其中例如DNA等異源核苷酸序列取代了部分或全部E3區(qū)、部分或全部E1或E1B區(qū)、部分或全部E2區(qū)、部分或全部E4區(qū)、E4和基因組右末端之間的部分或全部區(qū)域、部分或全部晚期區(qū)域(L1-L7)以及/或者部分或全部被五鄰體基因所占據(jù)的區(qū)域。其中DNA等外源核苷酸序列受到或未受到任何其它異源啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)體系都可使用。
本發(fā)明在人類基因治療方面的實(shí)施旨在預(yù)防或治療包括癌癥、心血管疾病等病患，但不局限于這些疾病。當(dāng)應(yīng)用于治療癌癥時(shí)，腺病毒載體可與化學(xué)療法聯(lián)合使用。就本發(fā)明的目的而言，用本發(fā)明方法制備的載體、細(xì)胞和病毒顆?？呻x體引入受試者中(即，在取自患者的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中)，或者直接引入待治療的個(gè)體體內(nèi)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是人細(xì)胞，更優(yōu)選是肺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或者造血系統(tǒng)細(xì)胞。
本發(fā)明的腺病毒可配制成針對(duì)患者進(jìn)行治療和診斷性應(yīng)用。就治療或預(yù)防應(yīng)用而言，可將含藥理學(xué)有效量的腺病毒的無(wú)菌組合物施用于待治療的人類患者或非人類患病牲畜，例如患癌癥的人類患者或牲畜。通常，組合物在水性懸浮液中將包含大約103-1015個(gè)或更多的腺病毒顆粒。藥用可接受載體或賦形劑常常在這種無(wú)菌組合物中應(yīng)用?？梢允褂酶鞣N水性溶液，例如，水、緩沖水溶液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。這些溶液是無(wú)菌的，并且通常除了所需的腺病毒載體之外不含其它微粒物質(zhì)。組合物中可包含達(dá)到生理學(xué)條件所需的藥用可接受輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖試劑、毒性調(diào)節(jié)試劑等等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等?？砂ㄔ鰪?qiáng)腺病毒的細(xì)胞感染能力的賦形劑。
本發(fā)明的B亞組腺病毒或其中所含的DNA也可通過(guò)脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體投遞方法投遞至腫瘤細(xì)胞中；所述的投遞可基于腫瘤細(xì)胞群中存在的細(xì)胞表面特性(例如，存在與免疫脂質(zhì)體中的免疫球蛋白可結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白質(zhì))選擇性的靶向腫瘤細(xì)胞。通常，含病毒粒子的水性懸浮液被封裝于脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體中。
例如，腺病毒病毒粒子懸浮液可用常規(guī)方法包裹在微團(tuán)中以形成免疫脂質(zhì)體(美國(guó)專利5,043,164、美國(guó)專利4,957,735、美國(guó)專利4,925,661；Connor和Huang(1985)J.Cell Biol.101582；LasicDD(1992)Nature 355279；新的藥物傳送方法(Novel DrugDelivery)(Prescott LF和Nimmo WS編Wiley，New York，1989)；Reddy等(1992)J.Immunol.148第1585頁(yè))。
可利用含有能與個(gè)體的癌細(xì)胞上所存在的癌細(xì)胞抗原(例如CALLA、CEA)特異結(jié)合的抗體的免疫脂質(zhì)體來(lái)將病毒粒子或病毒粒子DNA靶向于那些細(xì)胞。
可施用含本發(fā)明腺病毒的組合物或它們的混合物來(lái)治療腫瘤性疾病。在治療性應(yīng)用中，將組合物施用于受某具體腫瘤疾病影響的患者，施用劑量足以治愈或至少部分緩解病情及其并發(fā)癥。足以達(dá)到此目的的劑量被定義為“治療有效劑量”或“有效劑量”。就此應(yīng)用而言的有效量取決于疾病的嚴(yán)重程度、患者的總體狀況以及施用途徑。
下文所述的是本發(fā)明的實(shí)施例。這些實(shí)施例只供說(shuō)明，而不希望以任何方式局限本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的許多實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明白清楚的。說(shuō)明書(shū)中所引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此收編作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1腺病毒第3型和第34型的基因組序列人類B亞組腺病毒第3型和第34型(下文也分別稱為Ad3或Ad34)由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得。使用標(biāo)準(zhǔn)的感染和培養(yǎng)技術(shù)，在同樣可由ATCC獲得的A549細(xì)胞中繁殖病毒。通過(guò)氯化銫梯度條帶離心純化這兩種病毒。
由氯化銫梯度成帶病毒顆粒通過(guò)在含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、0.6％SDS、和1.5mg/ml鏈霉蛋白酶(Sigma公司)的溶液中裂解病毒顆粒獲得病毒DNA。溶液處于37℃。將裂解后的顆粒用酚/氯仿抽提兩次，并用乙醇沉淀病毒DNA。將純化后的病毒DNA溶于蒸餾水并用于DNA測(cè)序。
接著，將病毒DNA用Sau3A I進(jìn)行有限消化，隨后在1％瓊脂糖凝膠中拆分消化后的DNA。使用商品化DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)純化大小在0.8kb和1.2kb之間的片段，隨后克隆到經(jīng)過(guò)BamH I消化的載體pGem-7zf(+)(Promega公司)中。
使用自動(dòng)化測(cè)序儀CEQ20000XL(Beckman)，用T7和SP6測(cè)序引物，對(duì)200個(gè)單克隆測(cè)序。使用SeqMan軟件(DNAStar公司)構(gòu)建毗連序列群。根據(jù)構(gòu)建的序列，合成寡核苷酸并進(jìn)行引物行走，直至將所有毗連序列群連接起來(lái)。大多數(shù)區(qū)域被至少2次獨(dú)立測(cè)序所覆蓋。
實(shí)施例2Ad34主鏈上E1B 55K缺失病毒的構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)基于pGEM(Promega公司)的載體進(jìn)行修飾，并用于克隆、亞克隆相關(guān)核苷酸序列。質(zhì)粒構(gòu)建基于以下事實(shí)Ad34基因組中距左末端6.5kb處存在唯一的Nhe I限制位點(diǎn)。質(zhì)粒構(gòu)建由用HindIII消化Ad34基因組(15ug)開(kāi)始。在1％瓊脂糖凝膠上分離大小為2.2kb和3.4kb的兩個(gè)片段，并使用Bio101基因清潔試劑盒純化。將該2.2kb片段連接到事先用HindIII消化過(guò)的pGEM-7Z(Promega)中。通過(guò)限制性作圖對(duì)構(gòu)建體評(píng)估正確片段和定向。將此構(gòu)建體稱為2.2/pGEM-7Z。接著，通過(guò)用Nhe I和Cla I消化除去2.2/pGEM7Z構(gòu)建體中Nhe I位點(diǎn)附近的HindIII位點(diǎn)，然后用Klenow補(bǔ)平，并重連。使用PCR引物P04 Fwd(5′CATGAGCTCGCGGCCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGA-3′)和Ad34-1370B(5′GGCTTAAGCTTCACAGGAA-3′)、lng基因組模板DNA、和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)通過(guò)PCR(美國(guó)專利號(hào)4,683,202)生成Ad34基因組的前1.4kb。使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，用Sac I和Hind III進(jìn)行消化，在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并用Bio101基因清潔試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的1.4kb片段連接到用Sac I和Hind III消化過(guò)的2.2/pGEM-7Z中，生成1.4/2.2/pGEM-7Z構(gòu)建體。將3.4kb片段連接到事先用Hind III消化過(guò)的pGEM-9Z(Promega)中。通過(guò)限制性作圖對(duì)構(gòu)建體評(píng)估正確片段和定向。
由于E1B19K和E1B55K基因存在交疊，通過(guò)在E1B55K起始位點(diǎn)的后面引入終止密碼子并缺失E1B19K終點(diǎn)與剩余E1B55K基因之間的序列而實(shí)現(xiàn)了E1B55K基因的滅活。
缺失的區(qū)域以Pme I位點(diǎn)取代。E1B55K的誘變使用兩步PCR過(guò)程對(duì)3.4/pGEM9Z構(gòu)建體進(jìn)行。來(lái)自第一步PCR的產(chǎn)物是使用PCR引物P02 fwd(5′-CCCTCCAGTGGAGGAGGCGGAGTAGGTTTAAACGGTGAGTATTGGGAAAACTTGGGGT-3′)、P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)、10ng 3.4/pGEM-9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。第二步PCR是使用PCR引物P01 fwd(5′-ATAAATGGATCCCGCAGACTCATTTTAGCAGGGGATACGTTTTGGATTTCG-3′)和來(lái)自第一個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物、10ng 3.4/pGEM9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。將PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化、用BsmB I和BamH I消化、在2％瓊脂糖凝膠上分離、并用Bio101基因清潔試劑盒純化。將純化后的E1B55K缺失片段連接到事先用BsmB I和BamH I消化過(guò)的3.4/pGEM9Z中，生成3.4Δ55K/pGEM-9Z。為了裝配1.4kb、2.2kb片段、和3.4Δ55K片段，用Hind III消化3.4Δ55K/pGEM-9Z構(gòu)建體，在1％瓊脂糖凝膠上分離3.4Δ55K片段，并用Bio101基因清潔試劑盒純化。將純化后的3.4Δ55K片段連接到用Hind III消化過(guò)并用CIP處理過(guò)的1.4/2.2/pGEM-7Z構(gòu)建體中，生成穿梭載體SV13。
對(duì)穿梭載體SV13測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)1.4kb片段中存在一個(gè)點(diǎn)突變，它是由PCR中的錯(cuò)誤引起的。為了糾正這個(gè)錯(cuò)誤，使用相同PCR條件但使用校正DNA聚合酶(購(gòu)自Strategene)的Pfu生成新的1.4kb PCR產(chǎn)物。
將純化后的1.4kb片段連接到用Not I和BmgB I消化過(guò)的SV13穿梭載體中，生成穿梭載體SV2-5。該構(gòu)建體通過(guò)測(cè)序得到了證實(shí)。病毒構(gòu)建和分離如S.Miyake等(PNAS 1996)所述制備B亞組腺病毒第34型(Ad34)(ATCC)TP DNA。為了構(gòu)建Ad34ΔE1B55K病毒，用Not I和Nhe I消化SV2-5構(gòu)建體(8.5ug)，在1％瓊脂糖凝膠上分離，并用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN)純化。然后將5ug該片段于室溫O/N連接到0.25ug已用Nhe I于37℃消化6小時(shí)的AD34-TP DNA中。使用哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)，依照制造商的方案，將連接混合物轉(zhuǎn)染到位于60mm培養(yǎng)皿、添加2％FBS的DMEM中的HEK293細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染物于37℃/3％CO2O/N保溫24小時(shí)。24小時(shí)后停止轉(zhuǎn)染，即除去培養(yǎng)基，并換入添加了2％FBS、2％L-谷氨酰胺、1％PS的DMEM，然后于37℃/5％CO2保溫24小時(shí)。用含有2％FBS、2％L-谷氨酰胺、1％NEAA、1％PS、和1.5％SeaPlaque瓊脂糖的DMEM感染培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，并且每2-3天用新鮮的覆蓋培養(yǎng)基供料。分離噬斑，在HEK293細(xì)胞中增殖，并使用QIAamp DNA血液試劑盒(QIAGEN)遵循制造商的建議分離病毒DNA。使用下列引物SV fwd05(5′-GGAAGACCTTAGAAAGACTAGGC-3′)和P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)，通過(guò)PCR對(duì)病毒篩選E1B55K缺失區(qū)。PCR是使用Faststart DNA聚合酶(Roche)在下列循環(huán)條件下進(jìn)行的1個(gè)循環(huán)的94℃5分鐘，25-30個(gè)循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒-90秒，以及1個(gè)循環(huán)的72℃7分鐘，最后4℃不限時(shí)。將陽(yáng)性噬斑在293/E4細(xì)胞(MicrobixBiosystems公司)上純化4輪。用引物3.4fwd03(5′-GGGATGAAGTTTCTGTATTGC-3′)和3.4rev12(5′-GTCACATCTACACACACCGG-3′)通過(guò)PCR對(duì)所有病毒分離物篩選EIB55K缺失和內(nèi)部Ad34野生型E1B55K序列。
Ad34ΔE1B55K病毒、穿梭載體、SV2-5保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)分別是______和______。
雖然出于清楚理解的目的已經(jīng)較為詳細(xì)的描述了本發(fā)明作為例示，但是顯然可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修改。
權(quán)利要求
1.用于消除細(xì)胞群中的腫瘤細(xì)胞的方法，包括下列步驟在感染條件下使(1)重組復(fù)制缺陷型B亞組腺病毒接觸(2)包含非腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群，從而產(chǎn)生受感染細(xì)胞群；所述腺病毒缺乏能夠與功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物相結(jié)合的經(jīng)表達(dá)的病毒癌蛋白，所述非腫瘤細(xì)胞包含能夠與病毒癌蛋白形成結(jié)合復(fù)合物的所述功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物，所述腫瘤細(xì)胞缺乏該功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤抑制基因是p53或pRb。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述病毒癌蛋白包含腺病毒E1b或E1A多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述B亞組腺病毒選自第3型或第34型。
5.治療患者癌癥的方法，包括下列步驟對(duì)所述患者施用重組復(fù)制缺陷型B亞組腺病毒，所述腺病毒缺乏能夠與功能性腫瘤抑制基因產(chǎn)物相結(jié)合的經(jīng)表達(dá)的腺病毒癌蛋白。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述B亞組腺病毒選自第3型或第34型。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述腺病毒癌蛋白包含E1b或E1A多肽。
8.包含圖1中所示核苷酸序列的重組B亞組第3型人類腺病毒。
9.在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與圖1中所示核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
10.包含圖2中所示核苷酸序列的重組B亞組第34型人類腺病毒。
11.在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與圖2中所示核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求8的重組B亞組第3型人類腺病毒，其在編碼分別與pRb或p53相結(jié)合的癌蛋白的E1A和/或E1B區(qū)域中包含突變，所述突變可分別減輕或消除所述癌蛋白與pRb或p53的結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的重組人類腺病毒，其中所述突變是缺失或點(diǎn)突變。
14.權(quán)利要求10的重組B亞組第34型人類腺病毒，其在編碼分別與pRb或p53結(jié)合的癌蛋白的E1A和/或B1B區(qū)中包含突變，所述突變分別減輕或消除所述癌蛋白與pRb或p53的結(jié)合。
15.權(quán)利要求14的重組人類腺病毒，其中所述突變是缺失或點(diǎn)突變。
16.圖1或2中顯示的核苷酸序列，其中包含編碼E1B 55K蛋白質(zhì)的區(qū)域，或者在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
17.由圖1或2中所示核苷酸序列編碼的E1B 55K蛋白質(zhì)，或者由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述序列發(fā)生雜交的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用人B亞組腺病毒治療疾病的方法和組合物，由這種病毒衍生的載體，包括其中一個(gè)或多個(gè)B亞組腺病毒基因被外源基因所替代的表達(dá)載體系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1934253SQ200480019901
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者Y·J·沈, A·沈, A·佩雷斯, E·塞維拉, A·阿斯佩倫德 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司