專利名稱：在含油酵母中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼可用于在含油酵母中生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的酶的核酸片段的合成。
背景技術(shù)：
很久以來(lái)就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，某些多不飽和脂肪酸，或PUFAs，是健康細(xì)胞的重要的生物學(xué)成分。例如，這樣的PUFAs被認(rèn)為是·″必需″脂肪酸，它不能夠在哺乳動(dòng)物體內(nèi)從頭合成，相反，必須從飲食中獲得或者通過(guò)亞油酸(LA)或α-亞麻酸(ALA)的進(jìn)一步去飽和及延伸產(chǎn)生；·細(xì)胞質(zhì)膜的成分，其中，它們能夠以諸如磷脂或甘油三酯的形式存在；·為正常發(fā)育所必需，特別是為嬰兒腦發(fā)育和組織形成和修復(fù)所必需；和，·在哺乳動(dòng)物體內(nèi)起著重要作用的若干種生物學(xué)活性類二十烷酸的前體，包括前列環(huán)素，類二十烷酸，白三烯和前列腺素。
在二十世紀(jì)70年代，發(fā)現(xiàn)格陵蘭島愛(ài)斯基摩人的心臟病的低發(fā)病率和大量攝入長(zhǎng)鏈ω-3PUFAs相關(guān)(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin Nutr.28958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet 2(8081)117-119(July 15，1978))。更近一些的研究業(yè)已證實(shí)了ω-3PUFAs的心血管保護(hù)作用(Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88100-108(2001)；von Schacky，C.，和Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，8890-99(2001))。另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，某些病癥對(duì)用ω-3脂肪酸治療有反應(yīng)，如在血管成形術(shù)之后的再狹窄率，炎癥癥狀和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，牛皮癬和濕疹。業(yè)已證實(shí)γ-亞麻酸(GLA，一種ω-6PUFA)能降低與應(yīng)激相關(guān)的血壓升高，并且改善算術(shù)測(cè)驗(yàn)的表現(xiàn)。業(yè)已證實(shí)GLA和二高-γ-亞麻酸(DGLA，另一種ω-6PUFA)能抑制血小板聚集，導(dǎo)致血管舒張，降低膽固醇含量，并且抑制血管壁平滑肌和纖維組織的增殖(Brenner等，Adv.Exp.Med.Viol.8385-101(1976))。施用單獨(dú)的或者與二十碳五烯酸(EPA，ω-3PUFA)組合的GLA或DGLA，業(yè)已表現(xiàn)出能減輕或防止胃腸出血，和由非甾體類抗炎藥物導(dǎo)致的其他副作用(U.S.4,666,701)。另外，業(yè)已證實(shí)GLA和DGLA能預(yù)防或治療子宮內(nèi)膜異位和經(jīng)前綜合征(U.S.4,758,592)，并且治療肌痛性腦脊髓炎和在病毒感染之后的慢性疲勞(U.S.5,116,871)。其他證據(jù)表明，PUFAs可能與鈣代謝的調(diào)控有關(guān)，表明了它們可用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和腎或尿道結(jié)石。最后，PUFAs可用于治療癌癥和糖尿病(U.S.4,826,877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)732S-737S(1993))。
PUFAs通常被劃分成兩種主要類型(由ω-6和ω-3脂肪酸組成)，它們是分別通過(guò)必需脂肪酸，LA和ALA的去飽和和延伸產(chǎn)生的。盡管具有從“必需”脂肪酸的這種常見(jiàn)的衍生，越來(lái)越明確飲食中ω-6與ω-3的比例對(duì)維持良好的健康狀態(tài)很重要。由于人類飲食習(xí)慣的改變，目前ω-6與ω-3的比例是大約10∶1，而優(yōu)選的比例是2∶1(Kris-Etherton，P.M.et al.，Am.J.Olin.Nutr.71(1SuppI.)179S-88S(2000)；Simopoulos，A.P.et al.，Ann.Nutr.Metab.43127-130(1999)；Krauss，R.M.et al.AHA Circulation 1022284-2299(2000)).
ω-6脂肪酸的主要來(lái)源是含有大量LA的植物油(如玉米油、大豆油)。GLA存在于許多植物的種子，包括月見(jiàn)草(Oenothera biennis)，，琉璃苣(Borago officinalis)和黑醋栗(Ribes nigrum)。被孢霉屬(絲狀真菌)的微生物、Entomophthora、腐酶屬和Porphyridium(紅藻)可以用于ω-6脂肪酸花生四烯酸(ARA)的商業(yè)生產(chǎn)。例如，用一種真菌高山被孢霉生產(chǎn)含ARA的油，而U.S.5,658,767(Martek Corporation)教導(dǎo)了生產(chǎn)含ARA的油的方法，包括在含有碳和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Pythium insidiuosum。
重要的ω-3PUFAs包括EPA和二十二碳六烯酸(DHA)，兩者都存在于不同類型的魚(yú)油和海洋浮游生物中。U.S.5,244,921(MartekCorporation)描述了用于生產(chǎn)含EPA的可食用油的方法，包括在發(fā)酵罐中培養(yǎng)異養(yǎng)硅藻，具體是Cyclotella sp.和Nitzschia sp。DHA可以獲自冷水海洋魚(yú)類、蛋黃部分，以及通過(guò)培養(yǎng)Dinophyceae綱的某些異養(yǎng)微藻類，具體是Crypthecodinium sp.，如C.cohnii(U.S.5,492,938和U.S.5,407,957)。十八碳四烯酸(STA)，即EPA和DHA的一種前體，可以存在于海洋油類和植物種子中；其商業(yè)來(lái)源包括在Trichodesma和Echium屬中的生產(chǎn)。ω-3酸的其它來(lái)源存在于亞麻籽油和胡桃油，它們均含有占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的ALA。
盡管PUFAs的多種商業(yè)來(lái)源來(lái)自于天然來(lái)源，但是存在與所述生產(chǎn)方法相關(guān)的若干缺陷。首先，諸如魚(yú)和植物的天然來(lái)源傾向于具有高度的不一致的油類組成。因此，從這些來(lái)源獲得的油，可能需要高度純化，以便分離或者富集一種或多種需要的PUFAs。魚(yú)油通常具有不佳的味道和氣味，這可能不能與需要的產(chǎn)物經(jīng)濟(jì)地分開(kāi)，并且可導(dǎo)致所述產(chǎn)物不能被接受為食物補(bǔ)充物。不佳的味道和氣味可以導(dǎo)致基于攝入高劑量的醫(yī)學(xué)方案不被接受，并且可能降低患者的依從性。此外，魚(yú)類可能積累環(huán)境污染物，并且攝入魚(yú)油膠囊作為飲食補(bǔ)充物可能導(dǎo)致攝入不良的污染物。天然來(lái)源同樣會(huì)出現(xiàn)可利用性的無(wú)法控制的波動(dòng)(例如，由于天氣，疾病，或者對(duì)于魚(yú)類資源來(lái)說(shuō)的過(guò)度捕撈)；和產(chǎn)生PUFAs的作物通常在經(jīng)濟(jì)上無(wú)法與為了食物生產(chǎn)而培育的雜交作物競(jìng)爭(zhēng)。能天然產(chǎn)生PUFAs的某些生物(例如，Porphyridium，被孢霉)的大規(guī)模發(fā)酵同樣可能是昂貴的，和/或難以以商業(yè)化規(guī)模培養(yǎng)。
上述限制的結(jié)果是，為了達(dá)到以下目的必須進(jìn)行大量的研究1.)開(kāi)發(fā)便于商業(yè)化生產(chǎn)的PUFAs的重組資源；和2.)修飾脂肪酸生物合成途徑，以便能夠生產(chǎn)需要的PUFAs。
在過(guò)去若干年中在從各種生物中分離，克隆并且操作脂肪酸去飽和酶和延伸酶基因方面取得了進(jìn)展。對(duì)這些基因序列的了解，提供了在不能天然產(chǎn)生PUFAs的新的宿主生物中生產(chǎn)需要的脂肪酸和/或脂肪酸組合物的前景。以下文獻(xiàn)披露了在釀酒酵母中的多種例子，如1.Domergue，F(xiàn).，et al.(Eur.J.Biochem.2694105-4113(2002))，其中海洋硅藻三角褐指藻來(lái)源的兩種去飽和酶被克隆進(jìn)釀酒酵母內(nèi)，導(dǎo)致生成了EPA；2.Beaudoin F.，et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)6421-6426(2000))，其中利用了秀麗新桿線蟲(chóng)來(lái)源的基因在釀酒酵母內(nèi)重構(gòu)了ω-3和ω-6PUFA生物合成途徑；3.Dyer，J.M.et al.(Appl.Eniv.Microbiol.，59224-230(2002))，其中在釀酒酵母內(nèi)表達(dá)了植物脂肪酸去飽和酶(FAD2和FAD3)，導(dǎo)致生成了ALA；以及4.U.S.6,136,574(Knutzon et al.，Abbott Laboratories)，其中將甘藍(lán)型油菜來(lái)源的一種去飽和酶和真菌高山被孢霉來(lái)源的兩種去飽和酶克隆進(jìn)釀酒酵母內(nèi)，導(dǎo)致生成了LA、GLA、ALA和STA。
不過(guò)，仍然需要合適的微生物系統(tǒng)，其中，上述類型的基因可以表達(dá)，以便提供商業(yè)化數(shù)量的一種或多種PUFAs的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。另外，需要富集了特殊PUFAs，特別是EPA和DHA的油。
許多微生物(包括藻類、細(xì)菌、霉菌和真菌)能夠在細(xì)胞代謝的普通過(guò)程中合成油類。因此，油生產(chǎn)包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以合成油，然后從發(fā)酵培養(yǎng)基分離微生物，并且進(jìn)行處理以回收細(xì)胞內(nèi)的油。已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試以便通過(guò)發(fā)酵手段優(yōu)化脂肪酸的生產(chǎn)，所述手段包括改變?nèi)缡褂玫奈⑸?、允許油生產(chǎn)的培養(yǎng)基和條件等參數(shù)。但是，已經(jīng)證明這些努力在改進(jìn)油產(chǎn)率或控制產(chǎn)生的油組合物的特征方面非常不成功。
以前尚未作為PUFAs的生產(chǎn)平臺(tái)檢驗(yàn)的一種類型的微生物是含油酵母。這種微生物能夠積累最多占它們的干細(xì)胞重量80％的油類。業(yè)已完善了用于生長(zhǎng)具有高油含量的含油酵母的技術(shù)(例如，參見(jiàn)EP 0005277B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16119-206(1982))，并且可以提供與生產(chǎn)ω-3或ω-6PUFAs的商業(yè)化微藻發(fā)酵相比的成本優(yōu)勢(shì)。完整的酵母細(xì)胞可能還體現(xiàn)了對(duì)ω-3或ω-6PUFA-富集的油進(jìn)行包囊以便用于功能性食品和動(dòng)物飼料添加劑的方便途徑。
盡管具有上述優(yōu)點(diǎn)，含油酵母天然上是ω-6和ω-3PUFAs缺陷型的，因?yàn)樵谶@種微生物中天然產(chǎn)生的PUFAs局限于18:2脂肪酸(以及更不常見(jiàn)的是18:3脂肪酸)。因此，要解決的問(wèn)題是，開(kāi)發(fā)能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類的含油酵母。為此，必須導(dǎo)入去飽和酶和延伸酶，這兩種酶能夠在含油酵母中合成和積累ω-3和/或ω-6脂肪酸。盡管在基因工程領(lǐng)域已經(jīng)有了進(jìn)展，但是這類技術(shù)沒(méi)有被開(kāi)發(fā)用于含油酵母。因此，必須克服與將這些特定宿主生物用于生產(chǎn)PUFAs相關(guān)的問(wèn)題。
申請(qǐng)人通過(guò)導(dǎo)入異源ω-3和/或ω-6生物合成途徑，證明了宿主解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)中PUFAs的生產(chǎn)，從而解決了上述問(wèn)題。具體地，在此生產(chǎn)了ARA(代表ω-6脂肪酸)和EPA(代表ω-3脂肪酸)，以例證本發(fā)明的技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了在含油酵母宿主中表達(dá)包括ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的酶，以便生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法，包括a)提供包括功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母；b)在可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，從而生產(chǎn)ω-3或ω-6脂肪酸；并且c)任選回收ω-3或ω-6脂肪酸。在一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)亞油酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ12去飽和酶多肽的基因；和(ii)油酸的內(nèi)源來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ12去飽和酶多肽的基因并且將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸；并且c)任選回收步驟(b)的亞油酸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)從頭生物合成或從合適的前體進(jìn)行單步驟酶促反應(yīng)而生產(chǎn)特殊ω-6脂肪酸，如亞油酸(LA)，γ-亞麻酸(GLA)，二高-γ-亞油酸(DGLA)，和花生四烯酸(ARA)的方法。類似地，本發(fā)明提供了通過(guò)單步驟酶促反應(yīng)從合適的前體生產(chǎn)特殊ω-3脂肪酸，如α-亞油酸(ALA)，十八碳四烯酸(STA)，二十碳四烯酸(ETA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸的方法。
附圖和序列描述的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示含油酵母內(nèi)脂質(zhì)積累生化機(jī)制的示意圖。
圖2表示ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑。
圖3表示用于在解脂耶氏酵母中進(jìn)行基因表達(dá)的質(zhì)粒載體pY5的構(gòu)建。
圖4表示用于在解脂耶氏酵母中進(jìn)行基因表達(dá)的質(zhì)粒載體pY5-4和pY5-13的構(gòu)建。
圖5表示中間載體pYZM5CHPPA的構(gòu)建示意圖。
圖6表示異絲水霉Δ17去飽和酶基因和密碼子優(yōu)化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成基因的DNA序列的比較。
圖7表示在解脂耶氏酵母中位于翻譯起始密碼子′ATG′周圍的優(yōu)選的共有序列。
圖8表示體外合成密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因的方案。
圖9表示用于在解脂耶氏酵母內(nèi)表達(dá)合成的密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因和野生型Δ17去飽和酶基因的質(zhì)粒。
圖10A和10B所示為對(duì)在分別經(jīng)過(guò)野生型Δ17去飽和酶基因和合成的密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母內(nèi)生成的脂肪酸進(jìn)行氣相色譜分析的結(jié)果。
圖11所示為中間載體pY24-4的構(gòu)建示意圖。
圖12所示為中間載體pYZV16的構(gòu)建示意圖。
圖13所示為整合載體pYZM5EL6的構(gòu)建示意圖。
圖14所示為整合載體pYZV5EL6和pYZV5EL6/17的構(gòu)建示意圖。
圖15是說(shuō)明由工程改造的解脂耶氏酵母生產(chǎn)ARA的色譜圖。
圖16是說(shuō)明由工程改造的解脂耶氏酵母生產(chǎn)EPA的色譜圖。
通過(guò)以下的詳細(xì)說(shuō)明和所附的序列說(shuō)明能夠更全面地理解本發(fā)明，這些內(nèi)容構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“對(duì)含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開(kāi)內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求---序列規(guī)則”)，并符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理細(xì)則的規(guī)則5.2和49.5(a-bis)，以及第208節(jié)和附錄C)。應(yīng)用于核苷酸和氨基酸序列信息的符號(hào)和格式遵循37C.F.R.§1.822所述規(guī)則。
SEQ ID NO1表示高山被孢霉Δ6去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO2表示高山被孢霉Δ6去飽和酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3表示高山被孢霉Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO4表示高山被孢霉Δ5去飽和酶的相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO5表示異絲水霉Δ17去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO6表示異絲水霉Δ17去飽和酶的相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO7表示高山被孢霉高親和力延伸酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO8表示高山被孢霉高親和力延伸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO9表示密碼子優(yōu)化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成的Δ17去飽和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs10-31相當(dāng)于11對(duì)寡核苷酸，它們共同組成了異絲水霉Δ17去飽和酶基因的完整的密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)(例如，分別為D17-1A，D17-1B，D17-2A，D17-2B，D17-3A，D17-3B，D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B，D17-9A，D17-9B，D17-10A，D17-10B，D17-11A和D17-11B)。
SEQ ID NOs32-37分別相當(dāng)于引物D17-1，D17-4R，D17-5，D17-8D，D17-8U和D17-11，用于在合成密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因期間進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
SEQ ID NOs38和39分別相當(dāng)于用于分離TEF啟動(dòng)子的引物TEF5′和TEF3′。
SEQ ID NOs40和41分別相當(dāng)于用于分離XPR2轉(zhuǎn)錄終止子的引物XPR5′和XPR3′。
SEQ ID NOs42和43相當(dāng)于引物YL21A和YL22，用于從質(zhì)粒pRSP19擴(kuò)增異絲水霉的野生型Δ17去飽和酶基因。
SEQ ID NOs44和45分別相當(dāng)于引物YL53和YL54，用于定點(diǎn)誘變，以便產(chǎn)生pYSD17M。
SEQ ID NO46和47分別對(duì)應(yīng)于引物KU5和KU3，被用于擴(kuò)增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO48；氨基酸序列如SEQ ID NO49所示)。
SEQ ID NO50和51分別對(duì)應(yīng)于引物KI5和KI3，被用于擴(kuò)增含有Impatient balsama的接合酶基因的1.1kB DNA片段(SEQ IDNO52；氨基酸序列如SEQ ID NO53所示)。
SEQ ID NO54和55分別對(duì)應(yīng)于引物KTI5和KTI3，被用于擴(kuò)增含有TEF::接合酶::XPR嵌合基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO56；氨基酸序列如SEQ ID NO57所示)。
SEQ ID NO58和59分別對(duì)應(yīng)于引物KH5和KH3，被用于擴(kuò)增含有大腸桿菌潮霉素抗性基因的1kB DNA片段(SEQ ID NO60；氨基酸序列如SEQ ID NO61所示)。
SEQ ID NO62和63分別對(duì)應(yīng)于引物KTH5和KTH3，被用于擴(kuò)增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kB DNA片段(SEQ ID NO64；氨基酸序列如SEQ ID NO65所示)。
SEQ ID NO66和67分別對(duì)應(yīng)于解脂耶氏酵母URA3基因中401bp的5’-序列和568bp的3’-序列，被用于將表達(dá)盒直接整合進(jìn)耶氏酵母基因組的Ura位點(diǎn)。
SEQ ID NO68-71分別對(duì)應(yīng)于引物YL63、YL64、YL65和YL66，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pY24-4。
SEQ ID NO72和73分別對(duì)應(yīng)于引物YL11和YL12，被用于擴(kuò)增高山被孢霉Δ5去飽和酶。
SEQ ID NO74-77分別對(duì)應(yīng)于引物YL81、YL82、YL83和YL84，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pYZM5CH。
SEQ ID NO78和79分別對(duì)應(yīng)于引物YL105和YL106，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pYZM5CHPP。
SEQ ID NO80和81分別對(duì)應(yīng)于引物YL119和YL120，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pYZM5CHPPA。
SEQ ID NO82和83分別對(duì)應(yīng)于引物YL121和YL122，被用于擴(kuò)增解脂耶氏酵母URA3基因上游440bp的5’-非編碼DNA序列(SEQ IDNO84)。
SEQ ID NO85和86分別對(duì)應(yīng)于引物YL114和YL115，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pYZV5和pYZV5P。
SEQ ID NO87對(duì)應(yīng)于適合在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)整合和表達(dá)Δ5去飽和酶基因的5.2kB DNA片段。
SEQ ID NO88-91分別對(duì)應(yīng)于引物YL61、YL62、YL69和YL70，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pY58BH。
SEQ ID NO92-95分別對(duì)應(yīng)于引物YL77、YL78、YL79A和YL80A，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pY54PC。
SEQ ID NO96對(duì)應(yīng)于適合在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)整合和同步表達(dá)Δ6去飽和酶、高山被孢霉延伸酶和高山被孢霉Δ5去飽和酶基因的8.9kB DNA片段。
SEQ ID NO97-100分別對(duì)應(yīng)于引物YL101、YL102、YL103和YL104，被用于定點(diǎn)誘變，以生成pYSD17SPC。
SEQ ID NO101對(duì)應(yīng)于適合在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)整合和同步表達(dá)Δ6去飽和酶、高山被孢霉延伸酶、高山被孢霉Δ5去飽和酶和密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因的10.3kB DNA片段。
SEQ ID NO102-113分別對(duì)應(yīng)于引物YL1、YL2、YL3、YL4、YL5、YL6、YL7、YL8、YL9、YL10、YL23和YL24，被用于構(gòu)建質(zhì)粒。
SEQ ID NO114表示異絲水霉Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO115表示異絲水霉Δ5去飽和酶的相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO116、117、120、121、124和125分別對(duì)應(yīng)于引物YL13A、YL14A、YL19A、YL20、YL15和YL16B，用于克隆多種Δ5去飽和酶基因。
SEQ ID NO118表示Isochrysis galbana Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO119表示Isochrysis galbana Δ5去飽和酶的相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO122表示Thraustochytrium aureum Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO119表示Thraustochytrium aureum Δ5去飽和酶的相應(yīng)的氨基酸序列。
SEQ ID NO126對(duì)應(yīng)于最適合在耶氏酵母種內(nèi)表達(dá)的基因的密碼子優(yōu)化翻譯起始位點(diǎn)。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人提供了在含油酵母中生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。具體地，申請(qǐng)人提供了生產(chǎn)亞油酸、γ-亞麻酸、二高-γ-亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的方法。這是通過(guò)將由賦予Δ17去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ4去飽和酶和延伸酶活性的基因編碼的功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑導(dǎo)入含油宿主酵母中以便進(jìn)行重組表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因此，本公開(kāi)內(nèi)容證明了可以對(duì)含油酵母進(jìn)行工程改造，以便能夠生產(chǎn)任何所需的PUFA組合物。
本發(fā)明具有多種用途。通過(guò)本文所披露的方法制備的PUFAs，或它的衍生物可被用作飲食代用品，或補(bǔ)充物，特別是嬰兒配方，用于靜脈內(nèi)喂飼的患者或用于預(yù)防或治療營(yíng)養(yǎng)不良。另外，可以將純化的PUFAs(或它的衍生物)摻入烹飪油，脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用時(shí)，受體能接受到所需數(shù)量的飲食補(bǔ)充。還可將PUFAs摻入嬰兒配方，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物或其他食品中，并且可以用作抗炎劑或降膽固醇劑?？扇芜x將所述組合物用于藥物學(xué)用途(人或獸醫(yī))。在這種場(chǎng)合下，PUFAs通常是口服的，不過(guò)，可以通過(guò)能夠成功地吸收它們的任何途徑施用，例如，腸胃外(例如皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi))，直腸內(nèi)，陰道內(nèi)或局部(例如，作為皮膚油膏或洗液)。
給人或動(dòng)物補(bǔ)充通過(guò)重組方法生產(chǎn)的PUFAs，可以導(dǎo)致水平增加的添加的PUFAs，以及它們的代謝產(chǎn)物。例如，用花生四烯酸(ARA)治療，不僅能夠產(chǎn)生水平增加的ARA，而且還能產(chǎn)生ARA的下游產(chǎn)物，如前列腺素。復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，可能需要組合各種PUFAs，或者添加PUFAs的不同的綴合物，以便預(yù)防，控制或克服這樣的機(jī)制，以便在個(gè)體內(nèi)獲得理想水平的特定的PUFAs。
定義在本說(shuō)明書(shū)中，使用了多種術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。提供了以下定義。
″開(kāi)放讀框″被縮寫(xiě)為ORF。
″聚合酶鏈反應(yīng)″被縮寫(xiě)為PCR。
″美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心″被縮寫(xiě)為ATCC。
″多不飽和脂肪酸″被縮寫(xiě)為PUFA(s)。
術(shù)語(yǔ)″脂肪酸″表示具有各種鏈長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈脂族酸(鏈烷酸)，從大約C12-C22(不過(guò)已知可以采用更長(zhǎng)和更短鏈長(zhǎng)的酸)。主要的鏈長(zhǎng)為C16至C22。脂肪酸的結(jié)構(gòu)是通過(guò)簡(jiǎn)單的符號(hào)系統(tǒng)″X:Y″表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的總數(shù)，而Y是雙鍵的數(shù)量。
一般，脂肪酸被劃分成飽和的或不飽和的。術(shù)語(yǔ)″飽和脂肪酸″表示在它們的碳主鏈之間沒(méi)有″雙鍵″的脂肪酸。相反，″不飽和脂肪酸″是沿它們的碳主鏈具有″雙鍵″的順式異構(gòu)體。″單不飽和脂肪酸″沿碳主鏈只有一個(gè)″雙鍵″(例如，對(duì)于棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)來(lái)說(shuō)通常位于第9和第10個(gè)碳原子之間)，而″多不飽和脂肪酸″(或″PUFAs″)沿碳主鏈具有至少兩個(gè)雙鍵(例如，對(duì)于亞油酸(18:2)來(lái)說(shuō)位于第9和第10和第12和第13個(gè)碳原子之間；對(duì)于α-亞麻酸(18:3)來(lái)說(shuō)位于第9和第10，第12和第13，和第15和第16個(gè)碳原子之間)。
″PUFAs″可以劃分成兩種主要類型(根據(jù)最靠近脂肪酸碳鏈的甲基末端的第一個(gè)雙鍵的位置(n))。因此，″ω-6脂肪酸″(ω-6或n-6)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω(甲基)末端六個(gè)碳原子，并且一共還具有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵，每一個(gè)隨后的不飽和出現(xiàn)在朝向該分子羧基末端的三個(gè)額外的碳原子。相反，″ω-3脂肪酸″(ω-3或n-3)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω末端三個(gè)碳原子，并且一共還具有三個(gè)或三個(gè)以上雙鍵，每一個(gè)隨后的不飽和出現(xiàn)在朝向該分子羧基末端的三個(gè)額外的碳原子。
在本說(shuō)明書(shū)中，將利用ω-參考系統(tǒng)表示碳原子的編號(hào)，雙鍵的編號(hào)，和最接近ω碳原子的雙鍵的位置，從ω碳原子開(kāi)始計(jì)數(shù)(它是用于這種目的的第1號(hào))。在下面的表1中示出了這種命名方法，表示在標(biāo)題為″簡(jiǎn)化符號(hào)″的欄目中。該表的其余部分歸納了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在說(shuō)明書(shū)中將要使用的縮寫(xiě)，以及每一種化合物的化學(xué)名稱。
表1多不飽和脂肪酸的命名
術(shù)語(yǔ)″必需脂肪酸″表示個(gè)體為了生存必須攝入的PUFA，因?yàn)樗鰝€(gè)體不能從頭合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳動(dòng)物不能合成必需脂肪酸亞油酸(18:2，ω-6)。其他必需脂肪酸包括GLA(ω-6)，DGLA(ω-6)，ARA(ω-6)，EPA(ω-3)和DHA(ω-3)。
術(shù)語(yǔ)″脂肪″表示脂類物質(zhì)，它在25℃下是固體，并且通常是飽和的。
術(shù)語(yǔ)″油″表示在25℃下是液體并且通常是多不飽和的脂類。PUFAs存在于某些藻類，含油酵母和絲狀真菌的油中。″微生物油″或″單細(xì)胞油″是由微生物在它們的生命過(guò)程中天然產(chǎn)生的油類。這種油類可能包括長(zhǎng)鏈PUFAs。
術(shù)語(yǔ)″PUFA生物合成途徑酶″表示與PUFA的生物合成相關(guān)的以下任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。
術(shù)語(yǔ)″ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑″表示一組基因，當(dāng)它們?cè)诤线m的條件下表達(dá)時(shí)，編碼能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生產(chǎn)的酶。通常，與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關(guān)的基因編碼某些或所有以下的酶Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。在圖2中示出了典型的途徑，證實(shí)了如何由普通來(lái)源生產(chǎn)ω-3和ω-6脂肪酸。本文所用與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“功能性”指該途徑中的所有基因或其中一部分可表達(dá)活性酶。應(yīng)當(dāng)理解的是，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”并不意味著該節(jié)所列的所有基因均是必需的，因?yàn)樵S多脂肪酸產(chǎn)物僅需該途徑中部分基因的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)″去飽和酶″表示能夠?qū)σ环N或多種脂肪酸去飽和以便產(chǎn)生單-或多不飽和脂肪酸或感興趣的前體的多種酶復(fù)合物的多肽成分。盡管在本說(shuō)明書(shū)中ω-參考系統(tǒng)被用于表示特殊的脂肪酸，更常見(jiàn)的是，利用Δ-系統(tǒng)從底物的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)以表示去飽和酶的活性。本發(fā)明特別感興趣的是1.)Δ17去飽和酶，它能使脂肪酸的位于從該分子的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)的第17和第18個(gè)碳原子之間去飽和，并且，例如，催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或DGLA轉(zhuǎn)化成ETA；2.)Δ6去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或ALA轉(zhuǎn)化成STA；3.)Δ5去飽和酶，它能催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或ETA轉(zhuǎn)化成EPA；4.)Δ4去飽和酶，它能催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA；5.)Δ12去飽和酶，它能催化油酸轉(zhuǎn)化成LA；6.)Δ15去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成ALA；和7.)Δ9去飽和酶，它能催化棕櫚酸酯或鹽轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸酯或鹽轉(zhuǎn)化成油酸(18:1)。
術(shù)語(yǔ)″延伸酶″表示能夠延伸脂肪酸碳鏈，以便產(chǎn)生比延伸酶作用的脂肪酸底物長(zhǎng)2個(gè)碳原子的單或多不飽和脂肪酸的多酶復(fù)合物的多肽成分。這種延伸過(guò)程是通過(guò)與脂肪酸合成酶相關(guān)的多步驟機(jī)制發(fā)生的，其中，CoA是酰基載體(Lassner等，The Plant Cell 8281-292(1996))。簡(jiǎn)單地講，丙二酰-CoA與長(zhǎng)鏈酰基-CoA縮合，以便產(chǎn)生CO2和β-酮酰基-CoA(其中，酰基部分業(yè)已延長(zhǎng)了兩個(gè)碳原子)。隨后的反應(yīng)包括還原成β-羥?；?CoA，脫水形成烯?；?CoA，并且第二次還原，以便產(chǎn)生延長(zhǎng)的?；?CoA。由延伸酶催化的反應(yīng)的例子是將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA，STA轉(zhuǎn)化成ETA和將EPA轉(zhuǎn)化成DPA。因此，延伸酶可以具有不同的特異性(例如，C16/18延伸酶優(yōu)選C16底物，C8/20延伸酶優(yōu)選C18底物，而C20/22延伸酶優(yōu)選C20底物)。
術(shù)語(yǔ)″高親和力延伸酶″表示它的底物特異性優(yōu)選GLA的延伸酶(DGLA是延伸酶反應(yīng)的產(chǎn)物)。在WO 00/12720中披露了一種這樣的延伸酶。
術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)化效率″和″底物轉(zhuǎn)化百分比″表示特定的酶(例如，去飽和酶或延伸酶)可以將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率。轉(zhuǎn)化效率是按照以下公式計(jì)算的([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])*100，其中′產(chǎn)物′包括產(chǎn)生它的途徑上的中間產(chǎn)物和所有產(chǎn)物。
術(shù)語(yǔ)″含油的″表示傾向于以脂類形式儲(chǔ)存它們的能源的生物(Weete，InFungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。一般，所述微生物的細(xì)胞PUFA含量遵循S形曲線，其中，脂類的濃度增加，直到在后對(duì)數(shù)期或早期靜止生長(zhǎng)期的最大值，然后在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57419-25(1991))。
術(shù)語(yǔ)″含油酵母″表示被分類為酵母的微生物，它們能夠積累占干細(xì)胞重量至少25％的油。含油酵母的例子包括，但不局限于以下屬耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
術(shù)語(yǔ)″可發(fā)酵的碳源″表示微生物能夠代謝以便產(chǎn)生能量的碳源。本發(fā)明的典型的碳源包括，但不局限于單糖，寡糖，多糖，鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸鹽或酯以及含碳的胺。
在本文中，″分離的核酸片段″是單鏈或雙鏈RNA或DNA，它任選包括合成的，非天然的或改變了的核酸堿基。DNA聚合物形式的分離的多核酸片段可能由一個(gè)或多個(gè)cDNA，基因組DNA或合成DNA的片段組成。
氨基酸或核苷酸序列的″主要部分″是包括多肽的一定數(shù)目的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，所述數(shù)目足夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)所述序列進(jìn)行的人工評(píng)估，或通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)化的序列比較，以及使用諸如BLAST的算法的鑒定(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215403-410(1993)而推測(cè)性地鑒定該多肽或基因。一般，核苷酸序列的″主要部分″包括足夠的序列(例如，20-30個(gè)連續(xù)的核苷酸)，以便特異性地鑒定和/或分離包括所述序列的核酸片段。本說(shuō)明書(shū)披露了編碼一種或多種特定蛋白的部分或全部核苷酸序列。技術(shù)人員利用本文所提供的序列，可以將所披露序列的全部或主要部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的目的。因此，本發(fā)明包括在所附序列表中所提供的完整的序列，以及如上文所定義的這些序列的主要部分。
術(shù)語(yǔ)″互補(bǔ)的″被用于表示能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的相互關(guān)系。例如，對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，腺嘌呤互補(bǔ)于胸腺嘧啶，而胞嘧啶互補(bǔ)于鳥(niǎo)嘌呤。因此，本發(fā)明還包括分離的核酸片段，它互補(bǔ)于在所附序列表中提供的完整序列，以及基本上類似的核酸序列。
″密碼子簡(jiǎn)并性″表示遺傳密碼的性質(zhì)，它允許改變核苷酸序列，而又不影響所編碼的多肽的氨基酸序列。技術(shù)人員在用核苷酸密碼子表示特定氨基酸時(shí)充分理解由特定宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出來(lái)的″密碼子偏倚″。因此，在合成用于改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時(shí)，需要設(shè)計(jì)所述基因，以便它的密碼子選擇的頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子選擇的頻率。
表示DNA序列的″化學(xué)合成的″表示組成核苷酸是在體外組裝的。DNA的人工化學(xué)合成，可以通過(guò)使用業(yè)已建立的方法完成；或可以利用多種商業(yè)化儀器中的一種進(jìn)行自動(dòng)化的化學(xué)合成?！搴铣苫颉蹇梢杂晒押塑账峄締挝唤M裝，它們是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法化學(xué)合成的。將這些基本單位連接在一起并且退火，以便形成基因片段，然后酶促組裝，以便構(gòu)建完整的基因。因此，可以對(duì)基因進(jìn)行修飾，以便根據(jù)核苷酸序列的優(yōu)化優(yōu)化基因表達(dá)，以便體現(xiàn)宿主細(xì)胞的密碼子偏倚。如果密碼子選擇偏向宿主優(yōu)選的密碼子，技術(shù)人員可以理解成功的基因表達(dá)的可能性。優(yōu)選密碼子的確定可以根據(jù)對(duì)來(lái)自宿主細(xì)胞的基因的檢查，其中，可以獲得序列信息。
″基因″表示能表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括位于編碼序列前面(5′非編碼序列)和后面(3′非編碼序列)的調(diào)控序列?！逄烊换颉灞硎咎烊慌c它自身的調(diào)控序列一起出現(xiàn)的基因。″嵌合基因″表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的調(diào)控和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來(lái)自不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或來(lái)自相同的來(lái)源，但是以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列?！鍍?nèi)源基因″表示存在于生物基因組上的天然位置上的天然基因?！逋庠础寤虮硎菊Ｇ闆r下不存在于宿主生物中，而是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因?！遛D(zhuǎn)基因″是業(yè)已通過(guò)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入所述基因組的基因。″密碼子優(yōu)化的基因″是具有經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以便模擬宿主細(xì)胞的優(yōu)選的密碼子選擇頻率的密碼子選擇頻率的基因。
″編碼序列″表示編碼特定氨基酸序列的DNA序列。″合適的調(diào)控序列″表示位于編碼序列上游(5′非編碼序列)，序列內(nèi)，或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，并且，它能影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，RNA加工或穩(wěn)定性，或翻譯。調(diào)控序列可以包括啟動(dòng)子，翻譯前導(dǎo)序列，內(nèi)含子，聚腺苷酸化識(shí)別序列，RNA加工位點(diǎn)，效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
″啟動(dòng)子″表示能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3′側(cè)。啟動(dòng)子可能完全來(lái)自天然基因，或者由來(lái)自天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，不同的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)，或者在發(fā)育的不同階段的表達(dá)，或者對(duì)不同的環(huán)境或生理學(xué)條件作出反應(yīng)的表達(dá)。能導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多數(shù)時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱作″組成型啟動(dòng)子″。還應(yīng)當(dāng)理解的是，由于在大多數(shù)場(chǎng)合下，調(diào)控序列的確切邊界未能完全確定，不同長(zhǎng)度的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。
術(shù)語(yǔ)″3′非編碼序列″或″轉(zhuǎn)錄終止子″表示位于編碼序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸化識(shí)別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的其他序列。聚腺苷酸化信號(hào)通常以影響聚腺苷酸添加在mRNA前體的3′末端為特征。所述3′區(qū)能夠影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，RNA加工或穩(wěn)定性，或翻譯。
″RNA轉(zhuǎn)錄物″表示由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄而得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是所述DNA序列的完整的互補(bǔ)拷貝時(shí)，它被稱作初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是來(lái)自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，并且被稱作成熟的RNA?！逍攀筊NA″或″mRNA″表示沒(méi)有內(nèi)含子，并且能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA?！錭DNA″表示雙鏈DNA，它是互補(bǔ)于mRNA并且由mRNA衍生的?！逵辛x″RNA表示包括mRNA，并能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物。″反義″RNA表示互補(bǔ)于靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分的RNA，并且它能抑制靶基因的表達(dá)(U.S.5,107,065；WO 99/28508)。反義RNA的互補(bǔ)性可以是與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即，位于5′非編碼序列，3′非編碼序列，或編碼序列互補(bǔ)的?！骞δ苄訰NA″表示反義RNA，核酶RNA，或不能翻譯，但仍然能影響細(xì)胞加工的其他RNA。
術(shù)語(yǔ)″可操作地連接的″表示核酸序列締合在一個(gè)核酸片段上，以便其中一個(gè)的功能受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，它就是與該編碼序列可操作地連接的(即，所述編碼序列受所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列能夠沿有義或反義方向可操作地與調(diào)控序列連接。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″表達(dá)″表示來(lái)自本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以表示mRNA翻譯成多肽。
″轉(zhuǎn)化″表示將核酸分子轉(zhuǎn)入宿主生物，導(dǎo)致了遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳性。例如，核酸分子可以是能自主復(fù)制的質(zhì)粒；或者它可以整合到宿主生物的基因組中。包括轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱作″轉(zhuǎn)基因″或″重組″或″轉(zhuǎn)化過(guò)的″生物。
術(shù)語(yǔ)″質(zhì)粒″，″載體″和″盒″表示染色體外元件，它通常攜帶有不是細(xì)胞的中央代謝部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA片段形式的。所述基因可以是自主復(fù)制的序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環(huán)狀的單或雙鏈DNA或RNA，可以來(lái)自任何來(lái)源，其中，多個(gè)核苷酸序列業(yè)已連接或重組成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，它能夠?qū)?dòng)子片段和選定的基因產(chǎn)物的DNA序列，以及合適的3′非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞。″轉(zhuǎn)化盒″表示包括外源基因，并且除了外源基因之外還具有能促進(jìn)在特定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！灞磉_(dá)盒″表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，還具有能夠增強(qiáng)基因在外源宿主中表達(dá)的元件的特定載體。
術(shù)語(yǔ)″序列分析軟件″表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序?！逍蛄蟹治鲕浖蹇梢允峭ㄟ^(guò)商業(yè)渠道獲得的或者獨(dú)立開(kāi)發(fā)的。典型的序列分析軟件包括，但不局限于1.)GCG程序組(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNew York，NY)。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)理解的是，在將序列分析軟件用于分析時(shí)，分析的結(jié)果是基于有關(guān)程序的″預(yù)設(shè)值″的，除非另有說(shuō)明。在本文中，″預(yù)設(shè)值″表示任何組的值或參數(shù)，它是在初次初始化時(shí)最初隨所述軟件加載的。
本發(fā)明所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且披露于以下文獻(xiàn)中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(此后稱作″Maniatis″)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor LaboratoryColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F(xiàn).M.等，Current ProtocolsinMolecular Bioloqy，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)出版。
脂肪酸的微生物生物合成一般，在含油微生物中的脂類的積累是反應(yīng)于存在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的總的碳與氮的比例引發(fā)的(圖1)。當(dāng)細(xì)胞耗盡了可利用的氮源時(shí)(例如，當(dāng)碳與氮的比例超過(guò)大約40時(shí))，細(xì)胞一磷酸腺苷(AMP)的消耗，導(dǎo)致了線粒體中AMP-依賴型異檸檬酸脫氫酶活性的終止和檸檬酸的積累，并且將檸檬酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并且隨后通過(guò)ATP-檸檬酸裂解酶裂解，產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA是脂肪酸從頭合成的主要基本單位。盡管任何能夠有效代謝產(chǎn)生乙酰-CoA的化合物都可用作脂肪酸的前體，葡萄糖是這種類型反應(yīng)中的主要碳源(圖1)。通過(guò)糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸，并且然后將丙酮酸轉(zhuǎn)入線粒體，在這里，它能夠通過(guò)丙酮酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA(”P(pán)D”)。由于乙酰-CoA不能直接通過(guò)線粒體膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，乙酰-CoA上的兩個(gè)碳與草酰乙酸縮合，以便產(chǎn)生檸檬酸(通過(guò)檸檬酸合酶催化)。檸檬酸被直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，在這里，它被ATP-檸檬酸酶裂解，以便再生乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸通過(guò)轉(zhuǎn)化成蘋(píng)果酸重新進(jìn)入三羧酸循環(huán)。
丙二酰-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，它是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的。丙二酰-CoA是通過(guò)乙酰-CoA羧化酶催化由乙酰-CoA的羧化產(chǎn)生的。脂肪酸合成是通過(guò)多種酶脂肪酸合酶復(fù)合物(″FAS″)催化的，并且通過(guò)八種二碳片段(來(lái)自乙酰-CoA的乙?；鶊F(tuán))的縮合進(jìn)行，以便形成16-碳飽和脂肪酸棕櫚酸。更具體地講，F(xiàn)AS催化一系列的7個(gè)反應(yīng)，該系列包括以下反應(yīng)(Smith，S.FASEB J，8(15)1248-59(1994))1.乙酰-CoA和丙二酰-CoA被轉(zhuǎn)移到FAS的?；d體肽(ACP)上。所述乙酰基團(tuán)然后被轉(zhuǎn)移到丙二?；鶊F(tuán)上，形成β-酮丁?；?ACP，并且釋放CO2。
2.所述β-酮丁?；?ACP發(fā)生還原(通過(guò)β-酮?；€原酶)和脫水(通過(guò)β-羥?；撍?，以便形成反式-單不飽和的脂肪?；?。
3.通過(guò)NADPH還原雙鍵，產(chǎn)生比最初的基團(tuán)長(zhǎng)兩個(gè)碳原子的飽和脂肪?；?。然后再生了丁酰基-基團(tuán)與新的丙二?；鶊F(tuán)縮合，并且重復(fù)所述延伸過(guò)程的能力。
4.當(dāng)脂肪?；兂?6個(gè)碳原子長(zhǎng)時(shí)，硫酯酶活性水解它，釋放游離的棕櫚酸。
棕櫚酸(16:0)是長(zhǎng)鏈飽和和不飽和脂肪酸(例如，硬脂酸(18:0)，棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1))的前體，通過(guò)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的延伸酶和去飽和酶的作用產(chǎn)生棕櫚酸。通過(guò)Δ9去飽和酶的作用分別將棕櫚酸和硬脂酸轉(zhuǎn)化成它們的不飽和衍生物，即棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)。
三?；视?脂肪酸的主要儲(chǔ)存單位)是通過(guò)將兩個(gè)分子的?；?CoA酯化成甘油-3-磷酸產(chǎn)生1，2-磷酸二?；视偷?通常被稱為磷脂酸)。然后通過(guò)磷脂酸磷酸酶除去磷酸，以便得到1，2-二?；视?。三?；视褪峭ㄟ^(guò)二酰基甘油-?；D(zhuǎn)移酶的作用添加第三個(gè)脂肪酸形成的。
Ω3和Ω6脂肪酸的生物合成簡(jiǎn)單地講，將LA轉(zhuǎn)化成GLA，DGLA和ARA(ω-6途徑)和ALA轉(zhuǎn)化成STA，ETA，EPA，DPA和DHA(ω-3途徑)的代謝過(guò)程涉及通過(guò)添加碳原子延長(zhǎng)碳鏈，和通過(guò)添加雙鍵使分子去飽和(圖2)。這需要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的一系列特殊去飽和和延伸酶。
ω-6脂肪酸通過(guò)Δ12去飽和酶的作用將油酸轉(zhuǎn)化成LA(18:2)，它是ω-6脂肪酸的第一個(gè)。按以下方法產(chǎn)生后續(xù)的ω-6脂肪酸1.)通過(guò)Δ6去飽和酶的活性將LA轉(zhuǎn)化成GLA；2.)通過(guò)延伸酶的作用將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA；和3.)通過(guò)Δ5去飽和酶的作用將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA。
ω-3脂肪酸通過(guò)Δ15去飽和酶的作用將亞油酸(LA)轉(zhuǎn)化成ALA，即ω-3脂肪酸的第一個(gè)。通過(guò)一系列類似于ω-6脂肪酸的步驟產(chǎn)生后續(xù)的ω-3脂肪酸。具體地講1.)通過(guò)Δ6去飽和酶的活性將ALA轉(zhuǎn)化成STA；2.)通過(guò)延伸酶的活性將STA轉(zhuǎn)化成ETA；和3.)通過(guò)Δ5去飽和酶的活性將ETA轉(zhuǎn)化成EPA。另外，ETA和EPA可以通過(guò)Δ17去飽和酶的活性分別由DGLA和ARA產(chǎn)生。還可以通過(guò)延伸酶和Δ4去飽和酶的活性進(jìn)一步將EPA轉(zhuǎn)化成DHA。
與Ω脂肪酸生產(chǎn)相關(guān)的基因很多微生物，包括藻類，細(xì)菌，霉菌和酵母都可以通過(guò)正常細(xì)胞代謝過(guò)程合成PUFAs和ω脂肪酸。進(jìn)行過(guò)充分研究的是包括Schizochytrium aggregatm，破囊壺菌屬的種和高山被孢菌在內(nèi)的真菌。很多溝鞭藻類(Dinophyceaae)都能天然產(chǎn)生高濃度的PUFAs。因此，業(yè)已通過(guò)遺傳學(xué)方法鑒定了與油類產(chǎn)生相關(guān)的多個(gè)基因，并且某些基因的DNA序列可以公開(kāi)獲得(非限定性例子如下面的表2所示)表2某些可公開(kāi)獲得的與PUFA生產(chǎn)相關(guān)的基因
另外，專利文獻(xiàn)提供了與PUFA生產(chǎn)相關(guān)的很多其他基因的DNA序列(和/或與上述若干基因相關(guān)的細(xì)節(jié)以及它們的分離方法)。例如，參見(jiàn)U.S.5,968,809(Δ6去飽和酶)；U.S.2003/0196217A1(Δ17去飽和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去飽和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去飽和酶)；WO 93/11245(Δ15去飽和酶)；WO 94/11516，U.S.5,443,974和WO 03/099216(Δ12去飽和酶)；WO 02/090493(Δ4去飽和酶)；和WO 00/12720和U.S.2002/0139974A1(延伸酶)。上述每一份專利和專利申請(qǐng)都以它們的全文形式收作本文參考。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，導(dǎo)入用于生產(chǎn)特定的PUFA最終產(chǎn)物的宿主生物所需要的特殊功能，取決于宿主細(xì)胞(以及它的天然PUFA譜和/或去飽和酶譜)，底物的可利用性和需要的最終產(chǎn)物。如圖2中所示出的，LA，GLA，DGLA，ARA，ALA，STA，ETA，EPA，DPA和DHA都可以在含油酵母中生產(chǎn)，這是通過(guò)導(dǎo)入以下PUFA酶功能的各種組合Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。根據(jù)可公開(kāi)獲得的文獻(xiàn)(例如，GenBank)，專利文獻(xiàn)，以及對(duì)具有生產(chǎn)PUFAs的能力的微生物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定編碼上述每一種酶的各種候選基因。所述序列可來(lái)自任何來(lái)源，例如，從天然來(lái)源中分離(從細(xì)菌，藻類，真菌，植物，動(dòng)物等中分離)，通過(guò)半合成途徑生產(chǎn)，或從頭合成。在一些實(shí)施方案中，宿主內(nèi)源基因的操作是優(yōu)選的；對(duì)于其它目的，必須導(dǎo)入異源基因。
盡管導(dǎo)入宿主的去飽和酶和延伸酶基因的特定來(lái)源并不重要，選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮因素包括1.)所述多肽的底物特異性；2.)所述多肽或它的成分是否是限速酶；3.)所述去飽和酶或延伸酶是否是合成需要的PUFA所必需的；和/或4.)所述多肽所需要的輔助因子。所表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與它在宿主細(xì)胞中的部位的生物化學(xué)環(huán)境相容的參數(shù)。例如，所述多肽可能必須與宿主細(xì)胞中的其他酶競(jìng)爭(zhēng)底物。因此，在確定特定多肽修飾PUFA在特定宿主細(xì)胞中的生產(chǎn)的合適性時(shí)，需要考慮KM和所述多肽比活性的分析。用于特定宿主細(xì)胞中的多肽是這樣的多肽，它能在存在于預(yù)期宿主細(xì)胞中的生物化學(xué)條件下起作用，但原本可以是具有能夠修飾需要的PUFA的具有去飽和酶或延伸酶活性的任何多肽。
內(nèi)源PUFA基因在某些情況下，需要用來(lái)生產(chǎn)PUFAs的宿主生物將具有編碼某些PUFA生物合成途徑酶的內(nèi)源基因。例如，含油酵母一般可以生產(chǎn)18:2脂肪酸(某些具有合成18:3脂肪酸的額外能力)；因此，含油酵母一般具有天然的Δ12去飽和酶活性，并且可能也具有Δ15去飽和酶活性。因此，在某些實(shí)施方案中，天然去飽和酶的表達(dá)相對(duì)于異源(或“外源”)酶是優(yōu)選的，因?yàn)?.)天然酶最適合與細(xì)胞內(nèi)其它酶和蛋白相互作用；且2.)異源基因不太可能與宿主生物共有相同的密碼子優(yōu)先。此外，已知天然基因序列時(shí)的優(yōu)勢(shì)在于，易于通過(guò)定向破壞將內(nèi)源基因破壞。
異源PUFA基因在很多情況下，合適的去飽和酶和延伸酶不存在于選擇用來(lái)生產(chǎn)需要的PUFA產(chǎn)物的宿主生物中。因此，必須導(dǎo)入異源基因。
為了此處描述的本發(fā)明的目的，需要證明將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導(dǎo)入含油宿主生物的例子；因此，高山被孢霉Δ5去飽和酶、高山被孢霉Δ6去飽和酶、異絲水霉Δ17去飽和酶、和高山被孢霉延伸酶被導(dǎo)入解脂耶氏酵母。但是，將特定的酶(和編碼這些酶的基因)導(dǎo)入宿主生物和產(chǎn)生的特定PUFAs并不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
如此處所證明的，如果需要產(chǎn)生EPA，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，來(lái)源于不同來(lái)源的許多其它基因?qū)⑦m于將Δ5去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ17去飽和酶、和延伸酶活性導(dǎo)入優(yōu)選的微生物宿主。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，也可以將與高山被孢霉Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶以及異絲水霉Δ17去飽和酶基本等同的其它DNA用于在含油酵母中生產(chǎn)ω-6和/或ω-3脂肪酸(如EPA)。“基本等同的”是指與選定的多肽或編碼氨基酸序列的核酸序列具有至少80％、90％或95％同源性的序列。對(duì)于多肽，比較序列的長(zhǎng)度通常為至少16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸或最優(yōu)選35個(gè)氨基酸。對(duì)于核酸，比較序列通常為至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸，最優(yōu)選110個(gè)核苷酸。
通常采用序列分析軟件測(cè)量同源性，其中″序列分析軟件″表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。″序列分析軟件″可以是通過(guò)商業(yè)渠道獲得的或者獨(dú)立開(kāi)發(fā)的。典型的序列分析軟件包括，但不局限于1.)GCG程序組(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNew York，NY)。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)理解的是，在將序列分析軟件用于分析時(shí)，分析的結(jié)果是基于有關(guān)程序的″預(yù)設(shè)值″的，除非另有說(shuō)明。在本文中，″預(yù)設(shè)值″表示任何組的值或參數(shù)，它是在初次初始化時(shí)最初隨所述軟件加載的。概言之，所述計(jì)算機(jī)軟件通過(guò)給多種取代、缺失和其它修飾分配同源性程度而匹配相似的序列。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，多肽可以具有氨基酸保守取代，其取代方式使得多肽的功能沒(méi)有改變或受損。具有此處描述的去飽和酶和延伸酶活性并且具有所述保守取代的多肽包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。保守取代一般包括下列各組內(nèi)的取代1.)甘氨酸和丙氨酸；2.)纈氨酸、異亮氨酸和賴氨酸；3.)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺4.)絲氨酸和蘇氨酸；5.)賴氨酸和精氨酸；和6.)苯丙氨酸和酪氨酸。也可以在保守的疏水性或親水性基礎(chǔ)上進(jìn)行取代(Kyte andDoolittle，J.Mol.Biol.157105-132(1982))，或在假定相似多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力的基礎(chǔ)上進(jìn)行取代(Chou and Fasman，Adv.Enzymol.4745-148(1978))。
在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，其它盡管不基本等同于高山被孢霉Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶以及異絲水霉Δ17去飽和酶的DNA也可以用于此處的目的(如，用于生產(chǎn)ω-3和/或ω-6PUFAs，如ARA和EPA)。例如，用于根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)導(dǎo)入含油酵母的編碼Δ6去飽和酶多肽的DNA序列可以獲自具有生產(chǎn)GLA或STA的能力的微生物。所述微生物包括，例如，屬于被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、Porphyridium、Coidosporium、毛霉屬、鐮孢屬、曲霉屬、紅酵母屬和蟲(chóng)霉屬的那些。在Porphyridium屬內(nèi)，特別感興趣的是P.Cruentum。在被孢霉屬內(nèi)，特別感興趣的是長(zhǎng)形被孢霉、微小被孢霉、喜濕被孢霉、M.ramanniana var.angulispora和高山被孢霉。在毛霉屬中，特別感興趣的是卷枝毛霉和爪哇毛霉。
或者，不與高山被孢霉Δ6去飽和酶基本等同，但可以在脂肪酸分子的羧基末端開(kāi)始的第6個(gè)碳對(duì)脂肪酸分子去飽和的相關(guān)去飽和酶也可以在本發(fā)明中用作Δ6去飽和酶，假定該去飽和酶仍然可以有效將LA轉(zhuǎn)化為GLA和/或?qū)LA轉(zhuǎn)化為STA。因此，可以通過(guò)基本與此處公開(kāi)的去飽和酶和延伸酶起相同作用的能力而鑒定相關(guān)的去飽和酶和延伸酶。
總之，可以從多種來(lái)源分離適于此處目的的編碼PUFA生物合成途徑酶的基因。用于此處目的的去飽和酶的特征在于以下能力1.)使脂肪酸的位于從該分子的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)的第17和第18個(gè)碳原子之間去飽和，并且，催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和DGLA轉(zhuǎn)化成ETA(Δ17去飽和酶)；2.)催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或ALA轉(zhuǎn)化成STA(Δ6去飽和酶)；3.)催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或ETA轉(zhuǎn)化成EPA(Δ5去飽和酶)；4.)催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA(Δ4去飽和酶)；5.)催化油酸轉(zhuǎn)化成LA(Δ12去飽和酶)；6.)催化LA轉(zhuǎn)化成ALA(Δ15去飽和酶)；和7.)催化棕櫚酸酯或鹽轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸和/或硬脂酸酯或鹽轉(zhuǎn)化成油酸。以相似的方式，用于此處目的的合適的延伸酶不限于來(lái)源于特定來(lái)源的那些；而是，用于此處目的的酶的特征在于它們具有使得脂肪酸碳鏈相對(duì)于延伸酶作用的底物能夠延長(zhǎng)2個(gè)碳，從而產(chǎn)生單或多不飽和脂肪酸的能力。
對(duì)Ω脂肪酸基因進(jìn)行優(yōu)化以便在特定生物中表達(dá)盡管PUFA去飽和酶或延伸酶的特定來(lái)源在本發(fā)明中不是關(guān)鍵的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，異源基因?qū)⒃趥溥x的宿主以多種效率進(jìn)行表達(dá)。因此，ω-3和/或ω-6PUFA生產(chǎn)可以通過(guò)選擇特定去飽和酶或延伸酶而進(jìn)行優(yōu)化，所述去飽和酶或延伸酶在異源宿主中的表達(dá)水平相對(duì)于備選去飽和酶或延伸酶在感興趣的宿主生物中的表達(dá)而言是優(yōu)選的。此外，可能需要根據(jù)感興趣的特定PUFA產(chǎn)物組成，修飾特定PUFA生物合成途徑酶的表達(dá)，以達(dá)到每一種的最佳轉(zhuǎn)化效力。多種基因工程技術(shù)可以用于優(yōu)化特定酶的表達(dá)。兩種這樣的技術(shù)包括密碼子優(yōu)化和基因突變，如下文所描述。例如，通過(guò)這兩種方法中的任意一種產(chǎn)生的具有去飽和酶和/或延伸酶活性的基因可以用于本發(fā)明中合成ω-3和/或ω-6脂肪酸。
密碼子優(yōu)化正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，通常修飾在外源宿主中表達(dá)的編碼特定多肽的密碼子的一部分，使得修飾的多肽使用替代的宿主優(yōu)選的密碼子。使用宿主優(yōu)選的密碼子能夠顯著增強(qiáng)編碼多肽的外源基因的表達(dá)。
一般，可以在特定的感興趣的宿主物種中確定宿主優(yōu)選的密碼子，包括檢查蛋白中的密碼子選擇(優(yōu)選大量表達(dá)的蛋白)，并且確定哪些密碼子是以最高頻率使用的。然后，可以使用在所述宿主物種中優(yōu)選的密碼子完全或部分合成具有去飽和酶或延伸酶活性的感興趣的多肽的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)，以便除去可能出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄的mRNA上的任何去穩(wěn)定化序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。還可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便改變將堿基組成改變成在需要的宿主細(xì)胞中更優(yōu)選形式。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，需要修飾編碼具有Δ17去飽和酶活性的多肽的密碼子的一部分，以便增強(qiáng)基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)。修飾了天然基因(如異絲水霉Δ17去飽和酶)的核酸序列，以便使用宿主優(yōu)選的密碼子。技術(shù)人員了可以理解的是，該優(yōu)化方法同樣可應(yīng)用于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的其他基因(例如，參見(jiàn)共同未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/468718，在此全文收作本文參考)。此外，對(duì)異絲水霉Δ17去飽和酶的調(diào)節(jié)僅僅是示例的。
基因突變用于合成序列并且將這些序列組合在一起的方法在文獻(xiàn)中業(yè)已完善。例如，體外誘變和選擇，定點(diǎn)誘變，易錯(cuò)PCR(Melnikov等，NucleicAcids Research，27(4)1056-1062(February 15，1999))，″基因改組″或其他方法可用于獲得天然存在的或密碼子優(yōu)化的去飽和酶或延伸酶基因的突變。這樣使得能夠生產(chǎn)去飽和酶或延伸酶多肽，它們分別具有，例如更長(zhǎng)的半衰期或需要的PUFA在體內(nèi)生產(chǎn)的更高速度。
如果需要，對(duì)酶促活性重要的感興趣多肽(即去飽和酶或延伸酶)的區(qū)可以通過(guò)常規(guī)誘變，所得到的突變多肽的表達(dá)以及確定它們的活性而確定。突變體可以包括缺失，插入或點(diǎn)突變，或它們的組合。典型的功能性分析始于缺失誘變，以便確定功能所需要的蛋白的N-末端和C-末端限制，然后進(jìn)行內(nèi)部缺失，進(jìn)行插入或點(diǎn)突變，以便進(jìn)一步確定功能所需要的區(qū)。還可以使用其他技術(shù)，如盒誘變或完全合成。例如，缺失誘變是通過(guò)使用核酸外切酶依次去掉5′或3′編碼區(qū)實(shí)現(xiàn)的。可以獲得用于這種技術(shù)的試劑盒。在缺失之后，在5′或3′缺失之后通過(guò)將包括起始或終止密碼子的寡核苷酸分別連接在缺失的編碼區(qū)上獲得所述編碼區(qū)。另外，通過(guò)各種方法將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入所述編碼區(qū)，包括定點(diǎn)誘變，誘變PCR或通過(guò)連接到在現(xiàn)有限制位點(diǎn)上消化過(guò)的DNA上。內(nèi)部缺失同樣可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，包括使用DNA上的現(xiàn)有限制位點(diǎn)，通過(guò)使用誘變引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變或誘變PCR。插入是通過(guò)諸如接頭-掃描誘變，定點(diǎn)誘變或誘變PCR的方法完成的。點(diǎn)突變是通過(guò)諸如定點(diǎn)誘變或誘變PCR的技術(shù)完成的。
還可將化學(xué)誘變用于鑒定對(duì)活性重要的去飽和酶或延伸酶多肽區(qū)。表達(dá)突變的構(gòu)建體，并且測(cè)定所得到的改變了的蛋白作為去飽和酶或延伸酶的能力。這種結(jié)構(gòu)-功能分析，可以確定哪些區(qū)可以缺失，哪些區(qū)能夠承受插入，以及哪些點(diǎn)突變使得突變的蛋白能夠以基本上與天然的去飽和酶或天然的延伸酶相同的方式起作用。所有這樣的突變蛋白及其來(lái)源于本文所述密碼子優(yōu)化的基因的編碼核苷酸序列均屬于本發(fā)明范疇。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，需要修飾編碼具有Δ17去飽和酶活性的多肽的密碼子的一部分，以便增強(qiáng)基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)。修飾了天然基因(如異絲水霉Δ17去飽和酶)的核酸序列，以便使用宿主優(yōu)選的密碼子。技術(shù)人員了可以理解的是，該優(yōu)化方法同樣可應(yīng)用于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的其他基因(例如，參見(jiàn)共同未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/468718，在此全文收作本文參考)。此外，對(duì)異絲水霉Δ17去飽和酶的調(diào)節(jié)僅僅是示例的。
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產(chǎn)與從諸如魚(yú)或植物的天然來(lái)源中純化相比具有若干優(yōu)點(diǎn)。例如1.)已知與高等生物相比，很多微生物具有大大簡(jiǎn)化了的油類組成，使得對(duì)需要成分的純化更容易；2.)微生物生產(chǎn)不容易出現(xiàn)由外部因素導(dǎo)致的波動(dòng)，如天氣和食物供應(yīng)；3.)微生物生產(chǎn)的油基本上不會(huì)受到環(huán)境污染物的污染；4.)微生物能夠以可能具有特殊用途的特定形式提供PUFAs；和，5.)微生物油類生產(chǎn)可以通過(guò)控制培養(yǎng)條件操縱，特別是通過(guò)提供用于微生物表達(dá)的酶的特定底物，或通過(guò)添加化合物或通過(guò)遺傳工程手段抑制不希望的生物化學(xué)途徑。
除了上述優(yōu)點(diǎn)之外，用重組微生物生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸，提供了通過(guò)在宿主中提供新的生物合成途徑或通過(guò)抑制不希望的途徑而改變天然存在的微生物脂肪酸特性的能力，從而提高需要的PUFAs，或它的綴合形式的水平，以及降低不需要的PUFAs的水平。例如，可以改變所生產(chǎn)的ω-3與ω-6脂肪酸的比例，專門(mén)生產(chǎn)ω-3或ω-6脂肪酸，同時(shí)消除其他ω脂肪酸的生產(chǎn)，或工程生產(chǎn)特定PUFA，而又沒(méi)有其他PUFA下游或上游產(chǎn)物的大量積累。
表達(dá)系統(tǒng)，盒和載體本發(fā)明所披露的序列的密碼子優(yōu)化的基因和基因產(chǎn)物可以在異源微生物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，特別是在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)的細(xì)胞中生產(chǎn)。在重組微生物宿主中的表達(dá)，可用于生產(chǎn)各種PUFA途徑中間產(chǎn)物，或用于調(diào)控業(yè)已存在于宿主中的PUFA途徑，以便利用所述宿主合成迄今為止不可能的新的產(chǎn)物。
包括能指導(dǎo)外源蛋白高水平表達(dá)的調(diào)控序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。它們都可用于構(gòu)建嵌合基因，以便生產(chǎn)本發(fā)明密碼子優(yōu)化的序列的任何基因產(chǎn)物。然后可以通過(guò)轉(zhuǎn)化將所述嵌合基因?qū)牒线m的微生物，以便提供所編碼酶的高水平表達(dá)。
因此，預(yù)計(jì)導(dǎo)入受合適啟動(dòng)子控制的編碼PUFA生物合成途徑(例如，本文所披露的Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶，和延伸酶)的嵌合基因，會(huì)導(dǎo)致ω-3和/或ω-6脂肪酸產(chǎn)量的增加。預(yù)計(jì)，可將它用于在宿主微生物中表達(dá)本發(fā)明密碼子優(yōu)化的基因的各種組合。預(yù)計(jì)可以用其在宿主微生物中一起表達(dá)這些PUFA去飽和酶和延伸酶基因的多種組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，包括在特定表達(dá)盒內(nèi)的特定基因?qū)⑷Q于宿主細(xì)胞，其采用天然去飽和酶和延伸酶合成PUFAs的能力、底物和所需終產(chǎn)物的可獲得性。例如，可能需要構(gòu)建的表達(dá)盒包括編碼下列一種或多種酶促活性的基因Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶這樣，本發(fā)明涉及生產(chǎn)PUFAs的方法，包括讓脂肪酸底物與本文所披露的PUFA酶接觸，以便將所述底物轉(zhuǎn)化成需要的脂肪酸產(chǎn)物。因此，可以將本文所披露的每一種PUFAs基因和相應(yīng)的酶產(chǎn)物(如具有合適的去飽和酶或延伸酶活性的野生型、密碼子優(yōu)化的、合成的和/或突變的酶)直接或間接用于生產(chǎn)PUFAs。PUFAs的直接生產(chǎn)是這樣進(jìn)行的，將脂肪酸底物直接轉(zhuǎn)化成需要的脂肪酸產(chǎn)物，而沒(méi)有任何中間步驟或中間途徑。例如，ARA生產(chǎn)能夠在能產(chǎn)生或提供了DLGA的宿主細(xì)胞中進(jìn)行，包括向所述細(xì)胞中添加或?qū)肽芴峁│?去飽和酶活性的表達(dá)盒。
相反，編碼PUFA生物合成途徑的多個(gè)基因可以組合使用，以便發(fā)生一系列反應(yīng)，以便產(chǎn)生需要的PUFA。例如，編碼延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶和Δ4去飽和酶活性的表達(dá)盒使得宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生GLA，而不是產(chǎn)生DHA(以便通過(guò)延伸酶將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA；然后可以通過(guò)Δ5去飽和酶將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA；然后通過(guò)Δ17去飽和酶將ARA轉(zhuǎn)化成EPA，再通過(guò)延伸酶將后者轉(zhuǎn)化成DPA；和通過(guò)Δ4去飽和酶將DPA轉(zhuǎn)化成DHA)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，其中，宿主細(xì)胞是含油酵母，編碼PUFA生物合成所必需的每一種酶的表達(dá)盒都需要導(dǎo)入所述生物，因?yàn)樵谶@些生物中天然產(chǎn)生的PUFAs局限于18:2脂肪酸(即，LA)，并且更不常見(jiàn)的是18:3脂肪酸(即，ALA)。另外，可能需要底物補(bǔ)給。
用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞的載體或DNA盒為本領(lǐng)域所公知。存在于所述構(gòu)建體中的序列的具體選擇取決于需要的表達(dá)產(chǎn)物(同上)、宿主細(xì)胞的性質(zhì)以及推薦的分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方式。不過(guò)，通常，所述載體或盒包括指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，選擇標(biāo)記，和使得它能夠自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包括所述基因的5′區(qū)，它控制轉(zhuǎn)錄起始，和DNA片段的3′區(qū)，它控制轉(zhuǎn)錄終止。最優(yōu)選的是，當(dāng)兩個(gè)控制區(qū)都來(lái)自轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主細(xì)胞的基因時(shí)是最優(yōu)選的，不過(guò)，可以理解的是，所述控制區(qū)不一定來(lái)自被選擇用作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。
可用于在需要的宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)去飽和酶和/或延伸酶ORFs表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子是多種多樣的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實(shí)際上，能夠指導(dǎo)這些基因在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何啟動(dòng)子都適合本發(fā)明。在宿主細(xì)胞中的表達(dá)能夠以瞬時(shí)或穩(wěn)定的方式進(jìn)行。瞬時(shí)表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)可操作地連接在感興趣的基因上的可調(diào)控啟動(dòng)子的活性而實(shí)現(xiàn)。穩(wěn)定表達(dá)可以通過(guò)使用可操作地與感興趣的基因連接的組成型啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，提供能夠在酵母細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)，特別是來(lái)自宿主物種的那些。例如，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)可以從以下渠道獲得1.)糖酵解途徑上的基因，如醇脫氫酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/482263)，磷酸甘油變位酶(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/482263)，果糖二磷酸醛縮酶(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/519971)，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，磷酸甘油酸激酶等；或2.)可調(diào)控的基因，如酸性磷酸酶，乳糖酶，金屬硫蛋白，葡糖淀粉酶，翻譯延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)，核糖體蛋白S7(U.S.6,265,185)等?？梢允褂枚喾N調(diào)控序列中的任意一種，這取決于是需要組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子在表達(dá)感興趣的ORF方面的效率，以及構(gòu)建的方便性等。
通過(guò)修飾外源基因的翻譯起始密碼子′ATG′周圍的核苷酸序列，以便它們包括有效的酵母翻譯起始序列可以在酵母中獲得最佳基因表達(dá)。具體地講，可以通過(guò)定點(diǎn)誘變?cè)黾拥托П磉_(dá)的基因的表達(dá)，其中，所述低效表達(dá)的基因與內(nèi)源酵母基因框內(nèi)融合，優(yōu)選與高表達(dá)的基因融合。另外，正如本發(fā)明中在解脂耶氏酵母中所證實(shí)的，可以確定宿主中的共有翻譯起始序列，并且通過(guò)工程手段將該序列結(jié)合到異源基因上，以便它們?cè)诟信d趣的宿主中實(shí)現(xiàn)最佳表達(dá)。
終止區(qū)可源于所述基因的3′區(qū)，所述起始區(qū)是從該基因上獲得的或者從不同的基因上獲得的。大量終止區(qū)是已知的，并且能在多種宿主中發(fā)揮令人滿意的作用(當(dāng)在與產(chǎn)生它們的相同和不同的屬和種中使用時(shí))。終止區(qū)通常在更大程度上是根據(jù)方便性選擇的，而不是因?yàn)槿魏翁厥馓匦?。?yōu)選的是，終止區(qū)源于酵母基因，特別是糖酵母屬，裂殖酵母屬，假絲酵母屬，耶氏酵母屬或克羅維酵母屬。同樣已知編碼γ-干擾素和α-2干擾素的哺乳動(dòng)物基因的3′-區(qū)在酵母中起作用。終止控制區(qū)還可以來(lái)自優(yōu)選宿主天然具有的各種基因。終止位點(diǎn)可以任選是必需的；不過(guò)，如果具有，它是最優(yōu)選的。
正如技術(shù)人員所了解的，僅僅將基因插入克隆載體，不能確保它能夠在需要的水平上成功地表達(dá)。根據(jù)對(duì)高表達(dá)速度的需要，業(yè)已通過(guò)操縱多種不同的遺傳因子產(chǎn)生了多種特化的表達(dá)載體，這些遺傳因子能控制來(lái)自宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白穩(wěn)定性，含氧極限，以及從宿主的分泌。更具體地講，業(yè)已對(duì)某些分子特征進(jìn)行了操作，以便控制基因表達(dá)，包括1.)相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子序列的性質(zhì)；2.)克隆基因的拷貝數(shù)量以及所述基因是質(zhì)粒攜帶的或者是整合到宿主細(xì)胞的基因組上的；3.)合成的外源蛋白的最終細(xì)胞定位；4.)宿主生物的翻譯效率；和5.)克隆的基因蛋白在宿主細(xì)胞中的內(nèi)在穩(wěn)定性。上述每一種類型的修飾包括在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步優(yōu)化密碼子優(yōu)化的PUFA生物合成途徑酶表達(dá)的手段。
微生物宿主的轉(zhuǎn)化一旦獲得了適合在含油酵母中表達(dá)的編碼密碼子優(yōu)化的去飽和酶或延伸酶多肽的DNA，將它放入能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體上，或者將它直接整合到宿主細(xì)胞的基因組上。表達(dá)盒的整合可以在宿主基因組中隨機(jī)地進(jìn)行，或者可以通過(guò)使用含有與宿主基因組具有足夠同源性以靶定宿主基因座內(nèi)的重組的區(qū)域的構(gòu)建體靶定。當(dāng)所述構(gòu)建體被靶定于內(nèi)源基因座時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)的全部或某些可以通過(guò)內(nèi)源基因座提供。
當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因由獨(dú)立的復(fù)制載體表達(dá)時(shí)，希望每一個(gè)載體具有不同的選擇方式，并且應(yīng)當(dāng)缺少與其他構(gòu)建體的同源性，以便保持穩(wěn)定表達(dá)，并且防止構(gòu)建體之間的元件的重新分類。對(duì)調(diào)控區(qū)，選擇方式和導(dǎo)入的構(gòu)建體的繁殖方法的明智的選擇，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，以便所有導(dǎo)入的基因在需要的水平上表達(dá)，以便提供需要產(chǎn)物的合成。
可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將包括感興趣的基因的構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述技術(shù)包括轉(zhuǎn)化(例如，乙酸鋰轉(zhuǎn)化[Methods in Enzymology，194186-187(1991)])，原生質(zhì)體融合，bolistic沖擊，電穿孔，顯微注射，或能夠?qū)⒏信d趣的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的任何其他方法?？捎糜诤徒湍?即，解脂耶氏酵母)的更具體的技術(shù)包括美國(guó)專利號(hào)4,880,741和5,071,764和Chen，D.C.等(Appl MicrobiolBiotechnol.48(2)232-235(1997))。
為了方便起見(jiàn)，業(yè)已通過(guò)任何方法操作以攝入DNA序列(例如，表達(dá)盒)的宿主細(xì)胞在本文中被稱作″轉(zhuǎn)化過(guò)的″或″重組的″。轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主具有至少一個(gè)拷貝的表達(dá)構(gòu)建體，并且可以具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝，這取決于所述基因是整合在所述基因組上，擴(kuò)增的，或者存在于具有多個(gè)拷貝的染色體外元件上。轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主細(xì)胞可以通過(guò)選擇包含在導(dǎo)入的構(gòu)建體上的標(biāo)記而鑒定。另外，可以將獨(dú)立的標(biāo)記構(gòu)建體與需要的構(gòu)建體共同轉(zhuǎn)化，因?yàn)楹芏噢D(zhuǎn)化技術(shù)能將很多DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。通常，選擇轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。選擇性培養(yǎng)基可以摻入抗生素或缺少未轉(zhuǎn)化的宿主生長(zhǎng)所需要的因子，如養(yǎng)分或生長(zhǎng)因子。導(dǎo)入的標(biāo)記基因可以產(chǎn)生抗生素抗性，或者編碼必須的生長(zhǎng)因子或酶，以便當(dāng)它在轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主中表達(dá)時(shí)能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。當(dāng)所表達(dá)的標(biāo)記蛋白可以直接或間接檢測(cè)時(shí)，還可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化宿主的選擇。所述標(biāo)記蛋白可以單獨(dú)表達(dá)，或者作為與另一種蛋白的融合體形式表達(dá)。標(biāo)記蛋白可以通過(guò)以下方法檢測(cè)1.)它的酶促活性(例如，β-半乳糖苷酶可以將底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-半乳吡喃糖苷]轉(zhuǎn)化成有顏色的產(chǎn)物；熒光素酶可以將熒光素轉(zhuǎn)化成發(fā)光產(chǎn)物)；或2.)它的產(chǎn)生光或修飾特征(例如，Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白在用蘭色光線照射時(shí)會(huì)發(fā)出熒光)。另外，例如，可將抗生素用于檢測(cè)存在于感興趣的蛋白上的標(biāo)記蛋白或分子量標(biāo)記。例如，能表達(dá)標(biāo)記蛋白或標(biāo)記的細(xì)胞可以肉眼篩選，或者通過(guò)諸如FACS的技術(shù)或使用抗生素淘選。為了選擇酵母轉(zhuǎn)化體，可以使用能夠在酵母中起作用的任何標(biāo)記。理想的是，對(duì)卡那霉素，潮霉素和氨基糖苷G418的抗性是感興趣的，以及在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培養(yǎng)基上生產(chǎn)的能力。
在轉(zhuǎn)化之后，將適合本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的序列的基因產(chǎn)物(并且任選包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)的其他PUFA酶)可以由所述宿主天然地或轉(zhuǎn)基因地生產(chǎn)，或者它們可以外源提供。
ω-3和/或ω-6脂肪酸在微生物中的生物合成的代謝工程對(duì)本發(fā)明基因的密碼子優(yōu)化的序列以及優(yōu)化其他PUFA基因以便在含油酵母中表達(dá)的方法的了解，可用于操作在含油酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成；特別是在解脂耶氏酵母中。這可能需要在PUFA生物合成途徑上的直接的代謝工程或途徑的其他操作，這些操作可以將碳貢獻(xiàn)給PUFA生物合成途徑。可用于操作生物化學(xué)途徑的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
在PUFA生物合成途徑內(nèi)操作的情況下，可能需要增加LA的生產(chǎn)，以便增加ω-3和/或ω-6脂肪酸的生產(chǎn)。這可以通過(guò)導(dǎo)入和/或擴(kuò)增編碼Δ9和/或Δ12去飽和酶的基因而實(shí)現(xiàn)。
為了使ω-6不飽和脂肪酸，如ARA的生產(chǎn)最大化，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，該生產(chǎn)在基本上不含ALA的宿主微生物中是有利的。因此，優(yōu)選地，宿主是通過(guò)去除或抑制使得LA轉(zhuǎn)化為ALA的Δ15或ω-3型去飽和酶活性而選擇或獲得的?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法減少或消除內(nèi)源去飽和酶活性，例如1)提供用于將反義序列轉(zhuǎn)錄到Δ15去飽和酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的盒；2)通過(guò)插入、取代和/或缺失全部或部分靶基因而破壞Δ15去飽和酶基因；或3)使用天然具有或經(jīng)過(guò)突變而具有低Δ15去飽和酶活性或無(wú)Δ15去飽和酶基因的宿主細(xì)胞。對(duì)不需要的去飽和酶途徑的抑制也可以通過(guò)使用如U.S.4,778,630中描述的特定去飽和酶抑制劑而實(shí)現(xiàn)。
或者，可能需要使ω-3脂肪酸的生產(chǎn)最大化(并且使ω-6脂肪酸的合成最小化)。因此，可以利用宿主微生物，其中利用上述任何一種方法(也參見(jiàn)，例如，共同未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/484209，在此全文引入作為參考)去除或抑制了將油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A的Δ12去飽和酶活性。隨后，可以將合適的表達(dá)盒與合適的底物(如ALA)一起導(dǎo)入宿主，用于轉(zhuǎn)化為ALA的ω-3脂肪酸衍生物(如STA，ETA，EPA，DPA，DHA)。
除了目前的PUFA生物合成途徑，預(yù)期操作導(dǎo)致前體脂肪酸生物合成的一些其它酶促途徑，可以導(dǎo)致特定PUFAs的總體凈生物合成。這些相關(guān)途徑的鑒定和途徑在將來(lái)是有用的。
上調(diào)需要的生物合成途徑的技術(shù)可以將額外拷貝的去飽和酶和延伸酶基因?qū)胨拗?，以便提高?3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑的產(chǎn)量。去飽和酶或延伸酶基因的表達(dá)還可以通過(guò)使用較強(qiáng)的啟動(dòng)子(調(diào)控型的或組成型的)而在轉(zhuǎn)錄水平上加強(qiáng)，以便導(dǎo)致增強(qiáng)了的表達(dá)，包括從mRNA或編碼的蛋白上去掉/缺失去穩(wěn)定化序列，或者向mRNA增加穩(wěn)定化序列(U.S.4,910,141)。正如本發(fā)明所證實(shí)的，增強(qiáng)去飽和酶或延伸酶基因表達(dá)的另一個(gè)途徑是提高所編碼的mRNAs的翻譯效率，包括用能在選定的宿主中優(yōu)化基因表達(dá)的密碼子取代天然基因上的密碼子。
下調(diào)不希望的生物合成途徑的技術(shù)相反，可以通過(guò)基因破壞消除或通過(guò)其他方式(例如，反義mRNA)下調(diào)與ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑競(jìng)爭(zhēng)能量或碳的生物化學(xué)途徑，或干擾特定PUFA最終產(chǎn)物產(chǎn)生的天然PUFA生物合成途徑酶。為了進(jìn)行基因破壞，將外源DNA片段(通常是選擇標(biāo)記基因)插入要破壞的結(jié)構(gòu)基因，以便破壞它的編碼序列，并因此功能性滅活所述基因。將所述破壞盒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，導(dǎo)致了非通過(guò)同源重組用無(wú)功能的破壞的基因替代功能性天然基因(例如，參見(jiàn)Hamilton等J.Bacteriol.1714617-4622(1989)；Balbas等Gene 136211-213(1993)；Gueldener等Nucleic Acids Res.242519-2524(1996)；和Smith等Methods Mol.Cell.Biol.5270-277(1996))。
當(dāng)靶基因的序列已知時(shí)，反義是下調(diào)基因的另一種方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，克隆了來(lái)自所需基因的核酸片段，并且可操作地與啟動(dòng)子連接，以便RNA的反義鏈能夠轉(zhuǎn)錄。然后將該構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并且生產(chǎn)RNA的反義鏈。反義RNA能通過(guò)抑制編碼感興趣的蛋白的mRNA的積累，抑制基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，特殊考慮與使用反義技術(shù)相關(guān)，以便減弱特定基因的表達(dá)。例如，反義基因的適當(dāng)水平的表達(dá)可能需要使用不同的嵌合基因，其中采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的不同的調(diào)控元件。
盡管當(dāng)序列已知時(shí)，定向基因破壞和反義技術(shù)提供了下調(diào)基因的有效方法，業(yè)已開(kāi)發(fā)了不是基于序列的其他特異性更低的方法，例如，細(xì)胞可以暴露于UV輻射，然后篩選需要的表型。用化學(xué)試劑進(jìn)行的誘變同樣能有效產(chǎn)生突變體，并且通常使用的物質(zhì)包括能影響非復(fù)制DNA的化學(xué)物質(zhì)(例如，HNO2和NH2OH)，以及能影響復(fù)制DNA的試劑(例如，吖啶染料，特別是導(dǎo)致移碼突變)。使用輻射或化學(xué)試劑產(chǎn)生突變體的特定方法在現(xiàn)有技術(shù)有大量報(bào)導(dǎo)。例如，參見(jiàn)Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，2nd ed.(1989)Sinauer AssociatesSunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
基因破壞的另一種非特異性方法是使用可轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子是遺傳元件，它能隨機(jī)地插入DNA，但是隨后可以根據(jù)序列回收，以便確定是否發(fā)生了插入。體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座方法是公知的。這兩種方法涉及組合使用可轉(zhuǎn)座元件和轉(zhuǎn)座酶。當(dāng)可轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子在存在轉(zhuǎn)座酶的條件下與核酸片段接觸時(shí)，可轉(zhuǎn)座元件能隨機(jī)地插入所述核酸片段。這種技術(shù)可用于隨機(jī)誘變，并且用于基因分離，因?yàn)槭艿狡茐牡幕蚩梢愿鶕?jù)可轉(zhuǎn)座元件的序列鑒定。用于體外轉(zhuǎn)座的試劑盒可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得[例如，參見(jiàn)1.)The Primer IslandTransposition Kit，可以從Perkin Elmer Applied Biosystems獲得，Branchburg，NJ，基于酵母Ty1元件；2.)The Genome Priming System，可以從New England Biolabs獲得，Beverly，MA，基于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7；和3.)EZTN轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)，可以從Epicentre Technologies獲得，Madison，WI，基于Tn5細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子]。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以通過(guò)上述另一種方法將它用于調(diào)控脂肪酸生物合成途徑的表達(dá)。例如，本發(fā)明提供了將編碼生物合成途徑上的關(guān)鍵酶的基因?qū)牒徒湍敢陨a(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。這些基因編碼以下一種或多種Δ6去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ4去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶，和PUFA延伸酶。特別適用于在含油酵母中表達(dá)這些基因，所述酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑，并且調(diào)控這些和其他PUFA生物合成基因的表達(dá)，以便使用各種方法使優(yōu)選的PUFA產(chǎn)物的產(chǎn)量最大化，用于宿主生物的代謝工程。
用于重組生產(chǎn)ω-3和/或ω-6脂肪酸的優(yōu)選的微生物宿主用于生產(chǎn)ω脂肪酸的宿主細(xì)胞可以包括包括在大范圍的溫度和pH值下，在多種飼料上生長(zhǎng)的微生物宿主，所述飼料包括簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的碳水化合物，有機(jī)酸和醇，和/或烴。
但是，優(yōu)選的微生物宿主是含油酵母。這些生物可天然地進(jìn)行油類合成和積累，所述油包括超過(guò)大約25％的細(xì)胞干重，更優(yōu)選超過(guò)大約30％的細(xì)胞干重，最優(yōu)選超過(guò)大約40％的細(xì)胞干重。通常被確定為含油酵母的屬包括，但不局限于耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，典型的油類合成酵母包括類酵母紅冬孢，斯達(dá)氏油脂酵母，產(chǎn)油油脂酵母，拉可夫氏假絲酵母，鐵紅假絲酵母，熱帶假絲酵母，產(chǎn)朊假絲酵母，茁芽絲孢酵母，皮狀絲孢酵母，膠粘紅酵母，禾木科紅酵母，和解脂耶氏酵母(以前被劃分為解脂假絲酵母)。
最優(yōu)選的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其他實(shí)施方案中，最優(yōu)選的是解脂耶氏酵母菌株，被命名為ATCC#20362，ATCC#8862，ATCC#18944，ATCC#76982和/或LGAM S(7)1(Papanikolaou S.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)43-9(2002))。
過(guò)去，已經(jīng)用解脂耶氏酵母的多種菌株制備和生產(chǎn)異檸檬酸裂合酶(DD259637)；脂酶(SU1454852，WO2001083773，DD279267)；多羥基鏈烷酸(WO2001088144)；檸檬酸(RU2096461，RU2090611，DD285372，DD285370，DD275480，DD227448，PL160027)；赤蘚糖醇(EP770683)；2-氧戊二酸(DD267999)；γ-癸內(nèi)酯(U.S.6,451,565，F(xiàn)R2734843)；γ-十二內(nèi)酯(EP578388)和丙酮酸(JP09252790)。
PUFA生產(chǎn)的發(fā)酵方法轉(zhuǎn)化過(guò)的微生物宿主細(xì)胞是在能優(yōu)化去飽和酶和延伸酶的活性并且產(chǎn)生最大的和最經(jīng)濟(jì)的優(yōu)選PUFAs的產(chǎn)量的條件下生長(zhǎng)的。一般，可以優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源的類型和用量，氮源的類型和用量，碳-氮的比例，氧氣含量，生長(zhǎng)溫度，pH，生物量生產(chǎn)期的長(zhǎng)度，油積累期的長(zhǎng)度，以及細(xì)胞收獲時(shí)間。感興趣的微生物，如含油酵母在復(fù)雜培養(yǎng)基(例如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)液(YPD))或缺少生長(zhǎng)所必需的成分，以便強(qiáng)制選擇需要的表達(dá)盒的特定基本培養(yǎng)基)(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括合適的碳源。合適的碳源包括，但不局限于單糖(例如，葡萄糖，果糖)，二糖(例如，乳糖，蔗糖)，寡糖，多糖(例如，淀粉，纖維素或它們的混合物)，糖醇(例如，甘油)或可更新飼料的混合物(例如，干酪乳清滲透物，玉米漿，甜菜糖漿，大麥芽)。另外，碳源可以包括鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，和脂肪酸的各種商業(yè)來(lái)源，包括植物油(例如，大豆油)和動(dòng)物脂肪。另外，碳源可以包括一-碳源(例如，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸和含碳胺)，業(yè)已證實(shí)了其轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵生物化學(xué)中間產(chǎn)物的代謝轉(zhuǎn)化。因此，預(yù)計(jì)，用于本發(fā)明的碳源包括可以包括多種含碳源，并且僅僅局限于宿主生物的選擇。盡管上述所有碳源及其混合物預(yù)計(jì)都適合本發(fā)明，優(yōu)選的碳源是糖和/或脂肪酸。最優(yōu)選的是葡萄糖和/或含有10-22個(gè)碳的脂肪酸。
氮可以由無(wú)機(jī)(例如，(NH4)2SO4)或有機(jī)來(lái)源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合適的碳和氮源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須還包括合適的礦物質(zhì)，鹽，輔因子，緩沖液，維生素，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合微生物生長(zhǎng)，并且促進(jìn)PUFA生產(chǎn)所需要的酶促途徑的其他成分。特別關(guān)注若干金屬離子(例如，Mn+2，Co+2，Zn+2，Mg+2)，它們能促進(jìn)脂類和PUFAs的合成(Nakahara，T.等，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本發(fā)明的優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是常見(jiàn)的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，如酵母Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其他確定的或合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基也可以使用，并且適合特定微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。用于發(fā)酵的合適的pH范圍通常為大約pH 4.0-pH 8.0，其中pH 5.5-pH 7.0是起始生長(zhǎng)條件的優(yōu)選范圍。發(fā)酵可以在需氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中，微需氧條件是優(yōu)選的。
通常，高水平PUFAs在含油酵母細(xì)胞中的積累，需要兩個(gè)階段的過(guò)程，因?yàn)樵谥镜纳L(zhǎng)和合成/儲(chǔ)存之間的代謝狀態(tài)必須是″平衡的″。因此，最優(yōu)選的是，需要兩個(gè)階段的發(fā)酵過(guò)程在含油酵母中生產(chǎn)PUFAs。在該方法中，發(fā)酵的第一階段被用于制備和積累細(xì)胞物質(zhì)，并且以快速細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂為特征。在發(fā)酵的第二階段，優(yōu)選在培養(yǎng)物中建立氮?jiǎng)儕Z條件，以便促進(jìn)高水平的脂類積累。這種氮?jiǎng)儕Z的作用是降低細(xì)胞中AMP的有效濃度，以便減弱線粒體的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶的活性。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時(shí)，將積累檸檬酸，因此在細(xì)胞質(zhì)中形成了乙酰-CoA的豐富的資源，并且啟動(dòng)了脂肪酸合成。因此，這一階段以細(xì)胞分裂終止，隨后是脂肪酸的合成和油的積累為特征。
盡管細(xì)胞通常是在大約30℃下生長(zhǎng)的，某些研究業(yè)已在較低溫度下增加了不飽和脂肪酸的合成(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57419-25(1991))。根據(jù)工藝的經(jīng)濟(jì)學(xué)，這種溫度偏移可能在兩個(gè)階段的發(fā)酵的第一階段之后發(fā)生，此時(shí)，業(yè)已出現(xiàn)了大量的微生物生長(zhǎng)。
預(yù)計(jì)，可以采用多種發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)，其中，使用本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的基因商業(yè)化生產(chǎn)ω脂肪酸是理想的。例如，用重組微生物宿主商業(yè)生產(chǎn)PUFAs，可以通過(guò)分批發(fā)酵，補(bǔ)料-分批發(fā)酵活連續(xù)發(fā)酵工藝生產(chǎn)。
分批發(fā)酵工藝是封閉的系統(tǒng)，其中，培養(yǎng)基組成是在工藝開(kāi)始時(shí)確定的，并且不再進(jìn)行超出在工藝過(guò)程中維持pH和氧氣含量需要的進(jìn)一步補(bǔ)充。因此，在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始時(shí)，用需要的微生物接種所述培養(yǎng)基，并且可以在不向培養(yǎng)基中添加其他來(lái)源(即，碳和氮源)條件下具有生長(zhǎng)或代謝活性。在分批發(fā)酵工藝中，該系統(tǒng)的代謝物和生物量組成經(jīng)常地改變，直到培養(yǎng)終止。在典型的分批發(fā)酵工藝中，細(xì)胞從停滯階段發(fā)展到高速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，并最終達(dá)到靜止期，在這里，生長(zhǎng)速度減弱或終止。在不處理的條件下，靜止階段的細(xì)胞會(huì)最終死亡。標(biāo)準(zhǔn)的分批發(fā)酵工藝的變化是補(bǔ)料-分批發(fā)酵工藝，其中，在發(fā)酵過(guò)程中將碳源連續(xù)地添加到發(fā)酵罐中。補(bǔ)料-分批發(fā)酵工藝同樣適用于本發(fā)明。當(dāng)代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞代謝或希望在任何時(shí)間在培養(yǎng)基中具有有限數(shù)量的來(lái)源時(shí)，補(bǔ)料-分批工藝是有用的。測(cè)定補(bǔ)料-分批系統(tǒng)中的碳源是困難的，因此，可以根據(jù)可測(cè)定因子的變化估算，如pH，溶解氧和廢氣(例如，CO2)的分壓。分批和補(bǔ)料-分批培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的和熟悉的，并且其例子可以參見(jiàn)以下文獻(xiàn)Thomas D.Brock，BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology.2nd ed.，(1989)Sinauer AssociatesSunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)，在此收作本文參考。
利用本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的基因商業(yè)化生產(chǎn)ω脂肪酸的方法還可以通過(guò)連續(xù)發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)，其中，將確定成分的培養(yǎng)基連續(xù)添加到生物反應(yīng)器中，同時(shí)取出等量的培養(yǎng)物體積，用于產(chǎn)物回收。連續(xù)培養(yǎng)通常將細(xì)胞保持在恒定細(xì)胞密度的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)方法能夠調(diào)節(jié)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或多種因素中的任意一種。例如，一種方法可以限制碳源，并且允許所有其他參數(shù)適當(dāng)?shù)卮x。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)地改變影響生長(zhǎng)的多種因素，同時(shí)保持通過(guò)培養(yǎng)基濁度測(cè)定的細(xì)胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)試圖保持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)，因此，細(xì)胞生長(zhǎng)速度必須與由于將培養(yǎng)基從培養(yǎng)物中排出而導(dǎo)致的細(xì)胞減少。調(diào)節(jié)連續(xù)培養(yǎng)工藝的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子的方法，以及用于增加生產(chǎn)形成速度的技術(shù)為工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域所熟知，并且上文提到的Brock詳細(xì)披露了多種方法。
PUFAs的純化
PUFAs可以作為游離脂肪酸形式出現(xiàn)在宿主微生物中，或者以諸如酰基甘油，磷脂，硫脂或醣脂的脂化形式出現(xiàn)，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的多種方法從宿主細(xì)胞中提取。酵母脂類的提取技術(shù)，品質(zhì)分析和可接受性標(biāo)準(zhǔn)的一種概述是以下文獻(xiàn)Z.Jacobs(CriticalReviews in Biotechnology 12(5/6)463-491(1992))。有關(guān)下游加工的簡(jiǎn)單概述還可以參見(jiàn)A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45271-312(1997))。
一般，純化PUFAs的方法可以包括用有機(jī)溶劑萃取，超聲波處理，超臨界流體萃取(例如，使用二氧化碳)，皂化和物理方法，如壓力，或它們的組合。特別感興趣的是用甲醇和氯仿在存在水的條件下萃取(E.G.，Bligh&W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))。如果需要，可以將含水層酸化，以便使帶負(fù)電荷的部分質(zhì)子化，并因此增加了想得到的產(chǎn)物向有機(jī)層中的分配。在萃取之后，可以通過(guò)在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)除去有機(jī)溶劑。當(dāng)以綴合形式分離時(shí)，可以對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行酶促或化學(xué)裂解，以便釋放游離的脂肪酸或感興趣的更低復(fù)雜性的綴合物，并且然后可以進(jìn)行進(jìn)一步的操作，以便生產(chǎn)需要的最終產(chǎn)物。理想的是，用氫氧化鉀裂解脂肪酸的綴合形式。
如果需要進(jìn)一步純化，可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法。所述方法可以包括萃取，用尿素處理，分級(jí)結(jié)晶化，HPLC，分級(jí)蒸餾，硅膠層析，高速離心或蒸餾，或這些技術(shù)的組合。對(duì)諸如酸或烯基的活性基團(tuán)的保護(hù)，可以在任何步驟通過(guò)已知技術(shù)(例如，烷基化，離子化)完成。所使用的方法包括脂肪酸甲基化，以便產(chǎn)生甲酯。類似地，可以在任何步驟除去保護(hù)基團(tuán)。理想的是，純化含有GLA，STA，ARA，DHA和EPA的級(jí)份可以通過(guò)用尿素處理和/或分級(jí)蒸餾實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明本發(fā)明證明了將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導(dǎo)入含油酵母以生產(chǎn)PUFAs的可行性。為此，選擇ARA(代表ω-6脂肪酸)和EPA(代表ω-3脂肪酸)作為在含油酵母-解脂耶氏酵母中生產(chǎn)的需要的產(chǎn)物。因此，ARA的合成需要將編碼Δ6去飽和酶、延伸酶和Δ5去飽和酶活性的基因?qū)胍辖湍?，而EPA的合成需要將編碼Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶活性的基因?qū)胍辖湍浮?br> 在解脂耶氏酵母中表達(dá)來(lái)自多種生物的多種公共可獲得的，具有將DGAL轉(zhuǎn)化為ARA和將ETA轉(zhuǎn)化為EPA的能力的Δ5去飽和酶，并且篩選其活性，以便鑒定在替代的宿主中顯示最高水平活性的基因。在此基礎(chǔ)上，選擇高山被孢霉Δ5去飽和酶(SEQ ID NO4)作為在含油酵母中表達(dá)的優(yōu)選基因，這是基于其將底物補(bǔ)料試驗(yàn)中大約30％細(xì)胞內(nèi)DGLA轉(zhuǎn)化為ARA的能力而選擇的。
進(jìn)行了其它底物補(bǔ)料試驗(yàn)，以證明由以下基因編碼的酶活性高山被孢霉Δ6去飽和酶(SEQ ID NO2)將LA轉(zhuǎn)化為GLA，并且將ALA轉(zhuǎn)化為STA(其中解脂耶氏酵母中LA至GLA的底物轉(zhuǎn)化百分比為約30％)；異絲水霉Δ17去飽和酶(SEQ ID NO6)將DGLA轉(zhuǎn)化為ETA，并且將ARA轉(zhuǎn)化為EPA(其中解脂耶氏酵母中ARA至EPA的底物轉(zhuǎn)化百分比為約23％)；高山被孢霉高親和力PUFA延伸酶(SEQ ID NO8)將GLA轉(zhuǎn)化為DGLA，將STA轉(zhuǎn)化為ETA，并且將EPA轉(zhuǎn)化為DPA(其中解脂耶氏酵母中GLA至DGLA的底物轉(zhuǎn)化百分比為約30％)。
根據(jù)異絲水霉Δ17去飽和酶更低的底物轉(zhuǎn)化百分比(相對(duì)于Δ5和Δ6去飽和酶和延伸酶)，對(duì)該特定基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以便增強(qiáng)其在耶氏酵母屬中的表達(dá)。這是通過(guò)確定解脂耶氏酵母中的密碼子選擇和結(jié)構(gòu)基因標(biāo)志，指定密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因，然后體外合成該基因，并且使其在替代的宿主中的效率增加(相對(duì)于野生型基因)而實(shí)現(xiàn)的。
為了合成ARA或EPA(由此證明含油宿主經(jīng)過(guò)工程改造以生產(chǎn)ω-6和ω-3脂肪酸(即ARA和EPA)的能力)，隨后制備了兩種不同的DNA表達(dá)構(gòu)建體1)第一種含Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶；和2)第二種構(gòu)建體含Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、高親和力PUFA延伸酶和密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶。將兩種構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中，并且整合到編碼乳清苷-5′-磷酸脫羧酶的染色體URA3基因中(EC 4.1.1.23)。用合適的底物補(bǔ)料的宿主細(xì)胞的GC分析檢測(cè)到了ARA(實(shí)施例5)和EPA(實(shí)施例6)的產(chǎn)生。因此，這是第一次證實(shí)了含油酵母中的PUFA生物合成，從而將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導(dǎo)入了含油酵母中。
根據(jù)此處描述的教導(dǎo)和結(jié)果，預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到通過(guò)采用含油酵母作為合成多種ω-3和/或ω-6PUFA的生產(chǎn)平臺(tái)而建立的可行性和商業(yè)用途。
實(shí)施例本發(fā)明還確定了以下實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解的是，在這些實(shí)施方案中，盡管指明了是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是，是以說(shuō)明形式提供的。通過(guò)上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，以便適應(yīng)各種用途和條件。
一般方法用于實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知的，并且披露于以下文獻(xiàn)中1.)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-interscience(1987)。
適合微生物培養(yǎng)物維持和生長(zhǎng)的材料和方法為本領(lǐng)域所公知。適合在以下實(shí)施例中使用的技術(shù)可以參見(jiàn)以下文獻(xiàn)Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Philips，Eds)，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994))；或參見(jiàn)Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbookof Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)。用于生長(zhǎng)和保持微生物細(xì)胞的所有試劑，限制酶和材料都是從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)獲得的，除非另有說(shuō)明。
大腸桿菌(XLl-Blue)感受態(tài)細(xì)胞是從Stratagene公司(SanDiego，CA)購(gòu)買的。大腸桿菌菌株通常是在37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生長(zhǎng)的。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，同上)進(jìn)行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成的。用Stratagene′sQuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖羞M(jìn)行定點(diǎn)誘變，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。當(dāng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或定點(diǎn)誘變與亞克隆相關(guān)時(shí)，對(duì)所述構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序，以便證實(shí)沒(méi)有將誤差導(dǎo)入所述序列。將PCR產(chǎn)物克隆到Promega′s pGEM-T-easy載體(Madison，WI)上。
DNA序列是利用染料終止技術(shù)(U.S.5,366,860；EP 272,007)和載體與插入片段特異性引物的組合在ABI自動(dòng)測(cè)序儀上生成的。序列編輯在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中進(jìn)行。所有序列在兩個(gè)方向上均表現(xiàn)了至少兩次的覆蓋。遺傳序列的比較是利用DNASTAR軟件(DNA Star，Inc.)實(shí)現(xiàn)的?；蛘?，遺傳序列的操作是使用可以從Genetics Computer Group Inc.(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)獲得的程序組進(jìn)行的。使用了所述GCG程序″Pileup″，空位形成預(yù)設(shè)值為12，空位延伸預(yù)設(shè)值為4。使用了GCG″Gap″或″Bestfit″程序，預(yù)設(shè)的空位形成罰分為50，預(yù)設(shè)的空位延伸罰分為3。除非另有說(shuō)明，在所有其他場(chǎng)合下，都使用GCG程序的預(yù)設(shè)參數(shù)。
縮寫(xiě)的含義如下″sec″表示秒，″min″表示分鐘，″h″表示小時(shí)，″d″表示天，″μL″表示微升，″mL″表示毫升，″L″表示升，″μM″表示微摩爾，″mM″表示毫摩爾，″M″表示摩爾，″mmol″毫摩爾，″μmole″表示微摩爾，″g″表示克，″μg″表示微克，″ng″表示納克，″U″表示單位，″bp″表示堿基對(duì)，而″kB″表示千堿基。
解脂耶氏酵母的培養(yǎng)解脂耶氏酵母菌株ATCC#76982和ATCC#90812購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常在28℃條件下生長(zhǎng)在YPD瓊脂(1％酵母提取物、2％細(xì)菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)上。為選擇轉(zhuǎn)化體，采用的是基本培養(yǎng)基(不含硫酸銨或氨基酸的0.17％酵母氮源(NIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、pH6.1)。作為補(bǔ)充的腺嘌呤、亮氨酸、賴氨酸和/或尿嘧啶是被適當(dāng)?shù)丶尤胫敝两K濃度0.01％。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析為了分析脂肪酸，先通過(guò)離心收集細(xì)胞，并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))所述方法提取脂質(zhì)。脂肪酸甲酯是通過(guò)下述方法制備的，即用甲氧基鈉使脂質(zhì)提取物轉(zhuǎn)酯(Roughan，G.和Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)38-46(1990))，并接著用裝配有30-m X 0.25mm(內(nèi)徑)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC對(duì)其進(jìn)行分析。烘箱溫度以3.5℃/分鐘的速度從170℃(保持25分鐘)上升至185℃。
為了直接進(jìn)行堿基轉(zhuǎn)酯，先收獲耶氏酵母培養(yǎng)物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，并在Speed-Vac內(nèi)的真空條件下干燥5-10分鐘。向樣品中加入甲氧基鈉(100μl，1％)，接著渦旋并振搖樣品20分鐘。加入3滴1M NaCl和400μl己烷后，渦旋并離心樣品。移出上層并如上所述通過(guò)GC對(duì)其進(jìn)行分析。
實(shí)施例1構(gòu)建適合在解脂耶氏酵母中表達(dá)異源基因的質(zhì)粒構(gòu)建了質(zhì)粒pY5，即pINA532(由Dr.Claude Gaillardin饋贈(zèng)，Insitut National Agronomics，Centre de biotechnologie Agro-Industrielle，laboratoire de Genetiq ue Moleculaire et Cellularie INRA-CNRS，F(xiàn)-78850 Thiverval-Grignon，F(xiàn)rance)衍生物，用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)異源基因，如圖2所示。
首先，將包括pINA532的ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bp EcoRl片段亞克隆到pBluescript(Strategene，San Diego，CA)的EcoRl位點(diǎn)上，以便制備pY2。通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自解脂耶氏酵母基因組DNA的TEF啟動(dòng)子(Muller S.，等，Yeast，141267-1283(1998))，用TEF5′(SEQ ID NO38)和TEF3′(SEQ ID NO39)作引物。PCR擴(kuò)增是在50μl的總體積中進(jìn)行的，它包括100ng耶氏酵母屬基因組DNA，含有10mM KCl的PCR緩沖液，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl(pH 8.75)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/mL BSA(最終濃度)，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，10皮摩爾每一種引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴(kuò)增是按以下方法進(jìn)行的首先在95℃下變性3分鐘，然后進(jìn)行35輪以下循環(huán)95℃1分鐘，56℃30秒，72℃1分鐘。在72℃下進(jìn)行了10分鐘的最終延伸，然后在4℃下終止反應(yīng)。將418的PCR產(chǎn)物連接到pCR-Blunt上，以便制備pIP-tef。將pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亞克隆到pY2的BamHI/Smal位點(diǎn)上，以便制備pY4。
使用pINA532作模板，用XPR5′(SEQ ID NO40)和XPR3′(SEQID NO41)作引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增XPR2轉(zhuǎn)錄終止子。PCR擴(kuò)增是在50μl的總體積中進(jìn)行的，使用上述成分和條件。用SacII消化179bp的PCR產(chǎn)物，然后連接到pY4的SacII位點(diǎn)上，以便制備pY5。因此，pY5(參見(jiàn)圖3和4)可用作耶氏酵母屬-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，它包括1.)耶氏酵母屬自主復(fù)制序列(ARS18)；2.)ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；3.)氨芐青霉素-抗性基因(AmpR)，用于在大腸桿菌中選擇；4.)耶氏酵母屬LEU2基因(E.C.4.2.1.33，編碼異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)酶，用于在耶氏酵母屬中選擇)；5.)翻譯延伸啟動(dòng)子(TEFP)，用于在耶氏酵母屬中表達(dá)異源基因；和6.)細(xì)胞外蛋白酶基因終止子(XPR2)，用于在耶氏酵母屬中表達(dá)的異源基因的轉(zhuǎn)錄終止。
作為pY5的衍生物構(gòu)建了pY5-13(圖4)，以便促進(jìn)在解脂耶氏酵母中的亞克隆和異源基因表達(dá)。用pY5作模板，通過(guò)6輪定點(diǎn)誘變構(gòu)建pY5-13。通過(guò)用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NOs106和107)進(jìn)行定點(diǎn)誘變將SaII和ClaI位點(diǎn)從pY5上消除，以便制備pY5-5。通過(guò)用寡核苷酸YL9和YL10(SEQ ID NOs110和111)進(jìn)行定點(diǎn)誘變將SaII位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-5的LEU2基因和TEF啟動(dòng)子之間，以便制備pY5-6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQ ID NOs108和109)將PacI位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-6的LEU2基因和ARS18之間，以便制備pY5-8。使用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs104和105)將NcoI位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-8的TEF啟動(dòng)子的翻譯起始密碼子周圍，以便制備pY5-9。使用YL1和YL2寡核苷酸(SEQ ID NOs102和103)將pY5-9的LEU2基因的NcoI位點(diǎn)消除，以便制備pY5-12。最后，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NOs88和89)將BsiWI位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-12的ColEl和XPR2區(qū)之間，以便制備pY5-13。
為了促進(jìn)亞克隆，構(gòu)建了質(zhì)粒pY5的第二種衍生物。具體地講，用pY5作模板，通過(guò)三輪定點(diǎn)誘變構(gòu)建了pY5-4(圖4)。用寡核苷酸YL1和YL2(SEQ ID NOs102和103)將位于Leu2報(bào)道基因上的NcoI位點(diǎn)位點(diǎn)從pY5除去，以便制備pY5-1。通過(guò)用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs104和105)進(jìn)行定點(diǎn)誘變將NcoI位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-1的TEF啟動(dòng)子和XPR2轉(zhuǎn)錄終止子之間，以便制備pY5-2。然后使用寡核苷酸YL23和YL24(SEQ ID NOs112和113)將PacI位點(diǎn)導(dǎo)入pY5-2的TEF啟動(dòng)子和XPR2轉(zhuǎn)錄終止子之間，以便制備pY5-4。
實(shí)施例2對(duì)用于在解脂耶氏酵母內(nèi)表達(dá)的Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因的選擇將編碼ω-3和/或ω-6生物合成途徑的特異性基因?qū)牒幸哑茐牡摩?2去飽和酶的解脂耶氏酵母內(nèi)之前，有必要證實(shí)在耶氏酵母屬中表達(dá)的異源Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因的功能性。這是通過(guò)測(cè)定各野生型蛋白在可選宿主內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率而得以實(shí)現(xiàn)的。具體而言，即分別表達(dá)高山被孢霉Δ5去飽和酶、高山被孢霉Δ6去飽和酶、異絲水霉Δ17去飽和酶和高山被孢霉高親和力PUFA延伸酶，并在底物補(bǔ)料試驗(yàn)中進(jìn)行活性篩選。根據(jù)這些結(jié)果，選擇高山被孢霉基因與Δ6和Δ17去飽和酶以及高親和力PUFA延伸酶組合。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通常是通過(guò)限制酶切消化分離野生型去飽和酶或延伸酶基因，或通過(guò)PCR擴(kuò)增，并將其插入合適的載體中進(jìn)行表達(dá)。各PCR擴(kuò)增均在總體積為50μl并包括PCR緩沖液的反應(yīng)混合物中進(jìn)行，所述PCR緩沖液含有10ng模板、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/mL BSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴(kuò)增步驟如下(除非另外指明)95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。
野生型高山被孢霉(登錄號(hào)#AF465281)Δ6去飽和酶將包括高山被孢霉Δ6去飽和酶基因(SEQ ID NO1)的1384bp的pCGR5的NcoI/NotI片段(U.S.5,968,809)插入pY5-2的NcoI/NotI位點(diǎn)(實(shí)施例1)上，以便制備pY54。
野生型高山被孢霉(登錄號(hào)#AF067654)Δ5去飽和酶通過(guò)以寡核苷酸YL11和YL12(SEQ ID NOs72和73)為引物、以質(zhì)粒pCGR-4(U.S.6,075,183)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增高山被孢霉Δ5去飽和酶基因(SEQ ID NO3)。PCR擴(kuò)增步驟如上所述，但延伸步驟延長(zhǎng)至1.5分鐘(對(duì)循環(huán)1-35而言)。用Ncol/Notl消化1357bp的PCR產(chǎn)物，并與Ncol/Notl消化的pY5-13(如實(shí)施例1所述)連接生成pYMA5bp(圖5)。
野生型異絲水霉(ATCC#56851)Δ5去飽和酶通過(guò)PCR，用寡核苷酸YL13A和YL14(SEQ ID NOs116和117)作引物，用質(zhì)粒pRSP3(WO02/081668)作模板，擴(kuò)增異絲水霉Δ5去飽和酶基因(SEQ ID NO114)。PCR擴(kuò)增步驟如上所述，但延伸步驟延長(zhǎng)至1.5分鐘(對(duì)循環(huán)1-35而言)。用NcoI/PacI消化1.4kB的PCR產(chǎn)物，然后連接到NcoI/PacI-消化過(guò)的pY5-4上(圖4；參見(jiàn)實(shí)施例1)，以便制備pYSD5。
野生型Isochrysis galbana CCMP1323Δ5去飽和酶通過(guò)PCR，用寡核苷酸YL19A和YL20(SEQ ID NOs120和121)作引物，用質(zhì)粒pRIG-1(WO02/081668)作模板，擴(kuò)增I.galbana Δ5去飽和酶基因(SEQ ID NO118)。PCR擴(kuò)增步驟如上所述，但延伸步驟延長(zhǎng)至1.5分鐘(對(duì)循環(huán)1-35而言)。用BamHI/PacII消化1.4kB的PCR產(chǎn)物，然后連接到BamHI/PacII-消化過(guò)的pY5-4上(圖4；參見(jiàn)實(shí)施例1)，以便制備pYIG5。
野生型Thraustochytrium aureum(ATCC#34304)Δ5去飽和酶通過(guò)PCR，用寡核苷酸YL15和YL16B(SEQ ID NOs124和125)作引物，用質(zhì)粒pRTA4(WO02/081668)作模板，擴(kuò)增T.aureum Δ5去飽和酶基因(SEQ ID NO122)。PCR擴(kuò)增步驟如上所述，但延伸步驟延長(zhǎng)至1.5分鐘(對(duì)循環(huán)1-35而言)。用NcoI/NcoI消化1.4kB的PCR產(chǎn)物，然后連接到NcoI/NcoI-消化過(guò)的pY5-2上(圖4；參見(jiàn)實(shí)施例1)，以便制備pYTA5。
野生型異絲水霉(ATCC#56851)Δ17去飽和酶通過(guò)PCR，用寡核苷酸YL21A(SEQ ID NO42)和YL22(SEQID NO43)作引物，由質(zhì)粒pRSP19(US2003/0196217A1)擴(kuò)增異絲水霉的野生型Δ17去飽和酶基因。用NcoI/PacI消化PCR產(chǎn)物，然后連接到NcoI/PacI-消化過(guò)的pY5-4上(圖4；參見(jiàn)實(shí)施例1)，以便制備pYSD17。
野生型高山被孢霉(登錄號(hào)#AX464731)高親和力延伸酶將包括高山被孢霉高親和力PUFA延伸酶基因的編碼區(qū)(SEQ IDNO7)的pRPB2的973bp的NotI片段(WO00/12720)插入pY5的NotI位點(diǎn)(實(shí)施例1；圖3和4)，以便制備pY58。
解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化按照Chen，D.C.等(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235-(1997))的方法將質(zhì)粒pY54，pYMA5pb，pYSD5，pYIG5，PYTA5，pYSD17和pY58分別轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母ATCC#76982中。
簡(jiǎn)單地講，將耶氏酵母屬的亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型在YPD平板上劃線，并且在30℃下生長(zhǎng)大約18小時(shí)。將幾個(gè)大環(huán)的細(xì)胞從平板上刮下來(lái)，并且重新懸浮在1mL的轉(zhuǎn)化緩沖液中，該緩沖液包括·2.25mL的50％PEG，平均分子量3350；·0.125mL的2M乙酸鋰，pH 6.0；·0.125mL的2M DTT；和·50μg的剪切的鮭魚(yú)精子DNA。
在100μl的重新懸浮的細(xì)胞中溫育大約500ng的質(zhì)粒DNA，并且在39℃下保持1小時(shí)，以15分鐘的間隔進(jìn)行渦旋混合。將細(xì)胞鋪平板到缺少亮氨酸的基本培養(yǎng)基平板上，并且在30℃下保持2-3天。
底物轉(zhuǎn)化百分比的測(cè)定含有pY54，pYMA5pb，pYSD5，pYIG5，PYTA5，pYSD17或pY58的轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的單個(gè)菌落分別在3mL基本培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，1.7g/L酵母氮基質(zhì)，不含氨基酸，1g/L L-脯氨酸，0.1g/L L-腺嘌呤，0.1g/L L-賴氨酸，pH 6.1)中，在30℃下生長(zhǎng)到OD600大約為1.0。為了進(jìn)行底物補(bǔ)料，將100μl的細(xì)胞放在含有10μg底物的3mL基本培養(yǎng)基中在30℃下繼代培養(yǎng)大約24小時(shí)。然后通過(guò)離心收集細(xì)胞，并提取脂類。脂肪酸甲酯是通過(guò)轉(zhuǎn)酯制備的，隨后進(jìn)行GC分析(如一般方法中的描述)。底物轉(zhuǎn)化百分比按以下公式測(cè)定([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])*100)。
野生型高山被孢霉Δ6去飽和酶的底物轉(zhuǎn)化百分比高山被孢霉Δ6去飽和酶能將LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或?qū)LA轉(zhuǎn)化成STA。含有pY54的解脂耶氏酵母菌株按上述方法生長(zhǎng)(不需要補(bǔ)充底物)，并且分析脂類。結(jié)果表明，具有pY54的耶氏酵母屬菌株能將大約30％LA轉(zhuǎn)化成GLA。
高山被孢霉、異絲水霉、I.galbana和T.aureum Δ5去飽和酶的底物轉(zhuǎn)化百分比高山被孢霉、異絲水霉、I.galbana和T.aureum的Δ5去飽和酶都將DGLA轉(zhuǎn)化為ARA，并且將ETA轉(zhuǎn)化為EPA。分別從單個(gè)菌落生長(zhǎng)含pYMA5pb，pYSD5，pYIG5或pYTA5的解脂耶氏酵母菌株，在含有10μg的ARA的基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，并且按上述方法進(jìn)行脂類分析。含有pYMA5pb(高山被孢霉)的耶氏酵母菌株將大約30％的細(xì)胞內(nèi)DGLA轉(zhuǎn)化為ARA，含有pYSD5(異絲水霉)的耶氏酵母菌轉(zhuǎn)化大約12％，含有pYIG5(I.galbana)的耶氏酵母菌轉(zhuǎn)化大約7％，含有pYTA5(T.Aureum)耶氏酵母菌轉(zhuǎn)化大約23％的細(xì)胞內(nèi)DGLA轉(zhuǎn)化為ARA。
野生型異絲水霉Δ17去飽和酶的底物轉(zhuǎn)化百分比異絲水霉Δ17去飽和酶能將ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或?qū)GLA轉(zhuǎn)化成ETA。含有pYSD17的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長(zhǎng)的，在含有10μg的ARA的基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，并且按上述方法進(jìn)行脂類分析。ARA補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明具有pYSD17的耶氏酵母屬菌株能將大約23％的細(xì)胞內(nèi)ARA轉(zhuǎn)化成EPA。
野生型高山被孢霉高親和力延伸酶的底物轉(zhuǎn)化百分比高山被孢霉高親和力PUFA延伸酶能將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA，將STA轉(zhuǎn)化成ETA和/或?qū)PA轉(zhuǎn)化成DPA。包括pY58的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長(zhǎng)的，在含有10μg的GLA基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，并且按上述方法進(jìn)行脂類分析。GLA補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，具有pY58的耶氏酵母屬菌株能將大約30％的細(xì)胞內(nèi)GLA轉(zhuǎn)化成DGLA。
實(shí)施例3密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母內(nèi)的合成和表達(dá)基于實(shí)施例2的結(jié)果，可利用的基因是編碼Δ6去飽和酶、延伸酶和Δ5去飽和酶活性的基因，因?yàn)檫@些基因在解脂耶氏酵母內(nèi)均能夠?qū)崿F(xiàn)約30％的底物轉(zhuǎn)化百分率。但異絲水霉來(lái)源的Δ17去飽和酶的最大轉(zhuǎn)化效率僅為23％。因此，根據(jù)耶氏酵母屬的密碼子選擇模式、ATG翻譯起始密碼子周圍的共有序列和RNA穩(wěn)定性的普遍規(guī)律，并基于異絲水霉DNA序列(SEQ ID NO5)設(shè)計(jì)了密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene 265(1-2)11-23(2001))。
除了對(duì)翻譯起始位點(diǎn)的修飾外，還對(duì)1077bp編碼區(qū)中的127bp片段(包括了117個(gè)密碼子)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。該密碼子優(yōu)化DNA序列(SEQ ID NO9)與異絲水霉△17去飽和酶基因DNA序列(SEQ IDNO5)之間的比較如圖6所示，其中粗體所示核苷酸對(duì)應(yīng)于密碼子優(yōu)化基因中被改動(dòng)的核苷酸。該密碼子優(yōu)化基因中的所有變更均未改變編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
在解脂耶氏酵母中測(cè)定優(yōu)選的密碼子選擇在National Center for Biotechnology Information公共數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了大約100個(gè)解脂耶氏酵母的基因。通過(guò)DNAStar的Editseq程序?qū)?21,167bp的這些基因的編碼區(qū)翻譯成相應(yīng)的40,389個(gè)氨基酸，并且制成表格，以便確定由表4所示的解脂耶氏酵母密碼子選擇譜。標(biāo)題為″No.″的欄表示編碼特定氨基酸的特定密碼子在40,389個(gè)氨基酸的樣品中出現(xiàn)的次數(shù)。標(biāo)題為″％″的欄表示編碼特定氨基酸的特定氨基酸的頻率。用粗體字符表示的代碼表示解脂耶氏酵母中優(yōu)選的密碼子。
表3解脂耶氏酵母的密碼子選擇
為了進(jìn)一步優(yōu)化在解脂耶氏酵母中的基因表達(dá)，檢查了79個(gè)基因的′ATG′起始密碼子周圍的共有序列。在圖7中，加下劃線的ATG翻譯起始密碼子的第一個(gè)′A′被設(shè)為+1。分析過(guò)的基因的77％在-3號(hào)位置上出現(xiàn)″A″，表明了″A″在該位置上的強(qiáng)烈偏好。還存在′A′或′C′在-4，-2和-1號(hào)位置上的偏好，′A′，′C′或′T′在+5號(hào)位置上的偏好，以及′G′或′C′在+6號(hào)位置上的偏好。因此，用于基因在解脂耶氏酵母中優(yōu)化表達(dá)的密碼子優(yōu)化的翻譯起始位點(diǎn)的優(yōu)選的共有序列是′MAMMATGNHS′(SEQ ID NO126)，其中使用了如下的核酸簡(jiǎn)并性密碼M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T；和N＝A/C/G/T。
密碼子優(yōu)化基因的體外合成被用于合成密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的方法如圖8所示。首先，設(shè)計(jì)11對(duì)寡核苷酸，以延伸異絲水霉Δ17去飽和酶基因的密碼子優(yōu)化編碼區(qū)的全長(zhǎng)(例如D17-1A、D17-1B、D17-2A、D17-2B、D17-3A、D17-3B、D17-4A、D17-4B、D17-5A、D17-5B、D17-6A、D17-6B、D17-7A、D17-7B、D17-8A、D17-8B、D17-9A、D17-9B、D17-10A、D17-10B、D17-11A和D17-11B，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs10-31)。每一對(duì)有義(A)和反義(B)寡核苷酸除5’-末端具有4bp突出端外，其它部分均互補(bǔ)。此外，引物D17-1A、D17-4B、D17-5A、D17-8A和D17-8B還分別導(dǎo)入了用于后續(xù)亞克隆的Ncol、Bglll和Sall限制位點(diǎn)。
于37℃、體積為20μl并含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、0.5mM ATP和10U T4多核苷酸激酶的混合液中，使均為100ng的各種寡核苷酸磷酸化。將各有義和反義寡核苷酸對(duì)混合，并在采用下列參數(shù)的熱循環(huán)儀中退火95℃(2分鐘)、85℃(2分鐘)、65℃(15分鐘)、37℃(15分鐘)、24℃(15分鐘)和4℃(15分鐘)。因此，D17-1A(SEQ ID NO10)退火至D17-1B(SEQ ID NO11)可生成雙鏈產(chǎn)物“D17-1AB”。同樣，D17-2A(SEQ ID NO12)退火至D17-2B(SEQ ID NO13)可生成雙鏈產(chǎn)物“D17-2AB”，依次類推。
接著將退火雙鏈寡核苷酸分別混合所獲得的三個(gè)集合連接在一起，如下所示●集合1包括D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB；●集合2包括D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB；和
●集合3包括D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB。
將各退火寡核苷酸集合混合在體積為20μl并含有10U T4 DNA連接酶的混合物中，并于16℃溫育過(guò)夜。
接著通過(guò)PCR擴(kuò)增各連接反應(yīng)的產(chǎn)物。具體而言，是通過(guò)以連接的“集合1”混合物(即D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB)為模板，以寡核苷酸D17-1(SEQ ID NO32)和D17-4R(SEQ IDNO33)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的第一個(gè)部分。該P(yáng)CR擴(kuò)增是在總體積為50μl并包括PCR緩沖液的混合物中進(jìn)行，其中的PCR緩沖液含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mMTris-HCl(pH 8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/mL BSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴(kuò)增步驟如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃40秒。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。將430bp PCR片段亞克隆進(jìn)pGEM-Teasy載體(Promega)中，可生成pT17(1-4)。
同樣，通過(guò)以連接的“集合2”混合物(即D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB)為模板，以寡核苷酸D17-5(SEQ ID NO34)和D17-8D(SEQ ID NO35)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的第二個(gè)部分，并將其克隆進(jìn)pGEM-T-easy載體中，可生成pT17(5-8)。最后，同樣通過(guò)以“集合3”連接混合物(即D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB)為模板，以寡核苷酸D17-8U(SEQ ID NO36)和D17-11(SEQ ID NO37)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的第三個(gè)部分，并將其克隆進(jìn)pGEM-T-easy載體中，可生成pT17(9-11)。
分別用pT17(1-4)、pT17(5-8)和pT17(9-11)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA，并用合適的限制性內(nèi)切核酸酶消化，以釋放出pT17(1-4)的420bp Ncol/Bglll片段、pT17(5-8)的400bp Bglll/Sall片段和pT17(9-11)的300bpSall/Notl片段。接著將這些片段組合、連接在一起作為模板，并以D17-1(SEQ ID NO32)和D17-11(SEQ ID NO37)為引物擴(kuò)增完整的合成密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因。對(duì)Δ17去飽和酶基因的每一個(gè)部分均采用上述條件，在總體積為50μl的混合物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，熱循環(huán)程序如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1.1分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。生成1.1kB PCR產(chǎn)物。
含密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶的質(zhì)粒pYSD17S的構(gòu)建用Ncol/Notl消化包括完整合成Δ17去飽和酶的上述1.1kB PCR產(chǎn)物，并將其亞克隆進(jìn)Ncol/Notl消化的pY5-13(實(shí)施例1)中，可生成pYSD17S(圖9A)。
為比較野生型和合成基因在耶氏酵母屬內(nèi)的效率，另一個(gè)“對(duì)照”是通過(guò)以YL53(SEQ ID NO44)和YL54(SEQ ID NO45)為引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變，消除pYSD17(包括所述野生型基因；如實(shí)施例2所述)中富含AT的Pacl位點(diǎn)，可生成pYSD17M(圖9B)。
用密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因?qū)庵辖湍傅霓D(zhuǎn)化根據(jù)實(shí)施例2所述方法，分別將含有野生型和密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)解脂耶氏酵母ATCC#76982中。利用該技術(shù)，獲得含有下述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體表4轉(zhuǎn)化體耶氏酵母中的質(zhì)粒一覽表
密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶基因的底物轉(zhuǎn)化百分率Δ17去飽和酶可將ARA轉(zhuǎn)化為EPA(參見(jiàn)圖2)。野生型和密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的底物轉(zhuǎn)化百分率([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物]*100)是通過(guò)利用一般方法中所述方法，在含有各可選質(zhì)粒構(gòu)建體的解脂耶氏酵母中測(cè)定的。
ARA補(bǔ)料試驗(yàn)結(jié)果顯示具有對(duì)照質(zhì)粒pYSD17或pYSD17M的耶氏酵母菌株可將大約23％的胞內(nèi)ARA轉(zhuǎn)化為EPA(圖10A)，而含有pYSD17S中的密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶基因的菌株則可將大約45％的胞內(nèi)ARA轉(zhuǎn)化為EPA(圖10B)。因此，含有密碼子優(yōu)化Δ17去飽和酶的耶氏酵母可轉(zhuǎn)化比含有野生型異絲水霉基因的菌株多大約2倍的ARA。
適合解脂耶氏酵母內(nèi)多種ω脂肪酸生物合成基因同步表達(dá)的質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例描述了需要合成多種表達(dá)質(zhì)粒，以便構(gòu)建1)適合于被整合進(jìn)解脂耶氏酵母屬基因組內(nèi)以表達(dá)Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、和Δ5去飽和酶(用于生產(chǎn)ARA)的DNA片段；和2)適合于被整合進(jìn)解脂耶氏酵母屬基因組內(nèi)以表達(dá)Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶(用于生產(chǎn)EPA)的DNA片段。
質(zhì)粒pY24的構(gòu)建質(zhì)粒pY24(圖11)是用于構(gòu)建適合被整合進(jìn)解脂耶氏酵母基因組內(nèi)的表達(dá)盒的親本載體。pY24的構(gòu)建方法如下以寡核苷酸KU5和KU3(SEQ ID NOs46和47)為引物，以耶氏酵母基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO48)。該P(yáng)CR擴(kuò)增是在總體積為50μl的混合物中進(jìn)行，該混合物包括100ng耶氏酵母基因組DNA和含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/mL BSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu TurboDNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)的PCR緩沖液。擴(kuò)增步驟如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃2分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入pGEM-T easy載體(Promega，Madison，WI)中，可生成pGYUM。
利用寡核苷酸KI5和KI3(SEQ ID NOs50和51)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有Impatients balsama的接合酶基因(或“imp H8”)(clone ids.pk0001.h8；E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.，Wilmington，DE)的1.1kB DNA片段(SEQ ID NO52)。該P(yáng)CR擴(kuò)增是利用上述組成進(jìn)行，但所用模板是ids.pk0001.h8的10ng質(zhì)粒DNA。擴(kuò)增步驟如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1.5分鐘、56℃30秒、72℃1.2分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。用Notl消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并接著將其插入pY5(圖3)的Notl位點(diǎn)，可生成pY9。
利用寡核苷酸KTI5和KTI3(SEQ ID NOs54和55)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有pY9的TEF::IMP H8::XPR嵌合基因的1.7kB DNA片段(SEQID NO56)。如上所述進(jìn)行該P(yáng)CR擴(kuò)增，但所用模板是pGYUM的10ng質(zhì)粒DNA。擴(kuò)增步驟如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃2分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入PCR-Script(Stratagene)中，可生成pY9R。用pGYUM的Xhol/EcoRV片段置換pY9R的1.7kB Xhol/EcoRV片段，可生成pY21。
以寡核苷酸KH5和KH3(SEQ ID NOs58和59)為引物，以KS65的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有大腸桿菌潮霉素抗性基因(“HPT”；Kaster，K.R.，et al.，Nucleic Acids Res.116895-6911(1983))的1kB DNA片段(SEQ ID NO60)。該P(yáng)CR擴(kuò)增是利用上述組分在總體積為50μl的混合物中進(jìn)行，但所用模板是ids.pk0001.h8的10ng質(zhì)粒DNA。擴(kuò)增步驟如下于95℃初始變性3分鐘，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1.2分鐘。最終延伸循環(huán)于72℃進(jìn)行10分鐘，接著于4℃終止反應(yīng)。用Notl消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并接著將其插入pY5的Notl位點(diǎn)(圖3)，可生成pTHPT-1。
以寡核苷酸KTH5和KTH3(SEQ ID NOs62和63)為引物，以pTHPT-1質(zhì)粒DNA為模板，如上所述擴(kuò)增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kB DNA片段(SEQ ID NO64)。用Bglll消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并接著將其插入pY21中，可生成pY24。
pY24-4的構(gòu)建質(zhì)粒pY24(圖11)被用于構(gòu)建適合被整合進(jìn)解脂耶氏酵母基因組的表達(dá)盒。利用pY24質(zhì)粒中解脂耶氏酵母URA3基因的401bp 5’序列(SEQ ID NO66)和568bp 3’-序列(SEQ ID NO67)將表達(dá)盒直接整合進(jìn)耶氏酵母基因組的Ura位點(diǎn)。通過(guò)BamHI消化，首先從pY24中移出兩個(gè)嵌合基因(TEF::HPT::XPR和TEF::IMP H8::XPR)，使它們自連接生成pY24-1。通過(guò)分別利用YL63和YL64(SEQ ID NOs68和69)和YL65和YL66(SEQ ID NOs70和71)引物對(duì)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Pacl和BsiWI位點(diǎn)導(dǎo)入pY24-1中，可生成pY24-4。
用于Δ5去飽和酶表達(dá)的整合載體的構(gòu)建將pYMA5pb的4261bp Pacl/BsiWI片段(包括高山被孢霉Δ5去飽和酶基因；如實(shí)施例2所述)連接進(jìn)pY24-4(圖11)的Pacl/BsiWI位點(diǎn)，可生成pYZM5(圖5)。通過(guò)分別利用引物對(duì)YL81和YL82(SEQID NOs74和75)和YL83和YL84(SEQ ID NOs76和77)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Hindlll和Clal位點(diǎn)導(dǎo)入pYZM5，可生成pYZM5CH。通過(guò)以YL105和YL106(SEQ ID NO78和79)為引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Pmel位點(diǎn)導(dǎo)入pYZM5CH，可生成pYZM5CHPP。通過(guò)以YL119和YL120(SEQ ID NO80和81)為引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Ascl位點(diǎn)導(dǎo)入pYZM5CHPP，可生成pYZM5CHPPA(圖5)。
為優(yōu)化該整合載體，以YL121和YL122(SEQ ID NOs82和83)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增解脂耶氏酵母URA3基因(SEQ ID NO84)上游的440bp 5’非編碼DNA序列。用Ascl和BsiWI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并接著用pYZM5CHPPA的Ascl/BsiWI片段置換(圖5和12)，可生成pYZM5UPA(圖12)。通過(guò)利用寡核苷酸YL114和YL115(SEQ IDNOs85和86)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Ascl位點(diǎn)導(dǎo)入pYZM5UPA，可生成pYZV5。為了減小pYZV5中URA3基因的3’非編碼區(qū)的大小，通過(guò)利用寡核苷酸YL114和YL115(如上所述)進(jìn)行的定點(diǎn)誘變，將第二個(gè)Pacl位點(diǎn)導(dǎo)入該區(qū)域的中部，可生成pYZV5P。通過(guò)Pacl消化切除pYZV5P的Pacl片段，再次連接后生成pYZV16(圖12)。用Ascl消化pYZV16，可釋放適用于Δ5去飽和酶基因(“MAD5”)在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)的整合和表達(dá)的5.2kB DNA片段(SEQ ID NO87)。
適合高親和力延伸酶和Δ5去飽和酶的表達(dá)的整合載體的構(gòu)建通過(guò)分別利用引物對(duì)YL61和YL62(SEQ ID NOs88和89)和YL69和YL70(SEQ ID NOs90和91)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將BsiWI和Hindlll位點(diǎn)導(dǎo)入pY58(含有高山被孢霉高親和力PUFA延伸酶的編碼區(qū)；如實(shí)施例2所述)，可生成pY58BH(圖13；延伸酶基因被標(biāo)記為“EL”)。將pY58BH中含有TEF::EL::XPR嵌合基因的1.7kBBsiWI/Hindlll片段連接進(jìn)pYZM5CHPP(構(gòu)建方法如圖5所示)的BsiWI/Hindlll位點(diǎn)，可生成pYZM5EL(圖13)。該質(zhì)粒適用于高山被孢霉Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母中的整合和同步表達(dá)。
適合Δ6去飽和酶、高親和力延伸酶和Δ5去飽和酶的表達(dá)的整合載體的構(gòu)建通過(guò)分別利用引物對(duì)YL77和YL78(SEQ ID NOs92和93)和YL79A和YL80A(SEQ ID NOs94和95)進(jìn)行的定點(diǎn)誘變，將Pacl和Clal位點(diǎn)導(dǎo)入pY54(含有高山被孢霉Δ6去飽和酶；如實(shí)施例2所述)，可生成pY54PC(圖13；Δ6去飽和酶基因被標(biāo)記為“MAD6”)。將pY54PC中含有TEF::MAD6::XPR嵌合基因的2kB Clal/Pacl DNA片段連接進(jìn)pYZM5EL的Clal/Pacl位點(diǎn)，可生成pYZM5EL6(圖13)。該質(zhì)粒適用于高山被孢霉Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)的整合和同步表達(dá)。
適合被整合進(jìn)入耶氏酵母基因組、適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶表達(dá)的DNA片段的構(gòu)建采用質(zhì)粒pYZV16(構(gòu)建方法如圖12所示)構(gòu)建含有多種表達(dá)盒的質(zhì)粒。
首先，將pYZV16的3.5kBBsiWI/Pacl片段與pYZM5EL6(構(gòu)建方法如圖13所示)的7.9kB BsiWI/Pacl片段連接，可生成pYZV5EL6(圖14)。用Ascl消化pYZV5EL6，可釋放適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)的整合和同步表達(dá)的8.9kBDNA片段(SEQ ID NO96)。
適合被整合進(jìn)耶氏酵母基因組、適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶表達(dá)的DNA片段的構(gòu)建如實(shí)施例3的描述，將合成的異絲水霉Δ17去飽和酶基因插入pY5-13的Ncol/Notl位點(diǎn)，可生成pYSD17S(圖9A)。通過(guò)分別利用引物對(duì)YL101和YL102(SEQ ID NOs97和98)和YL103和YL104(SEQ ID NOs99和100)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將Clal和Pmel位點(diǎn)導(dǎo)入pYSD17S中，可生成pYSD17SPC(圖14)。
用來(lái)源于pYSD17SPC并含有Δ17去飽和酶表達(dá)盒的1760bpClal/Pmel片段置換pYZV5EL6(圖14)的347bp Clal/Pmel片段，可生成pYZV5E6/17。用Ascl消化pYZV5E6/17，可釋放適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內(nèi)的整合和同步表達(dá)的10.3kB DNA片段(SEQ ID NO101)。
實(shí)施例5解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體中ω-6脂肪酸的生物合成用AscI限制性內(nèi)切核酸酶消化pYZV5EL6(來(lái)自實(shí)施例4，含有Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶基因)并且根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中。
在缺乏亮氨酸的基本培養(yǎng)基中選擇的52種轉(zhuǎn)化體中，34種不能在也缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明65％的轉(zhuǎn)化體含有整合到靶定的解脂耶氏酵母URA3基因座中的8.9kB的多基因表達(dá)盒。將來(lái)自單個(gè)菌落的轉(zhuǎn)化體接種到缺乏亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，在30℃下溫育最多48小時(shí)。
通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)酯制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890GC進(jìn)行分析(根據(jù)一般方法中描述的方法)。
GC分析表明在含有3種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體中存在花生四烯酸(ARA)(圖15)，但在野生型耶氏酵母對(duì)照菌株中不存在。工程改造解脂耶氏酵母，使其生產(chǎn)ARA，即一種ω-6脂肪酸。
實(shí)施例6解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體中ω-3脂肪酸的生物合成按照與實(shí)施例5相似的方式，用AscI限制性內(nèi)切核酸酶消化pYZV5E6/17(來(lái)自實(shí)施例4，含有Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因)并且轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母(ATCC#76982)中。在缺乏亮氨酸的基本培養(yǎng)基中選擇的133種轉(zhuǎn)化體中，89種不能在也缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明67％的轉(zhuǎn)化體含有整合到靶定的解脂耶氏酵母URA3基因座中的10.3kB的多基因表達(dá)盒。
GC分析(根據(jù)一般方法中描述的方法)表明在含有4種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體中存在二十碳五烯酸(EPA)(圖16)，但在野生型耶氏酵母對(duì)照菌株中不存在。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)過(guò)工程改造解脂耶氏酵母，生產(chǎn)了EPA，即一種ω-3脂肪酸。
序列表<110>E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.
<120>在含油酵母中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸<130>CL2233 PCT<150>US 60/468677<151>2003-05-07<160>126<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1374<212>DNA<213>高山被孢霉AF465281<400>1atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa tgccgaggct 60ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga caacaaggtg 120tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg ggagactctt 240gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa tgatgacttt 300gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta cgattcttcc 360aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt gtcgacggtc 420attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgcttttg 480ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca ccaggtcttc 540caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggcttc 600tcgtcctcgt ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ccgcccccaa cgtccacggc 660gaggatcccg acattgacac ccaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc gttggagatg 720ttctcggatg tcccagatga ggagctgacc cgcatgtggt cgcgtttcat ggtcctgaac 780cagacctggt tttacttccc cattctctcg tttgcccgtc tctcctggtg cctccagtcc 840
attctctttg tgctgcctaa cggtcaggcc cacaagccct cgggcgcgcg tgtgcccatc 900tcgttggtcg agcagctgtc gcttgcgatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc 960ctgttcatca aggatcccgt caacatgctg gtgtactttt tggtgtcgca ggcggtgtgc 1020ggaaacttgt tggcgatcgt gttctcgctc aaccacaacg gtatgcctgt gatctcgaag 1080gaggaggcgg tcgatatgga tttcttcacg aagcagatca tcacgggtcg tgatgtccac 1140ccgggtctat ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact atcagatcga gcaccacttg 1200ttcccttcga tgcctcgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gaccctgtgc 1260aaaaagtaca atgtccgata ccacaccacc ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt 1320agccgtctga acgaggtctc caaggctacc tccaagatgg gtaaggcgca gtaa1374<210>2<211>457<212>PRT<213>高山被孢霉AF465281<400>2Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu1 5 10 15Asn Ala Glu Ala Leu Ash Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe20 25 30Leu Met Ile Ile Asp Ash Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro35 40 45Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly50 55 60Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu65 70 75 80Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Asp Ile Lys
85 90 95Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln100 105 110Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val115 120 125Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys130 135 140Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His165 170 175His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys195 200 205His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp210 215 220Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met225 230 235 240Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe245 250 255Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala260 265 270Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly
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<211>1341<212>DNA<213>高山被孢霉AF067654<400>3atgggaacgg accaaggaaa aaccttcacc tgggaagagc tggcggccca taacaccaag 60gacgacctac tcttggccat ccgcggcagg gtgtacgatg tcacaaagtt cttgagccgc120catcctggtg gagtggacac tctcctgctc ggagctggcc gagatgttac tccggtcttt180gagatgtatc acgcgtttgg ggctgcagat gccattatga agaagtacta tgtcggtaca240ctggtctcga atgagctgcc catcttcccg gagccaacgg tgttccacaa aaccatcaag300acgagagtcg agggctactt tacggatcgg aacattgatc ccaagaatag accagagatc360tggggacgat acgctcttat ctttggatcc ttgatcgctt cctactacgc gcagctcttt420gtgcctttcg ttgtcgaacg cacatggctt caggtggtgt ttgcaatcat catgggattt480gcgtgcgcac aagtcggact caaccctctt catgatgcgt ctcacttttc agtgacccac540aaccccactg tctggaagat tctgggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtac600ctggtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcacccct acaccaacat tgctggagca660gatcccgacg tgtcgacgtc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg720tttgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc780aaggtgcgca ttcaggacat caacattttg tactttgtca agaccaatga cgctattcgt840gtcaatccca tctcgacatg gcacactgtg atgttctggg gcggcaaggc tttctttgtc900tggtatcgcc tgattgttcc cctgcagtat ctgcccctgg gcaaggtgct gctcttgttc960acggtcgcgg acatggtgtc gtcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020gttgaggaag ttcagtggcc gttgcctgac gagaacggga tcatccaaaa ggactgggca 1080gctatgcagg tcgagactac gcaggattac gcacacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140actggcagct tgaactacca ggctgtgcac catctgttcc ccaacgtgtc gcagcaccat 1200tatcccgata ttctggccat catcaagaac acctgcagcg agtacaaggt tccatacctt 1260gtcaaggata cgttttggca agcatttgct tcacatttgg agcacttgcg tgttcttgga 1320
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145 150 155 160Ala Cys Ala Gln Val Gly Leu Asn Pro Leu His Asp Ala Ser His Phe165 170 175Ser Val Thr His Asn Pro Thr Val Trp Lys Ile Leu Gly Ala Thr His180 185 190Asp Phe Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Val Trp Met Tyr Gln His Met195 200 205Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val210 215 220Ser Thr Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gln Lys Trp225 230 235 240Phe Val Asn His Ile Asn Gln His Met Phe Val Pro Phe Leu Tyr Gly245 250 255Leu Leu Ala Phe Lys Val Arg Ile Gln Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe260 265 270Val Lys Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His275 280 285Thr Val Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp Tyr Arg Leu290 295 300Ile Val Pro Leu Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe305 310 315 320Thr Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln325 330 335Ala Asn His Val Val Glu Glu Val Gln Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn
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100 105 110Cys Leu Val Ser Ile Ser Ala Tyr Met Cys Gly Gly Ile Leu Tyr Glu115 120 125Ala Tyr Gln Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Glu Asn Ala Ala Asp His Thr130 135 140Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser145 150 155 160Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn165 170 175Asn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe180 185 190Thr Ile Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr195 200 205Phe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr210 215 220Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe225 230 235 240Tyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln245 250 255Ser Ser Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr260 265 270Pro Phe Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu275 280 285Gly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln
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<210>10<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-1A<400>10catggctgag gataagacca aggtcgagtt ccctaccctg actgagctga agcactctat60ccctaacgct tgctttgagt ccaacctcgg actctcgctc tacta 105<210>11<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-1B<400>11cagtgtagta gagcgagagt ccgaggttgg actcaaagca agcgttaggg atagagtgct60tcagctcagt cagggtaggg aactcgacct tggtcttatc ctcagc 106<210>12<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-2A<400>12cactgcccga gcgatcttca acgcatctgc ctctgctgct ctgctctacg ctgcccgatc60tactcccttc attgccgata acgttctgct ccacgctctg gtttgc 106<210>13<211>106<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-2B<400>13gtggcgcaaa ccagagcgtg gagcagaacg ttatcggcaa tgaagggagt agatcgggca 60gcgtagagca gagcagcaga ggcagatgcg ttgaagatcg ctcggg106<210>14<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-3A<400>14gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac 60tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac tccgtcaact tcatc 105<210>15<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-3B<400>15ccaatgatga agttgacgga gtggtatcgg gagaaggcag agtgaccaca gtcgtgaccg 60acggtaaaga aaccccagaa gatgacaccc tgcacgtaga tgtag 105<210>16<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-4A<400>16attggctgca tcatgcactc tgccattctg actcccttcg agtcctggcg agtgacccac 60
cgacaccatc acaagaacac tggcaacatt gataaggacg agatc 105<210>17<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-4B<400>17tagaagatct cgtccttatc aatgttgcca gtgttcttgt gatggtgtcg gtgggtcact60cgccaggact cgaagggagt cagaatggca gagtgcatga tgcag 105<210>18<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-5A<400>18acgagatctt ctaccctcat cggtccgtca aggacctcca ggacgtgcga caatgggtct60acaccctcgg aggtgcttgg tttgtctacc tgaaggtcgg atatg 105<210>19<211>107<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-5B<400>19aggagcatat ccgaccttca ggtagacaaa ccaagcacct ccgagggtgt agacccattg60tcgcacgtcc tggaggtcct tgacggaccg atgagggtag aagatct 107<210>20<211>105
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-6A<400>20ctcctcgaac catgtcccac tttgacccct gggaccctct cctgcttcga cgagcctccg60ctgtcatcgt gtccctcgga gtctgggctg ccttcttcgc tgcct 105<210>21<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-6B<400>21aggcgtaggc agcgaagaag gcagcccaga ctccgaggga cacgatgaca gcggaggctc60gtcgaagcag gagagggtcc caggggtcaa agtgggacat ggttcg 106<210>22<211>104<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-7A<400>22acgcctacct cacatactcg ctcggctttg ccgtcatggg cctctactac tatgctcctc60tctttgtctt tgcttcgttc ctcgtcatta ctaccttctt gcat104<210>23<211>103<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-7B
<400>23ttgtgatgca agaaggtagt aatgacgagg aacgaagcaa agacaaagag aggagcatag60tagtagaggc ccatgacggc aaagccgagc gagtatgtga ggt 103<210>24<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-8A<400>24cacaacgacg aagctactcc ctggtacggt gactcggagt ggacctacgt caagggcaac60ctgagctccg tcgaccgatc gtacggagct ttcgtggaca acctgt 106<210>25<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-8B<400>25gtgagacagg ttgtccacga aagctccgta cgatcggtcg acggagctca ggttgccctt60gacgtaggtc cactccgagt caccgtacca gggagtagct tcgtcg 106<210>26<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-9A<400>26ctcaccacat tggcacccac caggtccatc acttgttccc tatcattccc cactacaagc60tcaacgaagc caccaagcac tttgctgccg cttaccctca cc 102
<210>27<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-9B<400>27cacgaggtga gggtaagcgg cagcaaagtg cttggtggct tcgttgagct tgtagtgggg60aatgataggg aacaagtgat ggacctggtg ggtgccaatg tg 102<210>28<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-10A<400>28tcgtgagacg taacgacgag cccatcatta ctgccttctt caagaccgct cacctctttg60tcaactacgg agctgt76<210>29<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-10B<400>29cgggcacagc tccgtagttg acaaagaggt gagcggtctt gaagaaggca gtaatgatgg 60gctcgtcgtt acgtct 76<210>30<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-11A<400>30gcccgagact gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag60cgactaa 67<210>31<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-11B<400>31ttagtcgctc ttggccttgg ctgcagcggc agactctttg agggtgaaaa tctgagcagt60ct 62<210>32<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-1<400>32tttccatggc tgaggataag accaaggtcg ag 32<210>33<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-4R<400>33ccctagaaga tctcgtcctt atcaatgttg ccag 34<210>34<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-5<400>34cccacgagat cttctaccct catcggt27<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-8D<400>35gaaagctccg tacgatcggt cgac 24<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-8U<400>36gtcgaccgat cgtacggagc tttc 24<210>37<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物D17-11<400>37aaagcggccg cttagtcgct cttggccttg gctg34<210>38<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TEF5’<400>38agagaccggg ttggcggcg 19<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TEF3’<400>39ttggatcctt tgaatgattc ttatactcag 30<210>40<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物XPR5’<400>40tttccgcggc ccgagattcc ggcctcttc 29<210>41<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物XPR3’<400>41tttccgcgga cacaatatct ggtcaaattt c 31<210>42<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL21A<400>42tttccatggc tgaggataag acgaaggtcg agt 33<210>43<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL22<400>43cccttaatta attagtccga cttggccttg gcggcc 36<210>44<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL53<400>44gccaagtcgg actaagctgc taactagagc ggccgc 36<210>45<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL54<400>45gcggccgctc tagttagcag cttagtccga cttggc 36<210>46<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KU5<400>46tttgcccggg cgagtatctg tctgactcgt cattg 35<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KU3<400>47aaagcccggg caaaggcctg tttctcggtg tac 33<210>48<211>1710<212>DNA<213>解脂耶氏酵母<400>48gtcgacgagt atctgtctga ctcgtcattg ccgcctttgg agtacgactc caactatgag60tgtgcttgga tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg120ttttcggcgc ggttggccga caacaatatc agctgcaacg tcattgctgg ctttcatcat180gatcacattt ttgtcggcaa aggcgacgcc cagagagcca ttgacgttct ttctaatttg240gaccgatagc cgtatagtcc agtctatcta taagttcaac taactcgtaa ctattaccat300aacatatact tcactgcccc agataaggtt ccgataaaaa gttctgcaga ctaaatttat360ttcagtctcc tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag420tccgcctttg ccgctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct480tctctggatg ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat540gtgtgcatga tcaagaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg600
ctccccctca aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc660gcagatattg gcaacactgt caagcaccag tacaagaacg gtgtctaccg aatcgccgag720tggtccgata tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga780gctggtgccg aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac840tcccagtaca aggagttcct ggtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc900atgctggccg agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc960attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct 1020aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga 1080gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc 1140ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga 1200taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga 1260tatgtcattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta 1320tgatggtcag acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc 1380atgatctgtc caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt 1440agctaatacg attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat 1500gacttattct caactacatc cccagtcaca ataccaccac tgcactacca ctacaccaaa 1560accatgatca aaccacccat ggacttcctg gaggcagaag aacttgttat ggaaaagctc 1620aagagagaga agccaagata ctatcaagac atgtgtcgca acttcaagga ggaccaagct 1680ctgtacaccg agaaacaggc ctttgtcgac1710<210>49<211>286<212>PRT<213>解脂耶氏酵母<400>49Met Pro Ser Tyr Glu Ala Arg Ala Asn Val His Lys Ser Ala Phe Ala1 5 10 15
Ala Arg Val Leu Lys Leu Val Ala Ala Lys Lys Thr Asn Leu Cys Ala20 25 30Ser Leu Asp Val Thr Thr Thr Lys Glu Leu Ile Glu Leu Ala Asp Lys35 40 45Val Gly Pro Tyr Val Cys Met Ile Lys Thr His Ile Asp Ile Ile Asp50 55 60Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Thr Val Leu Pro Leu Lys Glu Leu Ala Leu65 70 75 80Lys His Gly Phe Phe Leu Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly85 90 95Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Lys Asn Gly Val Tyr Arg Ile Ala Glu100 105 110Trp Ser Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Pro Gly Thr Gly Ile Ile115 120 125Ala Gly Leu Arg Ala Gly Ala Glu Glu Thr Val Ser Glu Gln Lys Lys130 135 140Glu Asp Val Ser Asp Tyr Glu Asn Ser Gln Tyr Lys Glu Phe Leu Val145 150 155 160Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Ala Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu165 170 175Leu Ser Cys Lys Gly Ser Leu Ala Thr Gly Glu Tyr Ser Lys Gln Thr180 185 190Ile Glu Leu Ala Arg Ser Asp Pro Glu Phe Val Val Gly Phe Ile Ala195 200 205
Gln Asn Arg Pro Lys Gly Asp Ser Glu Asp Trp Leu Ile Leu Thr Pro210 215 220Gly Val G1y Leu Asp Asp Lys Gly Asp Ala Leu Gly Gln Gln Tyr Arg225 230 235 240Thr Val Glu Asp Val Met Ser Thr Gly Thr Asp Ile Ile Ile Val Gly245 250 255Arg Gly Leu Tyr Gly Gln Asn Arg Asp Pro Ile Glu Glu Ala Lys Arg260 265 270Tyr Gln Lys Ala Gly Trp Glu Ala Tyr Gln Lys Ile Asn Cys275 280 285<210>50<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KI5<400>50agagcggccg catgggagaa gtgggaccca caaac 35<210>51<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KI3<400>51gtggcggccg ctcaaatgtc gttattgtac caataaac38<210>52<211>1152
<212>DNA<213>Impatients balsama<400>52atgggagaag tgggacccac aaaccgaacc aaaaccaagt tggacaagca acaagaatcc 60gaaaacaggg ttcctcacga gccacctcca ttcacactaa gtgaccttaa gaaagccatc120ccaccccatt gcttcgagcg ctccctcgtg aaatcattct accacgtgat tcacgacatt180atcatcctgt cctttttcta ctatgtcgcc gccaattaca tccccatgct accccaaaac240ctccgttacg ttgcatggcc aatttattgg gccatccaag gctgtgtcca acttggtata300ttggtcttag gccatgaatg cggccaccac gccttcagcg actaccaatg ggtagacgac360atggtcgggt tcgtcctcca ctcgtcccaa ttgattccct acttctcatg gaaacatagc420caccgtcgcc accactccaa cacggcctcc atcgagcgcg acgaggtcta cccgcccgcg480tacaaaaacg acctgccgtg gttcgccaaa tacctacgca accccgtcgg tcgtttcctc540atgattttcg gggcgctact gttcggctgg ccgtcgtacc ttctgttcaa cgcgaacggc600cgtctctacg accgcttcgc ttcccactac gacccgcaat ccccgatctt caacaaccgc660gagaggctgc aagtgatcgc gtccgacgtc gggctcgtct tcgcgtactt tgtcctgtac720aagatcgcgc tggccaaggg atttgtgtgg ttaatttgtg tgtatggcgt cccgtacgtg780atcctcaacg ggcttatcgt cttgatcacg ttcctacagc acacgcaccc gaatctgccc840cgttacgacc tttccgagtg ggactggctt aggggagccc tgtcgactgt ggaccgcgat900tacgggatgt tgaataaggt gttccataac gtgacggaca cgcacttggt gcatcatttg960ttcacgacca tgccacatta tcgcgccaag gaggcgaccg aggtgattaa accgatattg 1020ggagactact ataagtttga cgacactccg tttctcaaag cgttgtggaa ggacatggga 1080aagtgtattt atgtggagtc ggacgtgcct ggcaagaaca agggagttta ttggtacaat 1140aacgacattt ga 1152<210>53<211>383<212>PRT
<213>Impatients balsama<400>53Met Gly Glu Val Gly Pro Thr Asn Arg Thr Lys Thr Lys Leu Asp Lys1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Glu Asn Arg Val Pro His Glu Pro Pro Pro Phe Thr20 25 30Leu Ser Asp Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser35 40 45Leu Val Lys Ser Phe Tyr His Val Ile His Asp Ile Ile Ile Leu Ser50 55 60Phe Phe Tyr Tyr Val Ala Ala Asn Tyr Ile Pro Met Leu Pro Gln Asn65 70 75 80Leu Arg Tyr Val Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Ala Ile Gln Gly Cys Val85 90 95Gln Leu Gly Ile Leu Val Leu Gly His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110Ser Asp Tyr Gln Trp Val Asp Asp Met Val Gly Phe Val Leu His Ser115 120 125Ser Gln Leu Ile Pro Tyr Phe Ser Trp Lys His Ser His Arg Arg His130 135 140His Ser Asn Thr Ala Ser Ile Glu Arg Asp Glu Val Tyr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Lys Asn Asp Leu Pro Trp Phe Ala Lys Tyr Leu Arg Asn Pro Val165 170 175
Gly Arg Phe Leu Met Ile Phe Gly Ala Leu Leu Phe Gly Trp Pro Ser180 185 190Tyr Leu Leu Phe Asn Ala Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Arg Phe Ala Ser195 200 205His Tyr Asp Pro Gln Ser Pro Ile Phe Asn Asn Arg Glu Arg Leu Gln210 215 220Val Ile Ala Ser Asp Val Gly Leu Val Phe Ala Tyr Phe Val Leu Tyr225 230 235 240Lys Ile Ala Leu Ala Lys Gly Phe Val Trp Leu Ile Cys Val Tyr Gly245 250 255Val Pro Tyr Val Ile Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu Ile Thr Phe Leu260 265 270Gln His Thr His Pro Asn Leu Pro Arg Tyr Asp Leu Ser Glu Trp Asp275 280 285Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Met Leu290 295 300Asn Lys Val Phe His Asn Val Thr Asp Thr His Leu Val His His Leu305 310 315 320Phe Thr Thr Met Pro His Tyr Arg Ala Lys Glu Ala Thr Glu Val Ile325 330 335Lys Pro Ile Leu Gly Asp Tyr Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Pro Phe Leu340 345 350Lys Ala Leu Trp Lys Asp Met Gly Lys Cys Ile Tyr Val Glu Ser Asp355 360 365
Val Pro Gly Lys Asn Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Asn Asn Asp Ile370 375 380<210>54<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KTI5<400>54aagctcgaga ccgggttggc ggcgtatttg tgtc34<210>55<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KTI3<400>55ggtctcgaga tctccaccgc ggacacaata tctggtca38<210>56<211>1756<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TEF/接合酶/XPR嵌合基因<400>56gaccgggttg gcggcgtatt tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc60aaattgaccc agtagcgggc ccaaccccgg cgagagcccc cttcacccca catatcaaac 120ctcccccggt tcccacactt gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc 180ttgttcagac tttgtactag tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca 240aaatagacta ctgaaaattt ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag 300accaccgtcc ccgaattacc tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc 360
gaaatcgtta agcatttcct tctgagtata agaatcattc aaaggatcca ctagttctag420agcggccgca tgggagaagt gggacccaca aaccgaacca aaaccaagtt ggacaagcaa480caagaatccg aaaacagggt tcctcacgag ccacctccat tcacactaag tgaccttaag540aaagccatcc caccccattg cttcgagcgc tccctcgtga aatcattcta ccacgtgatt600cacgacatta tcatcctgtc ctttttctac tatgtcgccg ccaattacat ccccatgcta660ccccaaaacc tccgttacgt tgcatggcca atttattggg ccatccaagg ctgtgtccaa720cttggtatat tggtcttagg ccatgaatgc ggccaccacg ccttcagcga ctaccaatgg780gtagacgaca tggtcgggtt cgtcctccac tcgtcccaat tgattcccta cttctcatgg840aaacatagcc accgtcgcca ccactccaac acggcctcca tcgagcgcga cgaggtctac900ccgcccgcgt acaaaaacga cctgccgtgg ttcgccaaat acctacgcaa ccccgtcggt960cgtttcctca tgattttcgg ggcgctactg ttcggctggc cgtcgtacct tctgttcaac 1020gcgaacggcc gtctctacga ccgcttcgct tcccactacg acccgcaatc cccgatcttc 1080aacaaccgcg agaggctgca agtgatcgcg tccgacgtcg ggctcgtctt cgcgtacttt 1140gtcctgtaca agatcgcgct ggccaaggga tttgtgtggt taatttgtgt gtatggcgtc 1200ccgtacgtga tcctcaacgg gcttatcgtc ttgatcacgt tcctacagca cacgcacccg 1260aatctgcccc gttacgacct ttccgagtgg gactggctta ggggagccct gtcgactgtg 1320gaccgcgatt acgggatgtt gaataaggtg ttccataacg tgacggacac gcacttggtg 1380catcatttgt tcacgaccat gccacattat cgcgccaagg aggcgaccga ggtgattaaa 1440ccgatattgg gagactacta taagtttgac gacactccgt ttctcaaagc gttgtggaag 1500gacatgggaa agtgtattta tgtggagtcg gacgtgcctg gcaagaacaa gggagtttat 1560tggtacaata acgacatttg agcggccgcc accgcggccc gagattccgg cctcttcggc 1620cgccaagcga cccgggtgga cgtctagagg tacctagcaa ttaacagata gtttgccggt 1680gataattctc ttaacctccc acactccttt gacataacga tttatgtaac gaaactgaaa 1740tttgaccaga tattgt 1756
<210>57<211>383<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TEF/接合酶/XPR嵌合蛋白<400>57Met Gly Glu Val Gly Pro Thr Asn Arg Thr Lys Thr Lys Leu Asp Lys1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Glu Asn Arg Val Pro His Glu Pro Pro Pro Phe Thr20 25 30Leu Ser Asp Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser35 40 45Leu Val Lys Ser Phe Tyr His Val Ile His Asp Ile Ile Ile Leu Ser50 55 60Phe Phe Tyr Tyr Val Ala Ala Asn Tyr Ile Pro Met Leu Pro Gln Asn65 70 75 80Leu Arg Tyr Val Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Ala Ile Gln Gly Cys Val85 90 95Gln Leu Gly Ile Leu Val Leu Gly His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110Ser Asp Tyr Gln Trp Val Asp Asp Met Val Gly Phe Val Leu His Ser115 120 125Ser Gln Leu Ile Pro Tyr Phe Ser Trp Lys His Ser His Arg Arg His130 135 140
His Ser Asn Thr Ala Ser Ile Glu Arg Asp Glu Val Tyr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Lys Asn Asp Leu Pro Trp Phe Ala Lys Tyr Leu Arg Asn Pro Val165 170 175Gly Arg Phe Leu Met Ile Phe Gly Ala Leu Leu Phe Gly Trp Pro Ser180 185 190Tyr Leu Leu Phe Asn Ala Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Arg Phe Ala Ser195 200 205His Tyr Asp Pro Gln Ser Pro Ile Phe Asn Asn Arg Glu Arg Leu Gln210 215 220Val Ile Ala Ser Asp Val Gly Leu Val Phe Ala Tyr Phe Val Leu Tyr225 230 235 240Lys Ile Ala Leu Ala Lys Gly Phe Val Trp Leu Ile Cys Val Tyr Gly245 250 255Val Pro Tyr Val Ile Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu Ile Thr Phe Leu260 265 270Gln His Thr His Pro Asn Leu Pro Arg Tyr Asp Leu Ser Glu Trp Asp275 280 285Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Met Leu290 295 300Asn Lys Val Phe His Asn Val Thr Asp Thr His Leu Val His His Leu305 310 315 320Phe Thr Thr Met Pro His Tyr Arg Ala Lys Glu Ala Thr Glu Val Ile325 330 335
Lys Pro Ile Leu Gly Asp Tyr Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Pro Phe Leu340 345 350Lys Ala Leu Trp Lys Asp Met Gly Lys Cys Ile Tyr Val Glu Ser Asp355 360 365Val Pro Gly Lys Asn Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Asn Asn Asp Ile370 375 380<210>58<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KH5<400>58tagagcggcc gcttaaacca tgaaaaagcc tg 32<210>59<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KH3<400>59gtggcggccg ctttaggtac ctcactattc ctt 33<210>60<211>1026<212>DNA<213>大腸桿菌<400>60atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020gaatag 1026<210>61<211>341<212>PRT<213>大腸桿菌<400>61Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile1 5 10 15Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu20 25 30Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr50 55 60Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile65 70 75 80Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln85 90 95Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu100 105 110Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser115 120 125Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr130 135 140Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr145 150 155 160His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln165 170 175Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg180 185 190His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn195 200 205Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp210 215 220Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu245 250 255Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp260 265 270Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp275 280 285Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val290 295 300Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly305 310 315 320Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg325 330 335Pro Arg Ala Lys Glu340<210>62<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KTH5<400>62tttagatctc gagaccgggt tggcggcgta tttg34<210>63<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物KTH3<400>63tttagatctc caccgcggac acaatatctg g 31<210>64<211>1650<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TEF::HPT::XPR融合體<400>64gaccgggttg gcggcgtatt tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc60aaattgaccc agtagcgggc ccaaccccgg cgagagcccc cttcacccca catatcaaac 120ctcccccggt tcccacactt gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc 180ttgttcagac tttgtactag tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca 240aaatagacta ctgaaaattt ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag 300accaccgtcc ccgaattacc tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc 360gaaatcgtta agcatttcct tctgagtata agaatcattc aaaggatcca ctagttctag 420agcggccgct taaaccatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 480gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 540tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 600tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 660ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 720acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 780cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 840attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 900tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 960gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 1020
gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 1080tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 1140gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 1200gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 1260tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 1320aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 1380cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 1440tcgtccgagg gcaaaggaat agtgaggtac ctaaagcggc cgccaccgcg gcccgagatt 1500ccggcctctt cggccgccaa gcgacccggg tggacgtcta gaggtaccta gcaattaaca 1560gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 1620taacgaaact gaaatttgac cagatattgt 1650<210>65<211>341<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TEF::HPT::XPR融合體<400>65Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile1 5 10 15Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu20 25 30Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu35 40 45Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile65 70 75 80Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln85 90 95Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu100 105 110Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser115 120 125Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr130 135 140Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr145 150 155 160His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln165 170 175Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg180 185 190His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn195 200 205Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp210 215 220Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala225 230 235 240Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp260 265 270Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp275 280 285Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val290 295 300Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly305 310 315 320Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg325 330 335Pro Arg Ala Lys Glu340<210>66<211>401<212>DNA<213>解脂耶氏酵母<400>66cgagtatctg tctgactcgt cattgccgcc tttggagtac gactccaact atgagtgtgc60ttggatcact ttgacgatac attcttcgtt ggaggctgtg ggtctgacag ctgcgttttc 120ggcgcggttg gccgacaaca atatcagctg caacgtcatt gctggctttc atcatgatca 180catttttgtc ggcaaaggcg acgcccagag agccattgac gttctttcta atttggaccg 240atagccgtat agtccagtct atctataagt tcaactaact cgtaactatt accataacat 300atacttcact gccccagata aggttccgat aaaaagttct gcagactaaa tttatttcag 360tctcctcttc accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga g 401<210>67
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<223>引物YL119<400>80cgggaaacct gtcgtggcgc gccagctgca ttaatg 36<210>81<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物YL122<400>83tttcgtacga accaccaccg tcagcccttc tgac34<210>84<211>440<212>DNA<213>解脂耶氏酵母<400>84aaccaccacc gtcagccctt ctgactcacg tattgtagcc accgacacag gcaacagtcc60gtggatagca gaatatgtct tgtcggtcca tttctcacca actttaggcg tcaagtgaat 120gttgcagaag aagtatgtgc cttcattgag aatcggtgtt gctgatttca ataaagtctt 180gagatcagtt tggccagtca tgttgtgggg ggtaattgga ttgagttatc gcctacagtc 240tgtacaggta tactcgctgc ccactttata ctttttgatt ccgctgcact tgaagcaatg 300tcgtttacca aaagtgagaa tgctccacag aacacacccc agggtatggt tgagcaaaaa 360ataaacactc cgatacgggg aatcgaaccc cggtctccac ggttctcaag aagtattctt 420gatgagagcg tgatgtgata 440
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<223>引物YL115<400>86gctcaagaga gagaaggcgc gccaagatac tatca 35<210>87<211>5218<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于整合和表達(dá)Δ-5去飽和酶基因的5218bp片段<400>87tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca 120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg 180gcagcgagta tacctgtaca gactgtaggc gataactcaa tccaattacc ccccacaaca 240tgactggcca aactgatctc aagactttat tgaaatcagc aacaccgatt ctcaatgaag 300gcacatactt cttctgcaac attcacttga cgcctaaagt tggtgagaaa tggaccgaca 360agacatattc tgctatccac ggactgttgc ctgtgtcggt ggctacaata cgtgagtcag 420
aagggctgac ggtggtggtt cgtacgttgt gtggaagctt gtgagcggat aacaatttca480cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga540acaaaagctg gagctccacc gcggacacaa tatctggtca aatttcagtt tcgttacata600aatcgttatg tcaaaggagt gtgggaggtt aagagaatta tcaccggcaa actatctgtt660aattgctagg tacctctaga cgtccacccg ggtcgcttgg cggccgaaga ggccggaatc720tcgggccgcg gtggcggccg cctactcttc cttgggacgg agtccaagaa cacgcaagtg780ctccaaatgt gaagcaaatg cttgccaaaa cgtatccttg acaaggtatg gaaccttgta840ctcgctgcag gtgttcttga tgatggccag aatatcggga taatggtgct gcgacacgtt900ggggaacaga tggtgcacag ccggtagttc aagctgccag tgatgctggt ccagaggtgc960gaatcgtgtg cgtaatcctg cgtagtctcg acctgcatag ctgcccagtc cttttggatg 1020atcccgttct cgtcaggcaa cggccactga acttcctcaa caacgtggtt cgcctggaag 1080gtcagcgcca gccagtaaga cgacaccatg tccgcgaccg tgaacaagag cagcaccttg 1140cccaggggca gatactgcag gggaacaatc aggcgatacc agacaaagaa agccttgccg 1200ccccagaaca tcacagtgtg ccatgtcgag atgggattga cacgaatagc gtcattggtc 1260ttgacaaagt acaaaatgtt gatgtcctga atgcgcacct tgaacgccag cagtccgtac 1320aggaaaggaa caaacatgtg ctggttgatg tggttgacaa accacttttg gttgggcttg 1380atacgacgaa catcgggctc agacgtcgac acgtcgggat ctgctccagc aatgttggtg 1440taggggtgat ggccgagcat atgttggtac atccacacca ggtacgatgc tccgttgaaa 1500aagtcgtgcg tggctcccag aatcttccag acagtggggt tgtgggtcac tgaaaagtga 1560gacgcatcat gaagagggtt gagtccgact tgtgcgcacg caaatcccat gatgattgca 1620aacaccacct gaagccatgt gcgttcgaca acgaaaggca caaagagctg cgcgtagtag 1680gaagcgatca aggatccaaa gataagagcg tatcgtcccc agatctctgg tctattcttg 1740ggatcaatgt tccgatccgt aaagtagccc tcgactctcg tcttgatggt tttgtggaac 1800accgttggct ccgggaagat gggcagctca ttcgagacca gtgtaccgac atagtacttc 1860
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tggcgtcgct tccgacaccg agacctactc cgttcctgag gttgagcgaa ttgcccgaat3360ggccgccttc ctggcccttc agcacaaccc ccctcttccc gtgtggtctc ttgacaaggc3420caacgtgctg gcctcctctc gactttggcg aaagactgtc actcgagtcc tcaaggacga3480attcccccag ctcgagctca accaccagct gatcgactcg gccgccatga tcctcatcaa3540gcagccctcc aagatgaatg gtatcatcat caccaccaac atgtttggcg atatcatctc3600cgacgaggcc tccgtcatcc ccggttctct gggtctgctg ccctccgcct ctctggcttc3660tctgcccgac accaacgagg cgttcggtct gtacgagccc tgtcacggat ctgcccccga3720tctcggcaag cagaaggtca accccattgc caccattctg tctgccgcca tgatgctcaa3780gttctctctt aacatgaagc ccgccggtga cgctgttgag gctgccgtca aggagtccgt3840cgaggctggt atcactaccg ccgatatcgg aggctcttcc tccacctccg aggtcggaga3900cttgttgcca acaaggtcaa ggagctgctc aagaaggagt aagtcgtttc tacgacgcat3960tgatggaagg agcaaactga cgcgcctgcg ggttggtcta ccggcagggt ccgctagtgt4020ataagactct ataaaaaggg ccctgccctg ctaatgaaat gatgatttat aatttaccgg4080tgtagcaacc ttgactagaa gaagcagatt gggtgtgttt gtagtggagg acagtggtac4140gttttggaaa cagtcttctt gaaagtgtct tgtctacagt atattcactc ataacctcaa4200tagccaaggg tgtagtcggt ttattaaagg aagggagttg tggctgatgt ggatagatat4260ctttaagctg gcgactgcac ccaacgagtg tggtggtagc ttgttactgt atattcggta4320agatatattt tgtggggttt tagtggtgtt taaacggtag gttagtgctt ggtatatgag4380ttgtaggcat gacaatttgg aaaggggtgg actttgggaa tattgtggga tttcaatacc4440ttagtttgta cagggtaatt gttacaaatg atacaaagaa ctgtatttct tttcatttgt4500tttaattggt tgtatatcaa gtccgttaga cgagctcagt gccttggctt ttggcactgt4560atttcatttt tagaggtaca ctacattcag tgaggtatgg taaggttgag ggcataatga4620aggcaccttg tactgacagt cacagacctc tcaccgagaa ttttatgaga tatactcggg4680ttcattttag gctcatcgat tcgattcaaa ttaattaatt cgatatcata attgtcggcc4740
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<223>引物YL62<400>89tatgcttccg gctcgtacgt tgtgtggaat tgt 33<210>90<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL69
<400>90agcccatctg cagaagcttc aggagagacc ggg 33<210>91<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL70<400>91cccggtctct cctgaagctt ctgcagatgg gct 33<210>92<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL77<400>92tagtgagggt taattaatcg agcttggcgt aat 33<210>93<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL78<400>93attacgccaa gctcgattaa ttaaccctca cta 33<210>94<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL79A
<400>94attcctgcag cccatcgatg cagaattcag gaga34<210>95<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL80A<400>95tctcctgaat tctgcatcga tgggctgcag gaat34<210>96<211>8894<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于整合和表達(dá)Δ-6和Δ-5去飽和酶基因和延伸酶基因的8894bp片段<400>96tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca 120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg 180gcagcgagta tacctgtaca gactgtaggc gataactcaa tccaattacc ccccacaaca 240tgactggcca aactgatctc aagactttat tgaaatcagc aacaccgatt ctcaatgaag 300gcacatactt cttctgcaac attcacttga cgcctaaagt tggtgagaaa tggaccgaca 360agacatattc tgctatccac ggactgttgc ctgtgtcggt ggctacaata cgtgagtcag 420aagggctgac ggtggtggtt cgtacgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 480caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctcgaaat taaccctcac taaagggaac 540aaaagctgga gctccaccgc ggacacaata tctggtcaaa tttcagtttc gttacataaa 600tcgttatgtc aaaggagtgt gggaggttaa gagaattatc accggcaaac tatctgttaa 660
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<223>用于整合和表達(dá)Δ-6，Δ-5和Δ-17去飽和酶基因和延伸酶基因的10328bp片段<400>101tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt60
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<223>引物YL15<400>124ttttccatgg gacgcggcgg cgaaggtcag30<210>125<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物YL16B<400>125ttttgcggcc gctaagcggc cttggccgcc gcctggc 37<210>126<211>10<212>DNA<213>解脂耶氏酵母<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>n是a，c，g，或t<400>126mammatgnhs 10
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)ω-3或ω-6脂肪酸的方法，包括a)提供包括編碼功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的基因的含油酵母；b)在可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，從而生產(chǎn)一種或多種ω-3或ω-6脂肪酸；并且c)任選回收ω-3或ω-6脂肪酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的基因選自Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵碳源選自單糖，寡糖，多糖，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，甲醇以及含碳的胺。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述含油酵母選自下組耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母。
6.生產(chǎn)亞油酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ12去飽和酶多肽的基因；和(ii)由油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ12去飽和酶多肽的基因并且將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸；并且c)任選回收步驟(b)的亞油酸。
7.生產(chǎn)γ-亞麻酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ6去飽和酶多肽的基因；和(ii)由亞油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ6去飽和酶多肽的基因并且將亞油酸轉(zhuǎn)化為γ-亞麻酸；并且c)任選回收步驟(b)的γ-亞麻酸。
8.生產(chǎn)十八碳四烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ6去飽和酶多肽的基因；和(ii)由α-亞油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳底物的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ6去飽和酶多肽的基因并且將α-亞油酸轉(zhuǎn)化為十八碳四烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的十八碳四烯酸。
9.生產(chǎn)α-亞油酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ15去飽和酶多肽的基因；和(ii)由亞油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ15去飽和酶多肽的基因并且將亞油酸轉(zhuǎn)化為α-亞油酸；并且c)任選回收步驟(b)的α-亞油酸。
10.生產(chǎn)二高-γ-亞油酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼C18/20延伸酶多肽的基因；和(ii)由γ-亞麻酸組成的延伸酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼延伸酶多肽的基因并且將γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化為二高-γ-亞油酸；并且c)任選回收步驟(b)的二高-γ-亞油酸。
11.生產(chǎn)二十碳四烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼C18/20延伸酶多肽的基因；和(ii)由十八碳四烯酸組成的延伸酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼延伸酶多肽的基因并且將十八碳四烯酸轉(zhuǎn)化為二十碳四烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十碳四烯酸。
12.生產(chǎn)二十二碳五烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼C20/22延伸酶多肽的基因；和(ii)由二十碳五烯酸組成的延伸酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼延伸酶多肽的基因并且將二十碳五烯酸轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十二碳五烯酸。
13.生產(chǎn)花生四烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ5去飽和酶多肽的基因；和(ii)由二高-γ-亞油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ5去飽和酶多肽的基因并且將二高-γ-亞油酸轉(zhuǎn)化為花生四烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的花生四烯酸。
14.生產(chǎn)二十碳五烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ5去飽和酶多肽的基因；和(ii)由二十碳四烯酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ5去飽和酶多肽的基因并且將二十碳四烯酸轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十碳五烯酸。
15.生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ4去飽和酶多肽的基因；和(ii)由二十二碳五烯酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ4去飽和酶多肽的基因并且將二十二碳五烯酸轉(zhuǎn)化為二十二碳六烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十二碳六烯酸。
16.生產(chǎn)二十碳四烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ17去飽和酶多肽的基因；和(ii)由二高-γ-亞油酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ17去飽和酶多肽的基因并且將二高-γ-亞油酸轉(zhuǎn)化為二十碳四烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十碳四烯酸。
17.生產(chǎn)二十碳五烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ17去飽和酶多肽的基因；和(ii)由花生四烯酸組成的去飽和酶底物來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼Δ17去飽和酶多肽的基因并且將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十碳五烯酸。
18.權(quán)利要求6-17的任意一項(xiàng)的方法，其中去飽和酶或延伸酶底物來(lái)源對(duì)含油酵母來(lái)說(shuō)是內(nèi)源的。
19.權(quán)利要求6-17的任意一項(xiàng)的方法，其中去飽和酶或延伸酶底物來(lái)源對(duì)含油酵母來(lái)說(shuō)是外源的。
20.權(quán)利要求6-17的任意一項(xiàng)的方法，其中所述含油酵母選自下組耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母。
22.權(quán)利要求7或8的方法，其中編碼Δ6去飽和酶多肽的基因選自下組(a)編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的分離核酸分子；和(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子，所述雜交條件為0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，并相繼用2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。
23.權(quán)利要求10、11和12的任意一項(xiàng)的方法，其中編碼延伸酶多肽的基因選自下組(a)編碼SEQ ID NO8所示氨基酸序列的分離核酸分子；和(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子，所述雜交條件為0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，并相繼用2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。
24.權(quán)利要求13或14的方法，其中編碼Δ5去飽和酶多肽的基因選自下組(a)編碼選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO115、SEQ ID NO119和SEQ ID NO123所示氨基酸序列的分離核酸分子；和(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子，所述雜交條件為0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，并相繼用2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。
25.權(quán)利要求16或17的方法，其中編碼Δ17去飽和酶多肽的基因選自下組(a)編碼SEQ ID NO6所示氨基酸序列的分離核酸分子；和(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子，所述雜交條件為0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，并相繼用2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。
26.權(quán)利要求5或21的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自解脂耶氏酵母ATCC #20362，解脂耶氏酵母ATCC #8862，解脂耶氏酵母ATCC#18944，解脂耶氏酵母ATCC #76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
27.生產(chǎn)二十碳五烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的酶的基因；和(ii)油酸的內(nèi)源來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的酶的基因并且將油酸轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十碳五烯酸。
28.生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的酶的基因；和(ii)油酸的內(nèi)源來(lái)源；b)在合適的可發(fā)酵碳源的存在下生長(zhǎng)步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的酶的基因并且將油酸轉(zhuǎn)化為二十二碳六烯酸；并且c)任選回收步驟(b)的二十二碳六烯酸。
29.轉(zhuǎn)化的含油酵母，包含編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的酶的基因。
30.權(quán)利要求29的含油酵母，選自下組耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
31.權(quán)利要求30的含油酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母。
32.由權(quán)利要求1-28的任意一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的微生物油。
全文摘要
本發(fā)明涉及在含油酵母中生產(chǎn)ω－3和/或ω－6脂肪酸的方法。因此，將能夠催化亞油酸(LA)轉(zhuǎn)化成γ－亞麻酸(GLA)；α－亞油酸(ALA)轉(zhuǎn)化成十八碳四烯酸(STA)；GLA轉(zhuǎn)化成二高－γ－亞油酸(DGLA)；STA轉(zhuǎn)化成二十碳四烯酸(ETA)；DGLA轉(zhuǎn)化成花生四烯酸(ARA)；ETA轉(zhuǎn)化成二十碳五烯酸(EPA)；DGLA轉(zhuǎn)化成ETA；EPA轉(zhuǎn)化成二十二碳五烯酸(DPA)；以及將ARA轉(zhuǎn)化成EPA的去飽和酶和延伸酶導(dǎo)入了耶氏酵母屬中，用于合成ARA和EPA。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1852986SQ200480019580
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2004年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者S·K·皮卡塔吉奧, N·S·亞達(dá)夫, Q·Q·朱 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司