專利名稱：：檢測(cè)多核苷酸的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測(cè)多核苷酸的方法、組合物和分析系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：人們強(qiáng)烈需要對(duì)多核苷酸進(jìn)行鑒定及定量。目前用于對(duì)目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定的現(xiàn)有方法依賴于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、NASBA、TMA或bDNA等方法，所述目標(biāo)多核苷酸例如是與以下相關(guān)的病原體、病原感染、與疾病和紊亂相關(guān)的人類基因、經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)、生物戰(zhàn)爭(zhēng)試劑、獸醫(yī)應(yīng)用和農(nóng)業(yè)應(yīng)用。上述方法需要熟練的技術(shù)人員和專門的設(shè)備。因此，人們強(qiáng)烈需要對(duì)目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)、鑒定和定量的方便而經(jīng)濟(jì)的方法。本發(fā)明達(dá)到了這一目的和其它目的。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在含量的方法。在進(jìn)一步的方面，一種方法包括如下步驟將核酸類似物(其能以序列特異性的方式，與目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)核酸序列結(jié)合)與染料(有或沒有目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體存在的情況下，其光學(xué)性能的變化速率(rateofchange)會(huì)有所不同)組合起來(lái)，產(chǎn)生混合物。將混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比較，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，所述類似混合物含有已知量的目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體?；旌衔镏腥玖瞎鈱W(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的量相關(guān)。在另一個(gè)方面，方法包括如下步驟將肽核酸(PNA)(其能以序列特異性的方式，與目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)核酸序列結(jié)合)與染料(有或沒有目標(biāo)多核苷酸/PNA雜交體存在的情況下，其光學(xué)性能的變化速率會(huì)有所不同)組合起來(lái)，產(chǎn)生混合物。將混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，所述類似混合物含有已知量的目標(biāo)多核苷酸/PNA雜交體。混合物中染料光學(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的量相關(guān)。在其它方面，核酸類似物可以是鎖核酸(lockednucleicacid，LNA)、蘇糖核酸(threosenucleicacid)或連接有金屬的核酸。有或沒有目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體存在的情況下，以及當(dāng)向混合物提供輕微刺激時(shí)，染料光學(xué)性能的變化速率會(huì)有所不同。樣品可以是組織、細(xì)胞收集物、細(xì)胞裂解物、經(jīng)純化的多核苷酸或經(jīng)分離的多核苷酸、病毒、環(huán)境樣品、工業(yè)樣品、醫(yī)學(xué)樣品、食物樣品、農(nóng)業(yè)樣品、獸醫(yī)樣品、農(nóng)業(yè)牲畜樣品、水樣品、土壤樣品、空氣樣品、與生物武器試劑相關(guān)的樣品或與農(nóng)業(yè)戰(zhàn)爭(zhēng)試劑相關(guān)的樣品。在一個(gè)方面，目標(biāo)多核苷酸可以是DNA。在一些變化的情況下，目標(biāo)多核苷酸可以從全細(xì)胞DNA、核DNA、線粒體DNA、核糖體DNA、葉綠體DNA或病毒DNA、質(zhì)粒DNA、人工DNA、表觀基因組(epigenomic)DNA、表觀遺傳化(epigenetic)DNA、體外擴(kuò)增出的DNA或嵌合DNA獲得。在另一方面，目標(biāo)多核苷酸可以是RNA。在一些變化的情況下，RNA可以從核糖體RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、帶盔甲R(shí)NA(armoredRNA)、病毒RNA、小分子RNA(microRNA)、siRNA、人工RNA或嵌合RNA獲得。目標(biāo)多核苷酸可以從任何生物中獲得。在一種實(shí)施方式中，該生物可以是人。在另一種實(shí)施方式中，該生物可以是病原體。在又一種實(shí)施方式中，目標(biāo)多核苷酸可以來(lái)自病原體，例如病毒、細(xì)菌或真菌。關(guān)于此類病毒或細(xì)菌的非限制性的例子包括Bacillusanthracis、Clostridiumbotulinum、Brucellae、Vibriocholera、Clostridiumperfringes、Ebola病毒、Yersiniapesits、Coxiellaburnetii、天花病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒。核酸類似物可以與目標(biāo)核酸序列部分互補(bǔ)?；蛘?，核酸類似物可以與目標(biāo)核酸序列精確互補(bǔ)。核酸類似物的長(zhǎng)度可以大于大約4個(gè)核酸堿基和/或小于大約24個(gè)核酸堿基。在另一種變化中，核酸類似物的長(zhǎng)度還可以是大約12個(gè)核酸堿基。核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸可以被固定于固體基底(substrate)上。固定可以通過非共價(jià)相互作用來(lái)進(jìn)行，例如生物素和鏈親合素(streptavidin)之間的作用。在另一種變化中，核酸類似物可與生物素共價(jià)結(jié)合。在又一種變化中，非共價(jià)相互作用可以是抗原/抗體相互作用。核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸還可以與固體基底共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)方面，染料是青色素(cyanine)染料。青色素染料的例子是碘化3’，3’-二乙基硫雜羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫雜二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫雜三羰花青。較之不存在核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的情況，在存在有核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的時(shí)候，染料可以具有更高的光學(xué)性能變化速率?；蛘撸^之不存在核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的情況，在存在有核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的時(shí)候，染料可以具有更低的光學(xué)性能變化速率。染料的光學(xué)性能變化速率可以通過對(duì)染料的光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量來(lái)測(cè)定。此類光學(xué)性能的例子包括吸光度、熒光、反射率或化學(xué)發(fā)光。可在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量。在又一個(gè)方面，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)染料的光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量。在另一個(gè)方面，僅在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中生物進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該生物是否存在或存在的量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中一類生物進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該類生物是否存在或存在的量。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中生物的某些株系(strain)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該種類是否存在或存在的量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中經(jīng)過遺傳修飾的生物(GMO)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該經(jīng)過遺傳修飾生物是否存在或存在的量。本發(fā)明還涉及對(duì)受試對(duì)象(subject)是否存在疾病狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該疾病狀態(tài)。本發(fā)明還涉及對(duì)受試對(duì)象是否存在遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該遺傳變異。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)病原體引起的宿主的感染進(jìn)行檢測(cè)的方法，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在含量(其中目標(biāo)核酸是核糖核酸(RNA))，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能對(duì)初病原體引起的宿主感染進(jìn)行鑒定。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明SNP是否存在或存在的量。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中遺傳序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該遺傳序列是否存在或存在的量。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中體外擴(kuò)增的序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該體外擴(kuò)增的序列是否存在或存在的量。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中堿基對(duì)改變進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在含量進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行，其中，目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能表明該堿基對(duì)改變是否存在或存在的量。本發(fā)明還涉及對(duì)兩份或多份樣品中目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法通過如下步驟來(lái)進(jìn)行利用第一種核酸類似物分子，在多位點(diǎn)設(shè)備的第一個(gè)位點(diǎn)對(duì)第一份樣品中的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)；利用第二種核酸類似物分子，在多位點(diǎn)設(shè)備的第二個(gè)位點(diǎn)對(duì)第二份樣品中的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物分子被固定于固體基底上。本方法包括在兩份或多份樣品中對(duì)兩條或多條目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)?；蛘撸瑯悠房杀还潭ㄓ诠腆w基底上。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的試劑盒。試劑盒可以包括一種或多種包括目標(biāo)多核苷酸的樣品、與目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)核酸序列至少部分互補(bǔ)的一種或多種核酸類似物以及一種或多種染料。可選地，試劑盒可以包括刺激的來(lái)源。試劑盒可以包括用于使用試劑盒的說明書。圖1示出了使用PNA的分析系統(tǒng)的示意圖。圖2顯示了DNA分子和樣品PNA分子之間的結(jié)構(gòu)區(qū)別。圖3是光激活的基于PNA的分析系統(tǒng)的示意圖。圖4示出了光激活的分析系統(tǒng)。圖5示出了將不同濃度的目標(biāo)多核苷酸暴露給PNA和光刺激之后碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的發(fā)射率(emission)對(duì)時(shí)間的圖。圖6示出了對(duì)于不同DNA濃度而言，碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的發(fā)射率的百分比變化。圖7比較了用不同波長(zhǎng)的光刺激的情況下，樣品中碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的發(fā)射率的百分比變化。圖8對(duì)來(lái)自GMO大豆的DNA和來(lái)自非GMO大豆的DNA樣品中的染料發(fā)射率百分比變化進(jìn)行了比較。圖9示出了用混合波長(zhǎng)光源時(shí)對(duì)于不同待測(cè)DNA濃度的分析靈敏度。每行表示在不同DNA濃度下，暴露給光刺激后，染料的發(fā)射率的百分比變化。PNA是N’CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQIDNO1)，多核苷酸序列是5’CTACGGGAGGCAGCAGTG3’(SEQIDNO2)。圖10示出了在目標(biāo)多核苷酸的不同濃度下，碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青發(fā)射率出現(xiàn)20％的變化的時(shí)間。圖11示出了在DNA樣品和具有不同濃度的RNA的樣品中，染料發(fā)射率的百分比變化。圖12對(duì)存在或不存在deliwash背景的情況下，含有PNA和DNA的樣品中，碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青的發(fā)射率的百分比變化的比較。圖13示出了PNA“楔子”(“wedges”)的加入。圖14A-D比較了對(duì)一系列樣品應(yīng)用不同波長(zhǎng)之后的發(fā)射率。圖15示出了用通用細(xì)菌PNA探針的情況下，被固定的反應(yīng)對(duì)時(shí)間的圖。圖16示出了人類SRY檢測(cè)。圖17圖示了對(duì)核酸類似物進(jìn)行的光激活的、表面固定的檢測(cè)。圖18A-D示出了引入多核苷酸/核酸類似物雜交體的不同方案。圖19示出了不同波長(zhǎng)的光刺激的作用。圖20示出了對(duì)不同濃度的大豆DNA的檢測(cè)。圖21示出了光學(xué)性能的百分比變化對(duì)GMO陽(yáng)性大豆基因組數(shù)量的圖。圖22示出了不同濃度的tween20的效果。圖23示出了對(duì)于不同濃度的tween20而言發(fā)射率的百分比變化。圖24比較了具有不同濃度tween20的液體形式中，用PNA探針進(jìn)行的反應(yīng)和用LNA探針進(jìn)行的反應(yīng)。圖25示出了用PNA對(duì)LNA的反應(yīng)中，發(fā)射率的百分比變化。圖26示出了用不同數(shù)量的病毒RNA對(duì)丙型肝炎病毒進(jìn)行的檢測(cè)。圖27示出了暴露給光刺激后一分鐘時(shí)血漿的不同拷貝的發(fā)射率。圖28示出了用對(duì)HCV或細(xì)菌具有特異性的核酸類似物及細(xì)菌的情況下發(fā)射率的百分比變化。圖29示出了用短核酸類似物或用短核酸類似物的組合的情況下發(fā)射率的百分比變化。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用核酸類似物來(lái)檢測(cè)具有目標(biāo)核酸序列的多核苷酸的方法、組合物和分析系統(tǒng)。I.普通技術(shù)如無(wú)另外指明，本發(fā)明的應(yīng)用中使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和質(zhì)譜方面的傳統(tǒng)技術(shù)，這些都是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中也有完整闡述，例如，MolecularCloningALaboratoryManual，thirdedition(Sambrooketal.，2000)ColdSpringHarborPress；MolecularCloningALaboratoryManual，secondedition(Sambrooketal.，1989)ColdSpringHarborPress；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；MethodsinMolecularBiology，HumanaPress；CellBiologyALaboratoryNotebook(J.E.Cellis，ed.，1998)AcademicPress；AnimalCellCulture(R.I.Freshney，ed.，1987)；IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts，1998)PlenumPress；CellandTissueCultureLaboratoryProcedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，andD.G.Newell，eds.，1993-8)J.WileyandSons；MethodsinEnzymology(AcademicPress，Inc.)；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Calos，eds.，1987)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.，eds.，1987includingsupplementsthroughMay1，2004)；PCRThePolymeraseChainReaction，(Mullisetal.，eds.，1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coliganetal.，eds.，1991)；andShortProtocolsinMolecularBiology(WileyandSons，1999)；上述所有文獻(xiàn)都通過引用的方式被全文包括在本文中。此外，如無(wú)特別指明，通常按照廠商給出的方案，來(lái)使用通過商業(yè)途徑可獲得的分析試劑盒和試劑。II.定義術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)核酸序列”通常指通過本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)檢測(cè)到的核酸序列。目標(biāo)核酸序列的全部或部分可通過序列特異性雜交與核酸類似物分子結(jié)合。目標(biāo)核酸序列可以是任何長(zhǎng)度的，但是，通常，其長(zhǎng)度小于1Kb，小于500個(gè)堿基，小于24個(gè)堿基或者小于12個(gè)堿基。在另一種實(shí)施方式中，目標(biāo)核酸序列的長(zhǎng)度可以是10、12、14或18個(gè)堿基。在其它實(shí)施方式中，目標(biāo)核酸的長(zhǎng)度可以是至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)或至少50個(gè)堿基。本發(fā)明的目標(biāo)核酸序列可以包括蛋白質(zhì)編碼序列和非編碼序列(例如，調(diào)控序列、內(nèi)含子等)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指核苷酸的任何長(zhǎng)度的聚合形式，其可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸或其類似物。下述是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酸性酶(ribozyme)、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、核酸探針、引物和擴(kuò)增得到的DNA。多核苷酸可以含有經(jīng)過修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸的序列可被非核苷酸組分打斷。多核苷酸可以在聚合之前或之后被進(jìn)一步地修飾，例如與標(biāo)記組分結(jié)合。多核苷酸可以是擴(kuò)增得到的更長(zhǎng)的多核苷酸區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)多核苷酸”指包括目標(biāo)核酸序列的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸類似物”包括具有一個(gè)或多個(gè)不同于鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的堿基，和/或在RNA主鏈上的磷酸核糖或DNA主鏈上的磷酸去氧核糖上具有一處或多處不同的任何核酸類似物?！昂怂犷愃莆铩卑ǖ幌抻陔暮怂?PNA)，鎖核酸(LNA)(例如TrendsinBiotechnology2174-81，2003所公開的)，連接有金屬的核酸，經(jīng)修飾的多核苷酸(例如經(jīng)蒽醌修飾的)(如Yamanaetal.，2003所公開的)，蘇糖核酸(TNA)(例如Chaputetal.，JournaloftheAmericanChemicalSociety，125，856-857，(2003)所公開的)以及嵌合核酸。術(shù)語(yǔ)“肽核酸”或“PNA”包括下述任何核酸類似物，所述核酸類似物中，核酸的去氧核糖磷酸主鏈已被合成的類肽主鏈所取代，包括，例如，n-(2-氨基-乙基)-甘氨酸單元，例如，非限制性地，如圖2所示(Nielsenetal.，1991)以及U.S.PatentNos.5,786,461、6,357,163、6,107,470、5,773,571；6,441,130，6,451,968；6,228,982；5,641,625；5,766,855；5,736,336；5,719,262；5,714,331；5,719,262和6,414,112中所公開的。嘌呤和嘧啶堿基可以通過任何共價(jià)鍵連接結(jié)合，包括，例如，亞甲基羰基連接。本文中所使用的PNA分子可以在PNA主鏈和核酸堿基(nucleobase)之間具有其它原子。上述類似物包括，例如，D-賴氨酸鏈、環(huán)形結(jié)構(gòu)(例如環(huán)戊烷或吡咯烷環(huán))和/或手性取代結(jié)構(gòu)，包括U.S.PatentNo.6,403,763、U.S.PatentApplicationNo.US2003/0162699和U.S.PatentApplicationNo.US2003/0157500中所述的PNA分子。PNA主鏈可以包括肽主鏈上的取代或延伸。PNA可以包括基于肽的核酸模仿物(PENAM)(例如，例如U.S.PatentNO.5,705,333中所公開的)、具有不常見的手性中心的原子(例如D-手性中心和潛手性中心)以及PNA主鏈上的原子取代。術(shù)語(yǔ)“核酸類似物/多核苷酸雜交體”和“多核苷酸/核酸類似物雜交體”是同義的，它們指以序列特異性方式雜交的核酸類似物和多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“PNA/多核苷酸雜交體”和“多核苷酸/PNA雜交體”是同義的，它們指以序列特異性方式雜交的PNA和多核苷酸?！盎パa(bǔ)的”指單鏈核酸類似物分子具有以堿基特異性方式與多核苷酸結(jié)合的能力?？珊铣珊怂犷愃莆锓肿樱越Y(jié)合目標(biāo)多核苷酸，例如全長(zhǎng)多核苷酸鏈或其一部分?！盎パa(bǔ)的”核酸類似物分子可以具有一個(gè)或多個(gè)單個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配、添加和/或缺失，但仍能夠在選定的雜交條件下與目標(biāo)多核苷酸結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，互補(bǔ)的序列可以通過Watson-Crick方式(A-T或A-U及C-G)雜交。在另一種實(shí)施方式中，互補(bǔ)的序列可以通過核酸類似物和多核苷酸核酸堿基之間的Hoogstein堿基配對(duì)進(jìn)行雜交?！熬_互補(bǔ)的”指單鏈核酸類似物分子具有與目標(biāo)核酸序列結(jié)合的能力，且不含錯(cuò)配。如果在核酸類似物和目標(biāo)多核苷酸之間具有單個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配，那么核酸類似物分子就并非與目標(biāo)多核苷酸精確互補(bǔ)的。術(shù)語(yǔ)“速率”指變化(例如組合物或化合物性能的變化)。速率可以比速率常數(shù)的形式表示?？赏ㄟ^在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)量來(lái)確定速率?？赏ㄟ^測(cè)量對(duì)速率進(jìn)行描述，通過在過程中兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量(例如，特定刺激、組分加入等之前或之后)，或在至少三個(gè)、至少四個(gè)或至少五個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量來(lái)確定速率?？捎枚炕蚨ㄐ?例如，變化是“快”或“慢”的)的形式來(lái)表述速率?？赏ㄟ^對(duì)化合物的性能與相對(duì)值的比較來(lái)確定速率，或者通過其它方法來(lái)確定。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“相對(duì)速率”指與另一過程的速率相比較的一種過程的速率?！跋鄬?duì)速率”可以是大致的(例如，一種過程的速率可以比另一過程的速率“更快”或“更慢”)或定量的(例如，比較對(duì)兩種過程測(cè)量出的速率)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“染料”指具有可被測(cè)量的光學(xué)性能的化合物，或者可以轉(zhuǎn)化為具有可被測(cè)量的光學(xué)性能的化合物的化合物?？杀粶y(cè)量的光學(xué)性能包括但不限于顏色、吸光度、熒光、反射率或化學(xué)發(fā)光。染料在某些條件下可以展示出光學(xué)性能，例如結(jié)合上多核苷酸/核酸類似物雜交體時(shí)，或未結(jié)合上多核苷酸/核酸類似物雜交體時(shí)?！皫Э識(shí)NATM”指由于RNA被細(xì)菌噬菌體蛋白質(zhì)包裹上外殼從而對(duì)核糖核酸酶具有抗性的RNA。在例如U.S.Pat.Nos.6,399,307、6,214,982、5,939,262、5,919,625和5,677124中，有對(duì)“帶盔甲R(shí)NATM”的進(jìn)一步描述。本文中使用的“非特異性載體多核苷酸”指非目標(biāo)多核苷酸分子，其能增加核酸類似物與特異性目標(biāo)多核苷酸之間的結(jié)合親合力和/或提高分析系統(tǒng)的靈敏度。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸類似物結(jié)合位點(diǎn)”指一個(gè)或多個(gè)核酸類似物分子與固體支持物結(jié)合的位點(diǎn)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“PNA結(jié)合位點(diǎn)”指一個(gè)或多個(gè)PNA分子與固體支持物結(jié)合的位點(diǎn)?！皹悠贰敝溉魏晤愋偷囊后w樣品(例如，血液、血清、水或尿液)和/或任何類型的固體樣品(例如，細(xì)胞、食物、水、空氣、泥土或谷物)和/或任何類型的空氣傳播樣品。術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”指動(dòng)物，例如脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”還指植物。術(shù)語(yǔ)“病原體”指任何會(huì)導(dǎo)致疾病、紊亂和/或病理狀態(tài)和/或癥狀的介質(zhì)。舉例而言，病原體可以是自然界中發(fā)現(xiàn)的、實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生的生物(或其伴隨的毒素)，其會(huì)導(dǎo)致生物體中疾病的出現(xiàn)，或病理狀態(tài)或癥狀的發(fā)展，使得生物失去能力、虛弱和/或死亡。病原體包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、真核生物和/或原核生物，以及生物武器試劑、傳染性疾病、水傳播的(waterborne)病原體和食物病原體。術(shù)語(yǔ)“生物武器試劑”指自然界中發(fā)現(xiàn)的或?qū)嶒?yàn)室中產(chǎn)生的下述任何生物(或其伴隨的毒素)，其被主要用于在另外的活的生物體中導(dǎo)致疾病、使其失去能力或使其死亡。生物武器試劑的例子包括但不限于致病細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、立克次體和病毒。本文中使用的“感染(infection)”指宿主中存在病原體。感染可以是潛伏的或發(fā)作的。在一種實(shí)施方式中，病原體的存在由宿主多核苷酸和/或多肽表達(dá)的變化所指示。感染可以通過下述途徑發(fā)生，其包括但不限于空氣傳播的唾沫、直接接觸、動(dòng)物和昆蟲載體和受污染的食物或飲料。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“宿主應(yīng)答多核苷酸”指在應(yīng)答刺激(例如病原體感染和/或接觸)的宿主中，有所改變的多核苷酸或其表達(dá)有所改變的多核苷酸。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“宿主”指動(dòng)物和植物。動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括人類、非人類靈長(zhǎng)類、畜牧動(dòng)物、體育競(jìng)技動(dòng)物(sportanimal)、小鼠和大鼠。植物的例子包括但不限于農(nóng)業(yè)作物。III.檢測(cè)多核苷酸的方法本發(fā)明提供了用核酸類似物來(lái)檢測(cè)具有目標(biāo)核酸序列的多核苷酸的方法、組合物和分析系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，(i)含有、被認(rèn)為含有、或預(yù)期不含有目標(biāo)多核苷酸的樣品，(ii)能以序列特異性方式與多核苷酸的目標(biāo)核酸序列結(jié)合的核酸類似物和(iii)存在和不存在多核苷酸/核酸類似物雜交體的情況下，其光學(xué)性能變化速率會(huì)有所不同的染料，被組合起來(lái)產(chǎn)生混合物。該混合物還可以包括非特異性載體多核苷酸，例如但不限于非特異性植物DNA、酵母DNA、鮭魚精DNA或tRNA。將混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，所述類似混合物含有已知量(包括量為零的情況)的多核苷酸/核酸類似物雜交體?；旌衔镏腥玖瞎鈱W(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的含量相關(guān)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用肽核酸(PNA)分子來(lái)檢測(cè)具有目標(biāo)核酸序列的多核苷酸的方法、組合物和分析系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，(i)含有、被認(rèn)為含有、或預(yù)期不含有目標(biāo)多核苷酸的樣品，(ii)能以序列特異性方式與多核苷酸的目標(biāo)核酸序列結(jié)合的肽核酸(PNA)和(iii)存在和不存在多核苷酸/PNA雜交體的情況下，其光學(xué)性能變化速率會(huì)有所不同的染料，被組合起來(lái)產(chǎn)生混合物。該混合物還可以包括非特異性載體多核苷酸，例如但不限于非特異性植物DNA、酵母DNA、鮭魚精DNA或tRNA。將混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，所述類似混合物含有已知量(包括量為零的情況)的多核苷酸/PNA雜交體?；旌衔镏腥玖瞎鈱W(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的含量相關(guān)。參照值可以是具有已知特征的組合物或化合物的性能所特有的值。例如，在多種實(shí)施方式中，可用不含多核苷酸/核酸雜交體、含有一定量(例如，已知量)的多核苷酸/核酸雜交體、多核苷酸/核酸雜交體含量為零的混合物，或其中一種或多種組分(例如，核酸類似物、目標(biāo)多核苷酸或染料)不存在的反應(yīng)混合物，來(lái)確定參照值。進(jìn)一步的關(guān)于參照值的非限制性的例子包括未暴露給光刺激的混合物的光學(xué)性能所特有的值，或，在另外一種實(shí)施方式中，已暴露給光刺激的混合物的光學(xué)性能所特有的值。上述例子用于闡述，而非意欲限制本發(fā)明，在本申請(qǐng)文件的指導(dǎo)下，其它的例子對(duì)于操作者來(lái)說也是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可經(jīng)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定參照值，但這并非必須(例如，如果知道，在不存在目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體的情況下，含有染料的組合物的光學(xué)性能不發(fā)生變化，或者最小限度地變化，可對(duì)參照值進(jìn)行計(jì)算或推理，可不對(duì)其進(jìn)行測(cè)量)。參照值可以是恒定值。雖然在某些情況下，同時(shí)對(duì)“對(duì)照”樣品和測(cè)試樣品進(jìn)行分析是方便的，但并非必須要如此操作?？稍谝粋€(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)參照值進(jìn)行測(cè)定，該值被記錄下來(lái)在較后的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。應(yīng)當(dāng)理解到，上述例子僅用于闡述，而非加以限制。本申請(qǐng)文件中示出了多種不同的參照值。在一個(gè)方面，參照值是不含多核苷酸/核酸類似物雜交體的類似混合物的染料光學(xué)性能變化速率所特有的。在一種實(shí)施方式中，參照值可以是在所有組分組合于混合物之前的染料的光學(xué)性能所特有的。在另一種實(shí)施方式中，參照值可以是標(biāo)準(zhǔn)值。對(duì)于將混合物暴露給光刺激的實(shí)施方式而言，參照值可以是使用光刺激前染料光學(xué)性能所特有的。應(yīng)當(dāng)清楚地認(rèn)識(shí)到，無(wú)須同時(shí)對(duì)樣品、核酸類似物和染料混合物中染料的光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定。此外，還應(yīng)理解，參照值可以是恒定的值。參考特定的實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明。實(shí)施例1和圖4種示出了本發(fā)明的使用PNA的基于液體的方法。在微離心管中混合10μM與花菜花葉病毒35S啟動(dòng)子互補(bǔ)的PNA分子(35SPNA)和1μM35S啟動(dòng)子DNA(35SDNA)，加入150μM染料。將所述的管暴露于光刺激，在超過1分鐘的時(shí)間段內(nèi)觀察到了顏色變化(圖4)；即染料光學(xué)性能發(fā)生變化。在對(duì)照管中，目標(biāo)核苷酸不存在，甚至在24小時(shí)后，顏色仍為粉紅色(無(wú)光刺激)，表明光學(xué)性能變化速率非常低。當(dāng)35SPNA不存在(管3)或沒有特異性目標(biāo)時(shí)(管1)，在管中幾乎觀察不到光學(xué)性能(該情況下，即顏色變化)的變化。圖1中示出了另一種使用PNA探針的實(shí)施例。A)將帶有與一種或多種目標(biāo)多核苷酸序列互補(bǔ)的PNA序列的離散點(diǎn)的膜帶置于裂解/雜交管1中。B)將樣品加入到裂解/雜交緩沖液中，對(duì)混合物在＞95℃上加熱3分鐘，以及C)冷卻至室溫。D)將該膜帶轉(zhuǎn)移至新的管(管2)中，其中含有用于溫育的洗滌緩沖液。移去未結(jié)合的DNA、RNA和其它細(xì)胞殘余物。E)將所述膜帶轉(zhuǎn)移至含有檢測(cè)染料的新的管(管3)，對(duì)其進(jìn)行大約1分鐘的溫育。F)將所述的管在洗滌緩沖液中進(jìn)行簡(jiǎn)單的洗滌(管4)，去除殘余的未結(jié)合的染料。G)在該膜系統(tǒng)中，染料僅與PNA/目標(biāo)多核苷酸復(fù)合物結(jié)合?；陔s交圖案，可確定出特定目標(biāo)多核苷酸是否存在。通過與已知的圖案卡進(jìn)行比較，可確定物質(zhì)是否存在并對(duì)其進(jìn)行鑒定。圖22中示出了另一個(gè)實(shí)施例。在微離心管中混合10μM與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的PNA分子和1μM目標(biāo)多核苷酸。加入2μM染料和不同量的tween20。將微離心管暴露于光刺激，在超過10分鐘的時(shí)間段內(nèi)觀察到光學(xué)性能的變化(圖22)。當(dāng)超過1.0％的tween20存在時(shí)，對(duì)于含有染料而不含目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體的樣品來(lái)說，僅觀察到光學(xué)性能的很小的變化。當(dāng)將含有目標(biāo)多核苷酸/核酸雜交體的樣品暴露給光刺激時(shí)，染料的熒光(或其它光學(xué)性能)發(fā)生改變。通過觀察熒光(或其它光學(xué)性能)的變化對(duì)是否存在目標(biāo)多核苷酸或其存在的量進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可通過單次測(cè)量來(lái)測(cè)知是否存在目標(biāo)多核苷酸或其存在的量。在另一種實(shí)施方式中，可將多種核酸類似物序列組合于混合物中，以通過多元技術(shù)(multiplexing)來(lái)檢測(cè)多種目標(biāo)多核苷酸?？稍诿绹?guó)專利5582989中發(fā)現(xiàn)涉及已知核酸分析系統(tǒng)的多元反應(yīng)。不打算受限于特定的機(jī)理或理論的情況下，在一個(gè)方面，核酸類似物/多核苷酸雜交體可以催化涉及染料的化學(xué)反應(yīng)。染料與作為催化位點(diǎn)的核酸類似物/多核苷酸雜交體的小溝(minorgroove)結(jié)合。光刺激的使用向混合物中增加了能量，導(dǎo)致核酸類似物/多核苷酸雜交體中染料的光學(xué)性能以較之不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況下更快的速率變化。例如，使用光刺激時(shí)，碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青變得澄清(turnsclear)。染料光學(xué)性能變化速率較高對(duì)應(yīng)于樣品中目標(biāo)多核苷酸的存在量增加。下述部分更為詳細(xì)地描述了本發(fā)明。A.設(shè)計(jì)核酸類似物序列為用于本發(fā)明，可對(duì)核酸類似物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其與目標(biāo)多核苷酸的核酸序列互補(bǔ)或精確互補(bǔ)。在一種實(shí)施方式中，除接頭、氨基酸和標(biāo)記之外，核酸類似物長(zhǎng)度大于大約4個(gè)核苷酸，并且小于大約24個(gè)核酸堿基。在其它實(shí)施方式中，核酸類似物長(zhǎng)度可以為5-100、8-60或10-25個(gè)核酸堿基。在另一種實(shí)施方式中，除接頭、氨基酸和標(biāo)記之外，核酸類似物的長(zhǎng)度可以是10、12、14或18個(gè)堿基。在其它實(shí)施方式中，目標(biāo)核酸的長(zhǎng)度可以是至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)或至少50個(gè)堿基。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為含有與目標(biāo)多核苷酸不互補(bǔ)的區(qū)域，例如在多核苷酸末尾延伸出去的序列。可用多種不同的方法來(lái)設(shè)計(jì)核酸類似物分子的序列。非限制性地舉例而言，核酸類似物分子可被設(shè)計(jì)為具有基于已知引物的序列，所述引物是用于基于PCR的擴(kuò)增以及對(duì)特定目標(biāo)序列的檢測(cè)的。核酸類似物分子還可被設(shè)計(jì)為與多核苷酸的任何目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)或精確互補(bǔ)。舉例而言，核酸類似物分子的序列可以基于PCR引物的序列，所述引物用于檢測(cè)與病原體相關(guān)的多核苷酸、宿主中病原體的存在與否、疾病基因或遺傳情況。核酸類似物分子還可與下述序列互補(bǔ)或精確互補(bǔ)，所述序列包括編碼蛋白質(zhì)活性或功能結(jié)構(gòu)域的全部或部分序列，編碼完整蛋白質(zhì)的全部或部分序列或非編碼序列(例如，調(diào)控序列、內(nèi)含子等)。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被用于區(qū)分具有精確互補(bǔ)序列的多核苷酸和具有單個(gè)堿基錯(cuò)配的多核苷酸。非限制性地舉例而言，用于本發(fā)明的核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用以檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。核酸類似物/多核苷酸雜交受到堿基錯(cuò)配的影響。根據(jù)本發(fā)明的方法，加入染料后，目標(biāo)序列(例如SNP)和核酸類似物之間的單個(gè)堿基錯(cuò)配導(dǎo)致染料光學(xué)性能變化速率不同，這是較之不具有錯(cuò)配的核酸類似物而言的。對(duì)用于診斷目的的對(duì)SNPs的鑒定方法和其它方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)一類生物是否存在或存在的量。生物的類指，所有這些生物都具有與核酸類似物序列互補(bǔ)或精確互補(bǔ)的一條或多條序列?？苫诤怂嵝蛄械幕パa(bǔ)性將此類生物與其它生物區(qū)分開來(lái)。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物分子具有小于大約60％的嘌呤含量，并在一排中最多具有4個(gè)嘌呤堿基或三個(gè)鳥嘌呤堿基。富含嘌呤的核酸類似物分子傾向于聚集，在水溶液中溶解度很低。對(duì)核酸類似物分子加以選擇，以避免具有反向重復(fù)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和回文結(jié)構(gòu)的自身互補(bǔ)的序列，或使其最小化。核酸類似物分子可以任何方向與多核苷酸雜交，但是反平行(anti-parallel)的方向是優(yōu)選的。反平行是用于反義和DNA探針類型應(yīng)用的優(yōu)選構(gòu)型。當(dāng)核酸類似物的方向?yàn)榉雌叫袝r(shí)，核酸類似物探針的N-末端等同于DNA的5’末端。N’和5’都用于本文中。在本文的指導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，除本文特別列出的核酸類似物之外，其它核酸類似物(包括未來(lái)發(fā)現(xiàn)或發(fā)展出的核酸類似物)也可用于本發(fā)明的方法。在本文所述的分析條件下能形成多核苷酸/核酸類似物雜交體的核酸類似物適于本發(fā)明的方法，其能影響到光學(xué)性能變化的速率。可用若干篩選方法中的任何方法，來(lái)鑒定適合用于本發(fā)明方法中的核酸類似物。在一種方法中，非限制性地舉例而言，在能形成核酸類似物/多核苷酸雜交體的條件下，將含有候選核酸類似物(可選地，以不同濃度存在的)的樣品，與具有互補(bǔ)序列的多核苷酸組合。在一種實(shí)施方式中，然后加入染料。然后對(duì)染料光學(xué)性能的變化速率進(jìn)行測(cè)定。將該速率與不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值進(jìn)行比較。在另一種實(shí)施方式中，參照值是不存在多核苷酸的情況所特有的。在又一種實(shí)施方式中，參照值是存在目標(biāo)多核苷酸(單鏈或雙鏈的)的情況所特有的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，加入的順序不是關(guān)鍵因素，組分可按照另外的順序加入。在另一種實(shí)施方式中，參照值是多核苷酸濃度不為零的情況所特有的。在該種實(shí)施方式中，相對(duì)參照值(例如，存在雙鏈多核苷酸但不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體)而言，光學(xué)性能隨時(shí)間以不同速率變化的核酸類似物/多核苷酸雜交體被選用于本發(fā)明所要求保護(hù)的方法。光學(xué)性能的相對(duì)變化速率與特定多核苷酸是否存在或者存在的量相關(guān)。B.肽核酸(PNAs)在一個(gè)方面，核酸類似物是PNAs。PNA通過序列特異性雜交，與目標(biāo)多核苷酸中的目標(biāo)核酸序列的全部或部分雜交?；蛘?，條件變化使得單個(gè)堿基對(duì)的改變被區(qū)分出來(lái)。PNA分子能與目標(biāo)多核苷酸迅速雜交。PNA對(duì)多核苷酸的雜交不依賴于鹽濃度(Demidovetal.，1994)。PNA對(duì)核酸酶和蛋白酶的攻擊具有抗性，相對(duì)于傳統(tǒng)的DNA而言，其能以更高的特異性與多核苷酸結(jié)合。短探針可用于序列特異性高的情況(RayandNorden，2000)。此外，PNA/多核苷酸雜交體較之相應(yīng)的DNA/多核苷酸雜交體具有更高的熱穩(wěn)定性，PNA/多核苷酸雜交體的熔點(diǎn)對(duì)離子強(qiáng)度相對(duì)不敏感，在低鹽濃度(＜10mMNaCl)和中等鹽濃度(500mMNaCl)顯示出相等的熱穩(wěn)定性。在低鹽濃度下PNA/多核苷酸雜交體形成的能力是顯著的，因?yàn)閐sDNA和rRNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)在鹽濃度低于200mM時(shí)會(huì)被顯著去穩(wěn)定。因此，可對(duì)分析條件進(jìn)行選擇，選出偏向于對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行破壞而仍能促進(jìn)PNA分子的強(qiáng)烈雜交的條件(StefanoandHyldig-Nielsen，1997)。PNA/多核苷酸雜交會(huì)受到堿基錯(cuò)配的嚴(yán)重影響，PNA分子在僅有單個(gè)錯(cuò)配的水平下仍能保持對(duì)序列差異的分辨。例如，可從Eurogentec(UK)、BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA)和AppliedBiosystemsInc.(ABI)購(gòu)得PNA分子，或通過本領(lǐng)域已知的方法對(duì)PNA分子進(jìn)行合成。C.雜交條件通常，對(duì)雜交條件的設(shè)計(jì)和/或選擇受若干參數(shù)的影響，其例如但不限于核酸類似物分子與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的程度、將要使用的核酸類似物分子以及目標(biāo)多核苷酸本身的長(zhǎng)度。優(yōu)選的雜交條件能使下述情況的一種或多種發(fā)生核酸類似物與目標(biāo)多核苷酸高效結(jié)合，RNA或DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小化，RNA的降解最小化，以及，一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的變化得以被分辨，或一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的變化被包含進(jìn)來(lái)。雜交反應(yīng)可在不同“嚴(yán)謹(jǐn)度”條件下進(jìn)行。影響雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)度的條件眾所周知，并在本領(lǐng)域中公開過。例如，見MolecularCloning，ALaboratoryManual，thirdedition(Sambrooketa1.2000)，ColdSpringHarborPress。相關(guān)條件的例子包括但不限于鹽濃度、pH(緩沖液)和溫度。使用低鹽濃度的雜交條件通常會(huì)增加DNA的不穩(wěn)定性和PNA/多核苷酸的穩(wěn)定性?？梢允褂玫木彌_液的例子包括但不限于，Na3PO4、NaHSO4、K2HPO4、K2SO4或CaSO4。舉例而言，緩沖液的摩爾濃度范圍在大約10mM至大約0.5M之間，pH在大約4至大約10之間，或在大約7至大約10之間，例如大約7.0或大約7.5。舉例而言，可使用大約0.5mM至0.5M之間的Na3PO4，例如，2.5mM，其pH在大約至大約10之間，或在大約7至大約10之間，例如大約7.0或大約7.5。作為示例的條件的例子包括但不限于(以嚴(yán)謹(jǐn)度逐漸增加的順序)溫育溫度為25℃、37℃、50℃和68℃；緩沖液濃度為10XSSC、6XSSC、4XSSC、1XSSC、0.1XSSC(其中SSC是0.15MNaCl和15mM如本文所述的任何緩沖液)以及使用其它緩沖液體系的其等同條件；甲酰胺濃度為0％、25％、50％和75％；溫育時(shí)間從5分鐘至24小時(shí)，1個(gè)、2個(gè)或多個(gè)洗滌步驟；洗滌溫育時(shí)間為1、2或15分鐘；洗滌溶液為6XSSC、1XSSC、0.1XSSC或去離子水。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交和洗滌條件都在高嚴(yán)謹(jǐn)度下進(jìn)行。舉例而言，雜交可在下述條件下進(jìn)行50％甲酰胺、4XSSC，接著在50℃用2xSSC/甲酰胺和1xSSC進(jìn)行洗滌。緩沖液可以含有離子或其他化合物，或不同的緩沖能力?；蛘?，緩沖液中的成分可以具有穩(wěn)定化能力；例如可使三體DNA穩(wěn)定的新霉素或其它氨基糖苷(Aryaetal，2003)或增強(qiáng)三體穩(wěn)定性的二酰亞胺萘(GianolioandMcLaughlin，2001)或萘基喹啉(Keppleretal，1999)。D.染料可使用一種或多種染料來(lái)測(cè)定是否存在多核苷酸或其存在的量，其中，存在核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況與已知濃度的核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況相比，所述染料光學(xué)性能變化速率不同。在一個(gè)方面，光學(xué)性能可以是顏色、吸光度、熒光、反射率或化學(xué)發(fā)光方面的變化。還可在分析期間的單個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量?？蓪⑷玖瞎鈱W(xué)性能變化的速率與含有已知量的核酸類似物/多核苷酸雜交體或多核苷酸/PNA雜交體的混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率。參照值可以是定性的或近似的值(例如，存在或不存在顏色)?；蛘撸瑓⒄罩悼梢允怯脭?shù)字表示的值。如另一個(gè)實(shí)施例所示，可在對(duì)樣品中染料光學(xué)性能變化速率的測(cè)定之前、期間或之后，對(duì)參照值進(jìn)行測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)施例中，參照值可以是恒定的，例如速率常數(shù)。參照值還可以是不存在目標(biāo)多核苷酸或多核苷酸/核酸類似物雜交體的情況下(即，核酸類似物/多核苷酸雜交體的量已知為零)光學(xué)性能的變化速率。在一些情況下，存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)，染料的光學(xué)性能的變化速率要比不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)高。因此，通過光學(xué)性能較之參照值的相對(duì)變化速率的增加，可檢測(cè)到多核苷酸的存在或其存在的量。存在有核酸類似物/DNA雜交體的情況下其光學(xué)性能變化會(huì)更為迅速的染料的例子包括羰花青染料，其是多環(huán)芳香化合物。這些染料在可見光范圍內(nèi)具有強(qiáng)烈的吸收，優(yōu)先與溶液中的核酸類似物/多核苷酸雜交體結(jié)合，結(jié)合之后顏色會(huì)有所改變。羰花青染料的例子包括但不限于碘化3，3’-二乙基硫雜青色素、碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青、碘化3，3’-二乙基硫雜二羰花青和碘化3，3’-二乙基硫雜三羰花青。在一種示例性的實(shí)施方式中，本文所述的分析條件下，存在有目標(biāo)核酸和互補(bǔ)PNA時(shí)，光刺激使得3’，3’-二乙基硫雜羰花青從桃紅色(hotpink)變得澄清(clear)。不存在目標(biāo)核酸時(shí)，染料的變化速率較慢。存在目標(biāo)核酸和互補(bǔ)PNA時(shí)，光刺激還會(huì)降低染料的熒光發(fā)射。不存在光刺激時(shí)，存在目標(biāo)核酸時(shí)，染料立刻從桃紅變回暗粉色(dullpink)，并且，存在目標(biāo)核酸時(shí)，染料的熒光發(fā)射立刻減少。在本文所述的分析條件下，存在目標(biāo)核酸時(shí)，3，3’-二乙基硫雜二羰花青從藍(lán)色變?yōu)樽仙?。在本文所述的分析條件下，存在目標(biāo)核酸時(shí)，3，3-二乙基硫雜三羰花青保持為水藍(lán)色，不存在目標(biāo)核酸時(shí)，其變得澄清。在其它情況下，存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)，染料光學(xué)性能變化速率要比不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)慢。因此，可以通過光學(xué)性能的相對(duì)變化速率的降低來(lái)檢測(cè)出多核苷酸是否存在或存在的量，所述相對(duì)變化速率的降低是較之不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況下速率所特有的參照值而言的。染料可以選自，例如，能以若干種方法中的任何方法與核酸結(jié)合的分子。有用的染料包括小溝結(jié)合物、大溝結(jié)合物、嵌入物(intercalator)以及與其它多核苷酸結(jié)合的分子、其衍生物或其結(jié)合物(conjugates)?？捎糜诒景l(fā)明方法中的一些染料與核酸類似物/多核苷酸雜交體的小溝結(jié)合。這些染料包括羰花青染料，例如碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青、碘化3，3’-二乙基硫雜二羰花青和碘化3，3’-二乙基硫雜三羰花青。例子包括但不限于溴化乙錠(Fiebigetal，1999)、熒光素、吩噻嗪染料(例如亞甲基藍(lán)(Wagner，2002)，DAPI(Kapuscinski，1995))、噻唑橙(BogerandTse，2001，Carreonetal，2004)、Hoechst33258(Adhikaryetal，2003，Maitietal，2003，Morozkinetal，2003，Taniousetal.，2004，Tawaretal，2003)、SYBRGreenII(Morozkinetal.，2003)、BEBO、BETO、BOXTO、BO、BO-PRO、TO-PRO，YO-PRO(Karlssonetal.，2003，Erikssonetal，2003)、PicoGreen(ToluandMyers，2003)、TO-PRO-3(Sovenyhazyetal，2003)、二青色素染料(Schaberleetal，2003)、甲基綠-派洛寧Y(PrentoandLyon，2003)、溴化乙錠和吖啶橙(Johnsonetal，2003，Laurettietal，2003，Luedtkeetal，2003)、中性紅(Wangetal，2003)、BO(Karlssonetal，2003)、單lexitropsins及雙lexitropsins和噴他脒(Pentamidine)(Puckowskaetal，2004)、2-(甲基硫雜)苯基水楊基醛亞胺Schiff堿銅(II)(Reddyetal，2004)、雙功能鉑(II)復(fù)合物(MaandChe，2003)、雙(9-氨基吖啶-4-羧基酰胺)(Wakelinetal，2003)、二咪唑吖啶酮(Tarasovetal，2003)、平行或反平行羧基酰胺小溝結(jié)合物(Boutorineetal，2003)、具有小溝結(jié)合物的寡(2′-O-甲基核糖核苷酸)結(jié)合物(Novopashinaetal，2003)、吡咯咪唑多胺(Briehnetal，2003，DervanandEdelson，2003，Reddyetal，2003，RennebergandDervan，2003)、吡咯(Huangetal，2000)、二吡咯(Carrascoetal.，2003)、釕復(fù)合物(Kuwabaraetal，2003)、鉈(Ouameuretal，2003)、芳香二脒(Nguyenetal，2002)、教酒菌素(Chartreusin)(Barceloetal，2002)、鉑復(fù)合物(Silvermanetal，2002)、S-3-硝基-2-吡啶亞磺酰-N-乙?；?半胱氨酸(Shimetal，2004)、甲基磺酸酯(Varadarajanetal，2003)、肽雙嵌入物(bis-intercalator)(Guelevetal，2001)、金屬嵌入物(Proudfootetal，2001)、2，2′-聯(lián)二萘(Kondoetal，2004)、嵌入核酸(ChristensenandPedersen，2002，Nielsenetal，2004)、釕(II)復(fù)合物(Liuetal，2004)、環(huán)狀多胺新三烯/銅(II)復(fù)合物(Biveretal，2004)、2，6-二磺酸蒽醌(WongandGooding，2003)、二茂鐵基蒽、二茂鐵和其它萘二酰亞胺衍生物(GianolioandMcLaughlin，2001，Takenakaetal，2002，TokandFenker，2001)、阿霉素(Patolskyetal，2002，Xiaoetal，2003)、吖啶-9-基硫脲(BaruahandBierbach，2003)、萘二酰亞胺(Nojimaetal，2001，Nunezetal，2000)、米托蔥醌(mitoxantrone)(Wangetal，2003)、白葉藤堿和新白葉藤堿(Guittatetal，2003)、與亞氨基二乙酸相連的聚酰胺(Woodsetal，2002)、樹枝狀多胺結(jié)合物(Branaetal，2002)、雙嵌入物delta-delta[mu-C49cpdppz)(2)-(phen)(4)Ru(2)](Onfeltetal，200l，Onfeltetal，2002)、地特諾(ditercalinium)(Bergeetal，2002)、8-甲氧補(bǔ)骨脂素(Arabzadehetal，2002)、道諾霉素和玫瑰樹堿(ellipticine)(Rehaetal，2002)、1，4，5，8-萘四羧基二酰亞胺(Guelevetal，2002)、白葉藤堿(Lisgartenetal，2002)、AMAC(Ferryetal，2001)、(-)-6-[[(氨基烷基)氧]甲基]-4-去甲氧基-6，7-二去氧柔紅霉酮(1)(DienesandVogel，1996)、NLCQ-1(Papadopoulouetal，2000)、YOYO-1(Wongetal，2001)、DACA(Hicksetal，2001)、環(huán)金屬化Rh(III)(KiskoandBarton，2000)、CI-958(Deesetal，2000)，pyrazoloacridine(Pelleyetal，2000)、順二氯鉑(II)復(fù)合物(Perrinetal，2000)、咪唑吖啶酮(MazerskiandMuchewicz，2000)、咔唑(SajewiczandDlugosz，2000)、5，11-二甲基-5H-吲哚[2，3-b]喹啉(Osiadaczetal，2000)、YOYO-3、紡錘菌素、SN6999、A3和SN6113(Kirschsteinetal，2000)、唑黃(Inoueetal，1999)、銠(III)的5，6-屈醌二亞胺復(fù)合物(chrysenequinonediimine)(JacksonandBarton，2000)、尼羅藍(lán)(Chenetal，1999)、usambarensine(Dassonnevilleetal，1999)、3-甲氧基苯并蒽酮(Yangetal，1999)、1，8-二羥基蒽醌(MuellerandStopper，1999)、環(huán)丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole)(Dempcyetal，1999)、蒽(Ostaszewskietal，1998)、吡咯里嗪(pyrrolizine)和咪唑(Atwelletal，1998)、蒽環(huán)復(fù)合物(Milanoetal，1998)、雜二聚體(例如，噻唑橙-噻唑藍(lán)，噻唑橙-溴乙非啶和熒光素-溴乙非啶(Bensonetal，1993a，Bensonetal1993b)。此外，公司(例如MolecularProbes)出售與本發(fā)明兼容的多種類型的核酸染劑。JournaloftheAmericanChemicalSociety1254132-4145(2003)和BioconjugateChemistry13387-391(2002)中，可發(fā)現(xiàn)其它類別的青色素染料和具有狀態(tài)反應(yīng)的(statereactive)染料。其它染料的例子包括但不限于三銅(II)復(fù)合物(Dharetal，2003)、偏端霉素A(Hirakuetal，2002，Woodsetal，2002)、吲哚[2，3-b]-quinolizinium溴(Viola，2002)、海鞘素(ecteinascidins)(AnthoneyandTwelves，2001)、金屬氨絡(luò)物(Barryetal，2002)或2-苯基喹啉-碳水化合物雜合體(Toshimaetal，1999)。在某些實(shí)施方式中，染料不是會(huì)促進(jìn)分裂的化合物。染料還可以包括孔雀綠、紅色雙砷化合物染料和熒光素。在某些實(shí)施方式中，染料不是孔雀綠、紅色雙砷化合物染料和熒光素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可對(duì)染料加以篩選，以確定出可以在本發(fā)明方法中使用的那些染料?？山Y(jié)合核酸類似物/多核苷酸雜交體，并展示出光學(xué)性能隨時(shí)間的變化(可選地，在被提供了刺激之后)的那些染料可被容易地鑒定和選擇出。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本申請(qǐng)文件的指導(dǎo)下將認(rèn)識(shí)到，除了本文所列出的染料外，其它染料(包括未來(lái)發(fā)現(xiàn)或發(fā)展出的染料)也可用于本發(fā)明的方法。在本文所述的分析條件下，存在和不存在目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體的情況下，其光學(xué)性能變化速率不同的染料是適合用于本發(fā)明的?？墒褂萌舾珊Y選方法中的任何方法來(lái)鑒定出合適的染料。非限制性地舉例而言，將含有核酸類似物的樣品與具有互補(bǔ)序列的多核苷酸在能形成核酸類似物/多核苷酸雜交體的條件下組合。在一種實(shí)施方式中，然后加入候選染料，可選地，為不同濃度的。加入的順序并不重要，組分可按照其它順序加入。然后對(duì)光學(xué)性能隨時(shí)間變化的速率進(jìn)行測(cè)定。將該速率與不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況下染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值進(jìn)行比較。在一種實(shí)施方式中，參照值是不存在多核苷酸的情況所特有的。在一種實(shí)施方式中，參照值是存在多核苷酸(單鏈的或雙鏈的)的情況所特有的。在另一種實(shí)施方式中，參照值是多核苷酸含量非零的情況所特有的。較之參照值，展示出其光學(xué)性能以不同速率隨時(shí)間變化的現(xiàn)象的染料可被選用于本發(fā)明所要求保護(hù)的方法。光學(xué)性能的相對(duì)變化速率與特定多核苷酸是否存在或存在的量相關(guān)。E.光刺激光刺激可被提供給樣品、核酸類似物和染料混合物，可與混合物的產(chǎn)生同時(shí)提供，或者可在混合物產(chǎn)生后的特定時(shí)刻提供。光刺激導(dǎo)致染料光學(xué)性能變化速率的變化。光刺激可以是可見光譜中的，或者是可見光譜以外的。光刺激可以是多種波長(zhǎng)的白光?；蛘?，光刺激可以是特定波長(zhǎng)的，或是具有波長(zhǎng)范圍的。光刺激也可以具有特定強(qiáng)度。光源是本領(lǐng)域已知的。不同的光源會(huì)導(dǎo)致不同的反應(yīng)速率，因?yàn)楣庠吹膹?qiáng)度或波長(zhǎng)不同。光源的例子包括(以反應(yīng)速率升高的順序排列)SylvaniaCoolWhiteT8-CW、GeneralElectricT8-C50和FritzAurora50/50。其它光源包括SylvaniaduluxS9WCF9DS/藍(lán)和OsramF9TT/50K，它們都能導(dǎo)致比GeneralElectricT8-C50更快的光刺激反應(yīng)速率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，針對(duì)特定染料、或特定核酸類似物、多核苷酸以及染料混合物，不用進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)，就能確定出最優(yōu)的光刺激。還可針對(duì)特定混合物測(cè)試出單獨(dú)的一套溫度和濃度條件。IV.形成目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體可用多種雜交流程來(lái)進(jìn)行對(duì)目標(biāo)多核苷酸的檢測(cè)分析。在一種形式中，可以通過目標(biāo)多核苷酸與核酸類似物直接雜交，形成目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體，來(lái)鑒定多核苷酸序列。在一種形式中，核酸類似物可以是PNA。PNA/PNA的距離(distance)與DNA/DNA距離和PNA/DNA距離有所不同。PNA/PNA與PNA/DNA雙鏈雜交體的具體結(jié)構(gòu)已被NMR和X-射線晶體分析給出。PNA/PNA雙鏈雜交體具有非常寬且深的大溝，以及非常窄且淺的小溝，該雙鏈體具有非常大的每周為18個(gè)堿基對(duì)的螺距(pitch)以及非常大的螺距高度(57.6)。就DNA/DNA雙鏈雜交體而言，規(guī)范的B型螺旋(helix)具有每周為10個(gè)堿基對(duì)的螺距，螺距高度為34，而PNA/DNA雙鏈雜交體具有每周13個(gè)堿基對(duì)的螺距，螺距高度為42。因?yàn)镻NA/DNA雙鏈雜交體的堿基對(duì)較之DNA雙螺旋具有不同的幾何學(xué)特性，人們認(rèn)為，PNA/DNA雙鏈雜交體的堆積(stacking)相互作用的強(qiáng)度與DNA/DNA雙鏈雜交體不同。10、12和16mer的PNA/DNA雙鏈雜交體的CD譜暗示了這些雙鏈雜交體的不同的堿基構(gòu)型。染料與核酸類似物/多核苷酸雜交體的結(jié)合位點(diǎn)可對(duì)反應(yīng)是否進(jìn)行產(chǎn)生影響，這取決于染料。例如，與雜交體的大溝或小溝結(jié)合的染料可能需要雜交體含有一定量的堿基對(duì)，以進(jìn)行有效結(jié)合。堿基對(duì)的最小數(shù)目可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。在一個(gè)方面，目標(biāo)核酸類似物分子與部分互補(bǔ)的核酸類似物互補(bǔ)。核酸類似物同時(shí)與核酸類似物分子及目標(biāo)多核苷酸雜交，如圖18A所示。這可在一步或多步過程中完成。在一步過程中，目標(biāo)多核苷酸和核酸類似物于一個(gè)步驟中組合。在多步過程中，目標(biāo)多核苷酸和核酸類似物依序組合。在另一個(gè)方面，可通過形成分支反應(yīng)的十字架型結(jié)構(gòu)，來(lái)檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的存在，其例子如圖18B所示。在該形式中，目標(biāo)多核苷酸與兩種中間產(chǎn)物多核苷酸雜交，后二者是與目標(biāo)多核苷酸部分互補(bǔ)的。中間產(chǎn)物多核苷酸形成帶分支的結(jié)構(gòu)，其與目標(biāo)多核苷酸和最初的核酸類似物分子雜交。可對(duì)中間產(chǎn)物多核苷酸的目標(biāo)雜交區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其短到不能令染料與核酸類似物分子單獨(dú)結(jié)合，但是又要足夠長(zhǎng)以便能在雜交時(shí)結(jié)合核酸類似物分子。然后對(duì)染料光學(xué)變化速率加以測(cè)定。在一種實(shí)施方式中，單個(gè)核酸類似物分子可以是用于所有分析中的通用核酸類似物，已針對(duì)染料光學(xué)性能有效變化對(duì)其進(jìn)行了最優(yōu)化。通用核酸類似物可被用于任何目標(biāo)核酸，中間產(chǎn)物序列可被改動(dòng)。可將該流程改造為使用被固定的核酸類似物的形式。在另一種形式中，多種核酸類似物分子在目標(biāo)多核苷酸的相鄰區(qū)域形成核酸類似物/多核苷酸雜交體。在該形式中，每種核酸類似物分子都短到不能令染料結(jié)合并導(dǎo)致染料光學(xué)性能的速率變化，但是多種核酸類似物分子可以提供足夠大到能獲得光學(xué)性能變化速率的區(qū)域。如圖18C所示，作為單個(gè)分子的目標(biāo)多核苷酸可與三條與相鄰序列雜交的單獨(dú)的核酸類似物分子結(jié)合，形成核酸類似物/多核苷酸雙鏈體。但是，如果中心核酸類似物分子不能雜交，如圖18D所示，可能就不會(huì)觀察到光學(xué)性能的變化。在這種形式中，核酸類似物分子中的一種可被固定。V.對(duì)目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行定量本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可被用于對(duì)樣品中目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行定量。在一種實(shí)施方式中，可通過下述方法對(duì)目標(biāo)多核苷酸的含量進(jìn)行檢測(cè)配制核酸類似物分子的一系列稀釋液，加入各種含量的目標(biāo)多核苷酸樣品，將樣品與已知濃度的對(duì)照品進(jìn)行比較。在另一種實(shí)施方式中，可通過如下方法來(lái)對(duì)目標(biāo)多核苷酸的含量進(jìn)行檢測(cè)配制目標(biāo)多核苷酸的一系列稀釋液，加入各種含量的核酸類似物分子，將樣品與已知濃度的對(duì)照品進(jìn)行比較。或者，可通過基于時(shí)間的動(dòng)力學(xué)分析，來(lái)檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的含量。對(duì)組合起來(lái)的混合物中染料的測(cè)量可以以規(guī)律間隔進(jìn)行于對(duì)混合物的制備之后，或應(yīng)用光刺激之后?？稍诨旌衔锝M合起來(lái)后，或應(yīng)用光刺激后，于特定時(shí)間來(lái)對(duì)染料進(jìn)行檢測(cè)。時(shí)間可以是任何的時(shí)間段，例如，針對(duì)光學(xué)性能變化的總的時(shí)間，或光學(xué)性能已發(fā)生了某個(gè)百分比的變化所需的時(shí)間，該百分比例如但不限于，大約20％?？蓪?duì)反應(yīng)體系進(jìn)行冷凍(進(jìn)一步的變化被停止)，例如，通過加入溶劑來(lái)進(jìn)行，例如，20％甲醇、15％異丙醇、15％DMSO或10％丁醇。反應(yīng)還可以包括一個(gè)范圍內(nèi)的緩沖液和溶劑。上述緩沖液和溶劑包括磷酸緩沖液、水、0.1％SDS、0.1％TritonX、0.1％Tween-20、3％丁醇、10％甲醇、10％異丙醇、10％DMSO、1X血液裂解緩沖液(0.15MNH4Cl、10mMNaHCO3、0.1mMEDTApH7.4)和蔗糖裂解緩沖液(0.32M蔗糖、10mMTris、1％Triton-X-100、5mMMgCl2)?？稍诒┞督o光刺激后再測(cè)定樣品中多核苷酸的量?？稍诒┞督o光刺激之前就開始對(duì)染料光學(xué)性能的變化進(jìn)行測(cè)量，用作為起始光學(xué)性能。暴露給光刺激之后，可在特定的時(shí)間(例如，取30秒的間隔)來(lái)進(jìn)行測(cè)量?？砂瓷衔乃鰧?duì)反應(yīng)體系進(jìn)行冷凍(進(jìn)一步的變化被停止)?？赏ㄟ^多種方法來(lái)觀察到由于暴露給光刺激所造成的樣品變化。光學(xué)性能的變化可作為顏色、吸光度、熒光、反射率、化學(xué)發(fā)光或其組合的變化被觀察到?；蛘撸捎米x出裝置(reader)來(lái)讀出光學(xué)性能的變化。可以用分光光度計(jì)，例如TecanGenios或者TecanSafire來(lái)測(cè)量該變化。特定的波長(zhǎng)可被觀察到，例如，通過濾光器來(lái)進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照展示出了較陰性試驗(yàn)更快的吸光度變化。其可作為變化速率的差異，或在設(shè)定時(shí)間處變化的差異被測(cè)量到。如果使用光刺激，并觀察熒光性能，那么提供給樣品的光刺激就比觀察到的發(fā)射光具有更高的能量(更低的波長(zhǎng))。激發(fā)可以在，例如535nm處，發(fā)射光可以在590nm處讀出。熒光可作為變化速率的差異，或在設(shè)定時(shí)間處變化的差異被測(cè)量到。此外，混合物可以具有發(fā)生于暴露給光刺激之前的變化。該差異可以在分光光度分析系統(tǒng)、熒光發(fā)射系統(tǒng)或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中被觀察到。VI.分析形式A.基于液體的分析系統(tǒng)如實(shí)施例1-4所示，用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的方法和分析系統(tǒng)可以是基于液體的。樣品、能以序列特異性方式與多核苷酸的目標(biāo)核酸序列結(jié)合的核酸類似物、存在和不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體時(shí)期光學(xué)性能變化速率會(huì)有所不同的染料被組合起來(lái)，產(chǎn)生液體溶液中的混合物。將混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能的變化速率所特有的參照值進(jìn)行比較，以測(cè)定光學(xué)術(shù)性的相對(duì)變化速率，所述類似混合物中含有已知量的核酸類似物/多核苷酸雜交體?；旌衔镏腥玖瞎鈱W(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中特定多核苷酸是否存在或存在的量相關(guān)，這樣來(lái)測(cè)定樣品中是否存在多核苷酸或存在的量。本發(fā)明的方法和分析系統(tǒng)還可被制備于任何容器中，例如微離心管、試管和通過表面張力裝有液體的芯片。本發(fā)明的方法和分析系統(tǒng)還可被制備于多孔板中。所述的板可以含有任何數(shù)量的孔。在一種形式中，使用96孔板。在另一種形式中，使用384孔板。當(dāng)分析實(shí)驗(yàn)以微孔形式進(jìn)行時(shí)，液體保留于微滴定板的每個(gè)孔中。B.基于固體支持物的分析系統(tǒng)本發(fā)明的方法和分析系統(tǒng)可以是基于固體的(例如，一種或多種組分被固定于固體支持物上)。最為常見地，核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸被固定?？梢栽谄渖线B接核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸的固體支持物有很多種類型，其包括但不限于鑄膜(castmembranes)(硝酸纖維素、尼龍)、陶瓷制品、痕跡刻蝕膜(TEM)、聚偏二氟乙烯、膠乳、順磁性珠粒、所有類型的塑料支持物、玻璃；支持物基質(zhì)上的粉狀硅土或礬土。如果使用柵格模式，核酸類似物分子/固體支持物就形成了微陣列。在另一種變化中，可對(duì)核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸分子進(jìn)行共價(jià)修飾，以使其包括連接部分，例如生物素或酰胺鍵，其被固定到膜上。在又一種變化中，可通過與一條或多條序列進(jìn)行序列特異性雜交來(lái)固定核酸類似物或目標(biāo)多核苷酸分子。圖17示出了對(duì)核酸類似物進(jìn)行的光刺激激活的、表面固定的檢測(cè)的示意圖。A)鏈親合素孔。B)將生物素化的核酸類似物加入到孔中，并允許其連接到支持物上。C)對(duì)該孔進(jìn)行洗滌，移去過量的核酸類似物。D)加入樣品多核苷酸，特定序列目標(biāo)連接到互補(bǔ)的核酸類似物上。E)洗去非特異性多核苷酸和過量的多核苷酸。F)加入染料，暴露給光刺激。將核酸類似物分子連接到支持物上的任何手段都被包括于本發(fā)明中。在一個(gè)方面，核酸類似物可以直接連接到膜上。核酸類似物可以是PNA(例如，AGiger，LesterA，KleiberJ，andOrumH，1998，PNAarraytechnologyinmoleculardiagnostics.NucleotidesandNucleoside，17(1717-1724))。可簡(jiǎn)單地將核酸類似物的(水)溶液施加到帶電荷或經(jīng)化學(xué)修飾的過濾器，并對(duì)其進(jìn)行空氣干燥。然后將過濾器用于雜交。在另一個(gè)方面，經(jīng)過生物素標(biāo)記的核酸類似物分子可被連接到涂有鏈親合素的表面上，例如珠?；蚩?見，例如，Chandler，D.P.，Stults，J.R.，Anderson，K.K.，Cebula，S.，Schuck，B.L.，andBrockman，F(xiàn).J.2000.AffinityCaptureandRecoveryofDNAatFemtomolarConcentrationswithPeptideNucleicAcidProbes.AnalyticalBiochem.283241-249)。經(jīng)過生物素標(biāo)記的核酸類似物分子與經(jīng)過鏈親合素標(biāo)記的膠乳或聚碳酸酯珠?；旌稀Ｉ锼嘏c鏈親合素緊密結(jié)合，使得核酸類似物分子可以以非定向的方式與珠粒結(jié)合。然后將珠粒施加到不帶電荷的膜上，所述的膜具有比珠粒直徑大25-30％的孔徑。珠粒被捕獲于網(wǎng)孔中，因此制得了“結(jié)合有核酸類似物分子的”局部區(qū)域。用標(biāo)準(zhǔn)的9-芴甲氧羰基(Fmoc)蛋白質(zhì)合成化學(xué)方法，可在固體支持物上，例如聚丙烯膜上，對(duì)核酸類似物分子進(jìn)行直接合成(見，例如，MatysiakS.，ReuthnerF.，andHoheiselJD.2001Automatingparallelpeptidesynthesisfortheproductionofnucleicacidanaloglibraryarrays，BioTechniques31896-904)。在另一個(gè)方面，通過將含有核酸類似物分子的水溶液直接施加到玻璃或其它支持物上并使其經(jīng)歷空氣干燥，可將核酸類似物分子固定到玻璃或其它固體支持物上。在一種變化中，核酸類似物分子被設(shè)計(jì)為能產(chǎn)生正電荷，其可以與帶有負(fù)電荷的膜連接。例如，在核酸類似物分子的5’或3’末端的帶正電荷的賴氨酸或甘氨酸可被用于將核酸類似物分子連接到帶負(fù)電荷的尼龍膜上。帶負(fù)電荷的膜會(huì)抵制與核酸類似物不互補(bǔ)和/或不精確互補(bǔ)的任何核酸，因此使得非特異性結(jié)合最小化?？梢酝ㄟ^基于固體支持物的系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)任何目標(biāo)多核苷酸，或目標(biāo)多核苷酸的組。在這種情況下，固體支持物含有多種核酸類似物分子，其被固定于固體支持物上。固體支持物上還可以包括對(duì)照核酸類似物，其不能形成核酸類似物/多核苷酸雜交體分子，不能雜交?；诠腆w支持物的分析系統(tǒng)可被用于檢測(cè)至少一種目標(biāo)多核苷酸。在其它的變化中，基于固體支持物的分析系統(tǒng)檢測(cè)或測(cè)量至少大約8種、至少大約10種、至少大約20種、至少大約30種、至少大約40種、至少大約50種或至少大約60種不同的目標(biāo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種變化中，基于固體支持物的系統(tǒng)檢測(cè)及區(qū)分60或更多種的目標(biāo)多核苷酸。非限制性地舉例而言，圖3中示出了使用膜作為固體支持物的基于固體支持物的分析系統(tǒng)。該分析用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的存在。該系統(tǒng)允許在數(shù)分鐘內(nèi)對(duì)小量特定目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定和/或定量，并給出可見信號(hào)(例如，粉紅色變澄清的速率)，而無(wú)需大量設(shè)備即可進(jìn)行。在非常迅速的樣品裂解、雜交和引入染料后，提供光刺激，觀察膜上帶顏色圖案的變化速率。膜上帶顏色條帶的圖案的變化速率使得使用者易于確定目標(biāo)多核苷酸的存在與否及對(duì)其進(jìn)行鑒定?？蛇x地，可在裝有小電池的手持式儀器中來(lái)進(jìn)行該方法或其變化。在自動(dòng)機(jī)器人系統(tǒng)中，所有步驟都可由機(jī)器完成，無(wú)需人力介入。基于固體支持物的分析系統(tǒng)可以處于微滴定板的裝置中。本領(lǐng)域已知的任何微滴定板都可使用。在此類分析系統(tǒng)中，分析系統(tǒng)的組件可以用于保留液體。在一種形式中，使用96孔板。在另一種形式中，使用384孔板。當(dāng)分析是微滴定板的形式時(shí)，所有組分(除了與固體表面結(jié)合的那些)以液體形式保留于微滴定板的每個(gè)孔中。VII.目標(biāo)多核苷酸和目標(biāo)多核苷酸的來(lái)源目標(biāo)多核苷酸可以是任何多核苷酸，包括天然存在的、合成的或擴(kuò)增出的。其它類型的多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。目標(biāo)多核苷酸的非限制性例子包括DNA、RNA、調(diào)控RNA、mRNA、調(diào)控小分子RNA、siRNA、人工RNA和嵌合RNA。目標(biāo)多核苷酸的其它非限制性例子包括表觀基因組DNA、表觀遺傳化DNA、體外擴(kuò)增出的DNA或嵌合DNA。目標(biāo)多核苷酸可以含有SNPs，可通過本文公開的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定和定量。本文描述的方法、系統(tǒng)和分析具有多種用途。這些用途的非限制性例子包括對(duì)生物、病原體(例如食物來(lái)源的病原體、環(huán)境病原體、水傳播的病原體或農(nóng)業(yè)恐怖攻擊中包含的病原體)進(jìn)行檢測(cè)和定量。其它非限制性的用途包括疾病診斷(例如對(duì)性傳播疾病的診斷)、對(duì)帶來(lái)抗生物抗性的基因進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)有效藥物應(yīng)答中涉及到的基因進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)經(jīng)遺傳修飾的生物進(jìn)行檢測(cè)以及對(duì)非本地植物或動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。另外的非限制性的應(yīng)用包括農(nóng)業(yè)應(yīng)用和獸醫(yī)應(yīng)用。下面描述的例子用于闡述而非用于限制。A.病原體在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)病原體是否存在和/或宿主是否被病原體感染的方法、組合物和分析系統(tǒng)。通常，通過對(duì)樣品中目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)病原體是否存在和/或宿主中是否存在病原體。更具體地，本發(fā)明涉及用于分析目標(biāo)多核苷酸的方法、物質(zhì)組合物和分析系統(tǒng)，其是通過與核酸類似物分子進(jìn)行序列特異性雜交以及加入染料形成混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然后對(duì)染料光學(xué)性能的變化速率進(jìn)行觀察，以檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量。可通過本發(fā)明的方法和分析系統(tǒng)檢測(cè)到的病原體或宿主中存在的病原體的例子包括但不限于Staphylococcusepidermidis、Escherichiacoli、具有甲氧苯青霉素抗性的Staphylococcusaureus(MSRA)、Staphylococcusaureus、Staphylococcushominis、Enterococcusfaecalis、Pseudomonasaeruginosa、Staphylococcuscapitis、Staphylococcuswarneri、Klebsiellapneumoniae、Haemophilusinflunzae、Staphylococcussimulans、Streptococcuspneumoniae和Candidaalbicans。另外的例子包括但不限于Bacillusanthracis(炭疽病)、Clostridiumbotulinum(肉毒桿菌中毒)、Brucellae(普魯氏菌病)、Vibriocholera(霍亂)、Clostridiumperfringens(氣性壞疽、梭菌性肌炎、壞死性腸炎)、Ebola病毒(埃博拉出血熱)、Yersiniapesits(瘟疫)、Coxiellaburnetii(Q熱)和天花病毒(天花)。在一種優(yōu)選的變化中，對(duì)由Bacillusanthracis造成的感染進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)Bacillusanthracis的宿主應(yīng)答多核苷酸的例子包括但不限于MockM，MignotT.Anthraxtoxinsandthehostastoryofintimacy.CellMicrobiol.2003Jan；5(1)15-23.和ReedDS，SmollJ，GibbsP，LittleSF.RelatedArticles，LinksMappingofantibodyresponsestotheprotectiveantigenofBacillusanthracisbyflowcytometricanalysis.Cytometry.2002Sep1；49(1)1-7公開的那些，或者很容易由本領(lǐng)域已知的方法獲得的那些?？苫谄淠繕?biāo)多核苷酸，將病原體與其它病原體區(qū)分開來(lái)。特定的病原體具有特定的目標(biāo)多核苷酸，這是不會(huì)在其它病原體中發(fā)現(xiàn)的。核酸類似物分子被設(shè)計(jì)為與用于鑒定特定病原體的一種或多種目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)或精確互補(bǔ)。當(dāng)與病原體的目標(biāo)多核苷酸接觸時(shí)，核酸類似物分子會(huì)與含有目標(biāo)多核苷酸的多核苷酸雜交，而不會(huì)與不含目標(biāo)多核苷酸的多核苷酸雜交。因此可將含有目標(biāo)多核苷酸的特定病原體與不含目標(biāo)多核苷酸的病原體區(qū)分開。此外，可以區(qū)分開相同病原體的不同株系。相同病原體的不同株系具有不同的多核苷酸序列。通常，這種差異小到只涉及單個(gè)的核苷酸。核酸類似物分子被設(shè)計(jì)為與用于鑒定病原體特定株系的一種或多種目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)或精確互補(bǔ)。當(dāng)與病原體的目標(biāo)多核苷酸接觸時(shí)，核酸類似物分子會(huì)與含有目標(biāo)多核苷酸的多核苷酸雜交，而不會(huì)與不含目標(biāo)多核苷酸的多核苷酸雜交。當(dāng)目標(biāo)多核苷酸是特異于特定病原體株系的時(shí)候，核酸類似物分子會(huì)與該病原體株系含有的目標(biāo)多核苷酸雜交，而不會(huì)與不同株系的目標(biāo)多核苷酸雜交。下面列出了具有臨床重要性的病原體的例子，以及用于基于PCR的檢測(cè)的對(duì)照的例子。核酸類似物分子可被設(shè)計(jì)為具有特定病原體PCR引物序列的序列，并可與本文所述的本發(fā)明的多種實(shí)施方式組合使用。在一種實(shí)施方式中，病原體可以是Staphylococcusepidermidis。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcusepidermidis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Francois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，andJ.Schrenzel.2003.RapidDetectionofMethicillin-ResistantStaphylococcusaureusDirectlyfromSterileorNonsterileClinicalSamplesbyaNewMolecularAssay.JClinMicrobiol41(1)254-60.，F(xiàn)itzpatrick，F(xiàn).，H.Humphreys，E.Smyth，C.A.Kennedy，andJ.P.O′Gara.2002.EnvironmentalregulationofbiofilmformationinintensivecareunitisolatesofStaphylococcusepidermidis.JHospInfect52(3)212-8.和Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，andG.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-encodinggeneasausefultaxonomictoolforStaphylococcusspp.JClinMicrobiol38(12)4351-5)。病原體可以是Escherichiacoli。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Escherichiacoli的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Heller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，andJ.Cattani.2003.ComparisonofMethodsforDNAIsolationfromFoodSamplesforDetectionofShigaToxin-ProducingEscherichiacolibyReal-TimePCR.ApplEnvironMicrobiol69(3)1844-6.，Rahman，H.2002.MultiplexPCRfordetectionofstxgenesofEscherichiacoli.IndianJMedRes115251-4.和Frahm，E.，andU.Obst.2003.Applicationofthefluorogenicprobetechnique(TaqManPCR)tothedetectionofEnterococcusspp.andEscherichiacoliinwatersamples.JMicrobiolMethods52(1)123-31)。病原體可以是具有甲氧苯青霉素抗性的Staphylococcusaureus(MSRA)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcusaureus(MSRA)的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如(vanLeeuwen，W.B.，C.vanPelt，A.Luijendijk，H.A.Verbrugh，andW.H.Goessens.1999.RapiddetectionofmethicillinresistanceinStaphylococcusaureusisolatesbytheMRSA-screenlatexagglutinationtest.JClinMicrobiol37(9)3029-30.，F(xiàn)rancois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，andJ.Schrenzel.2003.RapidDetectionofMethicillin-ResistantStaphylococcusaureusDirectlyfromSterileorNonsterileClinicalSamplesbyaNewMolecularAssay.JClinMicrobiol41(1)254-60和Tsuruoka，M.，andI.Karube.2003.RapidhybridizationathighsaltconcentrationanddetectionofbacterialDNAusingfluorescencepolarization.CombChemHighThroughputScreen6(3)225-34)。病原體可以是Candida。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Candida的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如(Ahmad，S.，Z.Khan，A.S.Mustafa，andZ.U.Khan.2002.SeminestedPCRfordiagnosisofcandidemiacomparisonwithculture，antigendetection，andbiochemicalmethodsforspeciesidentification.JClinMicrobiol40(7)2483-9和Tirodker，U.H.，J.P.Nataro，S.Smith，L.LasCasas，andK.D.Fairchild.2003.Detectionoffungemiabypolymerasechainreactionincriticallyillneonatesandchildren.JPerinatol23(2)117-22)。病原體可以是Candidaalbicans。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Candidaalbicans的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如White，P.L.，A.Shetty，andR.A.Barnes.2003.DetectionofsevenCandidaspeciesusingtheLight-Cyclersystem.JMedMicrobiol52(Pt3)229-38.，Grijalva，M.，R.Horvath，M.Dendis，J.Erny，andJ.Benedik.2003.Moleculardiagnosisofculturenegativeinfectiveendocarditisclinicalvalidationinagroupofsurgicallytreatedpatients.Heart89(3)263-8.和Willinger，B.，A.Obradovic，B.Selitsch，J.Beck-Mannagetta，W.Buzina，H.Braun，P.Apfalter，A.M.Hirschl，A.Makristathis，andM.Rotter.2003.Detectionandidentificationoffungifromfungusballsofthemaxillarysinusbymoleculartechniques.JClinMicrobiol41(2)581-5.)。病原體可以是Staphylococcusaureus。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcusaureus的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Francois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，andJ.Schrenzel.2003.RapidDetectionofMethicillin-ResistantStaphylococcusaureusDirectlyfromSterileorNonsterileClinicalSamplesbyaNewMolecularAssay.JClinMicrobiol41(1)254-60.，Palomares，C.，M.J.Torres，A.Torres，J.Aznar，andJ.C.Palomares.2003.RapiddetectionandidentificationofStaphylococcusaureusfrombloodculturespecimensusingreal-timefluorescencePCR.DiagnMicrobiolInfectDis45(3)183-9.和Xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，andM.J.Crowe.2003.Employmentofbroad-range16SrRNAPCRtodetectaetiologicalagentsofinfectionfromclinicalspecimensinpatientswithacutemeningitis--rapidseparationof16SrRNAPCRampliconswithouttheneedforcloning.JApplMicrobiol94(2)197-206.)。病原體可以是Staphylococcushominis。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcushominis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Marsou，R.，M.Bes，Y.Brun，M.Boudouma，L.Idrissi，H.Meugnier，J.Freney，andJ.Etienne.2001.Moleculartechniquesopenupnewvistasfortypingofcoagulase-negativestaphylococci.PatholBiol(Paris)49(3)205-15.，Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，andG.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-encodinggeneasausefultaxonomictoolforStaphylococcusspp.JClinMicrobiol38(12)4351-5.和Wieser，M.，andH.J.Busse.2000.RapididentificationofStaphylococcusepidermidis.IntJSystEvolMicrobiol50Pt31087-93.)。病原體可以是Enterococcusfaecalis。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Enterococcusfaecalis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Hudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，andL.M.Hiott.2003.Anomaliesinspeciesidentificationofenterococcifromveterinarysourcesusingacommercialbiochemicalidentificationsystem.LettApplMicrobiol36(4)245-50.，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F(xiàn).Angulo，andM.J.Zervos.2003.Molecularcharacterizationofgentamicin-resistantEnterococciintheUnitedStatesevidenceofspreadfromanimalstohumansthroughfood.JClinMicrobiol41(3)1109-13.和Gauduchon，V.，L.Chalabreysse，J.Etienne，M.Celard，Y.Benito，H.Lepidi，F(xiàn).Thivolet-Bejui，andF.Vandenesch.2003.MoleculardiagnosisofinfectiveendocarditisbyPCRamplificationanddirectsequencingofDNAfromvalvetissue.JClinMicrobiol41(2)763-6.)。病原體可以是Pseudomonasaeriginosa。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Pseudomonasaeriginosa的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Corbella，M.E.，andA.Puyet.2003.Real-TimeReverseTranscription-PCRAnalysisofExpressionofHalobenzoateandSalicylateCatabolism-AssociatedOperonsinTwoStrainsofPseudomonasaeruginosa.ApplEnvironMicrobiol69(4)2269-75.，Agarwal，G.，A.Kapil，S.K.Kabra，R.Chandra，B.Das，andS.N.Diwedi.2002.Phenotypic&genotypicvariantsofPseudomonasaeruginosaisolatedfromchildrenwithcysticfibrosisinIndia.IndianJMedRes11673-81.和Dabrowski，W.，U.Czekajlo-Kolodziej，D.Medrala，andS.Giedrys-Kalemba.2003.OptimisationofAP-PCRfingerprintingdiscriminatorypowerforclinicalisolatesofPseudomonasaeruginosa.FEMSMicrobiolLett218(1)51-7.)。病原體可以是Staphylococcuscapitis。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcuscapitis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Wieser，M.，andH.J.Busse.2000.RapididentificationofStaphylococcusepidermidis.IntJSystEvolMicrobiol50Pt31087-93.和Martineau，F(xiàn).，F(xiàn).J.Picard，P.H.Roy，M.Ouellette，andM.G.Bergeron.1996.Species-specificandubiquitousDNA-basedassaysforrapididentificationofStaphylococcusepidermidis.JClinMicrobiol34(12)2888-93.)。病原體可以是Staphylococcuswarneri。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcuswarneri的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Wieser，M.，andH.J.Busse.2000.RapididentificationofStaphylococcusepidermidis.IntJSystEvolMicrobiol50Pt31087-93.和Sashihara，T.，H.Kimura，T.Higuchi，A.Adachi，H.Matsusalci，K.Sonomoto，andA.Ishizalci.2000.Anovelantibiotic，nukacinISK-1，ofStaphylococcuswarneriISK-1cloningofthestructuralgeneandidentificationofthestructure.BiosciBiotechnolBiochem64(11)2420-8.)。病原體可以是Klebsiellapneumoniae。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Klebsiellapneumoniae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Perez-Perez，F(xiàn).J.，andN.D.Hanson.2002.Detectionofplasmid-mediatedAmpCbeta-lactamasegenesinclinicalisolatesbyusingmultiplexPCR.JClinMicrobiol40(6)2153-62，Steward，C.D.，J.K.Rasheed，S.K.Hubert，J.W.Biddle，P.M.Raney，G.J.Anderson，P.P.Williams，K.L.Brittain，A.Oliver，J.E.McGowan，Jr.，andF.C.Tenover.2001.CharacterizationofclinicalisolatesofKlebsiellapneumoniaefrom19laboratoriesusingtheNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandardsextended-spectrumbeta-lactamasedetectionmethods.JClinMicrobiol39(8)2864-72.和Carter，J.S.，andD.J.Kemp.2000.AcolorimetricdetectionsystemforCalymmatobacteriumgranulomatis.SexTransmInfect76(2)134-6.)。病原體可以是Haemophilusinflunzae。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Haemophilusinflunzae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Shoma，S.，M.Rahman，andM.Yasmin.2001.RapiddetectionofHaemophilusinfluenzaetypebinBangladeshichildrenwithpneumoniaandmeningitisbyPCRandanalysisofantimicrobialresistance.JHealthPopulNutr19(4)268-74.，Corless，C.E.，M.Guiver，R.Borrow，V.Edwards-Jones，A.J.Fox，andE.B.Kaczmarslci.2001.SimultaneousdetectionofNeisseriameningitidis，Haemophilusinfluenzae，andStreptococcuspneumoniaeinsuspectedcasesofmeningitisandsepticemiausingreal-timePCR.JClinMicrobiol39(4)1553-8.和Carter，J.S.，andD.J.Kemp.2000.AcolorimetricdetectionsystemforCalymmatobacteriumgranulomatis.SexTransmInfect76(2)134-6.)。病原體可以是Staphylococcussimulans。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Staphylococcussimulans的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，andG.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-encodinggeneasausefultaxonomictoolforStaphylococcusspp.JClinMicrobiol38(12)4351-5和Szweda，P.，R.Pladzylc，R.Kotlowslci，andJ.Kur.2001.Cloning，expression，andpurificationoftheStaphylococcussimulanslysostaphinusingtheintein-chitin-bindingdomain(CBD)system.ProteinExprPurif22(3)467-71.)。病原體可以是Streptococcuspneumoniae。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定Streptococcuspneumoniae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，andM.J.Crowe.2003.Employmentofbroad-range16SrRNAPCRtodetectaetiologicalagentsofinfectionfromclinicalspecimensinpatientswithacutemeningitis--rapidseparationof16SrRNAPCRampliconswithouttheneedforcloning.JApplMicrobiol94(2)197-206.，Greiner，O.，P.J.Day，P.P.Bosshard，F(xiàn).Imeri，M.Altwegg，andD.Nadal.2001.QuantitativedetectionofStreptococcuspneumoniaeinnasopharyngealsecretionsbyreal-timePCR.JClinMicrobiol39(9)3129-34.和Corless，C.E.，M.Guiver，R.Borrow，V.Edwards-Jones，A.J.Fox，andE.B.Kaczmarski.2001.SimultaneousdetectionofNeisseriameningitidis，Haemophilusinfluenzae，andStreptococcuspneumoniaeinsuspectedcasesofmeningitisandsepticemiausingreal-timePCR.JClinMicrobiol39(4)1553-8.)。病原體可以是冠狀病毒(一種RNA病毒)，用于檢測(cè)SARS。冠狀病毒的序列可被發(fā)現(xiàn)于，例如CenterforDiseaseControl網(wǎng)站上。這些目標(biāo)多核苷酸的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Ksiazek，T.G.，D.Erdman，C.S.Goldsmith，S.R.Zaki，T.Peret，S.Emery，S.Tong，C.Urbani，J.A.Comer，W.Lim，P.E.Rollin，S.F.Dowell，A.E.Ling，C.D.Humphrey，W.J.Shieh，J.Garner，C.D.Paddock，P.Rota，B.Fields，J.DeRisi，J.Y.Yang，N.Cox，J.M.Hughes，J.W.LeDuc，W.J.Bellini，andL.J.Anderson.2003.ANovelCoronavirusAssociatedwithSevereAcuteRespiratorySyndrome.NEnglJMed1616；Drosten，C.，S.Gunther，W.Preiser，S.VanDerWerf，H.R.Brodt，S.Becker，H.Rabenau，M.Panning，L.Kolesnikova，R.A.Fouchier，A.Berger，A.M.Burguiere，J.Cinatl，M.Eickmann，N.Escriou，K.Grywna，S.Kramme，J.C.Manuguerra，S.Muller，V.Rickerts，M.Sturmer，S.Vieth，H.D.Klenk，A.D.Osterhaus，H.Schmitz，andH.W.Doerr.2003.IdentificationofaNovelCoronavirusinPatientswithSevereAcuteRespiratorySyndrome.NEnglJMed1010)。病原體可以是Bordetellapertussis或百日咳(whoppingcough)。這些目標(biāo)多核苷酸的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中(Doucet-Populaire，F(xiàn).，N.Bourgeois，0.Charara，M.Bellaiche，F(xiàn).Richardin，J.L.Salomon，L.Berardi-Grassias，J.C.Ghnassia，andP.Foucaud.2002.[Routineuseofgeneamplificationforpertussisdiagnosisinchildren].ArchPediatr9(11)1145-52；Lingappa，J.R.，W.Lawrence，S.West-Keefe，R.Gautom，andB.T.Cookson.2002.Diagnosisofcommunity-acquiredpertussisinfectioncomparisonofbothcultureandfluorescent-antibodyassayswithPCRdetectionusingelectrophoresisordotblothybridization.JClinMicrobiol40(8)2908-12)。病原體可以是Phytophthoraramorum(櫟樹猝死病的成因)。這些目標(biāo)多核苷酸的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中(見，例如Levy，L.，andV.Mavrodieva.2003.EvaluationofthePCRDetectionandDNAisolationmethodsforuseinthePhytophthoraramorum.NationalPilotSurvey，vol.2003，可從thePurdueUniversity網(wǎng)站獲得；McPherson，B.A.，D.M.Rizzo，M.Garbelotto，P.Svihra，D.L.Wood，A.J.Storer，N.M.Kelly，N.Palkovsky，S.A.Tjosvold，R.B.Standiford，andS.T.Koike.2002.SuddenOakDeathinCalifornia，vol.2003.Home&Landscape，可從theUniversityofCaliforniaatDavis網(wǎng)站獲得)。病原體可以是諾沃克(norwalk)病毒。這些目標(biāo)多核苷酸的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中(見，例如Khan，A.S.，C.L.Moe，R.I.Glass，S.S.Monroe，M.K.Estes，L.E.Chapman，X.Jiang，C.Humphrey，E.Pon，J.K.Iskander，andetal.1994.Norwalkvirus-associatedgastroenteritistracedtoiceconsumptionaboardacruiseshipinHawaiicomparisonandapplicationofmolecularmethod-basedassays.JClinMicrobiol32(2)318-22；Herwaldt，B.L.，J.F.Lew，C.L.Moe，D.C.Lewis，C.D.Humphrey，S.S.Monroe，E.W.Pon，andR.I.Glass.1994.CharacterizationofavariantstrainofNorwalkvirusfromafood-borneoutbreakofgastroenteritisonacruiseshipinHawaii.JClinMicrobiol32(4)861-6)。病原體可以是HIV。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定HIV的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Smith，K.M.，K.A.Crandall，M.L.Kneissl，andB.A.Navia.2000.PCRdetectionofhostandHIV-1sequencesfromarchivalbraintissue.JNeurovirol6(2)164-71；Cuchacovich，R.，S.Quinet，andA.M.Santos.2003.Applicationsofpolymerasechainreactioninrheumatology.RheumDisClinNorthAm29(1)1-20，v；Cunningham，P.，D.Marriott，C.Harris，S.Hancock，A.Carr，andD.Cooper.2003.FalsenegativeHIV-1proviralDNApolymerasechainreactioninapatientwithprimaryinfectionacquiredinThailand.JClinVirol26(2)163-9)。病原體可以是Mycobacteriumtuberculosis。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有與用于鑒定tuberculosis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。這些PCR引物的例子被公開于現(xiàn)有技術(shù)中。(見，例如Torres，M.J.，A.Criado，M.Ruiz，A.C.Llanos，J.C.Palomares，andJ.Aznar.2003.Improvedreal-timePCRforrapiddetectionofrifampinandisoniazidresistanceinMycobacteriumtuberculosisclinicalisolates.DiagnMicrobiolInfectDis45(3)207-12；Bhattacharya，B.，K.Karak，A.G.Ghosal，A.Roy，S.Das，P.Dandapat，D.Khetawat，D.K.Mondal，S.Bhattacharya，andS.Chakrabarti.2003.Developmentofanewsensitiveandefficientmultiplexpolymerasechainreaction(PCR)foridentificationanddifferentiationofdifferentmycobacterialspecies.TropMedIntHealth8(2)150-7；Kafwabulula，M.，K.Ahmed，T.Nagatake，J.Gotoh，S.Mitarai，K.Oizumi，andA.Zumla.2002.EvaluationofPCR-basedmethodsforthediagnosisoftuberculosisbyidentificationofmycobacterialDNAinurinesamples.IntJTubercLungDis6(8)732-7)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為能與病原體整個(gè)組所共有的目標(biāo)多核苷酸結(jié)合。例如，可將核酸類似物設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)細(xì)菌(BP6)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(BP19)、革蘭氏陰性細(xì)菌(BP3)和真菌(FP8)。用于BP6、BP19、BP3和FP8的核酸類似物的序列的例子如下所示。BP6oI20185′gaaSSMYcYaacacYtagcact(SEQIDNo3)oI20195′tacaaMgagYYgcWagacSgYgaS(SEQIDNO4)BP19oI20215′gcagYWaacgcattaagcact(SEQIDNO5)oI20225′acgacacgagctgacgacaa(SEQIDNO6)BP3oI20035′tctagctggtctgagaggatgac(SEQIDNO7)oI20045′gagttagccggtgcttcttct(SEQIDNO8)FP8O120555′cctgcggcttaatttgactca(SEQIDNO9)O120575′tagcgacgggcggtgtgta(SEQIDNO10)核酸類似物可被用于臨床應(yīng)用，用于診斷敗血癥的微生物成因，或者用于其它應(yīng)用，其中，產(chǎn)品的微生物含量對(duì)于判斷其保質(zhì)期或穩(wěn)定性很重要，或者是用于要對(duì)其滅菌情況進(jìn)行評(píng)判的其它產(chǎn)品。目標(biāo)多核苷酸可以是特異于核糖體RNA序列的，例如E.coli中的16SRNA。核糖體RNA含有對(duì)其生物來(lái)說所特有的特定序列。通過使用與核糖體RNA序列特有的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)或精確互補(bǔ)的核酸類似物序列，可基于其核糖體RNA序列鑒定出病原體。不同病原體或病原體株系所特有的核糖體RNA序列可被發(fā)現(xiàn)于，例如(DinshawJ.Patel，AsifK.Suri，F(xiàn)engJiang，LicongJiang，PeiFanR.AjayKumarandSylvieNonin，Structure，RecognitionandAdaptiveBindinginRNAAptamerComplexesJ.Mol.Biol.(1997)272，645-664)。B.宿主應(yīng)答多核苷酸目標(biāo)多核苷酸還可以是宿主應(yīng)答多核苷酸。宿主被病原體感染后，宿主基因可能會(huì)應(yīng)答于病原體，表達(dá)發(fā)生差異，從而產(chǎn)生一種mRNA表達(dá)模式(基因表達(dá)圖，geneexpressionprofile)。其表達(dá)模式與特定病原體感染相關(guān)的宿主基因被稱為針對(duì)該誘因的“診斷標(biāo)志基因”。典型地，mRNA從樣品中的白細(xì)胞獲得。對(duì)宿主應(yīng)答和被改變的基因表達(dá)圖進(jìn)行鑒定的方法可被發(fā)現(xiàn)于，例如，1)Das，R.，Mendis，C.，Yan，Z.，Neill，R.，Boyle，T.，andJett，M.(1998)Alterationsingeneexpressionshowuniquepatternsinresponsetoagents.在Proceeingsofthe21stArmyScienceConference，F(xiàn)-P9和Mendis，C.，Das，R.，Yang，D.，andJett，M.(1998)IdentificationofalterationsingeneexpressioninresponsetoStaphylococcalenterotoxinB(SEB)usingdifferentialdisplay(DD).在theASCB38thAnnualMeeting，SanFrancisco，CA。用于檢測(cè)基因表達(dá)狀況的方法已被發(fā)展，用于診斷多種醫(yī)學(xué)條件，例如，如Eberwineetal.的U.S.5,723,290、Friendetal.的U.S.6,218,122、Yarramillietal.的WO99/10536和Prasharetal.的WO99/57130所述。簡(jiǎn)言之，該方法涉及獲得與選定條件相關(guān)的選定的細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，將其與用構(gòu)建的對(duì)照獲得的相關(guān)水平進(jìn)行比較。然后基于對(duì)mRNA表達(dá)水平的比較來(lái)進(jìn)行診斷?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的若干技術(shù)中的任何一種，從細(xì)胞中分離出mRNA，但是通常是，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后富集或純化出RNA。然后通過本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)獲知基因表達(dá)圖，這些方法包括但不限于由Prasharetal.在WO97/05286；Liangetal.在Science257967-971(1992)；Ivanovaetal.在NucleicAcidsRes.232954-2959(1995)和Prasharetal.在Proc.Natl.Acad.Sci.USA93659-663(1996)所公開的方法。典型地，上述技術(shù)使用northern分析、FRET檢測(cè)、寡核苷酸陣列雜交、cDNA陣列雜交、cDNA測(cè)序、cDNA指紋等來(lái)獲知基因表達(dá)圖。通常，基因表達(dá)圖指各種mRNA表達(dá)的示意圖，例如，可發(fā)現(xiàn)于對(duì)被標(biāo)記的cDNA片段進(jìn)行的自動(dòng)放射照相中的，所述cDNA片段產(chǎn)生自細(xì)胞總mRNA，其是通過平板凝膠(slabgel)電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、HPLC以及其它分離方法，基于大小尺寸分離出來(lái)的。本發(fā)明的分析系統(tǒng)和方法提供了另一種對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行判斷的方法。如下文進(jìn)一步所述，對(duì)mRNA表達(dá)的水平(即基因表達(dá)圖)進(jìn)行比較，或者，通過對(duì)宿主應(yīng)答mRNA與其互補(bǔ)或精確互補(bǔ)核酸類似物雜交情況的判斷，來(lái)檢測(cè)診斷標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)變化。C.食物來(lái)源的病原體和環(huán)境病原體本發(fā)明可用于檢測(cè)任何食物來(lái)源的病原體和環(huán)境病原體。食物來(lái)源的病原體包括但不限于Listeria、Campylobacter、E.coli和Salmonella。用本文公開的核酸類似物方法可以很容易地對(duì)食物來(lái)源的特定病原體進(jìn)行檢測(cè)。例如，可以容易地將Listeria與Salmonella分開。此外，可對(duì)食物來(lái)源的病原體的特定株系，例如L.monocytogenes的特定株系，進(jìn)行檢測(cè)。通過本發(fā)明的方法，可對(duì)與食物來(lái)源的病原體相關(guān)的任何目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定。如上所述，可對(duì)特定病原體和病原體株系所特有的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定。本發(fā)明可用于檢測(cè)與Listeria、Campylobacter、E.coli和Salmonella相關(guān)的目標(biāo)多核苷酸。例如，可用本文公開的方法來(lái)檢測(cè)的特定Listeria基因包括hly(李斯特溶素O，listeriolysinO)和iap(侵入相關(guān)蛋白)基因和mRNA(分別為HLYPNA和IAPPNA)?？捎帽景l(fā)明的方法，對(duì)具有與Salmonellaspp相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Salmonellaspp的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Perez-Perez，F(xiàn).J.，andN.D.Hanson.2002.Detectionofplasmid-mediatedAmpCbeta-lactamasegenesinclinicalisolatesbyusingmultiplexPCR.JClinMicrobiol40(6)2153-62.，Oliveira，S.D.，C.R.Rodenbusch，M.C.Ce，S.L.Rocha，andC.W.Canal.2003.Evaluationofselectiveandnon-selectiveenrichmentPCRproceduresforSalmonelladetection.LettApplMicrobiol36(4)217-21.和Strapp，C.M.，A.E.Shearer，andR.D.Joerger.2003.SurveyofretailalfalfasproutsandmushroomsforthepresenceofEscherichiacoilO157H7，Salmonella，andListeriawithBAX，andevaluationofthispolymerasechainreaction-basedsystemwithexperimentallycontaminatedsamples.JFoodProt66(2)182-7.)。在另一種實(shí)施方式中，可對(duì)具有與Escherichiacoli相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Escherichiacoli的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Heller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，andJ.Cattani.2003.ComparisonofMethodsforDNAIsolationfromFoodSamplesforDetectionofShigaToxin-ProducingEscherichiacolibyReal-TimePCR.ApplEnvironMicrobiol69(3)1844-6.，Rahman，H.2002.MultiplexPCRfordetectionofstxgenesofEscherichiacoli.IndianJMedRes115251-4.和Frahm，E.，andU.Obst.2003.Applicationofthefluorogenicprobetechnique(TaqManPCR)tothedetectionofEnterococcusspp.andEscherichiacoliinwatersamples.JMicrobiolMethods52(1)123-31.)。在另一種實(shí)施方式中，可對(duì)具有與Campylobacterspp.相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Campylobacterspp.的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Carter，J.S.，andD.J.Kemp.2000.AcolorimetricdetectionsystemforCalymmatobacteriumgranulomatis.SexTransmInfect76(2)134-6.，Moreno，Y.，S.Botella，J.L.Alonso，M.A.Ferrus，M.Hernandez，andJ.Hernandez.2003.SpecificdetectionofArcobacterandCampylobacterstrainsinwaterandsewagebyPCRandfluorescentinsituhybridization.ApplEnvironMicrobiol69(2)1181-6.和Bang，D.D.，A.Wedderkopp，K.Pedersen，andM.Madsen.2002.RapidPCRusingnestedprimersofthe16SrRNAandthehippuricase(hipO)genestodetectCampylobacterjejuniandCampylobactercoliinenvironmentalsamples.MolCellProbes16(5)359-69.)。在又一種實(shí)施方式中，可對(duì)具有與Bacillusspp.相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Bacillusspp.的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Mantynen，V.，andK.Lindstrom.1998.ArapidPCR-basedDNAtestforenterotoxicBacilluscereus.ApplEnvironMicrobiol64(5)1634-9.，Schraft，H.，andM.W.Griffiths.1995.Specificoligonucleotideprimersfordetectionoflecithinase-positiveBacillusspp.byPCR.ApplEnvironMicrobiol61(1)98-102.和Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，andM.R.Millar.1998.Detectionofbacteraemiainpatientswithfeverandneutropeniausingl6SrRNAgeneamplificationbypolymerasechainreaction.EurJClinMicrobiolInfectDis17(4)247-53)。還可對(duì)具有與Pseudomonasspp.相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Pseudomonasspp.的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，andM.J.Crowe.2003.Employmentofbroad-range16SrRNAPCRtodetectaetiologicalagentsofinfectionfromclinicalspecimensinpatientswithacutemeningitis--rapidseparationof16SrRNAPCRampliconswithouttheneedforcloning.JApplMicrobiol94(2)197-206，Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，andM.R.Millar.1998.Detectionofbacteraemiainpatientswithfeverandneutropeniausing16SrRNAgeneamplificationbypolymerasechainreaction.EurJClinMicrobiolInfectDis17(4)247-53和Johnsen，K.，O.Enger，C.S.Jacobsen，L.Thirup，andV.Torsvik.1999.QuantitativeselectivePCRof16SribosomalDNAcorrelateswellwithselectiveagarplatingindescribingpopulationdynamicsofindigenousPseudomonasspp.insoilhotspots.ApplEnvironMicrobiol65(4)1786-8)。還可對(duì)具有與Enterococcusspp.相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Enterococcusspp.的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如Hudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，andL.M.Hiott.2003.Anomaliesinspeciesidentificationofenterococcifromveterinarysourcesusingacommercialbiochemicalidentificationsystem.LettApplMicrobiol36(4)245-50，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F(xiàn).Angulo，andM.J.Zervos.2003.Molecularcharacterizationofgentamicin-resistantEnterococciintheUnitedStatesevidenceofspreadfromanimalstohumansthroughfood.JClinMicrobiol41(3)1109-13.和Vakulenko，S.B.，S.M.Donabedian，A.M.Voskresenskiy，M.J.Zervos，S.A.Lerner，andJ.W.Chow.2003.MultiplexPCRfordetectionofaminoglycosideresistancegenesinenterococci.AntimicrobAgentsChemother47(4)1423-6)。目標(biāo)多核苷酸還可具有與E.coliO157相應(yīng)的多核苷酸序列。特異于E.coliO157的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如PanTM，ChenLM，SuYC.IdentificationofEscherichiacoliO157H7bymultiplexPCRwithprimersspecifictothehlyA，eaeA，stx1，stx2，fliCandrfbgenes，JFormosMedAssoc.2002Sep；101(9)66l-4；BoppDJ，SaudersBD，WaringAL，AckelsbergJ，DumasN，Braun-HowlandE，DziewulskiD，WallaceBJ，KellyM，HalseT，MusserKA，SmithPF，MorseDL，LimbergerRJ.Detection，Isolation，andMolecularSubtypingofEscherichiacoliO157H7andCampylobacterjejuniAssociatedwithaLargeWaterborneOutbreak，JClinMicrobiol.2003Jan；41(1)174-80；IbekweAM，GrieveCM.DetectionandquantificationofEscherichiacoliO157H7inenvironmentalsamplesbyreal-timePCR，JApplMicrobiol.2003；94(3)421-31)。目標(biāo)多核苷酸還可具有與Listeriaspp.和L.monocytogenes相應(yīng)的多核苷酸序列。特異于Listeriaspp.和L.monocytogenes的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如VolokhovD，RasoolyA，ChumakovK，ChizhikovV.IdentificationofListeriaspeciesbymicroarray-basedassay.JClinMicrobiol.2002Dec；40(12)4720-8；CocolinL，RantsiouK，IacuminL，CantoniC，ComiG.DirectidentificationinfoodsamplesofListeriaspp.andListeriamonocytogenesbymolecularmethods.ApplEnvironMicrobiol.2002Dec；68(12)6273-82；ShearerAE，StrappCM，JoergerRD.Evaluationofapolymerasechainreaction-basedsvstemfordetectionofSalmonellaenteritidis，EscherichiacoliO157H7，Listeriaspp.，andListeriamonocytogenesonfreshfruitsandvegetables.JFoodProt.2001Jun；64(6)788-95；BubertA，HeinI，RauchM，LehnerA，YoonB，GoebelW，WagnerM.DetectionanddifferentiationofListeriaspp.byasinglereactionbasedonmultiplexPCR.ApplEnvironMicrobiol.1999Oct；65(10)4688-92；JungYS，F(xiàn)rankJF，BrackettRE，ChenJ.PolymerasechainreactiondetectionofListeriamonocytogenesonfrankfurtersusingoligonucleotideprimerstargetingthegenesencodinginternalAB.JFoodProt.2003Feb；66(2)237-41和PangalloD，KaclikovaE，KuchtaT，DrahovskaH.DetectionofListeriamonocytogenesbypolymerasechainreactionorientedtoinlBgene.NewMicrobiol.2001Oct；24(4)333-9)?？蓪?duì)具有與大腸菌(coliform)相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于大腸菌的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如CasasN，SunenE.Detectionofenteroviruses，hepatitisAviruSandrotavirusesinsewagebymeansofanimmunomagneticcapturereversetranscription-PCRassay.MicrobiolRes.2002；157(3)169-7；SchvoererE，VenturaM，DubosO，CazauxG，SerceauR，GoumierN，DuboisV，CaminadeP，F(xiàn)leuryHJ，LafonMEQualitativeandquantitativemoleculardetectionofenterovirusesinwaterfrombathingareasandfromasewagetreatmentplant；ResMicrobiol.2001Mar；152(2)179-86.BernhardAE，F(xiàn)ieldKG.Identificationofnonpointsourcesoffecalpollutionincoastalwatersbyusinghost-specific16SribosomalDNAgeneticmarkersfromfecalanaerobes.ApplEnvironMicrobiol.2000Apr；66(4)1587-94)。在另一種實(shí)施方式中，可對(duì)具有與Vibriocholerae和V.parahaemolyticus相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于Vibriocholerae和V.parahaemolyticus的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如MyersML，PanickerG，BejAK.PCRDetectionofaNewlyEmergedPandemicVibrioparahaemolyticusO3K6PathogeninPureCulturesandSeededWatersfromtheGulfofMexico.ApplEnvironMicrobiol.2003Apr；69(4)2194-200；BlackstoneGM，NordstromJL，VickeryMC，BowenMD，MeyerRF，DePaolaA.DetectionofpathogenicVibrioparahaemolyticusinoysterenrichmentsbyrealtimePCR.JMicrobiolMethods.2003May；53(2)149-155和LyonWJ.TaqManPCRfordetectionofVibriocholeraeO1，O139，non-O1，andnon-O139inpurecultures，rawoysters，andsyntheticseawater.ApplEnvironMicrobiol.2001Oct；67(10)4685-93)。在又一種實(shí)施方式中，可對(duì)具有與霉菌相應(yīng)的多核苷酸序列的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。特異于霉菌的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如ZurG，ShimoniE，HallermanE，KashiY.DetectionofAlternariafungalcontaminationincerealgrainsbyapolymerasechainreaction-basedassay.JFoodProt.2002Sep；65(9)1433-40；JimenezL，SmallsS，IgnarR.UseofPCRanalysisfordetectinglowlevelsofbacteriaandmoldcontaminationinpharmaceuticalsamples.JMicrobiolMethods.2000Aug；41(3)259-65；andVanittanalcomN，VanittanakomP，HayRJ.RapididentificationofPenicilliummarneffeibyPCR-baseddetectionofspecificsequencesontherRNAgene，JClinMicrobiol.2002May；40(5)1739-42)。目標(biāo)多核苷酸還可具有與Legionella相應(yīng)的多核苷酸序列。特異于Legionella的序列是本領(lǐng)域已知的(見，例如AokiS，HirakataY，MiyazakiY，IzumikawaK，YanagiharaK，TomonoK，YamadaY，TashiroT，KohnoS，KamihiraS.DetectionofLegionellaDNAbyPCRofwhole-bloodsamplesinamousemodel.JMedMicrobiol.2003Apr；52(Pt4)325-9；RaggamRB，LeitnerE，MuhlbauerG，BergJ，StocherM，GrisoldAJ，MarthE，KesslerHH.QualitativedetectionofLegionellaspeciesinbronchoalveolarlavagesandinducedsputabyautomatedDNAextractionandreal-timepolymerasechainreaction.MedMicrobiolImmunol(Berl).2002Oct；191(2)119-25和Alexiou-DanielS，StylianakisA，PapoutsiA，ZorbasI，PapaA，LambropoulosAF，AntoniadisA.ApplicationofpolymerasechainreactionfordetectionofLegionellapneumophilainserumsamples.ClinMicrobiolInfect.1998Mar；4(3)144-148)。還可通過對(duì)食物來(lái)源的病原體的感染的應(yīng)答來(lái)檢測(cè)宿主應(yīng)答mRNA。D.水傳播的病原體本文公開的方法還提供了一種快速且敏感的試驗(yàn)方法，用于判斷水傳播的病原體存在與否以及存在的量。水傳播的病原體包括細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物。水傳播的病原體的例子包括Enterococci、E.coli、Bacillusspp.、Psuedomonasspp、Cryptosporidium和Giardia。水傳播的病原體可以從任何水樣中獲得，其包括但不限于游泳池、有水的公園、井、家庭飲用水、水庫(kù)、海灘、湖泊、海洋、魚和貝類養(yǎng)殖場(chǎng)、農(nóng)業(yè)用水、透析用水、醫(yī)藥補(bǔ)充用水、水處理設(shè)備、郵輪、航天飛機(jī)污水和瓶裝水。用本文公開的方法可以很容易地對(duì)水傳播的病原體進(jìn)行檢測(cè)。舉例而言，可對(duì)特定株系進(jìn)行檢測(cè)。例如，可與其它株系區(qū)分開并檢測(cè)到的Enterococci的特定株系包括Enterococciavium、E.casseliflavus、E.cecorum、E.columbae、E.dispar、E.durans、E.faecium、E.faecalis、E.gallinarum、E.hirae、E.malodoratus、E.mundtii、E.pseudovium、E.raffinosus、E.saccharolyticus和E.sulfurous。通過本發(fā)明的方法可對(duì)任何與水傳播的病原體相關(guān)的多核苷酸進(jìn)行鑒定。本發(fā)明可用于檢測(cè)與Enterococcusspp.，E.coli，Bacillusspp.和Psuedomonasspp.相關(guān)的基因，其已被描述(見，例如EscherichiacoliHeller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，andJ.Cattani.2003，ComparisonofMethodsforDNAIsolationfromFoodSamplesforDetectionofShigaToxin-ProducingEscherichiacolibyReal-TimePCR.ApplEnvironMicrobiol69(3)1844-6.；Rahman，H.2002.MultiplexPCRfordetectionofstxgenesofEscherichiacoli.IndianJMedRes115251-4.和Frahm，E.，andU.Obst.2003.Applicationofthefluorogenicprobetechnique(TaqManPCR)tothedetectionofEnterococcusspp.andEscherichiacoliinwatersamples.JMicrobiolMethods52(1)123-31.BacillussppMantynen，V.，andK.Lindstrom.1998.ArapidPCR-basedDNAtestforenterotoxicBacilluscereus.ApplEnvironMicrobiol64(5)1634-9.，Schaft，H.，andM.W.Griffiths.1995.Specificoligonucleotideprimersfordetectionoflecithinase-positiveBacillusspp.byPCR.ApplEnvironMicrobiol61(1)98-102.和Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，andM.R.Millar.1998.Detectionofbacteraemiainpatientswithfeverandneutropeniausing16SrRNAgeneamplificationbypolymerasechainreaction.EurJClinMicrobiolInfectDis17(4)247-53.PseudomonassppXu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，andM.J.Crowe.2003.Employmentofbroad-range16SrRNAPCRtodetectaetiologicalagentsofinfectionfromclinicalspecimensinpatientswithacutemeningitis-rapidseparationof16SrRNAPCRampliconswithouttheneedforcloning.JApplMicrobiol94(2)197-206.，Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，andM.R.Millar.1998.Detectionofbacteraemiainpatientswithfeverandneutropeniausing16SrRNAgeneamplificationbypolymerasechainreaction.EurJClinMicrobiolInfectDis17(4)247-53.和Johnsen，K.，O.Enger，C.S.Jacobsen，L.Thirup，andV.Torsvik.1999.QuantitativeselectivePCRof16SribosomalDNAcorrelateswellwithselectiveagarplatingindescribingpopulationdynamicsofindigenousPseudomonasspp.insoilhotspots.ApplEnvironMicrobiol65(4)1786-8.EnterococcussppHudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，andL.M.Hiott.2003.Anomaliesinspeciesidentificationofenterococcifromveterinarysourcesusingacommercialbiochemicalidentificationsystem.LettApplMicrobiol36(4)245-50.，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F(xiàn).Angulo，andM.J.Zervos.2003.Molecularcharacterizationofgentamicin-resistantEnterococciintheUnitedStatesevidenceofspreadfromanimalstohumansthroughfood.JClinMicrobiol41(3)1109-13.，andVakulenko，S.B.，S.M.Donabedian，A.M.Voskresenskiy，M.J.Zervos，S.A.Lerner，andJ.W.Chow.2003.MultiplexPCRfordetectionofaminoglycosideresistancegenesinenterococci.AntimicrobAgentsChemother47(4)1423-6)。例如，可通過本文公開的方法進(jìn)行檢測(cè)的特定的Enterococci基因包括Enterococci中保守的16S核糖體RNA序列。還可通過其對(duì)水傳播病原體造成的感染的應(yīng)答，來(lái)檢測(cè)宿主應(yīng)答mRNA。E.農(nóng)業(yè)恐怖攻擊核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)農(nóng)業(yè)恐怖攻擊中涉及的病原體進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。下面列出了具有臨床重要性的病原體的例子，以及用于基于PCR的檢測(cè)的參照的例子。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有特定PCR引物序列的序列，并可與本文所述的發(fā)明的很多種實(shí)施方式組合使用。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為，例如，具有用于對(duì)Toxoplasmagondii進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。Toxoplasmagondii具有非常低的宿主特異性，可能會(huì)感染幾乎所有的哺乳動(dòng)物。已有報(bào)道稱其來(lái)自鳥類，事實(shí)上其已被發(fā)現(xiàn)于世界上每一個(gè)國(guó)家。與Apicomplexa中的大多數(shù)一樣，Toxoplasma(弓形蟲)是專性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。在感染了Toxoplasma的人類中的大多數(shù)中，該疾病是沒有癥狀的。但是，在某些條件下，弓形蟲病能導(dǎo)致嚴(yán)重的病理，包括肝炎、肺炎、失明和嚴(yán)重的神經(jīng)紊亂。用于對(duì)Toxoplasmagondii進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Aspinall，T.V.，D.Marlee，J.E.Hyde，andP.F.Sims.2002.PrevalenceofToxoplasmagondiiincommercialmeatproductsasmonitoredbvpolymerasechainreaction--foodforthought？IntJParasitol32(9)1193-9.，Aspinall，T.V.，E.C.Guy，K.E.Roberts，D.H.Joynson，J.E.Hyde，andP.F.Sims.2003.MolecularevidenceformultipleToxoplasmagondiiinfectionsinindividualpatientsinEnglandandWalespublichealthimplications.IntJParasitol33(1)97-103.，F(xiàn)uentes，I.，J.M.Rubio，C.Ramirez，andJ.Alvar.2001.GenotypiccharacterizationofToxoplasmagondiistrainsassociatedwithhumantoxoplasmosisinSpaindirectanalysisfromclinicalsamples.JClinMicrobiol39(4)1566-70.和Warnekulasuriya，M.R.，J.D.Johnson，andR.E.Holliman.1998.DetectionofToxoplasmagondiiincuredmeats.IntJFoodMicrobiol45(3)211-5.)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為，具有用于對(duì)Shingellaspp(一種革蘭氏陰性細(xì)菌)進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)Shingellaspp進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(Hartman，A.B.，Essiet，II，D.W.Isenbarger，andL.E.Lindler.2003.EpidemiologyofTetracyclineResistanceDeterminantsinShigellaspp.andEnteroinvasiveEscherichiacoliCharacterizationandDisseminationoftet(A)-1.JClinMicrobiol41(3)1023-32.，Lampel，K.A.，andP.A.Orlandi.2002.PolymerasechainreactiondetectionofinvasiveShigellaandSalmonellaentericainfood.MethodsMolBiol179235-44.，Wang，R.F.，W.W.Cao，andC.E.Cerniglia.1997.AuniversalprotocolforPCRdetectionof13speciesoffoodbornepathogensinfoods.JApplMicrobiol83(6)727-36.和Lampel，K.A.，J.A.Jagow，M.Trucksess，andW.E.Hill.1990.PolymerasechainreactionfordetectionofinvasiveShigellaflexneriinfood.ApplEnvironMicrobiol56(6)1536-40.)。在又一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為，具有用于對(duì)Cyclosporacayetanensis進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。Cyclosporacayetanensis是由一個(gè)細(xì)胞組成的寄生蟲，其非常之小，不用顯微鏡無(wú)法看見。由Cyclospora感染導(dǎo)致的人類疾病(即，環(huán)孢子蟲病)的第一個(gè)已知例子被報(bào)道于1979年。在80年代中期開始有對(duì)此情況的更為經(jīng)常的報(bào)道。在最近若干年，在美國(guó)和加拿大都已報(bào)道過環(huán)孢子蟲病的爆發(fā)。Cyclospora分布于被受感染糞便污染過的水或食物中。環(huán)孢子蟲病的爆發(fā)與各種生鮮制品有關(guān)。Cyclospora經(jīng)過腸道運(yùn)動(dòng)排出后需要一段時(shí)間(數(shù)天或數(shù)周)才能具有感染性。因此，Cyclospora不太可能從一個(gè)人直接傳染給另一個(gè)人。用于對(duì)Cyclosporacayetanensis進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如，Eberhard，M.L.，N.J.Pieniazek，andM.J.Arrowood.1997.LaboratorydiagnosisofCyclosporainfections.ArchPatholLabMed121(8)792-7.，PieniazekN.J.，S.B.Slemenda，A.J.daSilva，E.M.Alfano，andM.J.Arrowood.1996.PCRconfirmationofinfectionwithCyclosporacayetanensis.EmergInfectDis2(4)357-9.，Quintero-Betancourt，W.，E.R.Peele，andJ.B.Rose.2002.CryptosporidiumparvumandCyclosporacayetanensisareviewoflaboratorymethodsfordetectionofthesewaterborneparasites.JMicrobiolMethods49(3)209-24.和Varma，M.，J.D.Hester，F(xiàn).W.Schaefer，3rd，M.W.Ware，andH.D.Lindquist.2003.DetectionofCyclosporacayetanensisusingaquantitativereal-timePCRassay.JMicrobiolMethods53(1)27-36.)。F.疾病診斷本文中公開的方法還提供了對(duì)是否存在基因(例如，疾病等位基因)或改變的基因表達(dá)進(jìn)行快速且靈敏的診斷測(cè)試的方法。被檢測(cè)的基因序列可以是遺傳疾病、紊亂和易感體質(zhì)所涉及的。目標(biāo)多核苷酸的一個(gè)例子包括包括突變、多態(tài)性、添加或缺失在內(nèi)的特定基因組序列。目標(biāo)多核苷酸的另一個(gè)例子是在特定疾病或紊亂中基因表達(dá)會(huì)發(fā)生改變(例如正調(diào)或負(fù)調(diào)表達(dá))的多核苷酸序列。疾病和紊亂相關(guān)的基因的例子包括但不限于癌癥、囊腫性纖維化和Down’s綜合征以及與多態(tài)性和突變相關(guān)的疾病所涉及的基因。還可對(duì)遺傳性血色病、因子11和因子V以及用于組織移植的HLA基因型進(jìn)行鑒定。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)癌癥或細(xì)胞增殖變化所涉及的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。癌癥或細(xì)胞增殖變化所涉及的目標(biāo)多核苷酸可被檢測(cè)。癌癥中涉及的許多基因都是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)胰腺癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)胰腺癌(例如，DPC4缺失)進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Barbera，V.M.，M.Martin，L.Marinoso，A.Munne，A.Carrato，F(xiàn).X.Real，andM.Fabre.2000.The18q21regionincolorectalandpancreaticcancerindependentlossofDCCandDPC4expression.BiochimBiophysActa1502(2)283-96，Bartsch，D.，P.Barth，D.Bastian，A.Ramaswamy，B.Gerdes，B.Chaloupka，Y.Deiss，B.Simon，andA.Schudy.1999.HigherfrequencyofDPC4/Smad4alterationsinpancreaticcancercelllinesthaninprimarypancreaticadenocarcinomas.CancerLett139(1)43-9和Bartsch，D.，S.A.Hahn，K.D.Danichevslsi，A.Ramaswamy，D.Bastian，H.Galehdari，P.Barth，W.Schmiegel，B.Simon，andM.Rothmund.1999.MutationsoftheDPC4/Smad4geneinneuroendocrinepancreatictumors.Oncogene18(14)2367-71)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)子宮頸癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)子宮頸癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物。對(duì)應(yīng)于子宮頸癌相關(guān)基因的全部或部分的目標(biāo)多核苷酸也可被鑒定(見，例如Si，H.X.，S.W.Tsao，C.S.Poon，L.D.Wang，Y.C.Wong，andA.L.Cheung.2003.ViralloadofHPVinesophagealsquamouscellcarcinoma.IntJCancer103(4)496-500，Si，H.X.，S.W.Tsao，C.S.Poon，L.D.Wang，Y.C.Wong，andA.L.Cheung.2003.ViralloadofHPVinesophagealsquamouscellcarcinoma.IntJCancer103(4)496-500和Castle，P.E.，M.Schiffman，P.E.Gravitt，H.Kendall，S.Fishman，H.Dong，A.Hildesheim，R.Herrero，M.C.Bratti，M.E.Sherman，A.Lorincz，J.E.Schussler，andR.D.Burk.2002.ComparisonsofHPVDNAdetectionbyMY09/11PCRmethods.JMedVirol68(3)417-23)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)乳腺癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)乳腺癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物?？蓪⒛繕?biāo)多核苷酸選為具有對(duì)應(yīng)于乳腺癌相關(guān)基因的全部或部分的序列的多核苷酸(見，例如Min，C.J.，L.Tafra，andK.M.Verbanac.1998.Identificationofsuperiormarkersforpolymerasechainreactiondetectionofbreastcancermetastasesinsentinellymphnodes.CancerRes58(20)4581-4，Abbaszadegan，M.R.，J.P.Struewing，K.M.Brown，J.V.Snider，F(xiàn).Goodsaid，R.Gore-Langton，andM.R.Hughes.1997.AutomateddetectionofprevalentmutationsinBRCA1andBRCA2genes，usingafluorogenicPCRallelicdiscriminationassay.GenetTest1(3)171-80和Tamura，G.，C.Maesawa，Y.Suzuki，M.Kashiwaba，M.Ishida，K.Saito，andR.Satodate.1994.Improveddetectionoflossofheterozygosityatretinoblastomagenelocusinhumanbreastcarcinoma.PatholInt44(1)34-8)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)黑色素瘤進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)黑色素瘤進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物?？蓪⒛繕?biāo)多核苷酸選為具有對(duì)應(yīng)于黑色素瘤相關(guān)基因的全部或部分的序列的多核苷酸。例如，目標(biāo)多核苷酸可以包括CDKN2突變。(見，例如Gonzalgo，M.L.，C.M.Bender，E.H.You，J.M.Glendening，J.F.Flores，G.J.Walker，N.K.Hayward，P.A.Jones，andJ.W.Fountain.1997.Lowfrequencyofp16/CDKN2Amethylationinsporadicmelanomacomparativeapproachesformethylationanalysisofprimarytumors.CancerRes57(23)5336-47，Chan，J.，E.S.Robinson，J.Atencio，Z.Wang，S.Kazianis，L.D.Coletta，R.S.Nairn，andJ.R.McCarrey.2001.CharacterizationoftheCDKN2AandARFgenesinUV-inducedmelanocytichyperplasiasandmelanomasofanopossum(Monodelphisdomestica).MolCarcinog31(1)16-26和Pollock，P.M.，J.Welch，andN.K.Hayward.2001.Evidenceforthreetumorsuppressorlocionchromosome9pinvolvedinmelanomadevelopment.CancerRes61(3)1154-61)。此外，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)直腸癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)直腸癌進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物。可將目標(biāo)多核苷酸選為具有對(duì)應(yīng)于直腸癌相關(guān)基因的全部或部分的序列的多核苷酸(見，例如AokiS.，Y.Takagi，M.Hayakawa，K.Yamaguchi，M.Futamura，K.Kunieda，andS.Saji.2002.Detectionofperitonealmicrometastasesbyreversetranscriptase-polymerasechainreactiontargetingcarcinoembryonicantigenandcytokeratin20incoloncancerpatients.JExpClinCancerRes21(4)555-62.，Shtoyerman-Chen，R.，E.Friedman，A.Figer，M.Carmel，Y.Patael，P.Rath，H.H.Fidder，S.Bar-Meir，andL.Theodor.2001.TheI1307KAPCpolymorphismprevalenceinnon-AshkenaiiJewsandevidenceforafoundereffect.GenetTest5(2)141-6.和Smith，W.M.，N.J.VanOrsouw，E.A.Fox，R.D.Kolodner，J.Vijg，andC.Eng.1998.Accurate，high-throughput″snapshot″detectionofhMLH1mutationsbytwo-dimensionalDNAelectrophoresis.GenetTest2(1)43-53.)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物。可將目標(biāo)多核苷酸選為具有對(duì)應(yīng)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)基因的全部或部分的序列的多核苷酸(見，例如Acikbas，I.，I.Keser，S.Kilic，H.Bagci，G.Karpuzoglu，andG.Luleci.2002.DetectionofLOHoftheRB1geneinbladdercancersbyPCR-RFLP.UrolInt68(3)189-92，Tamura，G.，C.Maesawa，Y.Suzuki，M.Kashiwaba，M.Ishida，K.Saito，andR.Satodate.1994.Improveddetectionoflossofheterozygosityatretinoblastomagenelocusinhumanbreastcarcinoma.PatholInt44(1)34-8和Lohmann，D.，B.Horsthemke，G.Gillessen-Kaesbach，F(xiàn).H.Stefani，andH.Hofler.1992.DetectionofsmallRB1genedeletionsinretinoblastomabymultiplexPCRandhigh-resolutiongelelectrophoresis.HumGenet89(1)49-53)。在又一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)血友病進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或其片段。用于對(duì)血友病進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物?？蓪⒛繕?biāo)多核苷酸選為具有對(duì)應(yīng)于血友病相關(guān)基因的全部或部分的序列的多核苷酸(見，例如Mannucci，P.M.2002.Ham-wassermanlecturehemophiliaandrelatedbleedingdisordersastoryofdismayandsuccess.Hematology(AmSocHematolEducProgram)1-9和Citron，M.，L.Godmilow，T.Ganguly，andA.Ganguly.2002.HighthroughputmutationscreeningofthefactorVIIIgene(F8C)inhemophiliaA37novelmutationsandgenotype-phenotypecorrelation.HumMutat20(4)267-74)。具有對(duì)應(yīng)于苯丙酮尿癥(PKU)相關(guān)基因的序列的目標(biāo)多核苷酸可被選擇(見，例如Pronina，N.，S.Giannattasio，P.Lattanzio，R.Lugovska，P.Vevere，andA.Kornejeva.2003.ThemolecularbasisofphenylketonuriainLatvia.HumMutat21(4)398-9，Sueoka，H.，M.Nagao，andS.Chiba.2000.Rapidmutationscreeningofphenylketonuriabypolymerasechainreaction-linkedrestrictionenzymeassayanddirectsequenceofthephenylalaninehydroxylasegeneclinicalapplicationinnorthernJapanandnorthernChina.GenetTest4(3)249-56，andEisensmith，R.C.，A.A.Goltsov，andS.L.Woo.1994.Asimple，rapid，andhighlyinformativePCR-basedprocedureforprenataldiagnosisandcarrierscreeningofphenylketonuria.PrenatDiagn14(12)1113-8.).Alford，R.L.，T.Ashizawa，J.Jankovic，C.T.Caskey，andC.S.Richards.1996.Moleculardetectionofnewmutations，resolutionofambiguousresultsandcomplexgeneticcounselingissuesinHuntingtondisease.AmJMedGenet66(3)281-6，Vnencak-Jones，C.L.2003.FluorescencePCRandGeneScananalysisforthedetectionofCAGrepeatexpansionsassociatedwithHuntington′sdisease.MethodsMolBiol217101-8和Panagopoulos，I.，C.Lassen，U.Kristoffersson，andP.Aman.1999.AnovelPCR-basedapproachforthedetectionoftheHuntingtondiseaseassociatedtrinucleotiderepeatexpansion.HumMutat13(3)232-6)。具有對(duì)應(yīng)于Huntington’s癥相關(guān)基因的序列的目標(biāo)多核苷酸可被選擇，例如，由于增加的CAG重復(fù)(見，例如Alford，R.L.，T.Ashizawa，J.Jankovic，C.T.Caskey，andC.S.Richards.1996.Moleculardetectionofnewmutations，resolutionofambiguousresultsandcomplexgeneticcounselingissuesinHuntingtondisease.AmJMedGenet66(3)281-6，Vnencak-Jones，C.L.2003.FluorescencePCRandGeneScananalysisforthedetectionofCAGrepeatexpansionsassociatedwithHuntington′sdisease.MethodsMolBiol217101-8和Panagopoulos，I.，C.Lassen，U.Kristoffersson，andP.Aman.1999.AnovelPCR-basedapproachforthedetectionoftheHuntingtondiseaseassociatedtrinucleotiderepeatexpansion.HumMutat13(3)232-6.)。具有對(duì)應(yīng)于血友病相關(guān)基因的序列的目標(biāo)多核苷酸可被選擇(見，例如Mannucci，P.M.2002.Ham-wassermanlecturehemophiliaandrelatedbleedingdisordersastoryofdismayandsuccess.Hematology(AmSocHematolEducProgram)1-9和Citron，M.，L.Godmilow，T.Ganguly，andA.Ganguly.2002.HighthroughputmutationscreeningofthefactorVIIIgene(F8C)inhemophiliaA37novelmntationsandgenotype-phenotypecorrelation.HumMutat20(4)267-74.)。具有對(duì)應(yīng)于Tay-Sach’s癥相關(guān)基因的序列的目標(biāo)多核苷酸可被選擇(見，例如Rice，J.E.，J.A.Sanchez，K.E.Pierce，andL.J.Wangh.2002.Real-timePCRwithmolecularbeaconsprovidesahighlyaccurateassayfordetectionofTay-Sachsallelesinsinglecells.PrenatDiagn22(12)1130-4，Tamasu，S.，H.Nishio，H.Ayaki，M.J.Lee，M.Mizutori，Y.Takeshima，H.Nakamura，M.Matsuo，T.Maruo，andK.Sumino.1999.PrenataldiagnosisofaJapanesefamilyatriskforTay-Sachsdisease.Applicationofafluorescentcompetitiveallele-specificpolymerasechainreaction(PCR)method.KobeJMedSci45(6)259-70，andSermon，K.，W.Lissens，Z.P.Nagy，A.VanSteirteghem，andI.Liebaers.1995.SimultaneousamplificationofthetwomostfrequentmutationsofinfantileTay-Sachsdiseaseinsingleblastomeres.HumReprod10(8)2214-7.)。具有對(duì)應(yīng)于多發(fā)性硬化(MultipleSchlorosis，MS)相關(guān)基因的序列的目標(biāo)多核苷酸可被選擇(見，例如Lauwers，S.，Y.VanderHeyden，andB.Rombaut.2002.ScreeningandoptimisationofanELISAmethodforthequantitativedetectionofenterovirusspecificRT-PCRproductsbymeansofatwo-levelexperimentaldesign.JPharmBiomedAnal29(4)659-68，Perron，H.，J.A.Garson，F(xiàn).Bedin，F(xiàn).Beseme，G.Paranhos-Baccala，F(xiàn).Komurian-Pradel，F(xiàn).Mallet，P.W.Tuke，C.Voisset，J.L.Blond，B.Lalande，J.M.Seigneurin，andB.Mandrand.1997.Molecularidentificationofanovelretrovirusrepeatedlyisolatedfrompatientswithmultiplesclerosis.TheCollaborativeResearchGrouponMultipleSclerosis.ProcNatlAcadSciUSA94(14)7583-8和Kuhne，B.S.，andP.Oschmann.2002.Quantitativereal-timeRT-PCRusinghybridizationprobesandimportedstandardcurvesforcytokinegeneexpressionanalysis.Biotechniques33(5)1078，1080-2，1084各處.)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于Burkitt’s淋巴瘤相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如Wu，Y.，Y.Chen，J.Xu，andL.Lu.2002.AnticanceractivitiesofcurcuminonhumanBurkitt′slymphoma.ZhonghuaZhongLiuZaZhi24(4)348-52，Basso，K.，E.Frascella，L.Zanesco，andA.Rosolen.1999.Improvedlong-distancepolymerasechainreactionforthedetectionoft(8；14)(q24；q32)inBurkitt′slymphomas.AmJPathol155(5)1479-85和Asada，M.，T.Miyashita，F(xiàn).Bessho，N.Kobayashi，andS.Mizutani.1991.MalignantcelldetectioninBurkitt′slymphomausingthird-complementarity-determiningregion(CDRIII)，clone-specificprobedevelopedbysequencingDNAfromstoredslides.JpnJCancerRes82(7)848-53)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于囊性纖維化相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如Tomaiuolo，R.，M.Spina，andG.Castaldo.2003.Moleculardiagnosisofcysticfibrosiscomparisonoffouranalyticalprocedures.ClinChemLabMed41(1)26-32，Gonzalez-Gonzalez，M.C.，M.Garcia-Hoyos，M.J.Trujillo，M.RodriguezdeAlba，I.Lorda-Sanchez，J.Diaz-Recasens，E.Gallardo，C.Ayuso，andC.Ramos.2002.PrenataldetectionofacysticfibrosismutationinfetalDNAfrommaternalplasma.PrenatDiagn22(10)946-8和Corbetta，C.，M.Seia，A.Bassotti，A.Ambrosioni，A.Giunta，andR.Padoan.2002.Screeningforcysticfibrosisinnewborninfantsresultsofapilotprogrammebasedonatwotierprotocol(IRT/DNA/IRT)intheItalianpopulation.JMedScreen9(2)60-3.)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于青少年期發(fā)病的糖尿病相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如Knerr，I.，R.Repp，J.Dotsch，N.Gratzki，J.Hanze，T.Kapellen，andW.Rascher.1999.Quantitationofgeneexpressionbyreal-timePCRdisprovesa″retroviralhypothesis″forchildhood-onsetdiabetesmellitus.PediatrRes46(1)57-60，Lauwers，S.，Y.VanderHeyden，andB.Rombaut.2002.ScreeningandoptimisationofanELISAmethodforthequantitativedetectionofenterovirusspecificRT-PCRproductsbymeansofatwo-levelexperimentaldesign.JPharmBiomedAnal29(4)659-68和Salminen，K.，K.Sadeharju，M.Lonnrot，P.Vahasalo，A.Kupila，S.Korhonen，J.Ilonen，O.Simell，M.Knip，andH.Hyoty.2003.Enterovirusinfectionsareassociatedwiththeinductionofbeta-cellautoimmunityinaprospectivebirthcohortstudy.JMedVirol69(1)91-8.)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于Parkinson’s癥相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如Hoenicka，J.，L.Vidal，B.Morales，I.Ampuero，F(xiàn).J.Jimenez-Jimenez，J.Berciano，T.delSer，A.Jimenez，P.G.Ruiz，andJ.G.deYebenes.2002.MolecularfindingsinfamilialParkinsondiseaseinSpain.ArchNeurol59(6)966-70.；Lucking，C.B.，andA.Brice.2003.SemiquantitativePCRforthedetectionofexonrearrangementsintheParkingene.MethodsMolBiol21713-26；Le，W.D.，P.Xu，J.Jankovic，H.Jiang，S.H.Appel，R.G.Smith，andD.K.Vassilatis.2003.MutationsinNR4A2associatedwithfamilialParkinsondisease.NatGenet33(1)85-9.；andForoud，T.，S.K.Uniacke，L.Liu，N.Panl&lt；ratz，A.Rudolph，C.Halter，C.Shults，K.Marder，P.M.Conneally，andW.C.Nichols.2003.HeterozygosityforamutationintheparkingeneleadstolateronsetParkinsondisease.Neurology60(5)796-801)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于Alzheimer′s癥相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如Maresh，G.A.，D.Erezyilmaz，C.E.Murry，D.Nochlin，andA.D.Snow.1996.DetectionandquantitationofperlecanmRNAlevelsinAlzheimer′sdiseaseandnormalagedhippocampusbycompetitivereversetranscription-polymerasechainreaction.JNeurochem67(3)1132-44和Smith，M.J.，R.J.Gardner，M.A.Knight，S.M.Forrest，K.Beyreuther，E.Storey，C.A.McLean，R.G.Cotton，R.Cappal，andC.L.Masters.1999.Early-onsetAlzheimer′sdiseasecausedbyanovelmutationatcodon219ofthepresenilin-1gene.Neuroreport10(3)503-7)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于血栓癥相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如SandersSevall，J.2000.FactorVLeidengenotypingusingreal-timefluorescentpolymerasechainreaction.MolCellProbes14(4)249-53；Ferreira-Gonzalez，A.，L.M.Fisher，C.M.Lehman，M.H.Langley，D.H.Lofland，Q.Xia，N.X.Nguyen，D.Modesto，J.B.Willoughby，D.S.Wilkinson，andC.T.Garrett.1997.DetectionofacommonmutationinfactorVgeneresponsibleforresistancetoactivateproteinCcausingpredispositiontothrombosis.JClinLabAnal11(6)328-35；Warshawsky，I.，C.Hren，L.Sercia，B.Shadrach，S.R.Deitcher，E.Newton，andK.Kottke-Marchant.2002.Detectionofanovelpointmutationoftheprothrombingeneatposition20209.DiagnMolPathol11(3)152-6.)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于結(jié)核病易感性相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如BellamyR.Susceptibilitytomycobacterialinfectionstheimportanceofhostgenetics.GenesImmun.2003Jan；4(1)4-11；AwomoyiAA，MarchantA，HowsonJM，McAdamKP，BlackwellJM，NewportMJ.Interleukin-10，polymorphisminSLC11A1(formerlyNRAMP1)，andsusceptibilitytotuberculosis.JInfectDis.2002Dec15；186(12)1808-14.BellamyR.NRAMP1andsusceptibilitytotuberculosis.IntJTubercLungDis.2002Sep；6(9)747)。目標(biāo)多核苷酸可選用具有對(duì)應(yīng)于人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)基因的序列的多核苷酸(見，例如IferganI，BernardNF，BruneauJ，AlaryM，TsoukasCM，RogerM.AllelefrequencyofthreefunctionallyactivepolymorphismsoftheMDR-1Geneinhigh-riskHIV-negativeandHIV-positiveCaucasians.AIDS.2002Nov22；16(17)2340-2和FarzanM，MirzabekovT，KolchinskyP，WyattR，CayabyabM，GerardNP，GerardC，SodroskiJ，ChoeH.TyrosinesulfationoftheaminoterminusofCCR5facilitatesHIV-1entry.Cell.1999Mar5；96(5)667-76)。本文中的方法還提供了一種快速且靈敏的診斷檢驗(yàn)的方法，其用于在其它遺傳分析中檢驗(yàn)是否存在基因或基因表達(dá)有所改變。例如，這可用于確定人類樣品的同一性，例如，在親子鑒定、計(jì)算機(jī)法醫(yī)學(xué)中，或用于匹配有親緣關(guān)系或無(wú)親緣關(guān)系的器官捐贈(zèng)者。診斷也可開展于非人類樣品中，例如用于確定牛的家系。G.性傳播疾病核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)導(dǎo)致性傳播疾病(STD)的病原體進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列或序列片段。下面列出了具有臨床重要性的STD的例子，以及用于基于PCR的檢測(cè)的參照的例子。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有特定PCR引物序列的序列，并可與本文所述的本發(fā)明的很多種實(shí)施方式組合使用。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)衣原體進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。很多此類引物都是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Koumans，E.H.，C.M.Black，L.E.Markowitz，E.Unger，A.Pierce，M.K.Sawyer，andJ.R.Papp.2003.ComparisonofmethodsfordetectionofChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeaeusingcommerciallyavailablenucleicacidamplificationtestsandaliquidpapsmearmedium.JClinMicrobiol41(4)1507-11；Puolakkainen，M.，E.Hiltunen-Back，T.Reunala，S.Suhonen，P.Lahteenmaki，M.Lehtinen，andJ.Paavonen.1998.Comparisonofperformancesoftwocommerciallyavailabletests，aPCRassayandaligasechainreactiontest，indetectionofurogenitalChlamydiatrachomatisinfection.JClinMicrobiol36(6)1489-93；BetsouF，BeaumontK，SueurJM，OrfilaJ.ConstructionandevaluationofinternalcontrolDNAforPCRamplificationofChlamydiatrachomatisDNAfromurinesamples.JClinMicrobiol.2003Mar；41(3)1274-6；KnoxJ，TabriziSN，MillerP，PetoumenosK，LawM，ChenS，GarlandSM.Evaluationofself-collectedsamplesincontrasttopractitioner-collectedsamplesfordetectionofChlamydiatrachomatis，Neisseriagonorrhoeae，andTrichomonasvaginalisbypolymerasechainreactionamongwomenlivinginremoteareas.SexTransmDis.2002Nov；29(11)647-54；MygindT，BirkelundS，BirlcebaekN，OestergaardL，JensenJ，ChristiansenG.DeterminationofPCRefficiencyinchelex-100purifiedclinicalsamplesandcomparisonofreal-timequantitativePCRandconventionalPCRfordetectionofChlamydiapneumoniae.BMCMicrobiol.2002Jul9；2(1)17)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)梅毒螺旋體(Treponemapallidum)進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)梅毒螺旋體進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Centurion-Lara，A.，C.Castro，J.M.Shaffer，W.C.VanVoorhis，C.M.Marra，andS.A.Lukehart.1997.DetectionofTreponemapallidumbyasensitivereversetranscriptasePCR.JClinMicrobiol35(6)1348-52；Martin，A.A.，H.Liu，M.Y.Sutton，B.Steiner，A.Pillay，andL.E.Markowitz.2001.AmplificationoftheDNApolymeraseIgeneofTreponemapallidumfromwholebloodofpersonswithsyphilis.DiagnMicrobiolInfectDis40(4)163-6；Orton，S.L.，H.Liu，R.Y.Dodd，andA.E.Williams.2002.PrevalenceofcirculatingTreponemapallidumDNAandRNAinblooddonorswithconfirmed-positivesyphilistests.Transfusion42(1)94-9)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)HIV進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)HIV進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Gibney，L.，M.Macaluso，K.Kirk，M.S.Hassan，J.Schwebe，S.H.Vermund，andP.Choudhury.2001.PrevalenceofinfectiousdiseasesinBangladeshiwomenlivingadjacenttoatruckstandHIV/STD/hepatitis/genitaltractinfections.SexTransmInfect77(5)344-50；Spinillo，A.，M.Debiaggi，F(xiàn).Zara，R.Maserati，F(xiàn).Polatti，andA.DeSantolo.2001.Factorsassociatedwithnucleicacidsrelatedtohumanimmunodeficiencyvirustype1incervico-vaginalsecretions.Bjog108(6)634-41)。在又一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)HPV進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Winer，R.L.，S.K.Lee，J.P.Hughes，D.E.Adam，N.B.Kiviat，andL.A.Koutsky.2003.Genitalhumanpapillomavirusinfectionincidenceandriskfactorsinacohortoffemaleuniversitystudents.AmJEpidemiol157(3)218-26；Levi，J.E.，B.Kleter，W.G.Quint，M.C.Fink，C.L.Canto，R.Matsubara，I.Linhares，A.Segurado，B.Vanderborght，J.E.Neto，andL.J.VanDoorn.2002.Highprevalenceofhumanpapillomavirus(HPV)infectionsandhighfrequencyofmultipleHPVgenotypesinhumanimmunodeficiencyvirus-infectedwomeninBrazil.JClinMicrobiol40(9)3341-5；Skerlev，M.，M.Grce，M.Sirotkoviae-Slcerlev，K.Husnjak，andJ.Lipozencic.2002.Humanpapillomavirusmalegenitalinfections；clinicalvariationsandthesignificanceofDNAtyping.ClinDermatol20(2)173-8)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)Neisseriagonorrhoeae進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)Neisseriagonorrhoeae進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Mgone，C.S.，T.Lupiwa，andW.Yeka.2002.HighprevalenceofNeisseriagonorrhoeaeandmultiplesexuallytransmitteddiseasesamongruralwomenintheEasternHighlandsProvinceofPapuaNewGuinea，detectedbypolymerasechainreaction.SexTransmDis29(12)775-9；Gomes，J.P.，L.Tavira，F(xiàn).Exposto，E.Prieto，andM.A.Catry.2001.NeisseriagonorrhoeaeandChlamydiatrachomatisinfectionsinpatientsattendingSTDandfamilyplanningclinicsinBissau，Guinea-Bissau.ActaTrop80(3)261-4；Diemert，D.J.，M.D.Libman，andP.Lebel.2002.Confirmationby16SrRNAPCRoftheCOBASAMPLICORCT/NGtestfordiagnosisofNeisseriagonorrhoeaeinfectioninalow-prevalencepopulation.JClinMicrobiol40(11)4056-9)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)生殖器皰疹進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)生殖器皰疹進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Wolff，M.H.，J.Schmitt，M.Rahaus，H.Dudda，andW.Hatzmann.2002.Clinicalandsubclinicalreactivationofgenitalherpesvirus.Intervirology45(1)20-3；Wald，A.2002.Testingforgenitalherpeshow，who，andwhy.CurrClinTopInfectDis22166-80；Scoular，A.2002.Usingtheevidencebaseongenitalherpesoptimisingtheuseofdiagnostictestsandinformationprovision.SexTransmInfect78(3)160-5)。核酸類似物也可以被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)Trichomonasvanginalis進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析對(duì)Trichomonasvanginalis進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Wendel，K.A.，E.J.Erbelding，C.A.Gaydos，andA.M.Rompalo.2002.Trichomonasvaginalispolymerasechainreactioncomparedwithstandarddiagnosticandtherapeuticprotocolsfordetectionandtreatmentofvaginaltrichomoniasis.ClinInfectDis35(5)576-80；Wendel，K.A.，E.J.Erbelding，C.A.Gaydos，andA.M.Rompalo.2003.UseofurinepolymerasechainreactiontodefinetheprevalenceandclinicalpresentationofTrichomonasvaginalisinmenattendinganSTDclinic.SexTransmInfect79(2)151-153)。最后，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)普通的STD。用于通過基于PCR的分析對(duì)STD進(jìn)行鑒定的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Mitrani-Rosenbaum，S.，R.Tsvieli，O.Lavie，R.Boldes，E.Anteby，S.Shimonovitch，T.Lazarovitch，andA.Friedmann.1994.Simultaneousdetectionofthreecommonsexuallytransmittedagentsbypolymerasechainreaction.AmJObstetGynecol171(3)784-90)。H.抗生素抗性本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于檢測(cè)賦予抗生素抗性的基因表達(dá)是否存在或是否有所改變。目標(biāo)多核苷酸可與對(duì)病原體賦予抗生素抗性的基因相對(duì)應(yīng)?；蛘?，目標(biāo)多核苷酸可以對(duì)應(yīng)于其代謝發(fā)生了可能影響到抗生素療效的改變的宿主的基因。表達(dá)抗生素抗性的基因的例子可在下述文獻(xiàn)中找到。提供例子并非是用提供的例子進(jìn)行限制。編碼例如beta內(nèi)酰胺酶的基因賦予對(duì)如下抗生素的抗性，所述抗生素包括但不限于青霉素、紅霉素、頭孢噻肟(cefotaxime)、氨芐青霉素、哌拉西林(piperacillin)、先鋒必素(cefoperazone)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢吡肟(cefepime)、拉氧頭孢(moxalactam)、伊米配能(imipenem)(見，例如Livermore，D.M.1995.β-LactamasesinLaboratoryandClinicalResistance.Clin.Microbiol.Reviews.8557-584.，Hsueh，P.，Teng，L.，Lee，L.，Yang，P.，Ho，S.，andLuh，K，1999.DisseminationofHigh-LevelPenicillin-，Extended-SpectrumCephalosporin-，andErythromycin-ResistantStreptococcuspneumoniaeClonesinTaiwan.J.Clin.Microbiol.37221-224.，Setchanova，L.，andTomasz，A.1999.MolecularCharacterizationofPenicillin-ResistantStreptococcuspneumoniaeIsolatesfromBulgaria.J.Clin.Microbiol.37638-648.，Wichelhaus，T.A.，Kern，S.，Schfer，V.，Brade，V.1999.RapidDetectionofEpidemicStrainsofMethicillin-ResistantStaphylococcusaureus.J.Clin.Microbiol.37690-693.和JacobyG.A.1994.GeneticsofExtended-SpectrumBeta-Lactamases.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.13suppl.12-11)?？股乜剐再x予基因的其它非限制性例子包括喹諾酮類(quinolones)抗性基因，其賦予對(duì)下述抗生素的抗性，例如ceprofloxacin、氧氟沙星(ofloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、司氟沙星(sparfloxacin)(見，例如Margerrison，E.E.C.，Hopewell，R.，andFisher，L.M.1992.NucleotideSequenceoftheStaphylococcusaureusgyrB-gyrALocusEncodingtheDNAGyraseAandBProteins.J.Bacteriol.1741596-1603.，McWhinney，P.H.M.，Patel，S.，Whiley，R.A.，Hardie，J.M.，Gillespie，S.H.，andKibbler，C.C.1993.ActivitiesofPotentialTherapeuticandProphylacticAntibioticsagainstBloodCultureIsolatesofViridansGroupStreptococcifromNeutropenicPatientsReceivingCiprofloxacin.Antimicrob.Agents.Chemother.372493-2495.，andYoshida，H.，Bogaki，M.，Nakamura，S.，Ubukata，K.，andKonno，M.1990.NucleotideSequenceandCharacterizationoftheStaphylococcusaureusnorAGene，WhichConfersResistancetoQuinolones.J.Bacteriol.1726942-6949)?？股乜剐再x予基因的其它例子包括糖肽抗性基因，其賦予對(duì)下述抗生素的抗性，例如萬(wàn)古霉素和壁霉素(teicoplanin)(見，例如Tremlett，C.H.，Brown，D.F.J，andWoodford，N.1999.VariationinStructureandLocationofVanAGlycopeptideResistanceElementsamongEnterococcifromaSinglePatient.J.Clin.Microbiol.37818-820.，andArthur，M.，Depardieu，F(xiàn).，Molinas，C.，Reynolds，P.，andCourvalin，P.1995.ThevanZgeneofTnl546fromEnterococcusfaeciumBM4147confersresistancetoteicoplanin.Gene，154(1995)87-92.)aminoglycosideresistancegeneswhichconveyresistancetoantibioticssuchas托普霉素(tobramycin)，慶大霉素(gentamicin)，鏈霉素(strepomycin)，卡那霉素(kanamycin)，氨基丁卡霉素(amikacin)(GalimandM.，Lambert，T.，Gerbaud，G.，andCourvalin，P.1993.Characterizationoftheaac(6′)-IbgeneEncodinganAminoglycoside6′-N-AcetyltransferaseinPseudomonasaeruginosaBM2656.Antimicrob.Agents.Chemother.371456-1462.，Lambert，T.，Gerbaud，G.，andCourvalin，P.1994.CharacterizationofTransposonTnl528，WhichConfersAmikacinResistancebySynthesisofAminoglycoside3′-O-PhosphotransferaseTypeVI.Antimicrob.Agents.Chemother.38702-706，andShaw，K.J.，Munayyer，H.，Rather，P.N.，Hare，R.S.，andMiller，G.H.1993.NucleotideSequenceAnalysisandDNAHybridizationStudiesoftheant(4′)-IIaGenefromPseudomonasaeruginosa.Antimicrob.Agents.Chemother.37708-714)。某些情況下，存在引起高度關(guān)注的某些特定種類的抗性。它們包括具有甲氧西林(methicillin)抗性的Staphylococcusaureus(見，例如Ito，T.，K.Okuma，X.X.Ma，H.Yuzawa，andK.Hiramatsu.2003.InsightsonantibioticresistanceofStaphylococcusaureusfromitswholegenomegenomicislandSCC.DrugResistUpdate6(1)41-52，Kuroda，M.，T.Ohta，I.Uchiyama，T.Baba，H.Yuzawa，I.Kobayashi，L.Cui，A.Oguchi，K.Aoki，Y.Nagai，J.Lian，T.Ito，M.Kanamori，H.Matsumaru，A.Maruyama，H.Murakami，A.Hosoyama，Y.Mizutani-Ui，N.K.Takahashi，T.Sawano，R.Inoue，C.Kaito，K.Sekimizu，H.Hirakawa，S.Kuhara，S.Goto，J.Yabuzaki，M.Kanehisa，A.Yamashita，K.Oshima，K.Furuya，C.Yoshino，T.Shiba，M.Hattori，N.Ogasawara，H.Hayashi，andK.Hiramatsu.2001.Wholegenomesequencingofmeticillin-resistantStaphylococcusaureus.Lancet357(9264)1225-40，andSkurray，R.A.，andN.Firth.1997.Molecularevolutionofmultiply-antibiotic-resistantstaphylococci.CibaFoundSymp207167-83′)。其它可被檢測(cè)到的抗生素抗性賦予基因包括結(jié)核病抗生素抗性基因(見，例如Mokrousov，I.，T.Otten，M.Filipenko，A.Vyazovaya，E.Chrapov，E.Limeschenko，L.Steldova，B.Vyshnevskiy，andO.Narvskaya.2002.Detectionofisoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisstrainsbyamultiplexallele-specificPCRassaytargetingkatGcodon315variation.JClinMicrobiol40(7)2509-12；Gong，G.，H.Lee，G.H.Kang，Y.H.Shim，J.Huh，andS.K.Khang.2002.NestedPCRfordiagnosisoftuberculouslymphadenitisandPCR-SSCPforidentificationofrifampicinresistanceinfine-needleaspirates.DiagnCytopathol26(4)228-31；GarciadeViedma，D.，M.delSolDiazInfantes，F(xiàn).Lasala，F(xiàn).Chaves，L.Alcala，andE.Bouza.2002.Newreal-timePCRabletodetectinasingletubemultiplerifampinresistancemutationsandhigh-levelisoniazidresistancemutationsinMycobacteriumtuberculosis.JClinMicrobiol40(3)988-95)。I.對(duì)藥物應(yīng)答(DrugResponse)易感體質(zhì)的遺傳篩選本發(fā)明的方法、組合物和分析方法可被用于檢測(cè)造成對(duì)藥物應(yīng)答的易感體質(zhì)的基因。目標(biāo)多核苷酸可對(duì)應(yīng)于造成對(duì)藥物應(yīng)答的易感體質(zhì)的任何多核苷酸序列。目標(biāo)多核苷酸可對(duì)應(yīng)于影響心血管系統(tǒng)的藥物的易感體質(zhì)所涉及的序列(見，例如Dudley，C.，B.Keavney，B.Casadei，J.Conway，R.Bird，andP.Ratcliffe.1996.Predictionofpatientresponsestoantihypertensivedrugsusinggeneticpolymorphismsinvestigationofrenin-angiotensinsystemgenes.JHypertens14(2)259-62；Lima，P.R.，J.A.Gontijo，J.B.LopesdeFaria，F(xiàn).F.Costa，andS.T.Saad.1997.Band3Campinasanovelsplicingmutationintheband3gene(AE1)associatedwithhereditaryspherocytosis，hyperactivityofNa+/Li+countertransportandanabnormalrenalbicarbonatehandling.Blood90(7)2810-8；Sakaeda，T.，T.Nalcamura，M.Horinouchi，M.Kakumoto，N.Ohmoto，T.Sakai，Y.Morita，T.Tamura，N.Aoyama，M.Hirai，M.Kasuga，andK.Olcumura.2001.MDR1genotype-relatedpharmacokineticsofdigoxinaftersingleoraladministrationinhealthyJapanesesubiects.PharmRes18(10)1400-4.)。目標(biāo)多核苷酸還可對(duì)應(yīng)于對(duì)精神病藥物的易感體質(zhì)所涉及的基因和其它多核苷酸(見，例如Nikoloff，D.，J.C.Shim，M.Fairchild，N.Patten，B.A.Fijal，W.H.Koch，A.MacPherson，D.Flockhart，Y.R.Yoon，J.S.Yoon，Y.H.Kim，andJ.G.Shin.2002.AssociationbetweenCYP2D6genotypeandtardivedyskinesiainKoreanschizophrenics.PharmacogenomicsJ2(6)400-7；Bertilsson，L.，M.L.Dahl，andG.Tybring.1997.Pharmacogeneticsofantidepressantsclinicalaspects.ActaPsychiatrScandSuppl39114-21.；Chen，S.，W.H.Chou，R.A.Blouin，Z.Mao，L.L.Humphries，Q.C.Meek，J.R.Neill，W.L.Martin，L.R.Hays，andP.J.Wedlund.1996.ThecytochromeP4502D6(CYP2D6)enzymepolymorphismscreeningcostsandinfluenceonclinicaloutcomesinpsychiatry.ClinPharmacolTher60(5)522-34)。目標(biāo)多核苷酸還可對(duì)應(yīng)于與應(yīng)答止痛藥的易感體質(zhì)相對(duì)應(yīng)的基因序列或其它多核苷酸序列(見，例如Torres-Galvan，M.J.，N.Ortega，F(xiàn).Sanchez-Garcia，C.Blanco，T.Carrillo，andJ.Quiralte.2001.LTC4-synthaseA-444CpolymorphismlackofassociationwithNSAID-inducedisolatedperiorbitalangioedemainaSpanishpopulation.AnnAllergyAsthmaImmunol87(6)506-10.)。J.有效藥物應(yīng)答中涉及的基因本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于遺傳檢驗(yàn)，用于對(duì)藥物反應(yīng)的可能的指示。本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于確定目前的治療是否有效，或是否抗性(或耐受性)正在發(fā)展?；虮磉_(dá)檢驗(yàn)可被用于檢測(cè)腫瘤是否形成，或?qū)⒁纬?，?duì)治療的抗性?；诨虻脑\斷試驗(yàn)還可包括對(duì)在未來(lái)發(fā)展成疾病或紊亂的可能性進(jìn)行初篩，對(duì)某些類型的癌癥的遺傳易感體質(zhì)進(jìn)行初篩，以及確定遺傳多態(tài)性。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)特定基因是否存在以及是否表達(dá)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)能代謝相關(guān)藥物的酶的表達(dá)水平。多態(tài)性酶會(huì)改變藥物的效果，并因此改變它們用于治療的能力?？蓪?duì)影響到相關(guān)藥物應(yīng)答(并因此影響到藥物用于治療的能力)的基因中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼細(xì)胞色素CYP2D6的序列或序列片段。細(xì)胞色素CYP2D6可代謝用于治療抗高血壓的Debrisoquin。CYP2D6表達(dá)的提高暗示了對(duì)Debrisoquin的抗性(見，例如Mahgoub，A.，J.R.Idle，L.G.Dring，R.Lancaster，andR.L.Smith.1977.PolymorphichydroxylationofDebrisoquineinman.Lancet2(8038)584-6；andWennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，andL.L.Gustafsson.1999.DecreasedcapacityfordebrisoquinemetabolismamongblackTanzaniansanalysesoftheCYP2D6genotypeandphenotype.Pharmacogenetics9(6)707-14)。細(xì)胞色素CYP2D6的存在或表達(dá)可被用于測(cè)定對(duì)司巴丁(sparteine)(用于治療手術(shù)后疼痛)的抗性(見，例如Eichelbaum，M.，N.Spannbrucker，B.Steincke，andH.J.Dengler.1979.DefectiveN-oxidationofsparteineinmananewpharmacogeneticdefect.EurJClinPharmacol16(3)183-7；Broly，F(xiàn).，D.Marez，N.Sabbagh，M.Legrand，S.Millecamps，J.M.LoGuidice，P.Boone，andU.A.Meyer.1995.AnefficientstrategyfordetectionofknownandnewmutationsoftheCYP2D6geneusingsinglestrandconformationpolymorphismanalysis.Pharmacogenetics5(6)373-84)。細(xì)胞色素CYP2D6的存在或表達(dá)可被用于測(cè)定對(duì)去甲替林(用于治療抑郁或心血管疾病)的抗性(見，例如Dalen，P.，M.L.Dahl，M.L.Ruiz，J.Nordin，andL.Bertilsson.1998.10-Hydroxylationofnortriptylineinwhitepersonswith0，1，2，3，and13functionalCYP2D6genes.ClinPharmacolTher63(4)444-52；Yue，Q.Y.，Z.H.Zhong，G.Tybring，P.Dalen，M.L.Dahl，L.Bertilsson，andF.sjoqvist.1998.Pharmacokineticsofnortriptylineandits10-hydroxymetaboliteinChinesesubjectsofdifferentCYP2D6genotypes.ClinPharmacolTher64(4)384-90)。細(xì)胞色素P459的存在或表達(dá)可被用于測(cè)定改變的可待因(codeine)代謝(見，例如Sindrup，S.H.，andK.Brosen.1995.Thepharmacogeneticsofcodeinehypoalgesia.Pharmacogenetics5(6)335-46；Mortimer，O.，K.Persson，M.G.Ladona，D.Spalding，U.M.Zanger，U.A.Meyer，andA.Rane.1990.PolymorphicformationofmorphinefromcodeineinpoorandextensivemetabolizersofdextromethorphanrelationshiptothepresenceofimmunoidentifiedcytochromeP-450IID1.ClinPharmacolTher47(1)27-35)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼細(xì)胞色素CYP2C9的序列或序列片段。細(xì)胞色素CYP2C9可代謝華法林(Warfarin)(其被用作為抗凝血?jiǎng)?(見，例如Aithal，G.P.，C.P.Day，P.J.Kesteven，andA.K.Daly.1999.AssociationofpolymorphismsinthecytochromeP450CYP2C9withwarfarindoserequirementandriskofbleedingcomplications.Lancet353(9154)717-9；Loebstein，R.，H.Yonath，D.Peleg，S.Almog，M.Rotenberg，A.Lubetsky，J.Roitelman，D.Harats，H.Halkin，andD.Ezra.2001.Interindividualvariabilityinsensitivitytowarfarin--Natureornurture？ClinPharmacolTher70(2)159-64)。細(xì)胞色素CYP2C9還可代謝用于治療腦部損傷的苯妥英(Phenytoin)(見，例如vanderWeide，J.，L.S.Steijns，M.J.vanWeelden，andK.deHaan.2001.TheeffectofgeneticpolymorphismofcytochromeP450CYP2C9onphenytoindoserequirement.Pharmacogenetics11(4)287-91；Brandolese，R.，M.G.Scordo，E.Spina，M.Gusella，andR.Padrini.2001.SeverephenytoinintoxicationinasubjecthomozygousforCYP2C9*3.ClinPharmacolTher70(4)391-4)。此外，細(xì)胞色素CYP2C19可代謝用于治療胃酸返流疾病的奧美拉唑(Omeprazole)(見，例如Balian，J.D.，N.Sukhova，J.W.Harris，J.Hewett，L.Pickle，J.A.Goldstein，R.L.Woosley，andD.A.Flockhart.1995.ThehydroxylationofomeprazolecorrelateswithS-mephenytoinmetabolismapopulationstudy.ClinPharmacolTher57(6)662-9；Tybring，G.，Y.Bottiger，J.Widen，andL.Bertilsson.1997.EnantioselectivehydroxylationofomeprazolecatalyzedbyCYP2C19inSwedishwhitesubjects.ClinPharmacolTher62(2)129-37)。在又一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼二氫嘧啶脫氫酶的序列或序列片段。二氫嘧啶脫氫酶可代謝氟尿嘧啶(其被用于治療抗腫瘤類疾病(對(duì)多種癌癥的治療))(見，例如Tuchman，M.，J.S.Stoeckeler，D.T.Kiang，R.F.O′Dea，M.L.Ramnaraine，andB.L.Mirkin.1985.Familialpyrimidinemiaandpyrimidinuriaassociatedwithseverefluorouraciltoxicity.NEnglJMed313(4)245-9；Diasio，R.B.，T.L.Beavers，andJ.T.Carpenter.1988.Familialdeficiencyofdihydropyrimidinedehydrogenase.Biochemicalbasisforfamilialpyrimidinemiaandsevere5-fluorouracil-inducedtoxicity.JClinInvest81(1)47-51)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼丁酰膽堿酯酶的序列或序列片段，丁酰膽堿酯酶可代謝作為肌肉弛緩劑的琥珀膽堿(見，例如Lockridge，O.1990.Geneticvariantsofhumanserumcholinesteraseinfuencemetabolismofthemusclerelaxantsuccinylcholine.PharmacolTher47(1)35-60；andCeppa，F(xiàn).，S.Gidenne，A.Benois，E.Fontan，andP.Burnat.2002.RapididentificationofatypicalvariantofplasmabutyrylcholinesterasebyPCR.ClinChemLabMed40(8)799-801)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2的序列或序列片段，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2可代謝用于治療結(jié)核病的異煙肼(Isoniazid)(見，例如Furet，Y.，Y.Bechtel，C.LeGuellec，P.R.Bechtel，E.Autret-Leca，andG.Paintaud.2002.ClinicalrelevanceofN-acetyltransferasetype2(NAT2)geneticpo1ymorphism，Therapie57(5)427-31；Kita，T.，Y.Tanigawara，S.Chikazawa，H.Hatanaka，T.Sakaeda，F(xiàn).Komada，S.Iwakawa，andK.Okumura.2001.N-Acetyltransferase2genotypecorrelatedwithisoniazidacetylationinJapanesetuberculouspatients.BiolPharmBull24(5)544-9；andHiratsuka，M.2002.Developmentofsimplifiedandrapiddetectionassayforgeneticpolymorphismsinfluencingdrugresponseanditsclinicalapplications.YakugakuZasshi122(7)451-63)。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2還可代謝用于治療抗高血壓的肼苯噠嗪(Hydralazine)(見，例如Timbrell，J.A.，S.J.Harland，andV.Facchini.1980.Polymorphicacetylationofhydralazine.ClinPharmacolTher28(3)350-5；和Zschieschang，P.，F(xiàn).Hiepe，E.Gromnica-Ihle，I.Roots，andI.Cascorbi.2002.LackofassociationbetweenarylamineN-acetyltransferase2(NAT2)polymorphismandsystemiclupuserythematosus.Pharmacogenetics12(7)559-63)。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2可代謝用于治療抗心律不齊的普魯卡因胺(Procainamide)(見，例如Reidenberg，M.M.，D.E.Drayer，M.Levy，andH.Warner.1975.Polymorphicacetylationprocainamideinman.ClinPharmacolTher17(6)722-30；andHickman，D.，J.R.Palamanda，J.D.Unadlcat，andE.Sim.1995.EnzymekineticpropertiesofhumanrecombinantarylamineN-acetyltransferase2allotypicvariantsexpressedinEscherichiacoli.BiochemPharmacol50(5)697-703)。在另一個(gè)方面，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(ruidinedisphosphate-glucuronosyltransferase)1A1的序列或序列片段。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1可代謝用于治療直腸癌的伊立替康(Irinotecan)(見，例如Iyer，L.，D.Hall，S.Das，M.A.Mortell，J.Ramirez，S.Kim，A.DiRienzo，andM.J.Ratain.1999.Phenotype-genotypecorrelationofinvitroSN-38(activemetaboliteofirinotecan)andbilirubinglucuronidationinhumanlivertissuewithUGT1A1promoterpolymorphism.ClinPharmacolTher65(5)576-82；Ando，Y.，H.Saka，G.Asai，S.Sugiura，K.Shimokata，andT.Kamataki.1998.UGTlAlgenotypesandglucuronidationofSN-38，theactivemetaboliteofirinotecan.AnnOncol9(8)845-7)。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1還可代謝用于治療Gilbert’s綜合征(溫和的肝臟紊亂)的膽紅素(見，例如Bosma，P.J.，J.R.Chowdhury，C.Bakker，S.Gantla，A.deBoer，B.A.Oostra，D.Lindhout，G.N.Tytgat，P.L.Jansen，R.P.OudeElferink，andetal.1995.ThegeneticbasisofthereducedexpressionofbilirubinUDP-glucuronosyltransferase1inGilbert′ssyndrome.NEnglJMed333(18)1171-5；Kim，Y.H.，J.E.Yeon，G.M.Jung，H.J.Kim，J.S.Kim，K.S.Byun，Y.T.Bak，andC.H.Lee.2002.AstudyofpolymorphisminUDP-glucuronosyltransferase1(UGT-1A1)promotergeneinKoreanpatientswithGilbert′ssyndrome.TaehanKanHakhoeChi8(2)132-8)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼硫嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶的序列或序列片段，硫嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶可代謝用于治療Crohn′s癥的巰基嘌呤(Mercaptopurine)(見，例如Weinshilboum，R.M.1992.Methylationpharmacogeneticsthiopurinemethyltransferaseasamodelsystem.Xenobiotica22(9-10)1055-71；andWennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，andL.L.Gustafsson.1999.DecreasedcapacityfordebrisoquinemetabolismamongblackTanzaniansanalysesoftheCYP2D6genotypeandphenotype.Pharmacogenetics9(6)707-14)。硫嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶還可代謝也是用于治療Crohn′s癥的咪唑硫嘌呤(Azathioprine)(見，例如Kaskas，B.A.，E.Louis，U.Hindorf，E.Schaeffeler，J.Deflandre，F(xiàn).Graepler，K.Schmiegelow，M.Gregor，U.M.Zanger，M.Eichelbaum，andM.Schwab.2003.SafetreatmentofthiopurineS-methyltransferasedeficientCrohn′sdiseasepatientswithazathioprine.Gut52(1)140-2；andMarra，C.A.，J.M.Esdaile，andA.H.Anis.2002.PracticalPharmacogenetiesTheCostEffectivenessofScreeningforThiopurines-MethyltransferasePolymorphismsinPatientswithRheumatologicalConditionsTreatedwithAzathioprine.JRheumatol29(12)2507-12)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶的序列或序列片段，兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶可代謝用于治療Parkinson′s癥的左旋多巴(Levodopa)(見，例如Reilly，D.K.，L.Rivera-Calimlim，andD.VanDyke.1980.Catechol-O-methyltransferaseactivityadeterminantoflevodoparesponse.ClinPharmacolTher28(2)278-86；andWennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，andL.L.Gustafsson.1999.DecreasedcapacityfordebrisoquinemetabolismamongblackTanzaniansanalysesoftheCYP2D6genotypeandphenotype.Pharmacogenetics9(6)707-14)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)與藥物抗性相關(guān)的遺傳多態(tài)性。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)ACE多態(tài)性，其會(huì)影響到ACE抑制劑抗高血壓藥(用于治療心力衰竭)的應(yīng)答(見，例如Jacobsen，P.，K.Rossing，P.Rossing，L.Tarnow，C.Mallet，O.Poirier，F(xiàn).Cambien，andH.H.Parving.1998.AngiotensinconvertingenzymegenepolymorphismandACEinhibitionindiabeticnephropathy.KidneyInt53(4)1002-6；Kohno，M.，K.Yokokawa，M.Minami，H.Kano，K.Yasunari，T.Hanehira，andJ.Yoshikawa.1999.Associationbetweenangiotensin-convertingenzymegenepolymorphismsandregressionofleftventricularhypertrophyinpatientstreatedwithangiotensin-convertingenzymeinhibitors.AmJMed106(5)544-9)。ACE多態(tài)性還會(huì)影響對(duì)氟伐他汀(Fluvastatin，用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化)的應(yīng)答(見，例如Marian，A.J.，F(xiàn).Safavi，L.Ferlic，J.K.Dunn，A.M.Gotto，andC.M.Ballantyne.2000.Interactionsbetweenangiotensin-Iconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphismandresponseofplasmalipidsandcoronaryatherosclerosistotreatmentwithfluvastatinthelipoproteinandcoronaryatherosclerosisstudy.JAmCollCardiol35(1)89-95；Bosse，Y.，M.C.Vohl，M.Dumont，M.Brochu，J.Bergeron，J.P.Despres，andD.Prud′homme.2002.Influenceoftheangiotensin-convertingenzymegeneinsertion/deletionpolymorphismonlipoprotein/lipidresponsetogemfibrozil.ClinGenet62(1)45-52)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)花生四烯酸5-酯加氧酶多態(tài)性，其會(huì)影響到用作為抗炎藥的白細(xì)胞三烯抑制劑的應(yīng)答(見，例如Fowler，S.J.，I.P.Hall，A.M.Wilson，A.P.Wheatley，andB.J.Lipworth.2002.5-Lipoxygenasepolymorphismandin-vivoresponsetoleukotrienereceptorantagonists.EurJClinPharmacol58(3)187-90；andKoshino，T.，S.Takano，S.Kitani，N.Ohshima，Y.Sano，T.Takaishi，K.Hirai，K.Yamamoto，andY.Morita.1999.Novelpolymorphismofthe5-lipoxygenaseactivatingprotein(FLAP)promotergeneassociatedwithasthma.MolCellBiolResCommun2(1)32-5)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)β2-腎上腺素受體多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療哮喘和肺部疾病的β2激動(dòng)藥的應(yīng)答(見，例如Liggett，S.B.2000.beta(2)-adrenergicreceptorpharmacogenetics.AmJRespirCritCareMed161(3Pt2)S197-201；Dishy，V.，G.G.Sofowora，H.G.Xie，R.B.Kim，D.W.Byrne，C.M.Stein，andA.J.Wood.2001.Theeffectofcommonpolymorphismsofthebeta2-adrenergicreceptoronagonist-mediatedvasculardesensitization.NEnglJMed345(14)1030-5)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)緩激肽B2受體多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療心力衰竭的ACE抑制劑的應(yīng)答(見，例如Mukae，S.，S.Aoki，S.Itoh，T.Iwata，H.Ueda，andT.Katagiri.2000.BradykininB(2)receptorgenepolymorphismisassociatedwithangiotensin-convertingenzymeinhibitor-relatedcough.Hypertension36(1)127-31；Mukae，S.，S.Itoh，S.Aoki，T.Iwata，K.Nishio，R.Sato，andT.Katagiri.2002.Associationofpolymorphismsoftherenin-angiotensinsystemandbradykininB2receptorwithACE-inhibitor-relatedcough.JHumHypertens16(12)857-63)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)多巴胺受體(D2、D3、D4)多態(tài)性，其會(huì)影響到抗精神病藥的應(yīng)答(見，例如Arranz，M.J.，J.Munro，J.Birkett，A.Bolonna，D.Mancama，M.Sodhi，K.P.Lesch，J.F.Meyer，P.Sham，D.A.Collier，R.M.Murray，andR.W.Kerwin.2000.Pharmacogeneticpredictionofclozapineresponse.Lancet355(9215)1615-6；IBasile，V.S.，M.Masellis，F(xiàn).Badri，A.D.Paterson，H.Y.Meltzer，J.A.Lieberman，S.G.Potkin，F(xiàn).Macciardi，andJ.L.Kennedy.1999.AssociationoftheMscIpolymorphismofthedopamineD3receptorgenewithtardivedyskinesiainschizophrenia.Neuropsychopharmacology21(1)17-27)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)雌激素(Estrogen)受體-α多態(tài)性，其會(huì)影響到共軛雌激素的應(yīng)答，并可用于對(duì)絕經(jīng)、骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行的激素替代療法(見，例如Herrington，D.M.，T.D.Howard，G.A.Hawkins，D.M.Reboussin，J.Xu，S.L.Zheng，K.B.Brosnihan，D.A.Meyers，andE.R.Bleecker.2002.Estrogen-receptorpolymorphismsandeffectsofestrogenreplacementonhigh-densitylipoproteincholesterolinwomenwithcoronarydisease.NEnglJMed346(13)967-74；Ongphiphadhanakul，B.，S.Chanprasertyothin，P.Payatikul，S.S.Tung，N.Piaseu，L.Chailurkit，S.Chansirikarn，G.Puavilai，andR.Rajatanavin.2000.Oestrogen-receptor-alphagenepolymorphismaffectsresponseinbonemineraldensitytooestrogeninpost-menopausalwomen.ClinEndocrinol(Oxf)52(5)581-5)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)糖蛋白IIb/IIIa的糖蛋白IIIa亞基多態(tài)性，其會(huì)影響到阿司匹林或糖蛋白IIb/IIIa抑制劑(用于治療心肌梗塞)的應(yīng)答(見，例如Michelson，A.D.，M.I.Furman，P.Goldschmidt-Clermont，M.A.Mascelli，C.Hendrix，L.Coleman，J.Hamlington，M.R.Barnard，T.Kickler，D.J.Christie，S.Kundu，andP.F.Bray.2000.PlateletGPIIIaP1(A)polymorphismsdisplaydifferentsensitivitiestoagonists.Circulation101(9)1013-8；Andrioli，G.，P.Minuz，P.Solero，S.Pincelli，R.Ortolani，S.Lussignoli，andP.Bellavite.2000.DefectiveplateletresponsetoarachidonicacidandthromboxaneA(2)insubjectswithP1(A2)polymorphismofbeta(3)subunit(glycoproteinIIIa).BrJHaematol110(4)911-8)。在又一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)復(fù)合胺(5-羥色胺)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療Alzheimer′s癥和抑郁癥的抗抑郁藥的應(yīng)答(見，例如Kim，D.K.，S.W.Lim，S.Lee，S.E.Sohn，S.Kim，C.G.Hahn，andB.J.Carroll.2000.Serotonintransportergenepolymorphismandantidepressantresponse.Neuroreport11(1)215-9和Smeraldi，E.，R.Zanardi，F(xiàn).Benedetti，D.DiBella，J.Perez，andM.Catalano.1998.Polymorphismwithinthepromoteroftheserotonintransportergeneandantidepressantefficacyoffluvoxamine.MolPsychiatry3(6)508-11)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)內(nèi)收蛋白(adducin)多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療心肌梗塞、高血壓的利尿劑的應(yīng)答(見，例如Sciarrone，M.T.，P.Stella，C.Barlassina，P.Manunta，C.Lanzani，G.Bianchi，andD.Cusi.2003.ACEandalpha-adducinpolymorphismasmarkersofindividualresponsetodiuretictherapy.Hypertension41(3)398-403；Psaty，B.M.，N.L.Smith，S.R.Heckbert，H.L.Vos，R.N.Lemaitre，A.P.Reiner，D.S.Siscovick，J.Bis，T.Lumley，W.T.Longstreth，Jr.，andF.R.Rosendaal.2002.Diuretictherapy，thealpha-adducingenevariant，andtheriskofmyocardialinfarctionorstrokeinpersonswithtreatedhypertension.Jama287(13)1680-9)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)載脂蛋白E(APOE)多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療冠狀動(dòng)脈疾病、膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化的斯達(dá)汀(statin)的應(yīng)答(見，例如Ordovas，J.M.，J.Lopez-Miranda，F(xiàn).Perez-Jimenez，C.Rodriguez，J.S.Park，T.Cole，andE.J.Schaefer.1995.EffectofapolipoproteinEandA-IVphenotypesonthelowdensitylipoproteinresponsetoHMGCoAreductaseinhibitortherapy.Atherosclerosis113(2)157-66；Gerdes，L.U.，C.Gerdes，K.Kervinen，M.Savolainen，I.C.Klausen，P.S.Hansen，Y.A.Kesaniemi，andO.Faergeman.2000.Theapolipoproteinepsilon4alleledeterminesprognosisandtheeffectonprognosisofsimvastatininsurvivorsofmyocardialinfarctionasubstudyoftheScandinaviansimvastatinsurvivalstudy.Circulation101(12)1366-71)。APOE多態(tài)性還能影響到用于治療Alzheimer’s癥的他克林(Tacrine)的應(yīng)答(見，例如Poirier，J.，M.C.Delisle，R.Quirion，I.Aubert，M.Farlow，D.Lahiri，S.Hui，P.Bertrand，J.Nalbantoglu，B.M.Gilfix，andetal.1995.ApolipoproteinE4alleleasapredictorofcholinergicdeficitsandtreatmentoutcomeinAlzheimerdisease.ProcNatlAcadSciUSA92(26)12260-4.Poirier，J.1999.ApolipoproteinEapharmacogenetictargetforthetreatmentofAlzheimer′sdisease.MolDiagn4(4)335-41；Soininen，H.，O.Kosunen，S.Helisalmi，A.Mannermaa，L.Paljarvi，S.Talasniemi，M.Ryynanen，andP.Riekkinen，Sr.1995.AseverelossofcholineacetyltransferaseinthefrontalcortexofAlzheimerpatientscarryingapolipoproteinepsilon4allele.NeurosciLett187(2)79-82)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)HLA多態(tài)性，其會(huì)影響到用作為抗病毒藥及用于治療HIV的阿巴卡韋(Abacavir)的應(yīng)答(見，例如Mallal，S.，D.Nolan，C.Witt，G.Masel，A.M.Martin，C.Moore，D.Sayer，A.Castley，C.Mamotte，D.Maxwell，I.James，andF.T.Christiansen.2002.AssociationbetweenpresenceofHLA-B*5701，HLA-DR7，andHLA-DQ3andhypersensitivitytoHIV-1reverse-transcriptaseinhibitorabacavir.Lancet359(9308)727-32和Hetherington，S.，A.R.Hughes，M.Mosteller，D.Shortino，K.L.Baker，W.Spreen，E.Lai，K.Davies，A.Handley，D.J.Dow，M.E.Fling，M.Stocum，C.Bowman，L.M.Thurmond，andA.D.Roses.2002.GeneticvariationsinHLA-BregionandhyPersensitivityreactionstoabacavir.Lancet359(9312)1121-2)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療冠狀動(dòng)脈疾病、膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化的斯達(dá)汀的應(yīng)答(見，例如Kuivenhoven，J.A.，J.W.Jukema，A.H.Zwinderman，P.deKnjiff.R.McPherson，A.V.Bruschke，K.I.Lie，andJ.J.Kastelein.1998.Theroleofacommonvariantofthecholesterylestertransferproteingeneintheprogressionofcoronaryatherosclerosis.TheRegressionGrowthEvaluationStatinStudyGroup.NEnglJMed338(2)86-93；Rump，P.，R.P.Mensink，andG.Hornstra.2002.InteractionbetweenacommonvariantofthecholesterylestertransferproteingeneandtheapolipoproteinEpolymorphismeffectsonplasmalipidsandlipoproteinsinacohortof7-year-oldchildren.NutrMetabCardiovascDis12(6)317-24和vanVenrooij，F(xiàn).V.，R.P.Stolk，J.D.Banga，T.P.Sijmonsma，A.vanTol，D.W.Erkelens，andG.M.Dallinga-Thie.2003.Commoncholesterylestertransferproteingenepolymorphismsandtheeffectofatorvastatintherapyintype2diabetes.DiabetesCare26(4)1216-23)。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)離子通道相關(guān)的多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療細(xì)菌感染的紅霉素(一種抗生素)的應(yīng)答(見，例如Sesti，F(xiàn).，G.W.Abbott，J.Wei，K.T.Murray，S.Saksena，P.J.Schwartz，S.G.Priori，D.M.Roden，A.L.George，Jr.，andS.A.Goldstein.2000.Acommonpolymorphismassociatedwithantibiotic-inducedcardiacarrhythmia.ProcNatlAcadSciUSA97(19)10613-8；Abbott，G.W.，F(xiàn).Sesti，I.Splawslci，M.E.Buck，M.H.Lehmann，K.W.Timothy，M.T.Keating，andS.A.Goldstein.1999.MiRPlformsIKrpotassiumchannelswithHERGandisassociatedwithcardiacarrhythmia.Cell97(2)175-87)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療膠質(zhì)瘤的卡氯芥(Carmustine)的應(yīng)答(見，例如Esteller，M.，J.Garcia-Foncillas，E.Andion，S.N.Goodman，O.F.Hidalgo，V.Vanaclocha，S.B.Baylin，andJ.G.Herman.2000.InactivationoftheDNA-repairgeneMGMTandtheclinicalresponseofgliomastoalkylatingagents.NEnglJMed343(19)1350-4；Gerson，S.L.2002.ClinicalrelevanceofMGMTinthetreatmentofcancer.JClinOncol20(9)2388-99)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)Parkin多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療parkinson′s癥的左旋多巴的應(yīng)答(見，例如Lucking，C.B.，A.Durr，V.Bonifati，J.Vaughan，G.DeMichele，T.Gasser，B.S.Harhangi，G.Meco，P.Denefle，N.W.Wood，Y.Agid，andA.Brice.2000.Associationbetweenearly-onsetParkinson′sdiseaseandmutationsintheparkingene.FrenchParkinson′sDiseaseGeneticsStudyGroup.NEnglJMed342(21)1560-7；Bonifati，V.，G.DeMichele，C.B.Lucking，A.Durr，E.Fabrizio，G.Ambrosio，N.Vanacore，M.DeMari，R.Marconi，L.Capus，M.M.Breteler，T.Gasser，B.Oostra，N.Wood，Y.Agid，A.Filla，G.Meco，andA.Brice.2001.Theparkingeneanditsphenotype.ItalianPDGeneticsStudyGroup，F(xiàn)renchPDGeneticsStudyGroupandtheEuropeanConsortiumonGeneticSusceptibilityinParkinson′sDisease.NeurolSci22(1)51-2)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)凝血素和因子V多態(tài)性，其會(huì)影響到口服避孕藥的應(yīng)答，并能指示出血栓形成發(fā)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)(見，例如Tassin，J.，A.Durr，A.M.Bonnet，R.Gil，M.Vidailhet，C.B.Lucking，J.Y.Goas，F(xiàn).Durif，M.Abada，B.Echenne，J.Motte，A.Lagueny，L.Lacomblez，P.Jedynak，B.Bartholome，Y.Agid，andA.Brice.2000.Levodopa-responsivedystonia.GTPcyclohydrolaseIorparkinmutations？Brain123(Pt6)1112-21；Martinelli，I.，E.Sacchi，G.Landi，E.Taioli，F(xiàn).Duca，andP.M.Mannucci.1998.Highriskofcerebral-veinthrombosisincarriersofaprothrombin-genemutationandinusersoforalcontraceptives.NEnglJMed338(25)1793-7；andMartinelli，I.，E.Taioli，P.Bucciarelli，S.Akhavan，andP.M.Mannucci.1999.InteractionbetweentheG20210Amutationoftheprothrombingeneandoralcontraceptiveuseindeepveinthrombosis.ArteriosclerThrombVaseBiol19(3)700-3)。核酸類似物還可被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)基質(zhì)溶解酶-1(Stromelysin-1)多態(tài)性，其會(huì)影響到用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的斯達(dá)汀的應(yīng)答(見，例如Legnani，C.，G.Palareti，G.Guazzaloca，B.Cosmi，B.Lunghi，F(xiàn).Bernard，andS.Coccheri.2002.Venousthromboembolisminyoungwomen；roleofthrombophilicmutationsandoralcontraceptiveuse.EurHeartJ23(12)984-90；Liggett，S.B.2000.beta(2)-adrenergicreceptorpharmacogenetics.AmJRespirCritCareMed161(3Pt2)S197-201；Humphries，S.E.，L.A.Luong，P.J.Talmud，M.H.Frick，Y.A.Kesaniemi，A.Pasternack，M.R.Taskinen，andM.Syvanne.1998.The5A/6Apolymorphisminthepromoterofthestromelysin-1(MMP-3)genepredictsprogressionofangiographicallydeterminedcoronaryarterydiseaseinmenintheLOCATgemfibrozilstudy.LopidCoronaryAngiographyTrial.Atherosclerosis139(1)49-56).Humphries，S.，C.Bauters，A.Meirhaeghe，L.Luong，M.Bertrand，andP.Amouyel.2002.The5A6Apolymorphisminthepromoterofthestromelysin-1(MMP3)geneasariskfactorforrestenosis.EurHeartJ23(9)721-5；anddeMaat，M.P.，J.W.Jukema，S.Ye，A.H.Zwinderman，P.H.Moghaddam，M.Beekman，J.J.Kastelein，A.J.vanBoven，A.V.Bruschke，S.E.Humphries，C.Kluft，andA.M.Henney.1999.Effectofthestromelysin-1promoteronefficacyofpravastatinincoronaryatherosclerosisandrestenosis.AmJCardiol83(6)852-6)。K.經(jīng)遺傳修飾的生物本文公開的方法還提供了對(duì)是否存在經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)進(jìn)行快速且靈敏的診斷試驗(yàn)的方法。GMO的例子包括但不限于其中一種或多種基因已經(jīng)經(jīng)過修飾、添加或缺失的生物。GMO可具有如下特征存在一種或多種特定基因、不存在一種或多種特定基因、特定變化、或一種或多種特定基因的表達(dá)有所改變。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為用于與GMO所特有的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)。用本反應(yīng)的方法可對(duì)GMO是否存在和存在的量進(jìn)行測(cè)量。L.非本地植物和動(dòng)物本文公開的方法還提供了對(duì)非本地植物和動(dòng)物是否存在以及存在的數(shù)量進(jìn)行快速且靈敏的診斷試驗(yàn)的方法。對(duì)特定區(qū)域來(lái)說是非本地的生物會(huì)對(duì)本地植物和動(dòng)物造成環(huán)境和生物危害。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為與非本地植物和動(dòng)物所特有的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)。用本發(fā)明的方法，可對(duì)是否存在非本地植物和動(dòng)物以及存在的量進(jìn)行測(cè)量。M.農(nóng)業(yè)應(yīng)用本文公開的方法還提供了對(duì)特定植物和植物變異體是否存在以及存在的數(shù)量進(jìn)行快速且靈敏的診斷試驗(yàn)的方法。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為與特定植物和植物變異體所特有的目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)。用本發(fā)明的方法，可對(duì)是否存在特定植物和植物變異體以及存在的量進(jìn)行測(cè)量。N.獸醫(yī)應(yīng)用本文公開的方法、組合物和分析系統(tǒng)還提供了用于獸醫(yī)應(yīng)用中的快速且靈敏的診斷試驗(yàn)方法。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)，所述目標(biāo)多核苷酸對(duì)應(yīng)于基于動(dòng)物的感染，或?qū)?yīng)于遺傳疾病或紊亂。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可被用于檢測(cè)是否存在狂犬病病毒或是否被其感染。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)狂犬病進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定狂犬病的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如ItoM，ItouT，ShojiY，SakaiT，ItoFH，AraiYT，TakasakiT，KuraneI.Discriminationbetweendog-relatedandvampirebat-relatedrabiesvirusesinBrazilbystrain-specificreversetranscriptase-polymerasechainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis.JClinVirol.2003Apr；26(3)317-30；BlackEM，LowingsJP，SmithJ，HeatonPR，McElhinneyLM.ArapidRT-PCRmethodtodifferentiatesixestablishedgenotypesofrabiesandrabies-relatedvirusesusingTaqMantechnology.JVirolMethods.2002Aug；105(1)25-35；DavidD，YakobsonB，RotenbergD，DveresN，DavidsonI，StramY.RabiesvirusdetectionbyRT-PCRindecomposednaturallyinfectedbrains.VetMicrobiol.2002Jun20；87(2)111-8；ItoM，ItouT，SakaiT，SantosMF，AraiYT，TakasakiT，KuraneI，ItoFH.DetectionofrabiesvirusRNAisolatedfromseveralspeciesofanimalsinBrazilbyRT-PCR，JVetMedSci.2001Dec；63(12)1309-13)。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于檢測(cè)豬應(yīng)激綜合征。豬應(yīng)激綜合征是蘭尼定(ryanodine)受體(RYR-1)基因(同源的或異源的)突變所導(dǎo)致的。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)豬應(yīng)激綜合征進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定豬應(yīng)激綜合征的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如LeeSH，ChoKK，KangSK，KimCW，ParkHC，ChoyYH，ChoiYJ.Detectionofpigsresistanttopost-weaningdiarrheaea，oedemadiseaseandporcinestresssyndromebyallele-specificpolymerasechainreaction.AnimGenet.2002Jun；33(3)237-9，BuH，LiuJ，LiSF.TheRYR1genotypeofChineseinbredpigs.ZhongguoXiuFuChongJianWaiKeZaZhi.2000Sep；14(5)311-4)。本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于檢測(cè)高鉀性周期性麻痹疾病(HyPP)。HyPP是美國(guó)夸特(Quarter)馬或雜交種的遺傳疾病。數(shù)據(jù)暗示，HyPP作為共顯性遺傳缺陷被遺傳，因?yàn)榧兒象w較之雜合體顯示出更為嚴(yán)重的臨床征候。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)HyPP進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于檢測(cè)FeCV(貓科冠狀病毒)。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)貓科冠狀病毒進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定貓科冠狀病毒的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如KennedyM，CitinoS，McNabbAH，MoffattAS，GertzK，KaniaS.DetectionoffelinecoronavirusincaptiveFelidaeintheUSA.JVetDiagnInvest.2002Nov；14(6)520-2；AddieDD，JarrettO.Useofareverse-transcriptasepolymerasechainreactionformonitoringthesheddingoffelinecoronavirusbyhealthycats.VetRec.2001May26；148(21)649-53；HerreweghAA，MahlerM，HedrichHJ，HaagmansBL，EgberinkHF，HorzinekMC，RottierPJ，deGrootRJ.Persistenceandevolutionoffelinecoronavirusinaclosedcat-breedingcolony.Virology.1997Aug4；234(2)349-63)。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)可用于檢測(cè)FIP病毒(普遍存在于貓科腸道的冠狀病毒(FECV)的突變體)是否存在或是否被其感染。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)FIP病毒進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定FIP的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如Gunn-MooreDA，Gruffydd-JonesTJ，HarbourDA.Detectionoffelinecoronavirusesbycultureandreversetranscriptase-polymerasechainreactionofbloodsamplesfromhealthycatsandcatswithclinicalfelineinfectiousperitonitis.VetMicrobiol.1998Jul；62(3)193-205；KennedyM，BoedekerN，GibbsP，KaniaS.Deletionsinthe7aORFoffelinecoronavirusassociatedwithanepidemicoffelineinfectiousperitonitis.VetMicrobiol.2001Aug8；81(3)227-34)。本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)還可用于檢測(cè)馬傳染性貧血癥病毒(EIAV)是否存在或是否被其感染。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)EIAV病毒進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定EIAV的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如CookRF，CookSJ，LiFL，MontelaroRC，IsselCJ.Developmentofamultiplexreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionforequineinfectiousanemiavirus(EIAV).JVirolMethods.2002Aug；105(1)171-9；LangemeierJL，CookSJ，CookRF，RushlowKE，MontelaroRC，IsselCJ.DetectionofequineinfectiousanemiaviralRNAinplasmasamplesfromrecentlyinfectedandlong-terminapparentcarrieranimalsbyPCR.JClinMicrobiol.1996Jun；34(6)1481-7；NagarajanMM，SimardC.Detectionofhorsesinfectednaturallywithequineinfectiousanemiavirusbynestedpolymerasechainreaction.JVirolMethods.2001May；94(1-2)97-109)。本發(fā)明的方法、組合物和分析系統(tǒng)還可用于檢測(cè)Brucellaovis是否存在或是否被其感染。核酸類似物可被設(shè)計(jì)為具有用于對(duì)Brucellaovis病毒進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)的引物的序列。用于通過基于PCR的分析來(lái)鑒定Brucellaovis的引物的例子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(見，例如ManterolaL，Tejero-GarcesA，F(xiàn)icapalA，ShopayevaG，BlascoJM，MarinCM，Lopez-GoniI.EvaluationofaPCRtestforthediagnosisofBrucellaovisinfectioninsemensamplesfromrams.，VetMicrobiol.2003Mar20；92(1-2)65-72；HamdyME，AminAS.DetectionofBrucellaspeciesinthemilkofinfectedcattle，sheep，goatsandcamelsbyPCR.VetJ.2002May；163(3)299-305；BrickerBJ，HallingSM.DifferentiationofBrucellaabortusbv.1，2，and4，Brucellamelitensis，Brucellaovis，andBrucellasuisbv.1byPCR.JClinMicrobiol.1994Nov；32(11)2660-6)。前述例子僅僅是示例性的。目標(biāo)多核苷酸可以包括與本領(lǐng)域已知的、能賦予抗生素抗性的其它基因相對(duì)應(yīng)的多核苷酸。VIII.試劑盒在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的試劑盒。試劑盒可以包括一種或多種可用于本發(fā)明中的試劑，例如，染料、核酸類似物、光刺激的來(lái)源、緩沖液、用于對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)、顯示對(duì)照樣品陽(yáng)性或陰性以用于判斷反應(yīng)結(jié)果的參考(key)?？蛇x地，提供一種或多種緩沖液。試劑盒還可以包括對(duì)下文公開的組合物、說明書和/或其它可選的組分的合適的包裝。A.染料本文提供的試劑盒包括一種或多種染料。染料可以以預(yù)先包裝的量來(lái)提供，或者可以以單獨(dú)的小管來(lái)提供，從所述小管中可分出一定份量。還可以將染料進(jìn)一步包裝于任何合適的包裝中，以使其與試劑盒的其它組分分離，以及促進(jìn)組合物的調(diào)劑。B.核酸類似物試劑盒還可以包括一種或多種核酸類似物。核酸類似物可以是本文所述的任何形式的核酸類似物。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物是LNA。在另一種實(shí)施方式中，核酸類似物是PNA。核酸類似物可以具有任何與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的序列。所述序列可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何序列。在一種實(shí)施方式中，核酸類似物具有本文中公開的序列。核酸類似物可被提供于任何合適的容器中，并可以預(yù)先分裝為適于使用的份量，或者被提供于將進(jìn)行分裝的單獨(dú)的小管中。還可以將容器進(jìn)一步包裝于任何合適的包裝中，以使其與試劑盒的其它組分分離，以及促進(jìn)凈制組合物的調(diào)劑。在另一種實(shí)施方式中，同一包裝中可含有兩種或多種核酸類似物序列。試劑盒還可以包括媒介物，用于促進(jìn)核酸類似物與目標(biāo)多核苷酸有效雜交，例如鮭魚精DNA。C.光刺激的來(lái)源可選地，試劑盒還可以包括光刺激的來(lái)源。光源的非限制性的例子包括SylvaniaCoolWhiteT8-CW、GeneralElectricT8-C50和FritzAurora50/50、SylvaniaduluxS9WCF9DS/藍(lán)和OsramF9TT/50K。D.多核苷酸操作組分試劑盒還可包括用于對(duì)多核苷酸進(jìn)行操作的組分，例如緩沖液、酶、柱和其它物質(zhì)。緩沖液、酶、柱和其它物質(zhì)可以包括用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解或從細(xì)胞中提取DNA或RNA的那些。緩沖液、酶、柱和其它物質(zhì)還可包括用于對(duì)多核苷酸(包括DNA和RNA)進(jìn)行操作的組分。此類組分包括，例如，MolecularCloningALaboratoryManual，thirdedition(Sambrooketa1.，2000)ColdSpringHarborPress或本文公開的任何其它參考文獻(xiàn)中所公開的那些。E.說明書試劑盒還可包括用于開展本文所述的方法的說明書。說明書可作為單獨(dú)的部分和/或作為包裝或容器的一部分(例如，作為貼到容器上的標(biāo)簽，或者，被寫上去或用其它手段整合為容器一部分)被包括進(jìn)來(lái)。說明書可以告訴使用者應(yīng)用和/或移除試劑盒中內(nèi)含物的方法、關(guān)于對(duì)物質(zhì)進(jìn)行操作的預(yù)警和方法、期待結(jié)果、關(guān)于不正確使用的警告等。F.試劑盒的其它可選組分試劑盒還可含有可用于進(jìn)行本文公開的方法的組分。示例性的其它組分包括對(duì)化學(xué)物質(zhì)具有抗性的一次性包、試管、稀釋劑、手套、剪刀、記號(hào)筆和眼保護(hù)罩。實(shí)施例下述非限制性的實(shí)施例用于更為完整地描述使用上文所述的本發(fā)明的手段。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例并非以任何方式來(lái)限制本發(fā)明的范圍，其僅僅只作闡述示例目的之用。除非另有指明，下文中所有核酸類似物和DNA貯藏溶液都被配制于pH7.5的5mM磷酸緩沖液中。貯藏染料被配制于甲醇或DMSO中。實(shí)施例1用于檢測(cè)PNA/多核苷酸結(jié)合的基于液體的分析系統(tǒng)PNA/多核苷酸復(fù)合物的形成導(dǎo)致指示劑染料的顏色變化。花菜花葉病毒35S啟動(dòng)子DNA被用作為特定的目標(biāo)多核苷酸。染料是3’，3’-二乙基硫雜羰花青。在試管中，將15μM與花菜花葉病毒35S啟動(dòng)子互補(bǔ)的PNA分子(35SPNA)加入到5μM35S啟動(dòng)子DNA(35SDNA)中。PNA序列是CCCACCCACGAGG-LYS(SEQIDNO11)。加入處于5mM磷酸緩沖液(pH7.5)中的150μM染料。35SPNA和染料在系統(tǒng)中是過量的。顏色變化顯示多核苷酸的存在。用1μl2.5mM染料(稀釋于總體積為50μl的5mMPO4反應(yīng)緩沖液中)來(lái)進(jìn)行基于液體的分析。系統(tǒng)和方法都經(jīng)過檢驗(yàn)，其在pH4-10的范圍內(nèi)是成功的，但是，在pH大于5時(shí)，系統(tǒng)能更好地運(yùn)作。在時(shí)間為零時(shí)，pH4-10范圍內(nèi)的反應(yīng)看上去互相都近乎一致，但較之缺少PNA/目標(biāo)多核苷酸雜交體的對(duì)照具有更少的變動(dòng)。暴露給光刺激后，反應(yīng)物開始變澄清。進(jìn)一步暴露給光刺激后，有PNA/多核苷酸雜交體的反應(yīng)物變得完全澄清，pH6-10之間的反應(yīng)物變化速率都相同。具有PNA/多核苷酸雜交體的、pH4-5之間的反應(yīng)物具有殘余染料，以不同深淺的粉紅存在。已經(jīng)使用了大量10mM濃度的緩沖液。在不同的pH對(duì)一些緩沖液進(jìn)行了檢測(cè)。在高達(dá)0.5M的濃度下對(duì)NaPO4緩沖液進(jìn)行了檢測(cè)。最理想地，使用的緩沖液和鹽包括NaPO4、NaHSO4、K2HPO4、K2SO4和CaSO4。不能使本發(fā)明的方法成功進(jìn)行的緩沖液和鹽包括檸檬酸鈉、NaCl、CaH2PO4、FeSO4和MgSO4。本發(fā)明的方法還可使用純凈水、0.1％SDS、0.1％TritonX、0.1％Tween-20、3％丁醇、10％甲醇、10％異丙醇或10％DMSO、1X血液裂解緩沖液(0.15MNH4Cl、10mMNaHCO3、1mMEDTA)(pH7.4)或蔗糖裂解緩沖液(0.32M蔗糖、10mMTris、1％TritionX-100、5mMMgCl2)。在pH4、5、5.5、6、7、8、9、10處對(duì)磷酸鈉緩沖液進(jìn)行了檢驗(yàn)。在pH7.5時(shí)對(duì)其它所有緩沖液都進(jìn)行了檢驗(yàn)。pH7時(shí)，磷酸鈉緩沖液能提供最快的反應(yīng)。對(duì)每微升反應(yīng)物中300個(gè)目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。還檢測(cè)了濃度為1.5×1014目標(biāo)多核苷酸/反應(yīng)(3×1012目標(biāo)多核苷酸/μl反應(yīng)物)；108擴(kuò)增出的目標(biāo)多核苷酸/反應(yīng)(2×106擴(kuò)增目標(biāo)多核苷酸/μl反應(yīng)物)。實(shí)施例2測(cè)定PNA分子對(duì)PCR反應(yīng)的影響本實(shí)施例展示了不同PNA分子對(duì)PCR反應(yīng)的影響。PCR組分如下組分體積終濃度水38μlN/A上游引物，50μM0.5μl25μM下游引物，50μM0.5μl25μMMgCl2，25mM3μl1.5mM10X反應(yīng)緩沖液(Promega)5μl1XPCR核苷酸混合物(Promega)，1μl800μM10mM每種dNTPTaqDNA聚合酶，0.5μl0.05u/μlStorageBufferB(Promega)中，5u/μl10X反應(yīng)緩沖液的組成Tris-HCl100mMKCl500mMTritonX-1001％引物序列如下熱循環(huán)儀程序(MJResearchPTC-200)95℃，1分鐘42個(gè)循環(huán)94℃，10秒53℃，10秒72℃，20秒保存于4℃。通過PCR對(duì)下述樣品進(jìn)行分析，以確定PNA分子是否會(huì)抑制PCR反應(yīng)；1.1μlBt/RR玉米DNA(Bt/RR玉米已經(jīng)經(jīng)過了遺傳修飾)2.1μlBt/RR玉米DNA，1μlPNA(100mM)3.1μlBt/RR玉米DNA，5μlPNA(100mM)4.1μl水用2％TBEE瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀察PCR結(jié)果。對(duì)下述樣品進(jìn)行分析，以確定PNA的存在是否會(huì)抑制PCR。此外，測(cè)定PNA和甲醇對(duì)PCR效果的影響。1.1μlBt/RR玉米DNA2.1μlBt/RR玉米DNA，1μlPNA(100mM)3.1μlBt/RR玉米DNA，5μlPNA(100mM)4.1μlBt/RR玉米DNA，1μl甲醇5.1μlBt/RR玉米DNA，5μl甲醇6.1μlWater用2％TBEE瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀察PCR結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)向反應(yīng)物中加入1μlPNA時(shí)，PNA不抑制PCR(管2)。當(dāng)向向反應(yīng)物中加入5μlPNA時(shí)，PNA抑制PCR(管3)。當(dāng)向反應(yīng)物中加入1μl甲醇時(shí)，甲醇不抑制PCR(管4)。當(dāng)向反應(yīng)物中加入5μl甲醇時(shí)，甲醇抑制PCR(管5)。實(shí)施例3針對(duì)特定的目標(biāo)多核苷酸序列和PNA序列，對(duì)不同濃度的DNA分子，測(cè)定碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青光學(xué)性能受光刺激產(chǎn)生的變化的時(shí)間段。目標(biāo)多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)，互補(bǔ)的PNA分子是N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys.(SEQIDNO1)。目標(biāo)多核苷酸濃度是列于圖5的圖例說明中的那些。PNA濃度為14.4pmol/反應(yīng)。染料濃度為6nmol/反應(yīng)。圖5示出了對(duì)不同濃度的DNA而言，暴露給光刺激后碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料發(fā)射率隨時(shí)間的變化。用混合波長(zhǎng)的光源來(lái)刺激變化時(shí)，不同待測(cè)DNA濃度下的分析敏感度。圖例中描述了多核苷酸(本例中，DNA)的不同濃度。圖例濃度代表每項(xiàng)反應(yīng)中的DNA終濃度。(□)代表僅含有探針和染料的樣品；(△)代表僅含有染料的樣品；(×)代表僅含有緩沖液的樣品。圖6示出了不同DNA濃度下發(fā)射率的百分比變化。在較高的DNA濃度下，染料具有較高的發(fā)射率變化速率。通過對(duì)較高PNA濃度下染料光學(xué)性能變化速率與較低PNA濃度下(或不存在PNA時(shí))染料光學(xué)性能變化速率進(jìn)行比較，對(duì)目標(biāo)多核苷酸的存在情況進(jìn)行檢測(cè)，并可對(duì)其進(jìn)行定量，如圖10所示。多核苷酸濃度與圖5的圖例中所示一致。實(shí)施例4本實(shí)施例表明不同波長(zhǎng)的光刺激下，染料光學(xué)性能的變化速率也不同。將具有序列5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)的目標(biāo)多核苷酸(20pmol/反應(yīng))和具有序列N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQIDNO1)的PNA分子(14.4pmol/反應(yīng))與碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料組合起來(lái)，形成混合物。然后將該混合物暴露給不同光譜產(chǎn)生的光刺激(超過10分鐘)，測(cè)量染料發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化。圖7描述了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。用FritzAurora50/50可見光譜來(lái)產(chǎn)生白光刺激，產(chǎn)生400nm至700nm之間的波長(zhǎng)。用藍(lán)色濾光器來(lái)產(chǎn)生藍(lán)光刺激。得到的藍(lán)光在450nm至480nm之間。用綠色濾光器來(lái)產(chǎn)生綠光刺激。得到的綠光在450nm至480nm之間。用紅色濾光器來(lái)產(chǎn)生紅光刺激，得到的紅光在630nm至720nm之間。白光刺激得到了最大的發(fā)射率百分比變化。藍(lán)光和綠光波長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)射率的百分比變化初始時(shí)更慢。紅光波長(zhǎng)顯示了非常慢的發(fā)射率百分比變化。實(shí)施例5本實(shí)施例表明本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)核酸序列的區(qū)別。準(zhǔn)備兩種樣品。第一種樣品含有與DMO大豆多核苷酸中發(fā)現(xiàn)的GMO序列互補(bǔ)的PNA、GMO大豆多核苷酸以及碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青的混合物。第二種樣品含有與DMO大豆多核苷酸中發(fā)現(xiàn)的GMO序列互補(bǔ)的PNA、非GMO大豆多核苷酸以及碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青的混合物。暴露給光刺激后，對(duì)兩種樣品都觀察其發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化。對(duì)兩種混合物而言，大豆多核苷酸都是從大豆植株葉片中獲得的。在兩種混合物中，使用1μl經(jīng)過分離的DNA，反應(yīng)體積為100μl，DNA濃度為25ng/μl。圖8中示出了得到的發(fā)射率隨時(shí)間的變化速率。對(duì)樣品測(cè)量碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化，樣品中含有碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青、與經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)大豆的35S多核苷酸區(qū)域互補(bǔ)的PNA分子和經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)大豆多核苷酸或非GMO多核苷酸。染料的發(fā)射率變化來(lái)自PNA與GMO大豆的雜交，而雜交不會(huì)由非GMO大豆所導(dǎo)致。本方法能檢測(cè)到GMO大豆，而檢測(cè)不到的是非GMO大豆。本方法提供了檢測(cè)DNA中存在的多核苷酸序列的區(qū)別的方法。實(shí)施例6本實(shí)施例顯示可以通過下述方法來(lái)測(cè)定樣品中多核苷酸的含量測(cè)量具有未知濃度的多核苷酸的樣品中染料光學(xué)性能的變化速率，將光學(xué)性能的變化速率與已知的光學(xué)性能變化速率的曲線進(jìn)行比較。時(shí)間可以是固定的，可在特定的反應(yīng)時(shí)間對(duì)變化進(jìn)行測(cè)量。對(duì)速率的測(cè)定還可包括測(cè)定單個(gè)時(shí)間點(diǎn)處光學(xué)性能的變化，將光學(xué)性能的變化關(guān)聯(lián)于具有已知濃度的一種或多種樣品的濃度。計(jì)算出對(duì)一系列多核苷酸濃度而言，發(fā)射率發(fā)生20％變化所需要的時(shí)間。目標(biāo)多核苷酸序列是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)PNA分子序列是N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQIDNO1)。圖10中示出了作為目標(biāo)多核苷酸濃度的函數(shù)的降低20％所需要的時(shí)間。數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于圖6中的百分比變化數(shù)據(jù)。對(duì)分析的一種方式而言，對(duì)具有未知濃度的樣品，測(cè)量其發(fā)射率發(fā)生20％改變時(shí)的時(shí)間點(diǎn)?？赏ㄟ^外推標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定給定樣品中多核苷酸的含量。實(shí)施例7本實(shí)施例表明目標(biāo)多核苷酸可以是RNA。組合PNA、RNA和碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料。目標(biāo)RNA序列是5′CUACGGGAGGCAGCAGUG3′(SEQIDNO15)，PNA序列是通用的細(xì)菌PNA探針，其具有與RNA序列互補(bǔ)的序列。將混合物暴露給光刺激，測(cè)量染料的發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化，將其與包括DNA多核苷酸(用于代替RNA多核苷酸序列)的樣品進(jìn)行比較。圖11中示出了得到的光學(xué)性能隨時(shí)間的百分比變化。對(duì)20pmol目標(biāo)DNA/反應(yīng)(■)和目標(biāo)RNA(●)(RNA濃度為20pmol/反應(yīng)、10pmol/反應(yīng)和2pmol/反應(yīng))進(jìn)行了比較。Y軸代表較之僅有探針和染料的情況，熒光隨時(shí)間的百分比變化。RNA多核苷酸導(dǎo)致了染料的發(fā)射率隨時(shí)間變化?；谌玖瞎鈱W(xué)性能變化的速率，檢測(cè)到了RNA的存在。實(shí)施例8本實(shí)施例顯示，本方法可進(jìn)行于污染背景存在的情況下。在熟食肉汁的污染背景下，測(cè)量樣品中碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化。制備碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料和PNA分子。目標(biāo)多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)，PNA序列是CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQIDNO1)。圖12中示出了結(jié)果。其中示出了以(■)表示的未受污染的、清潔的系統(tǒng)的百分比變化，和濃度為1□l、2□l和4□l的熟食肉汁背景中受污染的樣品(以空心圖例表示)中的百分比變化。本例說明可以在受污染背景中檢測(cè)到多核苷酸的存在實(shí)施例9圖13描述了向系統(tǒng)中加入PNA“楔子”。將生物素化的PNA((5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt)(SEQIDNO16)結(jié)合到鏈親合素孔上，然后與多核苷酸反應(yīng)。雜交后，加入染料，系統(tǒng)被暴露于光刺激中，然后測(cè)量隨時(shí)間的百分比變化。多核苷酸可以是合成的多核苷酸或是擴(kuò)增子(amplicon)目標(biāo)多核苷酸。“試驗(yàn)/a”代表35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)和195bp的擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸?！霸囼?yàn)/a+1”包括35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)以及195bp的擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸和PNA5′tcttctttttccacg-LYS(SEQIDNO17)?！霸囼?yàn)/a+2”包括35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)以及195bp的擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸和PNA5′tcttctttttccacg-LYS(SEQIDNO17)?！霸囼?yàn)/a+b”包括35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)以及195bp的擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸、5′tcttctttttccacg-LYS(SEQIDNO17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQIDNO18)?！霸囼?yàn)/a+bpre”包括35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)以及195bp的擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸、5′tcttctttttccacg-LYS(SEQIDNO17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQIDNO18)，其中，在與結(jié)合的PNA雜交之前，5′tcttctttttccacg-LYS(SEQIDNO17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQIDNO18)與擴(kuò)增子目標(biāo)多核苷酸共同溫育?！霸囼?yàn)/o”代表35SPNA5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)以及互補(bǔ)的多核苷酸.接頭(linker)-oo-是8-氨基-3，6-二氧辛酸。在本實(shí)施方式和其它實(shí)施方式中，接頭可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知得任何化學(xué)連接基團(tuán)。將核酸類似物加入到目標(biāo)多核苷酸的不同位點(diǎn)會(huì)改變變化速率。實(shí)施例10本實(shí)施例描述了不同波長(zhǎng)下染料光學(xué)性能的變化速率。圖14示出了對(duì)一系列樣品暴露給不同波長(zhǎng)的光刺激的情況的比較。制備目標(biāo)多核苷酸、PNA和碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的混合物，觀察染料光學(xué)性能的變化。目標(biāo)多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)，PNA分子是CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQIDNO1)。圖14a)-d)示出了在一系列波長(zhǎng)下，染料發(fā)射率隨時(shí)間的變化圖，波長(zhǎng)如下所示a)混合光；b)藍(lán)光源，450nm；c)綠光源，510nm；d)紅光源，645nm。對(duì)a)-d)中的每種而言，(■)示出了陽(yáng)性對(duì)照或試驗(yàn)樣品；(□)示出了僅有PNA探針的情況；(▲)示出了僅有碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的情況；(×)示出了緩沖液背景。發(fā)射率對(duì)應(yīng)于圖7中所示的百分比變化。實(shí)施例11本實(shí)施例顯示，通過在與固體支持物結(jié)合之前或之后制備PNA/多核苷酸雜交體，本發(fā)明的方法可被用于基于固體的形式。將通用的細(xì)菌PNA探針及其互補(bǔ)的多核苷酸用于下述實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG3′(SEQIDNO2)，PNA分子是5′bio-CACTGCTGCCTCCCCGTAG3′(SEQIDNO1)。在第一種樣品中，通過鏈親合素-生物素結(jié)合，將經(jīng)生物素化的PNA探針固定到孔上。然后加入多核苷酸和碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料。將樣品暴露給光刺激，對(duì)染料熒光發(fā)射率的百分比變化進(jìn)行測(cè)量。在第二種樣品中，使生物素化的探針和目標(biāo)多核苷酸得以相互雜交，以形成PNA/多核苷酸雜交體。然后將PNA/多核苷酸雜交體加入到涂有鏈親合素的孔中，使雜交體得以與孔的表面結(jié)合。圖15示出了在第一種和第二種樣品中觀察到的發(fā)射率隨時(shí)間的百分比變化。在試驗(yàn)1(■)中，在與目標(biāo)DNA和染料反應(yīng)之前，通過鏈親合素-生物素的結(jié)合，對(duì)探針進(jìn)行生物固定，固定到孔上。試驗(yàn)2(●)中，PNA分子和目標(biāo)得以在加入到孔中之前在溶液中互相雜交。Y-軸表示較之僅有探針的情況，熒光隨時(shí)間的百分比變化。實(shí)施例12本實(shí)施例表明本發(fā)明的方法可被用于對(duì)從血液樣品中獲得的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定和/或定量。通過靜脈穿刺將人類血液收集到EDTA管中。將10μl男性血液和10μl女性血液加入到含有180μl裂解緩沖液的微離心管中，所述緩沖液為6M硫氰酸胍、20mMEDTA、10mMTRIS.HCl(pH6.5)、40g/LTritonX、10g/L二硫代蘇糖醇。加入血液之前，在60℃對(duì)緩沖液進(jìn)行加熱至其溶解。將10μl女性血液加入到含有190μl同樣的裂解緩沖液的微離心管中。反應(yīng)在室溫溫育10分鐘。在4000rpm對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行5分鐘的離心。棄去上清液，用500μl裂解緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。在最高速度下再對(duì)沉淀離心2分鐘。棄去上清液，用500μl洗滌緩沖液(25％乙醇、25％異丙醇、100mMNaCl、10mMTris.HCl(pH8.0))對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。再在最高速度下對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行2分鐘的離心，棄去上清液。用用于PNA雜交反應(yīng)的5mM磷酸緩沖液對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行兩次洗滌。最后一次漂洗后，將反應(yīng)物重新懸浮于200μl5mM的磷酸沖液中。下表顯示了用于在微孔中的試驗(yàn)條件。2.5μl全血液被用于50μl的反應(yīng)體積中。這相當(dāng)于300目標(biāo)/μl反應(yīng)物和1ng的DNA。PNA序列5′Bio-OO-TGAGTGTGTGGCTTTCG3′(SEQIDNO19)。用Genios分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為535nm和發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處來(lái)收集發(fā)射率數(shù)據(jù)。最初的零分鐘讀數(shù)后，樣品被暴露給Aurora50/50的光刺激，暴露30秒。在10分鐘內(nèi)，每30秒測(cè)一次熒光。圖16顯示，本分析檢測(cè)到了目標(biāo)男性血液的樣品，以(■)表示，而以(□)表示的女性血液作為陰性對(duì)照則沒有被檢測(cè)到。實(shí)施例14大量的核酸序列已被用于或可被用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸。下面列出了這些序列。實(shí)施例15圖19示出了暴露給不同波長(zhǎng)的光刺激的影響。將包括16SPNA(5′cactgctgcctcccgtag-LYS)(SEQIDNO1)、多核苷酸(5′ctacgggaggcagcagtg)(SEQIDNO2)和碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青染料的混合物暴露給具有所有可見波長(zhǎng)的白光刺激、藍(lán)光源(450nm)、綠光源(510nm)和紅光源(645nm)，以及無(wú)光刺激暴露。用于混合光的光源是來(lái)自FITZ的Aurora50/50。為獲得藍(lán)、綠和紅光，將濾光器置于Aurora50/50上。在Safire多孔板讀數(shù)器(Tecan制造)上進(jìn)行讀數(shù)。暴露給光刺激的混合物導(dǎo)致染料光學(xué)性能較之參照值具有了不同的變化速率。沒暴露給光刺激的混合物在測(cè)量中沒有表現(xiàn)出可被測(cè)量到的隨著時(shí)間的變化。不同的波長(zhǎng)導(dǎo)致了光學(xué)性能變化的不同速率。本實(shí)施例顯示，發(fā)光可被用于產(chǎn)生染料光學(xué)性能的不同變化速率。實(shí)施例16將PNA固定于固體支持物上，基于染料熒光變化速率對(duì)DNA的量進(jìn)行檢測(cè)。下述反應(yīng)物被用于本實(shí)施例中a)10μM探針-BIO(來(lái)自實(shí)施例14)；b)2mM碘化二乙基硫雜羰花青染料(DMSO中100mM的貯液；5mM緩沖液中，2mM工作濃度)；c)5mM緩沖液(pH5.5)(1ml100mMNa2HPO4·7H2O+24ml100mMNa2H2PO4·H2O+475mlH2O，pH至5.5)；d)1XPBS+0.05％Tween20(PBST)(1XPBS＝0.137MNaCl+2.68mMKCl+4.3mMNaH2PO4+1.47mMKH2PO4)；e)鏈親合素微滴定板(NUNC)和f)含有或缺乏目標(biāo)多核苷酸的試驗(yàn)樣品。對(duì)孔的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)孔都通過用200μl1XPBST對(duì)孔進(jìn)行3次預(yù)洗滌來(lái)準(zhǔn)備。將1μlPNA探針用于50μl總反應(yīng)體積。將3μl探針加入到147μl的PBST中。將PNA探針結(jié)合到微滴定孔的固體表面上。在輕微振蕩下，于室溫對(duì)混合物進(jìn)行1小時(shí)的溫育。然后用100μl的PBST對(duì)孔進(jìn)行3X洗滌。移去液體。然后用5mM磷酸緩沖液再對(duì)孔進(jìn)行3X洗滌。對(duì)陽(yáng)性對(duì)照而言，將1μl反應(yīng)物加入到49μl5mM磷酸緩沖液中，然后加入到陽(yáng)性對(duì)照孔中。將1μl樣品稀釋于49μl磷酸緩沖液中，然后加入到試驗(yàn)樣品孔中。對(duì)于僅有探針和緩沖液的孔，加入50μl磷酸緩沖液。在輕微振蕩下，于室溫對(duì)所有的孔進(jìn)行30分鐘的溫育。用100μl上述磷酸緩沖液對(duì)孔進(jìn)行5X洗滌。通過用1μl2mM的染料與49μl磷酸緩沖液/孔來(lái)制備染料溶液。將染料溶液加入到所有的孔中，除了僅有陰性對(duì)照緩沖液的孔。將50μl磷酸緩沖液加入到僅有緩沖液的孔中。觀察染料的熒光情況。在提供來(lái)自Aurora50/50光源的光刺激以前，對(duì)最初的熒光讀數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)位于535nm處，用Genios多孔板讀數(shù)器，對(duì)590nm處的發(fā)射率，每2分鐘進(jìn)行一次觀察。實(shí)施例17A.用液體PNA樣品來(lái)進(jìn)行下述方案。準(zhǔn)備對(duì)于試驗(yàn)樣品的數(shù)目來(lái)說足夠多的孔，再加3個(gè)供對(duì)照使用。分離DNA或RNA。每份試驗(yàn)反應(yīng)物含有1μLPNA探針、47μL緩沖液[(5mM)、2ml100mMNa2HPO4·7H2O+48mlNa2H2PO4·H2O/L(pH5.5)]以及1μL試驗(yàn)樣品。將樣品上樣至Greiner96孔條狀平板(stripplate)(#705070)。探針、染料和緩沖液組合起來(lái)形成混合物，對(duì)每個(gè)孔的安排如下將49μL混合物加入到所有孔中，只除了僅有緩沖液的孔。輕輕混合溶液。在下述波長(zhǎng)下，對(duì)沒有暴露給光刺激的熒光吸光度進(jìn)行測(cè)量吸收562nm；熒光發(fā)射535nm以及熒光激發(fā)590nm。用Aurora50/50，將樣品暴露給光刺激，暴露給光刺激每30秒后，測(cè)定吸光度或熒光。B.用固定到固體表面的PNA分子來(lái)進(jìn)行下述方案。下述體系被用于本方案a)10μMPNA(ABI)；b)2mM碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青(Sigma-Aldrich，目錄#173738)染料；c)5mM1XPBS(0.137MNaCl、2.68mMKCl、4.3mMNaH2PO4、1.47mMKH2PO4)+0.05％Tween-20；d)1XPBS(0.137MNaCl、2.68mMKCl、4.3mMNaH2PO4、1.47mMKH2PO4)+0.05％Tween-20；e)包括目標(biāo)多核苷酸的試驗(yàn)樣品和f)涂布有鏈親合素的平板(NuncbrandImmobilizerTM(目錄號(hào)436014))。在一種變化方式中，在引入多核苷酸樣品之前對(duì)PNA進(jìn)行固定。通過用300μl1XPBST洗三次，來(lái)準(zhǔn)備對(duì)于待試驗(yàn)樣品來(lái)說足夠多的孔(n)，再加3個(gè)額外的孔用于對(duì)照。分離出待試驗(yàn)的DNA或RNA。通過將1μl10μMPNA貯液加入到49μlPBST中，將經(jīng)生物素化的PNA固定到涂布有鏈親合素的孔上。制備PNA的總體預(yù)混合物(mastermix)，其中包括(n+2)X1μl10μMPNA貯液以及(n+2)X49μlPBST。向所有孔中加入50μlPNA混合物，只除了僅有緩沖液的孔。將混合物蓋住，在輕柔的搖床上，于室溫對(duì)其進(jìn)行1小時(shí)的溫育。用200μlPBST對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行3X洗滌，然后用5mM磷酸緩沖液進(jìn)行3X洗滌，將核酸樣品加入到被固定的探針上。將1μl樣品加入到49μl5mM磷酸緩沖液中。按照下表來(lái)制備對(duì)照孔將孔蓋住，在輕微振蕩下，于室溫對(duì)其進(jìn)行30分鐘的溫育。然后用100μl5mM磷酸緩沖液對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行6X洗滌。通過將1μl2mM染料溶液加入到49μl5mM磷酸緩沖液中(對(duì)每份樣品而言)來(lái)制備染料溶液。向僅有緩沖液的孔中加入50μl5mM磷酸緩沖液。在下述波長(zhǎng)下，對(duì)暴露給光刺激之前的最初的熒光或吸光度進(jìn)行測(cè)量吸收562nm；熒光發(fā)射535nm以及熒光激發(fā)590nm。用Aurora50/50，將樣品暴露給光刺激。Aurora50/50還可與不同顏色的濾光器(藍(lán)、綠、紅)一起使用，以在暴露給光刺激每20分鐘時(shí)提供人們感興趣的波長(zhǎng)。在另一種變化中，PNA被固定，同時(shí)用目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行雜交。通過用300μl1XPBST洗三次，來(lái)準(zhǔn)備對(duì)于待試驗(yàn)樣品來(lái)說足夠多的孔(n)，再加3個(gè)額外的孔用于對(duì)照。對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分離。按照下表來(lái)制備PNA探針和樣品的混合物在輕微振蕩下，于室溫對(duì)混合物進(jìn)行10-120分鐘(取決于應(yīng)用)的加蓋溫育。用100μl5mM磷酸緩沖液對(duì)混合物進(jìn)行6X洗滌。按照上文所述來(lái)制備染料溶液。向每個(gè)孔中加入50μl溶液，只除了僅有緩沖液的孔。實(shí)施例18用植物DNA來(lái)進(jìn)行下述方案。品系為RR2701大豆。其中使用的DNA來(lái)自經(jīng)過純化的DNA提取物，其中含有62ng/μl。對(duì)樣品進(jìn)行一系列稀釋，從62ng/μl至0.062ng/μl。將稀釋液中的1μl用于50μl反應(yīng)物。用400μl磷酸緩沖過的鹽緩沖液(PBS)(+0.5％tween(PBST))在室溫對(duì)鏈親合素平板進(jìn)行3X洗滌。用移液槍來(lái)進(jìn)行所有的洗滌、上樣、移開步驟。將400μl用于洗滌的溶液直接加入到孔中。然后用同樣的移液槍和槍頭吸走溶液。將PNAbio-18(35S)在水中進(jìn)行1/10的稀釋。(1μlPNA貯液到9μl水)。(BIO-OO-GATAGTGGGATTGTGCGT(SEQIDNO16)，其中OO是兩個(gè)接頭)。將1μl經(jīng)稀釋的PNA加入到49μlPBST中。制備總體預(yù)混合物，其中包括所有要用于結(jié)合的孔，再加上一個(gè)過量的孔。因此，如果我們要結(jié)合10個(gè)孔，那么要準(zhǔn)備足夠用于11個(gè)孔的混合物。(11μl經(jīng)稀釋的PNA+539μlPBST)。向每個(gè)孔中加入50μl該混合物。在軌道搖床(orbitalshaker)上，輕微振蕩下，于室溫對(duì)平板進(jìn)行1小時(shí)的溫育。同時(shí)，通過在微PCR管中，對(duì)每種DNA樣品制備一系列的稀釋水溶液(1/10、1/100、1/1000)，來(lái)制備DNA。將管置于熱循環(huán)儀中，開始進(jìn)行變性程序(95℃，5分鐘)。完成后將管放置于冰上，直至對(duì)其進(jìn)行使用。溫育之后，用上述PBST對(duì)平板進(jìn)行3X洗滌。然后用如上文所述的5mMPO4緩沖液(pH5.7)對(duì)平板進(jìn)行3X洗滌。將1μlDNA或經(jīng)稀釋的DNA樣品加入到每個(gè)孔中，(GM或非GMDNA，每個(gè)孔一種樣品)。加入49μl的PO4緩沖液。輕輕混合平板，在軌道搖床上，輕微振蕩下，于室溫對(duì)其進(jìn)行30分鐘的溫育。溫育之后，用上述的PO4緩沖液對(duì)平板進(jìn)行5X洗滌。向49μlPO4緩沖液中加入1μl碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青(3mM)(總體預(yù)混合物被制備為包括足夠用于所有的孔再加一個(gè)多余的孔的量)。用移液槍向每個(gè)孔中加入50μl染料/緩沖液。然后將平板置于Tecan掃描儀上，以監(jiān)測(cè)535nm激發(fā)和590nm發(fā)射處的光譜發(fā)射率。在時(shí)間為零處記錄最初的讀數(shù)。然后將平板暴露給光刺激，以1分鐘為間隔進(jìn)行讀數(shù)。在Excel中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用公式100-(樣品/僅有PNA染料)X100來(lái)繪制基于百分比變化對(duì)時(shí)間的圖。圖20顯示，檢測(cè)到了不同濃度的大豆DNA。這些被表示為+。不含GMO序列的大豆DNA與背景水平接近。這些被表示為-。本發(fā)明可以檢測(cè)到0.0625ng的GMO大豆DNA，其相應(yīng)于大約21個(gè)基因組。圖21示出了光學(xué)性能百分比變化對(duì)GMO陽(yáng)性大豆和不含PNA目標(biāo)序列的野生型大豆基因組數(shù)量的圖。實(shí)施例19下述反應(yīng)顯示了對(duì)僅有磷酸緩沖液以及具有多種tween20濃度中的目標(biāo)多核苷酸的檢測(cè)。用其它非離子去垢劑(包括NP-40和tritonX-100)進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。下述體系被用于本方案a)10μMPNA(ABI)；b)2mM碘化3，3’-二乙基硫雜羰花青(Sigma-Aldrich，目錄#173738)染料；c)5mM緩沖液(pH5.5)(2ml100mMNa2HPO4·7H2O+48mlNaH2PO4·H2O/L)；d)試驗(yàn)樣品。根據(jù)待試驗(yàn)樣品數(shù)目加上用于對(duì)照的3個(gè)，來(lái)準(zhǔn)備足夠的孔。對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分離。每份試驗(yàn)反應(yīng)物含有1μL探針、47μL緩沖液和1μL樣品，以組成混合物。向除了僅有緩沖液的孔之外的所有孔中，加入49μL混合物，對(duì)溶液進(jìn)行輕柔的混合。在沒有暴露給光刺激的情況下，發(fā)射設(shè)置為535nm，激發(fā)設(shè)置為590nm，對(duì)最初的熒光進(jìn)行測(cè)量。用Aurora50/50，將樣品暴露給光刺激，每暴露給光刺激60秒后，對(duì)吸光度和/或熒光進(jìn)行測(cè)量。使用標(biāo)準(zhǔn)的5mM磷酸緩沖液(pH5.5)，將其與含有0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2％tween20的磷酸緩沖液中的反應(yīng)物進(jìn)行比較。圖22示出了使用不同濃度的tween時(shí)的發(fā)射率。(■)代表與目標(biāo)DNA進(jìn)行的反應(yīng)，(□)代表僅有探針的情況，(△)代表緩沖液中有染料的情況，(*)代表僅有緩沖液的情況。圖23示出了對(duì)于不同濃度的tween而言發(fā)射率的％變化。實(shí)施例20本實(shí)施例顯示，反應(yīng)可用不是PNA的核酸類似物來(lái)進(jìn)行。本反應(yīng)使用鎖核酸(LNA)。還對(duì)磷酸緩沖液中多種濃度的tween20進(jìn)行了檢測(cè)。使用下述LNA序列LNA-ATgmcmCtmcmcmCGTAG(SEQIDNO25)LNA-BTGcmCtmCcmCGTAG(SEQIDNO26)LNA-CTGCCTCcmCGTAG(SEQIDNO27)帶有m的小寫字母代表經(jīng)過修飾的序列。根據(jù)上文實(shí)施例19中公開的方法，以液體形式進(jìn)行反應(yīng)。圖24比較了在液體反應(yīng)中使用PNA探針和LNA探針的原始數(shù)據(jù)。將磷酸緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)與加入到磷酸緩沖液中的多種濃度的tween20的情況進(jìn)行比較。實(shí)心符號(hào)代表試驗(yàn)反應(yīng)，空心符號(hào)代表僅存在各自的探針的情況。(■，□)PNA；(◆，◇)LNA-A；(▲，△)LNA-B；(●，○)LNA-C。圖25示出了用PNA和LNA時(shí)發(fā)射率的百分比變化比較。(■)代表與單獨(dú)使用PNA探針相比時(shí)，反應(yīng)中的百分比變化。(◆)代表與單獨(dú)使用LNA-A探針和染料相比時(shí)，LNA-A試驗(yàn)反應(yīng)中的百分比變化。(▲)代表與單獨(dú)使用LNA-B探針相比時(shí)，LNA-B試驗(yàn)反應(yīng)中的百分比變化。(●)代表與單獨(dú)使用LNA-C探針相比時(shí)，LNA-C試驗(yàn)反應(yīng)中的百分比變化。實(shí)施例21本發(fā)明的分析方法還可用于檢測(cè)丙型肝炎病毒。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，從存在已知量的丙型肝炎病毒的血漿中分離出丙型肝炎病毒的RNA。按照上文實(shí)施例19中公開的方法，使用該分離出的RNA，以液體形式來(lái)開展反應(yīng)。圖26示出了用不同量的血漿對(duì)丙型肝炎病毒探針進(jìn)行的檢測(cè)。對(duì)病毒而言，甚至在非常低的拷貝數(shù)的情況下，光學(xué)性能的變化速率也是不同的。還可對(duì)丙型肝炎病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。圖27示出了將不同數(shù)量丙型肝炎病毒RNA引入到分析中時(shí)獲得的染料發(fā)射率。系統(tǒng)中病毒RNA的數(shù)量較低，通常會(huì)使得一分鐘后的熒光發(fā)射率也較低。實(shí)施例22本實(shí)施例表明，本發(fā)明的方法可用于對(duì)細(xì)菌中的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行鑒定和/或定量。通過將500μl細(xì)菌(E.coli或Bacilluscereus)培養(yǎng)物(在TSB(典型大豆培養(yǎng)基)中培養(yǎng)過夜的)在6000rpm下離心5分鐘，獲得沉淀，然后將沉淀重新懸浮于500μl磷酸緩沖液中，靜置于室溫下，5分鐘。此后將PNA(用于16S序列的5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQIDNO16)或用于非特異性HCV陰性對(duì)照序列的5′Bio-OO-TGAGTGTGTGGCTTTCG3′(SEQIDNO19))以及染料加入到系統(tǒng)中，暴露給光刺激，并讀取讀數(shù)。下表顯示了用于50μl反應(yīng)體積的微孔的試驗(yàn)條件。用Genios分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為535nm和發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處來(lái)收集發(fā)射率數(shù)據(jù)。讀取零分鐘時(shí)的最初讀數(shù)后，將樣品暴露給來(lái)自Aurora50/50的光刺激，暴露60秒。十分鐘內(nèi)，每60秒對(duì)熒光進(jìn)行一次測(cè)量。圖28描述了較之不存在核酸類似物/多核苷酸雜交體的情況下，每份樣品中的熒光變化率。在分析中使用16SPNA探針，檢測(cè)到了目標(biāo)E.coli或B.cereus的樣品(分別由x和+表示)，而在分析中使用病毒性HCVPNA探針，則無(wú)法檢測(cè)到目標(biāo)E.coli或B.cereus的樣品(分別由◇和▲表示)。黑色的方形顯示了用寡核苷酸對(duì)作為目標(biāo)多核苷酸的16S序列做出的陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例23將寡核苷酸(5′tgtgaacgca3′and5′tgcgttcaca3′)混合于退火緩沖液(10mMTris，pH7.5-8.0，50mMNaCl，1mMEDTA)中，至10mM，在熱循環(huán)儀中于95℃加熱10分鐘。加熱后，將寡核苷酸混合物在室溫冷卻l小時(shí)。每份反應(yīng)中使用1微升的該混合物。將PNAN′Bio-OO-gatagtgggattgtgcgt，C(1)′和N′tcacatcaatccact-lys，C′，(2)混合使用，在反應(yīng)緩沖液(5mMPO4+0.05％Tween)中每種都為10mM。每份反應(yīng)中使用1微升的該混合物。將10mM3’，3’-二乙基硫雜羰花青染料貯液在反應(yīng)緩沖液中稀釋為4mM。每份反應(yīng)中使用1微升的該混合物。參考文獻(xiàn)1.Chandler，D.P.，J.R.Stults.，K.K.Anderson，S.Cebula，B.L.Schuck.，andF.J.Broclcman.2000.AffinitycaptureandrecoveryofDNAatfemtomolarconcentrationswithpeptidenucleicacidprobes.Anal.Biochem.283241-249.2.Das，R.，Cummings，C.，Mendis，C.，Neill，R.，Ludwig，G.，Hoover，D.，Paranavitana，C.，Yang，D.H.C.，Lindler，L.，Huang，X.，Henchal，E.，andJett，M.(2001).GlobalGeneAnalysisofVariousBiologicalThreatandInfectiousAgentsUsingPBMCImplicationsforTherapyandRapidDiagnostics.InDianneMcQuestion(ed)Proceedings，ChemicalandBiologicalDefenseSymposium.3.Demidov，V.V.，Potaman，V.N.，F(xiàn)rank-Kamenetskii，M.D.，Egholm，M.，Buchard，O.，Sonnichsen，S.H.，andNielsen，P.E.(1994).Stabilityofpeptidenucleicacidsinhumanserumandcellularextracts.BiochemPharmacol48，1310-3.4.Haaima，G.，Lohse，A.，Buchardt，O.andNielsen，P.E.(1996).PeptideNucleicAcids(PNA)containingthyminemonomersderivedfromchiralaminoacids.Hybridizationandsolubilitypropertiesofd-lysinePNA.AngChem35，1939-1941.5.Jett，M.，Das，R.，Cummings，C.，Mendis，C.，Neill，R.，Hoover，D.，Lindler，L.，Paranavitana，C.，Huang，X.，Ludwig，G.，Henchal，E.，andYang，D.H.C.(2001).IdentificationOfChangesInGeneExpressionInducedByToxicAgentsImplicationsforTherapyAndRapidDiagnosis.InProceedingsofNATOConferenceOperationalIssuesinChemicalandBiologicalDefenseHumanFactorsinMedicinePanel.Wade(ed).6.Mikheikin，A.L.，Zhuze，A.L.，andZasedatelev，A.S.(2000).BindingofsymmetricalcyaninedyesintotheDNAminorgroove.JBiomolStructDyn18，59-72.7.Nielsen，P.E.，Egholm，M.，Berg，R.H.，andBuchardt，O.(1991).Sequence-selectiverecognitionofDNAbystranddisplacementwithathymine-substitutedpolyamide.Science254，1497-500.8.Nielsen，P.E.(2001).Peptidenucleicacidaversatiletoolingeneticdiagnosticsandmo1ecularbiology.CurrOpinBiotechnol12，16-20.9.Ray，A.，andNorden，B.(2000).Peptidenucleicacid(PNA)itsmedicalandbiotechnicalapplicationsandpromiseforthefuture.FasebJ14，1041-60.10.Stefano，K.andHyldig-Nielsen，J.J.(1997).DiagnosticApplicationsofPNAoligomers.InDiagnosticGeneDetectionandQuantificationTechnologiesMinden(ed).pp.19-39.11.Wang，J.，Palecek，E.，Nielsen，P.E.，Rivas，G.，Cai，X.，Shiraishi，H.，Dontha，N.，Luo，D.，andFarias，P.A.M.(1996).PeptideNucleicAcidProbesforSequence-SpecificDNABiosensors.JAmChemSoc118，7667-70.12.Wilhelmsson，L.M.，Norden，B.，Mukherjee，K.，Dulay，M.T.，andZare，R.N.(2002).GeneticscreeningusingthecolorchangeofaPNA-DNAhybrid-bindingcyaninedye.NucleicAcidsRes30，E3.13.InstituteofFoodTechnologists(2002).EmergingMicrobiologicalFoodSafetyIssuesImplicationsforControlinthe215′Century.14.Wagner，SJ.2002.Virusinactivationinbloodcomponentsbyphotoactivephenothiazinedyes.Transfus.Med.Rev.1661-6.15.Kapuscinski，J.1995.DAPIaDNA-specificfluorescentprobe.Biotech.Histochem.70220-33.16.Carreon，JR.，Mahon，KPjr.，Kelley，SO.2004.Thiazoleorange-peptideconjugatessensitivityofDNAbindingtochemicalstrueture.Org.Lett.6517-9.17.Morozkin，ES.，Lalcionov，PP.，Rykova，EY.，Vlassov，VV.2003.FluorometricquantificationofRNAandDNAinsolutionscontainingbothnucleicacids.Anal.Biochem.32248-50.18.Eriksson，M.，Karlson，HJ.，Westman，G.，Akerman，B.2003.Groove-bindingunsy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賴氨酸連到g上<400>18tcacatcaatccact15<210>19<211>17<212>DNA<213>人類<400>19tgagtgtgtggctttcg17<210>20<211>17<212>DNA<213>細(xì)菌<400>20actgctgcctcccgtag17<210>21<211>12<212>DNA<213>細(xì)菌<400>21tgcctcccgtag12<210>22<211>11<212>DNA<213>細(xì)菌<400>22tgcctcccgta11<210>23<211>12<212>DNA<213>人類免疫缺陷病毒<400>23ctcattgatggt12<210>24<211>12<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>24cgcagaccacta12<210>25<211>12<212>DNA<213>細(xì)菌<220><221>misc_feature<222>2，3，5，6，7<223>經(jīng)修飾的<400>25tgcctcccgtag12<210>26<211>12<212>DNA<213>細(xì)菌<220><221>misc_feature<222>3，5，7<223>經(jīng)修飾的<400>26tgcctcccgtag12<210>27<211>12<212>DNA<213>細(xì)菌<220><221>misc_feature<222>7<223>經(jīng)修飾的<400>27tgcctcccgtag1權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)樣品中目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在含量的方法，所述方法包括a)將樣品、與所述目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的核酸類似物以及染料組合起來(lái)，得到混合物，其中，當(dāng)存在及不存在目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體時(shí)，所述染料光學(xué)性能變化速率會(huì)有所不同；b)將所述混合物中染料光學(xué)性能的變化速率與類似混合物中染料光學(xué)性能的變化速率所特有的參照值相比較，以測(cè)定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，其中，所述類似混合物含有已知量的多核苷酸/核酸類似物雜交體；以及c)將所述混合物中染料光學(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的量關(guān)聯(lián)起來(lái)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物是肽核酸(PNA)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物是鎖核酸(LNA)。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物是蘇糖核酸(TNA)。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物是連接有金屬的核酸。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包括組織、細(xì)胞收集物、細(xì)胞裂解物、經(jīng)純化的多核苷酸或經(jīng)分離的多核苷酸、病毒、環(huán)境樣品、工業(yè)樣品、醫(yī)學(xué)樣品、食物樣品、農(nóng)業(yè)樣品、獸醫(yī)樣品、農(nóng)業(yè)牲畜樣品、水樣品、土壤樣品、空氣樣品、與生物武器試劑相關(guān)的樣品或與農(nóng)業(yè)戰(zhàn)爭(zhēng)試劑相關(guān)的樣品。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述混合物被暴露給光刺激。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸是DNA。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸是全細(xì)胞DNA、核DNA、線粒體DNA、核糖體DNA、葉綠體DNA、病毒DNA、質(zhì)粒DNA、人工DNA、表觀基因組DNA、表觀遺傳化DNA、體外擴(kuò)增出的DNA或嵌合DNA。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸是RNA。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述RNA是核糖體RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、帶盔甲R(shí)NA、病毒RNA、小分子RNA、siRNA、人工RNA或嵌合RNA。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸從生物中獲得。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物是人類。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物是病原體。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病原體是病毒。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病原體是細(xì)菌。18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物是真菌。19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病原體選自由Bacillusanthracis、Clostridiumbotulinum、Brucellae、Vibriocholera、Clostridiumperfringes、Ebola病毒、Yersiniapesits、Coxiellaburnetii、天花病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒所構(gòu)成的組。20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物與目標(biāo)多核苷酸序列互補(bǔ)。21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸序列與目標(biāo)多核苷酸精確互補(bǔ)。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物的互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)度大于大約4個(gè)核酸堿基，并且長(zhǎng)度小于大約24個(gè)核酸堿基。23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物長(zhǎng)度為大約12個(gè)核酸堿基。24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸類似物被固定于固體基底上。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述核酸類似物通過非共價(jià)相互作用被固定于固體基底上。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述非共價(jià)相互作用是生物素和抗生物素蛋白或鏈親合素之間的相互作用。27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述非共價(jià)相互作用是抗原/抗體反應(yīng)。28.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)多核苷酸被固定于固體基底上。29.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述核酸類似物與固體基底共價(jià)結(jié)合。30.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，較之不存在核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的情況，在存在有核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的時(shí)候，所述染料可以具有更高的光學(xué)性能變化速率。31.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，較之不存在核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的情況，在存在有核酸類似物/目標(biāo)多核苷酸雜交體的時(shí)候，所述染料可以具有更低的光學(xué)性能變化速率。32.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述染料是青色素染料。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述染料選自由碘化3’，3’-二乙基硫雜羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫雜二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫雜三羰花青所構(gòu)成的組。34.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光學(xué)性能選自由吸光度、熒光、反射率或化學(xué)發(fā)光所構(gòu)成的組。35.如權(quán)利要求1所述的方法，還進(jìn)一步包括在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)所述光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量。36.如權(quán)利要求1所述的方法，還進(jìn)一步包括在單一時(shí)間點(diǎn)對(duì)所述光學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量。37.一種用于對(duì)樣品中生物進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述生物的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述生物是否存在或存在的量。38.一種用于對(duì)樣品中一類生物進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述的類的生物的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述的類的生物是否存在或存在的量。39.一種用于對(duì)樣品中生物的株系進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述生物的所述株系的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述生物的所述株系是否存在或存在的量。40.一種用于對(duì)樣品中經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述經(jīng)遺傳修飾的生物的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述經(jīng)遺傳修飾的生物是否存在或存在的量。41.一種用于對(duì)受試對(duì)象中是否存在疾病狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述疾病狀態(tài)的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述疾病狀態(tài)。42.一種用于對(duì)受試對(duì)象中是否存在遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述遺傳變異的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述遺傳變異。43.一種用于對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于SNP的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述SNP。44.一種用于對(duì)樣品中的遺傳序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述生物的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述生物是否存在或存在的量。45.一種用于對(duì)樣品中的體外擴(kuò)增序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于所述生物的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述生物是否存在或存在的量。46.一種用于檢測(cè)堿基對(duì)變化的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸序列是特異于SNP的序列，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述SNP是否存在或存在的量。47.一種用于檢測(cè)宿主是否被病原體感染的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)多核苷酸或存在的量進(jìn)行檢測(cè)，其中，所述目標(biāo)核酸是特異于所述病原體的核糖核酸(RNA)，并且，其中，所述目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量能夠表明所述宿主是否被所述病原體感染。48.一種用于對(duì)兩份或多份樣品中目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法，用第一種核酸類似物分子，在多位點(diǎn)設(shè)備的第一個(gè)位點(diǎn)對(duì)第一份所述樣品中的所述目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)；以及按照權(quán)利要求1所述的方法，用第二種核酸類似物分子，在多位點(diǎn)設(shè)備的第二個(gè)位點(diǎn)對(duì)第二份所述樣品中的所述目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述核酸類似物分子被固定于固體基底上。50.一種對(duì)樣品中兩種或多種目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在的量進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1所述的方法，對(duì)樣品中第一種目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)；按照權(quán)利要求1所述的方法，對(duì)樣品中第二種目標(biāo)多核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，兩種或多種序列被固定于固體基底上。52.用于檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包含a)與所述目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)核酸序列至少部分互補(bǔ)的一種或多種核酸類似物，以及b)一種或多種染料53.如權(quán)利要求52所述的試劑盒，還包括刺激源。54.如權(quán)利要求52所述的試劑盒，其中，所述染料選自由碘化3’，3’-二乙基硫雜羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫雜二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫雜三羰花青所構(gòu)成的組。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)目標(biāo)多核苷酸是否存在或存在含量的方法。多核苷酸、目標(biāo)核酸類似物和染料組合起來(lái)形成混合物。將染料的光學(xué)性能與類似混合物中染料光學(xué)性能變化速率所特有的參照值相比，以確定光學(xué)性能的相對(duì)變化速率，所述類似混合物含有已知量的目標(biāo)多核苷酸/核酸類似物雜交體。混合物中染料光學(xué)性能的相對(duì)變化速率與樣品中是否存在特定的目標(biāo)多核苷酸或存在的量相關(guān)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1894423SQ200480020948公開日2007年1月10日申請(qǐng)日期2004年5月20日優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日發(fā)明者希瑟·克施恩斯克,邁克爾·S·茲維克,永·K·喬依申請(qǐng)人:因維斯蒂恩有限公司