專利名稱：具有改良的胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有CDase活性的多肽，特征在于其通過添加氨基酸序列而衍生自天然CDase，條件是所述多肽沒有UPRtase或胸苷激酶活性。
本發(fā)明還涉及編碼這種具有CDase活性的多肽的核苷酸序列，涉及表達(dá)所述具有CDase活性的多肽的載體，涉及病毒顆粒和宿主細(xì)胞，并涉及包含其的組合物。最后，本發(fā)明還涉及其治療性應(yīng)用和使用其的治療方法。在自殺基因治療的情況下，本發(fā)明特別用于對于特別是增生性和感染性疾病的應(yīng)用。
基因治療定義為將遺傳信息轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞或生物體。在美國，1990年9月，對一個由于突變而影響了編碼腺嘌呤脫氨酶(ADA)的基因的遺傳免疫缺陷的患者進(jìn)行了對于人的第一次治療方案。這第一次實驗的相對成功鼓舞了這種方法用于多種疾病的研究，包括遺傳疾病(目的是校正缺陷基因的障礙)和獲得性疾病(癌癥、感染性疾病，如AIDS等)。從那時起這個技術(shù)經(jīng)歷了大量的發(fā)展，包括“自殺基因”治療，其應(yīng)用了表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)⒎腔钚晕镔|(zhì)(前體藥物)轉(zhuǎn)化為胞毒性物質(zhì)，從而引起細(xì)胞死亡的基因。1992年，幾個小組證實了這種新的方法用于治療腫瘤和抑制引起AIDS的HIV病毒的傳播的相關(guān)性。
在這方面，編碼單純皰疹1型病毒胸苷激酶(HSV-1 TK)的基因構(gòu)成了自殺基因的原型(Caruso et al.，1993，Proc.Nati.Acad.Sci.USA90，7024-7028；Culver et al.，1992，Science 256，1550-1552；Ramet al.，1997，Nat.Med.3，1354-1361)。雖然TK多肽沒有那樣的毒性，但是其催化核苷類似物如無環(huán)鳥苷或9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤的轉(zhuǎn)化。修飾的核苷摻入到正在延伸中的DNA鏈中，結(jié)果抑制了細(xì)胞分裂。目前可以獲得大量的自殺基因/前體藥物對?？梢员惶貏e提及的是大鼠細(xì)胞色素p450及環(huán)磷酰胺(Human Gene Therapy 5，969-978)、大腸桿菌(E.coli)嘌呤核苷磷酸化酶及6-甲基嘌呤脫氧核苷(Sorscher et al.，1994，Gene Therapy 1，223-238)、大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶及6-硫黃嘌呤(Mzoz and Moolten，1993，Human Gene Therapy 4，589-595)和胞嘧啶脫氨酶(CDase)及5-氟胞嘧啶(5FC)。
CDase參與嘧啶代謝途徑，通過其外源胞嘧啶通過水解脫氨轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。雖然CDase活性在原核生物和低等真核生物中被證實(Jund and Lacroute，1970，J.Bacteriol.102，607-615；Beck et al.，1972，J.Bacteriol.110，219-228；De Haan et al.，1972，Antonie vanLeeuwenhoek 38，257-263；Hoeprich et al.，1974，J.Inf.Dis.130，112-118；Esders and Lynn，1985，J.Biol.Chem.260，3915-3922)，但是其不存在于哺乳動物中(Koechlin et al.，1966，Biochem Pharmacol.15，435-446；Polak et al.，1976，Chemotherapy 22，137-153)。已知釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)FCY1和大腸桿菌codA基因，其分別編碼這兩種生物的CDase，其序列已被公開(EP402108；Erbs et al.，1997，Curr.Genet.31，1-6；WO93/01281)。
CDase也將胞嘧啶類似物，即5-氟胞嘧啶(5-FC)脫氨，從而形成5-氟尿嘧啶(5-FU)，當(dāng)轉(zhuǎn)化為5-氟-UMP(5-FUMP)時其是高毒性的化合物。因為使編碼該酶的基因失活的突變或者因為該酶天然缺陷，如哺乳動物細(xì)胞，而缺少CDase活性的細(xì)胞對于5-FC是抗性的(Jund and Lacroute，1970，J.Bacteriol.1989 171，2124-2127)。相反，轉(zhuǎn)移了編碼CDase活性的序列的哺乳動物細(xì)胞對于5-FC變得敏感(Huber et al.，1993，Cancer Res.53，4619-4626；Mullen et al.，1992，Proc.Nati.Acad.Sci USA 89，33-37；WO93/01281)。另外，鄰近的、未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對于5-FC也變得敏感(Huber et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，8302-8306)。稱為旁觀者效應(yīng)(bystandereffect)的這種現(xiàn)象是由于表達(dá)CDase活性的細(xì)胞分泌5-FU，其然后通過跨質(zhì)膜的直接擴散(straightforward diffusion)而使鄰近細(xì)胞中毒。與tk/GCV參考系統(tǒng)相比，5-FU的被動擴散的性質(zhì)顯示了一個優(yōu)勢，因為tk/GCV參考系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)要求與表達(dá)tk的細(xì)胞接觸(Mesnil et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1831-1835)。在基因治療中，特別是抗癌基因治療中CDase提供的所有優(yōu)點可以容易地被理解。
為了改良使用CDase活性方法的效率，現(xiàn)有技術(shù)WO-A-96/16183推薦使用編碼具有CDase和UPRTase活性的一種兩結(jié)構(gòu)域酶的融合蛋白，并且證實在體外通過表達(dá)質(zhì)粒攜帶的雜種codA::upp或FCY1::FUR1基因的轉(zhuǎn)移提高了轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞對于5-FC的敏感性。WO99/54481通過使用缺失N-末端部分突變的、編碼UPRTase的FUR1基因提供了對這個發(fā)明的改良。
本發(fā)明是對于現(xiàn)有技術(shù)的改良，其使用了具有CDase活性的多肽，特征在于其通過添加氨基酸序列而衍生自天然CDase，條件是所述多肽沒有UPRTase或胸苷激酶活性。
本發(fā)明提供了更有效率的多肽，從而可能提高細(xì)胞對5-FC的敏感性或者通過產(chǎn)生5-FU誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)并且改良了使用自殺基因的基因治療的前景。這個突變體可以用于大量的應(yīng)用，特別是抗癌和抗病毒應(yīng)用，以及所有需要細(xì)胞死亡的應(yīng)用。
“胞嘧啶脫氨酶活性”(CDase活性)應(yīng)被理解為涵蓋胞嘧啶或其類似物之一的脫氨作用。
“衍生自天然CDase”廣義指所述具有CDase活性的多肽包含與所述天然CDase具有大于70％，有利地大于80％，優(yōu)選大于90％及非常優(yōu)選大于95％的相同性程度的氨基酸序列。更優(yōu)選地，具有CDase活性的多肽包含天然CDase的氨基酸序列。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，天然CDase指原核或真核來源的CDase。優(yōu)選地，CDase是酵母CDase，特別是釀酒酵母FCY1基因編碼的酶。編碼不同來源的CDase的基因的克隆和序列在現(xiàn)有技術(shù)和專門的數(shù)據(jù)庫中是可獲得的。關(guān)于信息，F(xiàn)CY1基因的序列揭示于Erbs et al.(1997，Curr.Genet.31，1-6)。
優(yōu)選的例子是天然CDase，其包含基本上如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，起始于1位的Met殘基并終止于158位的Glu殘基。術(shù)語“基本上”指與所述SEQ ID NO1序列的相同性程度，其大于70％，有利地大于80％，優(yōu)選大于90％及非常優(yōu)選大于95％。更優(yōu)選地，所述多肽包含SEQ ID NO1所示的、起自1位的Met殘基并終止于158位的Glu殘基的氨基酸序列。具有SEQ ID NO1所示的、起自1位的Met殘基并終止于158位的Glu殘基的氨基酸序列的多肽是非常適于實施本發(fā)明的。
根據(jù)有利的實施方案，本發(fā)明的多肽具有略微高于所述天然CDase的CDase活性。因此，隨后的實例證實了添加沒有UPRTase活性的氨基酸序列可能提高靶細(xì)胞對5-FC的敏感性和/或在處理的動物中誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。敏感性提高的因數(shù)有利地至少為2，優(yōu)選至少為5及非常優(yōu)選為10或更高。
“沒有UPRtase活性的多肽”涵蓋了不能將5-FU轉(zhuǎn)化為5-FUMP的多肽。氨基酸序列轉(zhuǎn)化5-FU為5-FUMP的能力可以通過使用本申請的實施例中揭示的方法評估。
“沒有胸苷激酶活性的多肽”涵蓋了不能磷酸化核苷(例如dT)和核苷類似物如9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(9-{[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]}鳥苷)、泛昔洛韋(famciclovir)、布昔洛韋(buciclovir)、噴昔洛韋(penciclovir)、valciclovir、無環(huán)鳥苷(9-[2-羥基乙氧基甲基]鳥苷)、三氟胸苷、1-[2-脫氧、2-氟、β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶、ara-A(阿糖腺苷、vivarabine)、1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脫氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷、碘苷(5-碘-2’-脫氧尿苷)、AZT(3’疊氮-3’胸苷)、ddC(雙脫氧胞苷)、AIU(5-碘-5’-氨基2’，5’-雙脫氧尿苷)和AraC(阿糖胞苷)。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，添加到天然CDase的氨基酸序列長度在10和1000個氨基酸之間，優(yōu)選在100和400個氨基酸之間并非常優(yōu)選在200和300個氨基酸之間。盡管添加可以發(fā)生在天然CDase中的任何位點，但是優(yōu)選N-或者C-末端，特別是C-末端。
有利地，添加到天然CDase的氨基酸序列衍生自具有UPRTase活性的多肽。
“衍生自具有UPRtase活性的多肽”廣義指所述氨基酸序列與具有UPRTase活性的多肽的氨基酸序列具有大于70％，有利地大于80％，優(yōu)選大于90％及非常優(yōu)選大于95％的相同性程度。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，具有UPRTase活性的多肽指能夠?qū)⒛蜞奏せ蚱溲苌镏晦D(zhuǎn)化為單磷酸類似物，特別是將5-FU轉(zhuǎn)化為5-FUMP的多肽?！巴蛔儭笔侵冈谒龆嚯闹刑砑印⑷笔Ш?或取代一或多個殘基。
本發(fā)明的氨基酸序列衍生自其的、具有UPRtase活性的多肽可以是任何來源，特別是原核、真菌或酵母來源的。作為例子，來自大腸桿菌的UPRTase(Anderson et al.，1992，Eur.J.Biochem 204，51-56)、來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的UPRTase(Martinussen andHammer，1994，J.Bacteriol.176，6457-6463)、來自牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的UPRTase(Kim et al.，1997，BiochemMol.Biol.mt 41，1117-1124)和來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的UPRTase(Martinussen et al.，1995，J.Bacteriol.177，271-274)可以用于本發(fā)明。然而，非常特別優(yōu)選的是酵母UPRTase，特別是釀酒酵母FUR1基因編碼的，其序列揭示于Kern et al.(1990，Gene 88，149-157)。更特別地，已知所述基因的序列和相應(yīng)的UPRTase的序列可以發(fā)現(xiàn)于現(xiàn)有文獻(xiàn)和專門的數(shù)據(jù)庫中(SWISSPROT、EMBL、Genbank、Medline等)。更特別地，fur1-7、fur1-8和fur1-9編碼的突變體可以用于本發(fā)明。在一個優(yōu)選的實施方案中，衍生自具有UPRTase活性的多肽的氨基酸序列是fur1-8等位基因編碼的氨基酸序列(Kern et al.，1990，Gene 88，149-157)。
根據(jù)特別有利的實施方案，本發(fā)明添加到天然CDase的氨基酸序列衍生自天然UPRTase的缺失突變體。缺失優(yōu)選位于原始UPRTase的N末端區(qū)域。缺失可以是全部(影響所述N-末端區(qū)域的所有殘基)或部分的(影響一級結(jié)構(gòu)中可能連續(xù)或不連續(xù)的一或多個殘基)。通常，多肽由N-末端部分、中間部分和C-末端部分組成，每一部分代表了大約三分之一的分子。例如，在含有251個氨基酸的釀酒酵母UPRTase的情況中，N-末端部分由頭83個殘基組成，起自所謂的起始甲硫氨酸，位于天然形式的第一位。在大腸桿菌UPRTase的情況中，N-末端部分包括了第1-69位。
已經(jīng)示出名為FUR1Δ105的突變基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠互補釀酒酵母fur1突變體，從而證實其是功能性的。
非常優(yōu)選本發(fā)明具有UPRTase活性的多肽至少通過缺失全部或部分所述天然UPRTase的第二個ATG密碼子上游的N-末端區(qū)域而衍生自天然UPRTase。優(yōu)選全部缺失上述區(qū)域。例如，F(xiàn)UR1基因編碼的UPRTase包含+1位的第一個ATG密碼子，隨后在+36位還有一個。因此，可以設(shè)想在本發(fā)明中缺失+1-35位的殘基，從而得到起自位于天然形式的+36位的甲硫氨酸的多肽。已經(jīng)示出名為FUR1Δ105的突變基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠互補釀酒酵母fur1突變體，從而證實其是功能性的。
本發(fā)明添加到天然CDase的優(yōu)選氨基酸序列包括基本上如SEQID NO2所示的、起自第2位的Ser殘基并終止于216位的Val殘基的氨基酸序列。術(shù)語“基本上”指與所述序列相同性的程度，其大于70％，有利地大于80％，優(yōu)選大于90％及非常優(yōu)選大于95％。更優(yōu)選地，添加到天然CDase的氨基酸序列包括如SEQ ID NO2所示的、起自第2位的Ser殘基并終止于216位的Val殘基的氨基酸序列。添加到天然CDase的、具有如SEQ ID NO2所示的起自第2位的Ser殘基并終止于216位的Val殘基的氨基酸序列的氨基酸序列非常特別適用于實施本發(fā)明。這個添加到天然CDase的氨基酸序列可能含有額外的突變?？梢蕴貏e提及的是SEQ ID NO2中第2位的絲氨酸殘基被丙氨酸殘基取代。
本發(fā)明的具有CDase活性的優(yōu)選多肽包含基本上如SEQ ID NO1所示、起自第1位的Met殘基并終止于373位的Val殘基的氨基酸序列。術(shù)語“基本上”指與所述SEQ ID NO1序列相同性的程度，其大于70％，有利地大于80％，優(yōu)選大于90％及非常優(yōu)選大于95％。更優(yōu)選地，多肽包含SEQ ID NO1所示的、起自第1位的Met殘基并終止于373位的Val殘基的氨基酸序列。具有如SEQ ID NO1所示、起自第1位的Met殘基并終止于373位的Val殘基的氨基酸序列的多肽非常特別適于實施本發(fā)明。
通常，本發(fā)明的多肽可以通過常規(guī)的化學(xué)合成方法或者通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)(見例如Maniatis et al.，1989，Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。為此，本發(fā)明還涵蓋了一種制備方法，其中編碼所述多肽的核苷酸序列被導(dǎo)入細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)，并且從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中收集所述多肽。生產(chǎn)者細(xì)胞可以是任何來源的，沒有限制，可以是細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞，只要被研究的核苷酸序列能整合進(jìn)其基因組或者整合進(jìn)能復(fù)制的合適的表達(dá)載體中。當(dāng)然，所述核苷酸序列置于能使其在生產(chǎn)者細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的控制下。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知表達(dá)載體和控制信號。所述多肽可以從培養(yǎng)基或細(xì)胞(在其被裂解后)中回收并進(jìn)行常規(guī)的純化步驟(通過層析、電泳、過濾、免疫沉淀等)。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是cDNA或基因組序列或其混合類型。適當(dāng)?shù)?，其可以含有一或多個內(nèi)含子以提高宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這些內(nèi)含子可以是天然、異源(例如兔β-球蛋白基因的內(nèi)含子等)或合成來源的。本發(fā)明所用的序列可以通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得，例如通過用特異探針篩選文庫、通過免疫篩選表達(dá)文庫或通過使用適當(dāng)引物的PCR或通過化學(xué)合成法獲得。突變體可以通過使用定點誘變技術(shù)、PCR、用限制酶和連接酶消化取代、缺失和/或添加一或多個核苷酸產(chǎn)生自天然序列或者化學(xué)合成產(chǎn)生。突變體和構(gòu)建體有功能的能力可以通過分析酶活性或者通過測量靶細(xì)胞對5-FC和/或5-FU的敏感性而驗證。
本發(fā)明還涉及攜帶本發(fā)明核苷酸序列的重組載體，所述核苷酸序列置于在宿主細(xì)胞中表達(dá)其所需的元件的控制下。重組載體可以是質(zhì)?；虿《緛碓?，并適當(dāng)?shù)乜梢越M合了一或多種改良了載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)。這些物質(zhì)廣泛記載于現(xiàn)有文獻(xiàn)中，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得(見例如Feigner et al.，1987，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121；Hodgson and Solaiman，1996，Nature Biotechnology 14，339-342；Remy et al.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，647-654)。作為非限制性說明，所述物質(zhì)可以是聚合物、脂質(zhì)，特別是陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、核蛋白或中性脂質(zhì)。這些物質(zhì)可以單獨使用或組合使用。可以設(shè)想的組合是組合了陽離子脂質(zhì)(DOGS、DC-CHOL、精胺-Chol、亞精胺-Chol等)、溶血磷脂(例如十六烷基磷酸膽堿)和中性脂質(zhì)(DOPE)的重組質(zhì)粒載體。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，可以用于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)是EP901463B1中所述的陽離子脂質(zhì)，并更優(yōu)選pcTG90。
可以用于本發(fā)明的質(zhì)粒的選擇是廣泛的。它們可以是克隆載體和/或表達(dá)載體。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些質(zhì)粒，其中一些已經(jīng)可以商業(yè)獲得，也可以使用遺傳操作技術(shù)構(gòu)建它們或修飾它們?？梢蕴峒暗睦邮茄苌詐BR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Strategene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)或p Poly(Latheet al.，1987，Gene 57，193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的質(zhì)粒含有一個復(fù)制起點，以保證在生產(chǎn)者細(xì)胞和/或宿主細(xì)胞中起始復(fù)制(例如，對于一個要在大腸桿菌中生產(chǎn)的質(zhì)?？梢赃x擇ColE1起點，如果希望質(zhì)粒在哺乳動物宿主細(xì)胞中自我復(fù)制可以選擇oriP/EBNA1系統(tǒng)，Lupton and Levine，1985，Mol.Cell.Biol.5，2533-2542；Yates et al.，Nature 313，812-815)。質(zhì)?？梢灶~外包含選擇基因，使得可以選擇或鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞(營養(yǎng)缺陷突變的互補、編碼對抗生素抗性的基因等)。當(dāng)然，質(zhì)?？梢院蓄~外的改良其在給定細(xì)胞中的維持性(maintenance)和/或穩(wěn)定性的元件(cer序列，其有助于單體形式的質(zhì)粒的維持(Summers and Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103)、整合進(jìn)入細(xì)胞基因組的序列)。
對于病毒載體，可以設(shè)想衍生自痘病毒(痘苗病毒，特別是MVA、canarypoxvirus等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒屬、泡沫病毒或腺伴隨病毒的載體?？梢允褂糜袕?fù)制能力(replicationcompetent)的或復(fù)制缺陷的病毒載體。優(yōu)選使用不整合的載體。在這方面，腺病毒載體和MVA非常特別適于實施本發(fā)明。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的病毒載體衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara，MVA)。Mva載體和生產(chǎn)這種載體的方法在歐洲專利EP83286和EP206920以及Mayr et al.(1975，Infection 3，6-14)和Sutter et Moss(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，10847-10851)中被充分描述。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的核苷酸序列可以插入MVA載體的缺失I、II、III、IV、V和VI中，甚至更優(yōu)選插入缺失III中(Meyer et al.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038；Sutter et al.，1994，Vaccine 12，1032-1040)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染分裂細(xì)胞的特性，并且在大多數(shù)情況下整合進(jìn)分裂細(xì)胞，在這方面，其特別適于在與癌癥相關(guān)中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常含有LTR序列、殼體化區(qū)域和本發(fā)明的核苷酸序列，其置于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi)部啟動子如下述那些的控制下。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以衍生自任何來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒(鼠、靈長類、貓科、人類等)且特別來自M0MuLV(莫洛尼鼠類白血病毒)、MVS(鼠類肉瘤病毒)或弗羅德鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒(Friend murine retrovirus，F(xiàn)b29)。其在能夠反式(in trans)提供構(gòu)成病毒顆粒所需的病毒多肽gag、pol和/或env的殼體化細(xì)胞系中增殖。這種細(xì)胞系在現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述(PA137，Psi CRIP GP+Am-12等)。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以含有修飾，特別是在LTR中(用真核啟動子取代啟動子區(qū)域)或者是在殼體化區(qū)域中(用異源殼體化區(qū)域取代，例如VL30型)(見法國專利9408300和9705203)。
優(yōu)選使用腺病毒載體，其缺失全部或部分至少一個復(fù)制必需的區(qū)域，所述必需區(qū)域選自E1、E2、E4和L1-L5區(qū)域以避免載體在宿主生物體內(nèi)或在環(huán)境中增殖。優(yōu)選缺失E1區(qū)域。然而，其可以組合影響、特別是全部或部分E2、E4和/或L1-L5區(qū)域的其它修飾/缺失，只要缺陷的必需功能可以通過互補細(xì)胞系和/或輔助病毒反式互補。在這方面，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的第二代載體(second-generationvectors)(見例如國際申請WO-A-94/28152和WO-A-97/04119)。作為說明，缺失主要部分的E1區(qū)域和E4轉(zhuǎn)錄單位是非常特別有利的。為了提高克隆容量，腺病毒載體可以額外缺失全部或部分的非必需E3區(qū)域。按照另一種選擇，可以使用最小腺病毒載體，其保留了殼體化必需的序列，即5’和3’ITR(末端反向重復(fù)序列)和殼體化區(qū)域。不同的腺病毒載體和制備其的技術(shù)是已知的(見例如Graham andPrevect，1991，Methods in Molecular Biology，Vol 7，p109-128；EdE.J.Murey，The Human Press mc)。
而且，本發(fā)明腺病毒載體的來源可以根據(jù)物種和血清型而變化。載體可以來自人或動物來源(犬類、鳥類、牛、鼠類、綿羊、豬、猿等)的腺病毒基因組或者來自包含至少兩種不同來源的腺病毒基因組片段的雜種。更特別提及的可以是犬來源的CAV-1或CAV-2腺病毒、鳥類來源的DAV腺病毒或牛來源的Bad 3型腺病毒(Zakharchuk etal.，Arch.Virol.，1993，128171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.1989，70165-172；Jouvenne et al.，Gene 1987，6021-28；Mittal et al.，J.Gen.Virol.，1995，7693-102)。然而，優(yōu)選人來源的腺病毒載體，優(yōu)選來自血清型C腺病毒，特別是2型或5型血清型腺病毒。
本文所用術(shù)語“有復(fù)制能力”指在沒有任何反式互補的宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制的病毒載體。本發(fā)明中，該術(shù)語還涵蓋了復(fù)制選擇性或條件復(fù)制型腺病毒載體，其被工程化以在癌癥或高增生性宿主細(xì)胞中更好地或選擇性復(fù)制。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，有復(fù)制能力的載體是有復(fù)制能力的腺病毒載體。這些有復(fù)制能力的腺病毒載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。其中，缺失了編碼55kD P53抑制物的E1b區(qū)域的腺病毒載體是特別優(yōu)選的，如ONYX-015病毒(Bischoff et al.，1996；Heise et al.，2000；WO 94/18992)。因此，這個病毒可以用于選擇性感染和殺死p53缺陷性贅生性細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)已有技術(shù)突變和破壞腺病毒5或者其它病毒中的p53抑制基因。缺失了E1A Rb結(jié)合區(qū)域的腺病毒載體也可以用于本發(fā)明。例如，Delta24病毒，其是具有E1A區(qū)域中24個堿基對缺失的突變體腺病毒(Fueyo et al.，2000)。Delta24在Rb結(jié)合區(qū)域中具有缺失且不結(jié)合Rb。因此，在正常細(xì)胞中該突變體病毒的復(fù)制被抑制。然而，如果Rb是失活的及細(xì)胞變?yōu)橘樕缘?，Delta24不再被抑制。因此，突變體病毒有效復(fù)制并裂解Rb缺陷細(xì)胞。
本發(fā)明的腺病毒載體可以在體外在大腸桿菌中通過連接或同源重組產(chǎn)生(見例如國際申請WO-A-96/17070)或通過在互補細(xì)胞系中重組產(chǎn)生。
表達(dá)必需的元件由所有能使核苷酸序列能被轉(zhuǎn)錄為RNA和mRNA以翻譯為多肽的元件組成。這些元件包括，特別是，可被調(diào)節(jié)的或組成型啟動子。當(dāng)然，所述啟動子適用于所選擇的載體和宿主細(xì)胞。可以提及的例子是PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金屬硫蛋白；Mclvor et al.，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、α-1抗胰蛋白酶、CFTR、表面活性劑、免疫球蛋白、β-肌動蛋白(Tabin et al.，1982，Mol.Cell Biol.2，426-436)和SRa(Takebe et al.，1988，Mol.Cell Biol.8，466-472)基因的真核啟動子，SV40病毒(猿猴病毒)的早期啟動子，RSV(勞斯肉瘤病毒)的LTR，HSV-1TK啟動子、CMV病毒(巨細(xì)胞病毒)的早期啟動子，痘苗病毒的p7.5K pH5R、pK1L、p28和p11啟動子，及E1A和MLP腺病毒啟動子。所述啟動子也可以是在腫瘤或癌癥細(xì)胞中刺激表達(dá)的啟動子。特別提及的是MUC-1基因的啟動子，該基因在乳腺癌和前列腺癌中過表達(dá)(Chen et al.，1995，J.Clin.Invest.96，2775-2782)，CEA(代表癌胚抗原)基因的啟動子，其在結(jié)腸癌中過表達(dá)(Schrewe et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10，2783-2748)，酪氨酸酶基因的啟動子，其在黑素瘤中過表達(dá)(Vile etal.，1993，Cancer Res.53，3860-3864)，ERBB-2基因的啟動子，其在乳腺癌和胰腺癌中過表達(dá)(Harris et al.，1994，Gene Therapy 1，170-175)和α-胎蛋白基因的啟動子，其在肝癌中過表達(dá)(Kanai et al.，1997，Cancer Res.57，461-465)。巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子是非常特別優(yōu)選的。
然而，當(dāng)使用衍生自痘苗病毒的載體(例如MVA載體)時，胸苷激酶7.5K基因的啟動子時特別優(yōu)選的。
所需的元件還可以包括額外的改良本發(fā)明核苷酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)或其維持性的元件。可以特別提及的是內(nèi)含子序列、分泌信號序列、核定位序列、IRES類型的翻譯再起始的內(nèi)部位點、轉(zhuǎn)錄終止poly A序列、三聯(lián)前導(dǎo)序列和復(fù)制起點。這些元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
本發(fā)明的重組載體還可以包括一或多個感興趣的額外基因，可以將這些基因置于相同的調(diào)節(jié)元件(多順反子盒)或獨立的元件的控制之下?？梢蕴貏e提及的基因是編碼白細(xì)胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、特別是GM-CSF和對血管發(fā)生有作用的因子(例如PA1-1，代表纖溶酶原激活物抑制劑)的基因。在一個特別的實施方案中，本發(fā)明的重組載體包括編碼IL-2或編碼干擾素γ(INFγ)的感興趣的基因。也可以設(shè)想組合本發(fā)明的核苷酸序列和其它的自殺基因，如HSV-1TK基因、ricin基因、霍亂毒素基因等。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明重組載體的病毒顆粒。這種病毒顆?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)從病毒載體中產(chǎn)生。所述病毒顆粒再適用于載體缺陷型的互補細(xì)胞中增殖。對于腺病毒載體，例如將使用293細(xì)胞系，其是用人胚胎腎細(xì)胞建立的并且有效地互補E1功能(Graham et al.，1977，J.Gen.Virol.36，59-72)，使用A549-E1細(xì)胞系(Imler et al.，1996，Gene Therapy 3，75-84)或者使用允許雙重互補(double complementation)的細(xì)胞系(Yeh et al.，1996，J.Virol.70，559-565；Krougliak and Graham，1995，Human Gene Therapy 6，1575-1586；Wang et al.，1995，Gene Therapy 2，775-783；國際申請WO 97/04119)。還可以使用輔助病毒以至少部分互補缺陷的功能。互補細(xì)胞是能夠反式提供對于在病毒衣殼中殼體化病毒基因組所需的早期和/或晚期因子的細(xì)胞，以便產(chǎn)生含有所述重組載體的病毒顆粒。所述細(xì)胞自身可能不能互補載體的所有缺陷的功能，此時可以用提供額外功能的載體/輔助病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明還涉及制備病毒顆粒的方法，其中方法包括(i)將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入能夠反式互補所述載體的互補細(xì)胞中，以獲得轉(zhuǎn)染的互補細(xì)胞，(ii)在適于使所述病毒顆粒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的互補細(xì)胞，及(iii)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述病毒顆粒。
病毒顆粒當(dāng)然可以從培養(yǎng)上清中回收，其也可以從細(xì)胞中回收。一個常用的方法由通過連續(xù)冷凍/融解循環(huán)來裂解細(xì)胞組成，以便在裂解上清中收集病毒體。然后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)(層析方法、超速離心方法、特別是通過氯化銫梯度等)擴增和純化該病毒體。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核苷酸序列或重組載體、或者用本發(fā)明的病毒顆粒感染的宿主細(xì)胞。為此，宿主細(xì)胞由可以被上述的重組載體轉(zhuǎn)染或被病毒顆粒感染的任何細(xì)胞組成。哺乳動物細(xì)胞，特別是人細(xì)胞是非常特別適合的。所述細(xì)胞可以包含整合進(jìn)或未整合進(jìn)(附加體(episome))基因組的形式的所述載體。細(xì)胞可以是任何來源的原代或腫瘤細(xì)胞，特別是造血細(xì)胞(全能干細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等)、肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞、肌原細(xì)胞、成肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽、核苷酸序列、重組載體、病毒顆粒或宿主細(xì)胞并組合了藥用可接受賦形劑的組合物。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽和一種感興趣多肽的組合物，所述感興趣的多肽被前述一種感興趣的基因編碼。這些感興趣的多肽，可以特別提及的是白細(xì)胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)，特別是GM-CSF和對血管發(fā)生有作用的因子(例如PA1-1，代表纖溶酶原激活物抑制劑)。非常特別優(yōu)選IL-2或INFγ。
所述組合物還可以基于能使上述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核苷酸序列。該核苷酸序列可以被同一個表達(dá)載體或者被兩個獨立的載體攜帶。所述組合物當(dāng)然可以包含產(chǎn)生自表達(dá)所述核苷酸序列的病毒載體的病毒顆粒。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核苷酸序列和編碼選自IL-2和INFγ的多肽的感興趣的第二種核苷酸序列的組合物。
本發(fā)明的組合物更特異地用于通過基因治療預(yù)防或治療疾病，且更特異針對增生性疾病(癌癥、腫瘤、再狹窄等)及感染起源的疾病，特別是病毒感染(由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、HIV、皰疹、逆轉(zhuǎn)錄病毒等誘導(dǎo)的)。
本發(fā)明的組合物可以通過局部、腸胃外或通過消化道常規(guī)施用。特別地，治療有效量的治療性或預(yù)防性制劑組合了藥用可接受的賦形劑?？梢栽O(shè)想大量的施用途徑?？梢蕴峒暗睦邮俏竷?nèi)、皮下、心內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和氣管內(nèi)途徑。在后三種實施方案中，有利地通過氣霧劑或通過滴入法施用。施用可以是單劑量或一定時間間隔后一或多次重復(fù)施用的劑量。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩胶蛣┝恳蕾囉诙喾N參數(shù)而變化，例如個體、要治療的疾病或被轉(zhuǎn)移的感興趣基因?；诒景l(fā)明病毒顆粒的制備物可以如下劑量形式配制，當(dāng)使用腺病毒顆粒時，在104和1014pfu(蝕斑形成單位)之間，有利地為105和1013pfu之間，優(yōu)選在106和1012pfu之間，更優(yōu)選在109和1010之間，當(dāng)使用MVA顆粒時，在106和107之間。至于本發(fā)明的重組載體，可以設(shè)想劑量包含0.01-100mg的DNA，優(yōu)選0.05-10mg，非常特別優(yōu)選0.5-5mg?；诙嚯牡慕M合物優(yōu)選包含0.05-10g，非常特別優(yōu)選0.05-5g所述多肽。當(dāng)然，這些劑量在臨床時可以調(diào)整。
所述制劑還可以包括藥用可接受的稀釋劑、佐劑或賦形劑，以及增溶、穩(wěn)定和保存劑。在注射施用時，優(yōu)選水溶液、非水溶液或等滲溶液的制劑。其可以是單劑量或多劑量，以液體或使用適當(dāng)?shù)南♂寗┰谑褂脮r可以復(fù)水的干燥(粉末、凍干物等)形式。制劑還可以包含適當(dāng)量的前體藥物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽、重組載體、病毒顆?；蛩拗骷?xì)胞在制備用于通過基因治療或通過施用由重組途徑生產(chǎn)的蛋白而治療人或動物機體的藥物中的治療性或預(yù)防性應(yīng)用。根據(jù)第一種可能性，藥物可以直接體內(nèi)施用(例如通過靜脈內(nèi)注射，進(jìn)入可接近的腫瘤，通過氣霧劑進(jìn)入肺，使用適當(dāng)?shù)膶?dǎo)管進(jìn)入血管系統(tǒng))。還可以采用回體(ex vivo)方法，該方法從患者中取出細(xì)胞(骨髓干細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、肌細(xì)胞等)，在體外用本領(lǐng)域的技術(shù)轉(zhuǎn)染或感染它們，然后將其重新施用給患者。優(yōu)選的應(yīng)用是治療或預(yù)防癌癥、腫瘤和非所需細(xì)胞增殖導(dǎo)致的疾病。可以提及的可能想到的應(yīng)用是乳腺癌、子宮癌(特別是乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、喉癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病等)。其也可以用于心血管疾病中，例如抑制或延遲血管壁平滑肌細(xì)胞的增生(再狹窄)。最后，再感染性疾病中，可以設(shè)想所述藥物用于AIDS。
本發(fā)明還涉及通過基因治療治療疾病的方法，特征在于將本發(fā)明的核苷酸序列、重組載體、病毒顆?；蛩拗骷?xì)胞施用給需要這種治療的宿主生物體或細(xì)胞。
根據(jù)一個有利的實施方案，所述治療性應(yīng)用或治療方法還包含一個額外的步驟，其中藥用可接受量的前體藥物，有利的為胞嘧啶類似物，特別是5-FC被施用給宿主生物體或細(xì)胞。作為說明，可以使用50-500mg/kg/天的劑量，優(yōu)選200mg/kg/天的劑量。本發(fā)明中，在施用本發(fā)明的治療劑之前、同時或隨后，按照標(biāo)準(zhǔn)實踐(例如口服，系統(tǒng)性)施用前體藥物。優(yōu)選口服途徑?？梢允┯脝蝿┝康那绑w藥物或在足夠長的時間內(nèi)重復(fù)施用劑量以使得毒性代謝物在宿主生物體或細(xì)胞中產(chǎn)生。
而且，本發(fā)明的組合物或方法可以組合一或多種加強5-FU胞毒性作用的物質(zhì)?？梢蕴貏e提及的是抑制嘧啶從頭開始的生物合成途徑中的酶的藥物(例如如下提及的)，如甲酰四氫葉酸的藥物(Waxmanet al.，1982，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18，685-692)，其在沒有5-FU的代謝產(chǎn)物(5-FdUMP)時，增加了胸苷酸合酶的抑制，導(dǎo)致dTMP庫(pool)的降低，其是復(fù)制所需的，及最后如氨甲蝶呤的藥物(Cadmanet al.，1979，Science 250，1135-1137)，其通過抑制二氫葉酸還原酶和增加PRPP(磷酸核糖焦磷酸)庫，導(dǎo)致5-FU向細(xì)胞RNA中的摻入增加。
本發(fā)明的組合物或方法可以組合一或多種在抗癌治療中有效的物質(zhì)?？梢耘c本發(fā)明的組合物聯(lián)合或組合使用的、在抗癌治療中有效的藥物物質(zhì)可以是烷化劑，如絲裂霉素C、環(huán)磷酰胺、白消安、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、異環(huán)磷酰胺(Isosfamide)、苯丙氨酸氮芥、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、硫化三磷、苯丁酸氮芥或者達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；抗代謝物，如吉西他濱(gemcitabine)、卡西他濱(capecitabine)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Cytarabine)、2-氟脫氧胞苷、氨甲蝶呤、idatrexate、雷替曲塞(tomudex)或者三甲曲沙(trimetrexate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，如阿霉素、表阿霉素(epirubicin)、鬼臼亞乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷或米托蒽醌(mitoxantrone)；拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，如伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、7-乙基-10-羥基-喜樹堿(SN-38)或者托潑替坎(topotecan)；抗有絲分裂藥，如紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春花堿、長春花新堿或長春瑞賓(Vinorelbine)；及鉑(platinum)衍生物，如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、螺鉑(spiroplatinum)或者卡鉑(carboplatinum)。本發(fā)明的組合物或方法還可以組合放射治療。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的序列或重組載體作為哺乳動物細(xì)胞中的陽性選擇標(biāo)記。有利地，所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)染且然后在存在嘧啶的從頭生物合成途徑的抑制劑的情況下培養(yǎng)細(xì)胞混合物，如存在PALA(N(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸；Moore et al.，1982，Biochem.Pharmacol.31，3317-3321)、A771726(來氟諾胺(Leflunomide)的活性代謝物；Davis et al.，1996，Biochem.35，1270-1273)和布利喹啉(Brequinar)(Chen et al.，1992，Cancer Res.52，3251-3257)。這種抑制劑的存在阻斷了UMP的從頭合成，其是合成RNA和DNA所需的，從而導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。這種胞毒性作用可以通過在存在尿嘧啶時表達(dá)本發(fā)明的編碼UPRTase活性的核苷酸序列或者通過在存在胞嘧啶時將上述核苷酸序列與編碼CDase活性(合適的融合形式)的序列共表達(dá)而被克服。結(jié)果，只有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(整合了UPRTase/CDase序列的細(xì)胞)能夠在存在嘧啶合成途徑抑制劑時生長。因此，本發(fā)明的應(yīng)用使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠有效地從細(xì)胞混合物中被鑒定和/或分離。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的序列或重組載體作為陰性選擇標(biāo)記的應(yīng)用。例如，本發(fā)明的序列或重組載體可以用于選擇胚胎干細(xì)胞或進(jìn)行核轉(zhuǎn)移后獲得的細(xì)胞，所述細(xì)胞中的基因是間斷的或修飾的(例如在制備轉(zhuǎn)基因動物的方法中)的(見例如Capecchi，1989，Science 244，1288-1292；Reid et al.，1990，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 87，4299-4303)。這種應(yīng)用組合了對新霉素有抗性的基因例如可以選擇經(jīng)過了同源重組事件并在存在遺傳霉素核相應(yīng)的氟化嘧啶(使用編碼CDase活性的核苷酸序列時是5-FC)時單獨能夠生長的細(xì)胞。經(jīng)歷了非靶向重組事件的細(xì)胞可以在存在遺傳霉素時生長但不能在存在氟化嘧啶時生長。另一種作為陰性選擇標(biāo)記的潛在應(yīng)用發(fā)現(xiàn)于植物領(lǐng)域，因為就如哺乳動物細(xì)胞一樣，植物不具有任何內(nèi)源性CDase活性。通過轉(zhuǎn)染本發(fā)明能夠表達(dá)外源CDase的核苷酸序列它們對5-FC敏化(見例如Perera et al.，1993，Plant.Mol.Biol.23，797-799)。
本發(fā)明的序列或重組載體還可以用作細(xì)菌或酵母的陰性選擇標(biāo)記。在這個特定實施方案中，優(yōu)選使用缺少天然CDase基因的酵母或細(xì)菌。細(xì)菌中，特別優(yōu)選EP0792369BB1中揭示的那些。例如，本發(fā)明的序列可以用于在包含本發(fā)明序列的質(zhì)粒中通過同源重組來克隆序列。在這些實驗中，本發(fā)明的序列位于待克隆的序列要被插入的位置。因此，同源重組后，包含所需質(zhì)粒的細(xì)胞能夠在存在5-FC時生長。


圖1示出了用本發(fā)明的載體處理的CD1裸鼠中LOVO腫瘤細(xì)胞的生長。
實施例1構(gòu)建Fcu1-8FCU1-8通過定向誘變FCU1構(gòu)建，從pCI-neoFCU1(pTG13046)出發(fā)，以寡核苷酸5’-gtattcttattactgatgatgg-3’(以修飾A549en T)將183位的Arg以Ser取代，得到質(zhì)粒pCT-neoFCU1-8(pTG15546)。
實施例2在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)FCY1、FCU1及Fcu1-8并確定CDase和UPRTase活性測試了質(zhì)粒pCIneo(Promega)、pCI-neoFCY1(pTG15916)、pCI-neoFCU1(pTG13046)和pCI-neoFCU1-8(pTG15546)瞬時轉(zhuǎn)染的哺乳動物COS7的原液的CDase和UPRTase活性。
程序如下5105COS7細(xì)胞在37℃接種于含有5ml DMEM/10％FCS培養(yǎng)基的60mm燒瓶中。24小時后，在存在或不存在5μg質(zhì)粒時用20μl的lipofectine(GIbco BRL)處理細(xì)胞。于2ml DMEM培養(yǎng)基中在37℃20小時后，細(xì)胞在存在5ml DMEM/10％FCS下溫育。37℃48小時后，用PBS洗細(xì)胞，然后懸浮于25μl裂解緩沖液中(Tris-HClpH 7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT 1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分鐘后離心，在含有細(xì)胞裂解物的上清中測量CDase和UPRTase活性。
對于CDase活性在存在2μl反應(yīng)CDase緩沖液(Tris-HCl pH7.5100mM/[H3]5-FC 3mM具有0.25μCi/μl)的情況下，于37℃溫育4μl的細(xì)胞裂解物20分鐘。
對于UPRTase活性在存在2μl反應(yīng)UPRTase緩沖液(Tris-HClpH7.5100mM/MgCl210mM/5-PRPP 10mM/[C14]5-FU 3mM具有0.02μCi/μl)的情況下，于37℃溫育4μl的細(xì)胞裂解物20分鐘。
在100℃、1分鐘終止酶反應(yīng)。將等份的1μl沉積在TLC聚乙烯亞胺纖維素平板上(Merck)。通過使用混合物水/1-丁醇(14％/86％)作為溶劑從5-FC中分離5-FU，并且5-FUMP和5-FU的分離通過使用水作為溶劑進(jìn)行。遷移后，TLC平板在PosphorImager(445SI；Molecular Dynamics)上掃描。通過Bradford方法測量蛋白質(zhì)濃度。
來自3個獨立測量計算的酶活性結(jié)果示于下表中
相比于FCU1基因，F(xiàn)cu1-8突變體散失了UPRTase活性，保留了10倍高于天然FCY1基因的CDase活性的CDase活性?；騀CU1中Arg183變?yōu)镾er導(dǎo)致UPRTase活性，但不修飾CDase活性。
實施例3構(gòu)建表達(dá)FCU1的腺病毒(AdTG14800)分離含有FCU1基因的pCI-neoFCU1(pTG13046)的XhoI-MluI片段并將其導(dǎo)入用這些相同酶切割的轉(zhuǎn)移載體pTG13387中，得到轉(zhuǎn)移載體pTG14799。在BJ 5183大腸桿菌中通過pTG14799的PacI-BstEII片段和ClaI線性化的載體pTG6624之間的同源重組重構(gòu)(reconstitute)腺病毒載體AD-FCU1(pTG14800)。最終構(gòu)建體AD-FCU1含有E1和E3缺失的Ad5基因組(核苷酸459-3510及28249-30758)且代替E1，包含F(xiàn)CU1基因的表達(dá)盒置于CMV啟動子和β-球蛋白/IgG的控制下，隨后是bGH的poly A序列。在互補細(xì)胞系(例如PERC6系)中通過轉(zhuǎn)染產(chǎn)生表達(dá)FCU1(AdTG14800)的腺病毒顆粒。
實施例4構(gòu)建表達(dá)Fcu1-8的腺病毒(AdTG15606)分離含有Fcu1-8基因的pCI-neoFCU1-8(pTG15546)的XhoI-MluI片段并將其導(dǎo)入用這些相同酶切割的轉(zhuǎn)移載體pTG13387中，得到轉(zhuǎn)移載體pTG15547。在BJ 5183大腸桿菌菌株中通過pTG15547的PacI-BstEII片段和ClaI線性化的載體pTG6624之間的同源重組重構(gòu)腺病毒載體AD-FCU1-8(pTG15606)。最終構(gòu)建體AD-FCU1-8含有缺失了E1(NT 459-3510)和E3(NT 28249-30758)區(qū)域的Ad5基因組且代替E1，包含F(xiàn)cu1-8基因的表達(dá)盒置于CMV早期啟動子雜種β-球蛋白/IgG和MVC的控制下，隨后是bGH的poly A序列。在互補E1功能的細(xì)胞系例如PERC6中通過轉(zhuǎn)染產(chǎn)生表達(dá)Fcu1-8的病毒顆粒(AdTG15606)。
實施例5通過表達(dá)FCU1(AdTG14800)和Fcu1-8(AdTG15606)的腺病毒的感染體外結(jié)果確定CDase和UPRTase活性用空腺病毒(AdTG15149)、表達(dá)FCU1的腺病毒(AdTG14800)和表達(dá)Fcu1-8的腺病毒(AdTG15606)感染人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCCCcl-185)。感染程序如下于50μl PBS-2％FCS-陽離子1％懸液中的5106細(xì)胞在37℃在存在MOI5的腺病毒的情況下溫育30分鐘?？倲?shù)5106細(xì)胞然后在存在5ml的DMEM-10％FCS下在60mm的燒瓶中溫育。37℃24小時后，在PBS中洗細(xì)胞，然后重懸于25μl的裂解緩沖液中(Tris-HCl pH7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分鐘后離心，在含有細(xì)胞裂解物的上清中測量CDase和UPRTase活性(如前述)。
來自3個獨立測量計算的酶活性結(jié)果示于下表中
對于表達(dá)Fcu1-8的腺病毒感染的細(xì)胞，結(jié)果表示UPRTase活性喪失，但CDase活性保留了。
實施例6構(gòu)建表達(dá)FCU1的MVA(MVATG15637)在BJ 5183大腸桿菌菌株中通過pCI-neoFCU1(pTG13046)的HindIII-KpnI片段和XhoI線性化的載體pTG14269之間的同源重組重構(gòu)轉(zhuǎn)移載體Mva-fcu1(pTG15637)。這個轉(zhuǎn)移載體MVA-fcu1(pTG15637)含有置于p11K7.5啟動子控制下的FCU1基因表達(dá)盒，其兩側(cè)為與MVA缺失III相鄰的序列。在胚胎雞細(xì)胞中通過MVAN33和質(zhì)粒pTG15637之間的同源重組產(chǎn)生表達(dá)FCU1的MVA顆粒(具有FCU1插入缺失III且在p11K7.5啟動子控制下的MVATG15637)。
實施例7構(gòu)建表達(dá)Fcu1-8的Mva(MVATG15638)在BJ 5183大腸桿菌菌株中通過通過pCI-neoFCU1-8(pTG15546)的HindIII-KpnI片段和XhoI線性化的載體pTG14269之間的同源重組重構(gòu)轉(zhuǎn)移載體MVA-FCU1-8(pTG15638)。這個轉(zhuǎn)移載體MVA-FCU1-8(pTG15638)含有含有置于p11K7.5啟動子控制下的Fcu1-8基因表達(dá)盒，其兩側(cè)為與MVA缺失III相鄰的序列。在胚胎雞細(xì)胞中通過MVAN33和質(zhì)粒pTG15638之間的同源重組產(chǎn)生表達(dá)Fcu1-8的MVA顆粒(具有Fcu1-8插入缺失III且在p11K7.5啟動子控制下的MVATG15638)。
實施例8表達(dá)FCU1(MVATG15637)和FCU1-8(MVATG15638)的MVA的感染體外結(jié)果確定CDase和UPRTase活性用空MVA(MVAN33)、表達(dá)FCU1的MVA(MVA15637)和表達(dá)FCU1-8的MVA(MVA15638)感染人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCCCCCL-185)。感染程序如下于50μl PBS-FCS 2％-陽離子1％懸液中的5106細(xì)胞在37℃在存在MOI 0.05的腺病毒的情況下溫育30分鐘。總數(shù)5106細(xì)胞然后在存在5ml的DMEM-10％FCS下在60mm的燒瓶中溫育。37℃24小時后，在PBS中洗細(xì)胞，然后重懸于25μl的裂解緩沖液中(Tris-HCl pH7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分鐘后離心，在含有細(xì)胞裂解物的上清中測量CDase和UPRTase活性(按照前述程序)。
來自3個獨立測量計算的酶活性結(jié)果示于下表中
對于表達(dá)FCU1-8的MVA感染的細(xì)胞，結(jié)果表示UPRTase活性喪失，但CDase活性保留了。
實施例9體內(nèi)表達(dá)通過皮內(nèi)途徑在8組15只CD1裸鼠中在J0注射5.106人細(xì)胞LoVo(結(jié)腸腺癌)。只要腫瘤具有30-50mm3的體積(J+10)，通過腫瘤內(nèi)施用注射量為5.106PFU的MVA。從J+10，口服施用0.5ml水或0.5ml的0.5％5-FC溶液，一天兩次，14天。腫瘤的體積(圖1)顯出與MVA-FCU1/5-FC組相比，MVA-fCU1-8/5-FC組的腫瘤的大小得到了更好的控制。
序列表<110>特蘭斯吉恩股份有限公司<120>具有改良的胞嘧啶脫氨酶活性的多肽<130>D21447<140>PCT/IB2004/002505<141>2004-06-29<150>US 60/508 274<151>2003-10-06<150>EP 03/360 087<151>2003-07-21<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>373<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceFusionprotein having a CDase activity<300>
<400>1Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp1 5 10 15Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro20 25 30Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg35 40 45Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu50 55 60Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys65 70 75 80Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly85 90 95Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val100 105 110Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu115 120 125Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe130 135 140
Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser145 150 155 160Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu165 170 175Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe180 185 190Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu195 200 205Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu210 215 220Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile225 230 235 240Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg245 250 255Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala260 265 270Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg275 280 285Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile290 295 300Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile305 310 315 320Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His325 330 335Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly340 345 350Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp355 360 365Arg Tyr Tyr Cys Val370<210>2<211>216<212>PRT<213>Saccharomyces cerevisiae<400>2Met Ser Ser Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn1 5 10 15Gln Leu Leu Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg20 25 30Pro Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu35 40 45
Glu Gly Leu Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp50 55 60Thr Asn Glu Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly65 70 75 80Val Ser Ile Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp85 90 95Cys Cys Arg Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu100 105 110Glu Thr Ala Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile115 120 125Ser Glu Arg Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly130 135 140Ser Ala Ile Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro145 150 155 160Glu Arg Ile Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu165 170 175Lys Tyr His Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu180 185 190Asp Arg Gly Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp195 200 205Phe Gly Asp Arg Tyr Tyr Cys Val210 21權(quán)利要求
1.具有CDase活性的多肽，特征在于其通過添加一段氨基酸序列而衍生自天然CDase，條件是所述多肽不具有UPRtase或胸苷激酶活性。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述添加到天然CDase的氨基酸序列與天然CDase的C末端連接。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述添加到天然CDase的氨基酸序列長度在10和1000個氨基酸之間。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述添加到天然CDase的氨基酸序列長度在100個400個氨基酸之間。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述添加到天然CDase的氨基酸序列長度在200和300個氨基酸之間。
6.權(quán)利要求1-5任一項的多肽，其中所述添加到天然CDase的氨基酸序列來自具有UPRTase活性的多肽。
7.權(quán)利要求6的多肽，特征在于所述具有UPRTase活性的多肽衍生自酵母UPRTase，特別是被釀酒酵母FUR1基因編碼的。
8.權(quán)利要求7的多肽，特征在于所述添加到天然CDase的氨基酸序列來自基本為SEQ ID NO2所示的、起自第2位的Ser殘基并且終止于第216位的Val殘基的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的多肽，特征在于所述添加到天然CDase的氨基酸序列是如SEQ ID NO2所示的、起自第2位的Ser殘基并且終止于第216位的Val殘基的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-9任一項的多肽，特征在于所述天然CDase是酵母CDase，特別是釀酒酵母FCY1基因編碼的。
11.權(quán)利要求10的多肽，特征在于所述天然CDase包括基本為SEQ ID NO1所示的、起自第1位的Met殘基并且終止于第158位的Glu殘基的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的多肽，特征在于所述天然CDase包括SEQ IDNO1所示的、起自第1位的Met殘基并且終止于第158位的Glu殘基的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求10的多肽，特征在于其包括基本為SEQ ID NO1所示的、起自第1位的Met殘基并且終止于第373位的Val殘基的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的多肽，特征在于其其包括基本為SEQ ID NO1所示的、起自第1位的Met殘基并且終止于第374位的Val殘基的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1-14任一項的多肽，特征在于其具有比天然CDase活性略高的CDase活性。
16.編碼權(quán)利要求1-15任一項的多肽的核苷酸序列。
17.攜帶權(quán)利要求16的核苷酸序列的重組載體，所述核苷酸序列在其在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的元件的控制下。
18.權(quán)利要求17的重組載體，特征在于所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體，當(dāng)合適時，其與一或多種提高載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)組合。
19.權(quán)利要求18的重組載體，其中所述提高載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)選自陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、溶血磷脂和多肽的組。
20.權(quán)利要求18的重組載體，特征在于所述載體是衍生自痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒屬、泡沫病毒或腺伴隨病毒的病毒載體。
21.權(quán)利要求20的重組載體，特征在于所述載體衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
22.權(quán)利要求21的重組載體，特征在于權(quán)利要求16的核苷酸序列插入MVA基因組中天然發(fā)生缺失的位點中，所述天然發(fā)生缺失的位點選自缺失I、II、III、IV、V和VI。
23.權(quán)利要求22的重組載體，其中所述天然發(fā)生缺失的位點是缺失III。
24.權(quán)利要求17-23任一項的重組載體，特征在于表達(dá)所需的元件包括啟動子。
25.權(quán)利要求24的重組載體，特征在于所述啟動子是胸苷激酶7.5k基因的啟動子。
26.權(quán)利要求20的重組載體，特征在于所述載體是缺少全部或部分復(fù)制必需的、選自E1、E2、E4和L1-L5區(qū)域中的至少一個區(qū)域的腺病毒載體。
27.權(quán)利要求26的重組載體，特征在于所述載體是額外缺失全部或部分非必需E3區(qū)域的腺病毒載體。
28.權(quán)利要求24的重組載體，特征在于所述啟動子是巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子。
29.權(quán)利要求17-28任一項的重組載體，特征在于其額外包括一或多個感興趣的基因，所述基因選自編碼白細(xì)胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)和對血管發(fā)生有作用的因子的基因。
30.權(quán)利要求29的重組載體，特征在于感興趣的基因編碼選自IL-12和INFγ的多肽。
31.制備病毒顆粒的方法，包括(i)將權(quán)利要求17-29任一項的重組載體導(dǎo)入一種能夠反式互補所述載體的互補細(xì)胞中以獲得轉(zhuǎn)染的互補細(xì)胞，(ii)在適于使所述病毒顆粒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的互補細(xì)胞，及(iii)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述病毒顆粒。
32.包含權(quán)利要求17-30任一項的重組載體的病毒顆?；驒?quán)利要求31的方法獲得的病毒顆粒。
33.包含權(quán)利要求16的核苷酸序列或權(quán)利要求17-30任一項的重組載體的宿主細(xì)胞或用權(quán)利要求32的病毒顆粒感染的宿主細(xì)胞。
34.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-15任一項的多肽、權(quán)利要求16的核苷酸序列、權(quán)利要求17-30任一項的重組載體、權(quán)利要求32的病毒顆?；驒?quán)利要求33的宿主細(xì)胞，并組合一種藥學(xué)可接受賦形劑。
35.權(quán)利要求34的組合物，特征在于其包含權(quán)利要求1-15任一項的一種多肽及感興趣的第二種多肽，特別是選自IL-12和INFγ的多肽。
36.權(quán)利要求34的組合物，特征在于其包含權(quán)利要求16的一種核苷酸序列及感興趣的第二種核苷酸序列，所述第二種核苷酸序列編碼選自IL-12和INFγ的多肽。
37.權(quán)利要求1-15任一項的多肽、權(quán)利要求16的核苷酸序列、權(quán)利要求17-30任一項的重組載體、權(quán)利要求32的病毒顆?；驒?quán)利要求32的宿主細(xì)胞在制備用于通過基因治療或通過施用重組途徑生產(chǎn)的蛋白質(zhì)而治療人或動物機體的藥物中的治療性或預(yù)防性應(yīng)用。
38.權(quán)利要求37的治療性應(yīng)用，其用于制備用于治療癌癥、腫瘤和由非所需的細(xì)胞增殖而導(dǎo)致的疾病的藥物。
39.通過基因治療治療疾病的方法，特征在于權(quán)利要求16的核苷酸序列、權(quán)利要求17-30任一項的重組載體、權(quán)利要求32的病毒顆?；驒?quán)利要求33的宿主細(xì)胞施用給需要這種治療的生物體或宿主細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，或權(quán)利要求37或38的治療性應(yīng)用，其中施用給所述宿主生物體或細(xì)胞藥用可接受量的前體藥物，有利的是胞嘧啶類似物，特別是5-FC。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有CDase活性的多肽，特征在于其通過添加一段氨基酸序列而衍生自天然CDase，條件是所述多肽不具有UPRtase或胸苷激酶活性。
文檔編號C12N9/78GK1826410SQ200480021100
公開日2006年8月30日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者菲利普·埃爾布 申請人:特蘭斯吉恩股份有限公司