專利名稱：重組昆蟲痘病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組昆蟲痘病毒(EPV)，特別是生產(chǎn)能表達異源DNA序列的重組棉鈴蟲(Heliothis armigera)昆蟲痘病毒(HaEPV)。本發(fā)明具體的用途包括用該重組昆蟲痘病毒作為生物殺昆蟲劑，以及用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)所需的生物活性蛋白質(zhì);多肽和肽。
昆蟲痘病毒是大的，昆蟲的雙鏈DNA病毒，迄今已描述了來自毛蟲，甲蟲和蝗蟲的這類病毒(Goodwin el al.，1991)。這些昆蟲的經(jīng)濟重要性導(dǎo)致對以EPV作為潛在生物控制劑的深入考慮，并且其他一些研究者對支持利用它們這一能力方面所具有的各種特性的研究已有文獻記載。例如，不僅集合的EPV宿主范圍寬(覆蓋了重要的昆蟲群體)，同時個別JEPV分離物一般都有較窄的宿主范圍，從而使之可能有高水平的控制特異性。另外，已顯示與大量感染性EPV接觸的脊椎動物(和脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)物)并沒有感染或其他可辯明的有害影響的征象(Buckner & Cunnigham，1972;Langridge，1973)。
這些因素為將EPV用作昆蟲控制劑提供了重要的可能性。但不幸的是，大多數(shù)EPV都表現(xiàn)有低水平的致病性。這種已阻礙了開發(fā)以病毒作為主要商品殺昆蟲劑之深入嘗試的特性可以通過生產(chǎn)重組的昆蟲痘病毒將以克服，該重組病毒能表達編碼對昆蟲有毒性或其他有害作用之外源DNA序列。
重組昆蟲痘病毒在生產(chǎn)同質(zhì)和生物學(xué)活性蛋白質(zhì)、多肽和肽方面也有很大潛力。這些產(chǎn)品目前都是由重組細(xì)菌或使用表達載體在真核細(xì)胞中產(chǎn)生的。第一種方法在技術(shù)上更為簡單，但缺點是許多真核細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)不能在細(xì)菌中得到正確加工。沒有正確加工的許多蛋白質(zhì)是無生物學(xué)活性的，因此實用價質(zhì)很少。另一方面，在脊椎動物細(xì)胞中由表達載體生產(chǎn)一般費用都很大，而且蛋白質(zhì)產(chǎn)率較小。某些真核細(xì)胞表達載體(如桿狀病毒)還可引起宿主細(xì)胞溶解。
與桿狀病毒相反，EPV并不一定引起被感染的胞溶解，因而有可能長期持續(xù)感染大批細(xì)胞培養(yǎng)物。這將使蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率提高特別是對于那些可由宿主細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，因為這樣將不必破碎細(xì)胞即可收集產(chǎn)物(通過定期除去細(xì)胞培養(yǎng)基)。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供適于用作生物殺昆蟲劑的重組昆蟲痘病毒和/或在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)、多肽和肽的表達載體。為實現(xiàn)這一目的，有必要鑒定EPV基因組中的非必需區(qū)域。鑒定這些區(qū)域?qū)⑻峁┛捎糜诎l(fā)展EPV病毒載體的位點，通過用已知方法(最常用的是同源重組方法)將外源DNA插入EPV基因組的非必需區(qū)域中，其中也可以在插入外來DNA之前缺失非必需區(qū)域或其部分。
EPV的河豚精蛋白是閉合體(球形體)的主要成分。因為閉合只是病毒水平傳播所必需的，并且沒有感染，所以由強啟動系驅(qū)動的單一河豚精蛋白基因為將外源基因序列插入EPV基因組中提供了很有吸引力的位點。已報導(dǎo)了編碼Amsacta moorei EPV(Am EPV)河豚精蛋白的基因序列(Hall and Moyer，1991)。其產(chǎn)物是帶有半胱氨酸高含量，并有許多潛在糖基化位點的115kDa蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)與以前描述的其他蛋白質(zhì)，包括純化的Choristoneura biennis EPV(CbEPV)制劑的主要蛋白質(zhì)成分無關(guān)，后者已被鑒定為該病毒的河豚精蛋白部分(Yuen ey al.，1990)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，昆痘疾病毒在其基因組內(nèi)還具有適于用作引入外源DNA之位點的非必要區(qū)域。
因此，本發(fā)明的一個方面可提供了一種重組體昆蟲痘病毒，其特征在于外源DNA定位于昆蟲痘病毒的下述一個或多個區(qū)域中(ⅰ)p11.5開放讀碼(ORF)區(qū)域;
(ⅱ)胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域;
(ⅲ)紡錘體蛋白編碼區(qū)域(ⅳ)基因間區(qū)域基因間區(qū)域是指病毒基因組中上游基因或真正或潛在的編碼病毒蛋白之開放讀碼(ORF)的第一個轉(zhuǎn)譯終止密碼子后面的，或繼后下游基因或ORF之轉(zhuǎn)譯起始密碼子前面的任何區(qū)域。這樣的基因間區(qū)域可包含增強子或啟動子元件，其他功能元件，或沒有鑒定之活性的其他核苷酸序列。
異源DNA最好插入到p11.5ORF區(qū)域或紡錘體蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。
重組昆蟲痘病毒較好是桑燈蛾(Amsacta moorei)EPV，雙卷葉蛾(Choristoneura biennis)EPV，棉齡蟲(Heliothis armigera)EPV，云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)EPV，Aphodius tasmaniae EPV，Dermolepida albohirtum EPV，Melolontha melolon-tha EPV或Servicesthis nigrolineata EPV。
除球形體外，許多EPV分離物還產(chǎn)生大量的稱為紡錘體的第二種類型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這些小體并不閉合病毒顆粒，并且在某些EPV中它們本身閉合成球形體的基質(zhì)。已從棉齡蟲EPV(HaEPV)中分離了紡錘體蛋白(fusolin)編碼區(qū)(及相鄰區(qū)域)，并在圖I中給出其序列。因此，本發(fā)明的第二個方面提供了包含EPV紡錘體蛋白式其部分之編碼序列，并可能包含5′啟動子序列的分離的DNA分子。
已從HaEPV中分離出p11.5ORF和相鄰的5'區(qū)域。

圖1中給出了這些區(qū)域的序列。因此，本發(fā)明的第三個方面提供了包含p11.5ORF或其部分之編碼序列，并還可能包括5'啟動子/基因間序列的分離的DNA分子。
本發(fā)明的再一個方面提供了重組HaEPV，特征在于異源DNA定位在基因組的一個或多個非必需區(qū)域中。異源基因最好插入到該昆蟲痘病毒基因組的一個或多個下列區(qū)域中(ⅰ)p11.5開放讀碼(ORF)區(qū)域;
(ⅱ)胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域;
(ⅲ)紡錘體蛋白編碼區(qū)域;
(ⅳ)河豚精蛋白編碼區(qū)域;
(ⅴ)基因間區(qū)域;
異源基因最好插到p11.5ORF區(qū)域或紡錘體蛋白編碼區(qū)域中。
本發(fā)明的重組昆蟲痘病毒可用作生物殺昆蟲劑，可與一種可接受的農(nóng)用載體物質(zhì)制成混合物。插入重組EPV之基因組中的異源DNA可包括編碼一種或多種對昆蟲有害物質(zhì)的基因。例如，這些物質(zhì)包括蘇云金桿菌δ毒素、昆蟲神經(jīng)激素或與這些激素相互作用的蛋白質(zhì)(如保幼激素酸酶)、來源于黃蜂、蝎毒或其他異種來源的殺昆蟲化合物，或設(shè)計此一種引起被感染組織發(fā)生病變的方式攻擊或殺傷被感染細(xì)胞的因子[如對抗基本細(xì)胞功能的核糖酶(ribozyme)]?？捎商烊换蚱渌m當(dāng)啟動子，但最好由昆蟲痘病毒啟動子，特別是紡錘體蛋白基因啟動子，河豚精蛋白基因啟動子或p11.5ORF啟動子驅(qū)動異源基因的表達。因此，本發(fā)明的再一個方面包括含有衍生于昆蟲痘病毒之河豚糖蛋白基因或紡錘體蛋白基因，或昆蟲病毒更好是昆蟲痘病毒之p11.5ORF的啟動子區(qū)域或其部分的分離的DNA分子。
另外，本發(fā)明的重組昆蟲痘病毒可用于生產(chǎn)預(yù)期的生物子活性蛋白質(zhì)、多肽或肽，如干擾素(如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)、淋巴毒素(LT)、巨噬細(xì)胞激活因子(MAF)等細(xì)胞激活素、胰島素。表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、L生長激素(hGH)、抗體及其片段等?？捎商烊粏幼踊蚱渌m當(dāng)?shù)膯幼域?qū)動編碼預(yù)期蛋白質(zhì)之基因的表達，但更好是由昆蟲痘病毒啟動子，特別是紡錘體蛋白基因啟動子、河豚精蛋白基因啟動子或p11.5ORF啟動子驅(qū)動表達?？赏ㄟ^感染培養(yǎng)的Helicoverpa或夜蛾(Spodoptera)細(xì)胞如包含或或衍生于Helicoverpa BCIRL-HZ-AMI細(xì)胞素(U.S.Dept.of Agriculture)、夜蛾Sf9細(xì)胞素(American Type Culture Collection)的細(xì)胞或類似細(xì)胞，使用重組HaEPV來生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)、多肽或肽。
p11.5CRF似乎也存在于核多菌體病毒(NPV)中并在其中表達。即GeneBank登記號M59422，座位NPAIEN，其含有以前尚未描述過的可能編碼HaEOV p11.5同系物之ORF的AcNPV中的2011 bp ds-DNA。如已公開的，該ORF處在于核苷酸位置1662開始(即基因的3′端)的相反方向上。使用跨越1662至1969位的AcNPVPCR衍生的擴增子作為隨機預(yù)引標(biāo)記的探針的模板，得自AcNPV感染的和健康夜蛾sf9細(xì)胞的Northern印跡表明在被感染但不健康的細(xì)胞中存在有其大小預(yù)期可編碼P11.5蛋白質(zhì)同系物的RNA產(chǎn)物(約300個核苷酸)。這一結(jié)果有力地提示該ORF事實上是一功能性AcNPV基因。感染約48小時后出現(xiàn)表達AcNPV基因的峰。
此外，GeneBank登記號M63414，座位NPOIEIA述及一個來自O(shè)rgia pseudotsugata NPV(OpNPV)并且也含有先前未描述過的可能編碼p11.5同系物的ORF的3792bp ds-DNA序列。該同源區(qū)域從已公開的堿基350(推測的基因的5′末端)延伸到作為推測的轉(zhuǎn)譯終止密碼子之最后一個堿基的堿基637。
因此，本發(fā)明的再一個方面提供了重組NPV，其特征在于異源DNA定位于NPV基因組中基本上同源于p11.5ORF昆蟲痘病毒區(qū)域的區(qū)域內(nèi)。
NPV較好是桿狀病毒，特別是AcNPV或OpNPV。異源DNA可以是上述類型的。
因此，本發(fā)明還應(yīng)被理解為擴展到生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)、多肽或肽的方法，該方法包括用根據(jù)本發(fā)明的重組昆蟲痘病毒或重組核多菌體病毒感染敏感的宿主細(xì)胞。
重組HaEPV可用于控制例如Heliothis/Helicoverpa或Spodoptera。重組NPV可用于控制例如各種鱗翅目昆蟲。因此，本發(fā)明還擴展到控制有害昆蟲繁殖的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的重組昆蟲痘病毒或重組核多菌體病毒，或它們與適當(dāng)載體的混合物施用于遭受感染的地域。
如上所述，可使用同源重組方法很方便地將異源DNA插入EPV或NPV基因組的非必需區(qū)域。很容易推想到的是，可使用其中異源基因側(cè)翼接有相當(dāng)于非必需靶區(qū)域之5-10個核苷酸堿基序列的構(gòu)建體來實現(xiàn)同源重組。但0.5-2.0kb的側(cè)翼序列應(yīng)能以更大效率提供所需的重組體。
現(xiàn)借下附圖和下述非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。
圖1顯示棉齡蟲昆蟲痘病毒p11.5ORF、p50紡錘體蛋白(fusolin)、基因間和側(cè)翼區(qū)域的基因組DNA序列。該序列來自BglⅡ4.9kb克隆36。
圖2比較了棉齡蟲昆蟲痘病毒p50紡錘體蛋白(上面一行序列)和Choristoneura biennis昆蟲痘病毒之同源蛋白質(zhì)(下面一行序列)的氨基酸序列。其中全部使用單字母氨基酸代碼。
圖3比較了棉齡蟲昆蟲痘病毒p11.5ORF和p50紡錘體蛋白間的基因間區(qū)域的核苷酸序列(上面一行)和Choristoneura biennis昆蟲痘病毒中同源基因直接下游的核苷酸序列(下面一行)。
圖4(A)證明了被野生型棉齡蟲昆蟲痘病毒(HaEPV;左)感染的或被分離的G+F-重組HaEPV克隆H12(右)感染的H.Zea細(xì)胞中的GUS活性。
(B)證明了被野生型HaEPV;(左)或由pEPAS3∶GUS衍生的G+F-重組HaEPV(右)感染的美洲棉齡蟲(H.Zea)細(xì)胞中的GUS活性。
可以看出，在兩種情況下被野生型HaEPV感染的細(xì)胞中都沒有GUS活性，但被重組HaEPV感染的細(xì)胞中則有活性。
圖5提供了被表達GUS的重組棉齡蟲昆蟲痘病毒(HaEPV)克隆H12(實線)、野生型HaEPV(點線)感染的和偽感染的(破拆線)細(xì)胞培養(yǎng)物之溶胞產(chǎn)物的分光光度分析結(jié)果。表達GUS的重組體的吸收峰表明存在GUS催化的反應(yīng)產(chǎn)物。
圖6證明由重組棉齡蟲昆蟲痘病毒(HaEPV)表達NC10蛋白質(zhì)。該圖顯示被野生型和表達NC10的重組HaEPV的混合物(泳道1)或只被野生型HaEPV(泳道2)感染的美洲棉齡蟲(H.zea)細(xì)胞之溶胞產(chǎn)物的Western印跡。箭頭指出美洲棉齡蟲細(xì)胞產(chǎn)物中NC10單體的預(yù)期的遷移位置;可看到泳道1中存在免疫反應(yīng)性帶的位置上在泳道2中卻沒有檢出這個帶。圖左側(cè)示出的數(shù)字為蛋白質(zhì)標(biāo)志物的遷移位置和分子量。
實施例1棉鈴蟲昆蟲痘病毒基因和病毒蛋白質(zhì)的特性病毒。野生型棉鈴蟲昆蟲痘病毒(HaEPV)由Dr.R.E.Teakle(Entomology Branch Queensland Department of Primary Industries)提供并在從田野收集的昆蟲得到的Helicoverpa armigera的實驗室細(xì)胞株中增殖(Fernon et al.，待出版)。
用差速離心法從浸軟的受感染幼蟲中純化球形體和相關(guān)紡錘體?；旧习凑誂rif(1976)的方法純化病毒顆粒;用加在碳酸鹽緩沖液中的巰基醋酸鈉解離，在40-68%蔗糖梯度上(在1mM Tris，pH8.0中)離心并對2mM Mops(pH7.1)透析從球形體中釋放病毒顆粒。
在1mg/ml蛋白酶K中保溫(室溫過夜，然后37℃下2小時)，在TE飽合的(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)苯酚/氯仿/異戊醇(分別為25∶24∶1)中提取并沉淀，以從病毒顆粒中純化病毒基因組DNA。
蛋白質(zhì)分析。按Erlandson(1991)所述方法溶解HaEPV球形體和紡錘體，其中所用緩沖液基本上如Bilimoria和Arif(1979)所述，但不同的是尿素、SDS和巰基乙醇的終濃度分別為6.4m，4%和4%。用SDS-PAGE法分離蛋白質(zhì)并用膠質(zhì)考馬斯蘭(Gradipore Australia)染色。有些情況下，使Laemmli凝膠與加在室上部，電泳緩沖液中的20mM谷胱甘肽一起預(yù)電泳30分鐘;棄去該緩沖液并換成標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液，然后上樣?；旧习碩owbin等人(1979)的方法在硝酸纖維素膜上進行Westem印跡分析。使用聚糖檢測藥盒(Boehringer Mannheim)，按制造亦推薦的方法檢驗轉(zhuǎn)印到酯酸纖維素膜上的變性病毒蛋白質(zhì)的糖基化情況。在加有10%甲醇，pH10.5的5mMCAPS(環(huán)己基氨基丙磺酸)中，于Biorad Mini Trans-Blot小室內(nèi)，以250mA電流作用1小時，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Immobilon-p，Millipore)上。轉(zhuǎn)移后，分別用加在50%甲醇中的0.1%考馬斯蘭染色并用加在50%甲醇中的10%乙酸脫色以顯現(xiàn)蛋白帶，然后切下凝膠片并在滅菌蒸餾水中徹底清洗。使用Applied Biosystems 477A型脈沖液相序列分析儀，在PVDE基質(zhì)上分析蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。然后根據(jù)所得氨基酸序列數(shù)據(jù)證實4.9Kb Bg1 HaEPV基因組DNA克隆(＃36)中已測序列的同一性。
融合蛋白質(zhì)和抗血清。用限制酶消化以切掉含有大部分p50紡錘體蛋白(fusolin)基因之編碼區(qū)的972 bp SspI片段，并克隆到pGex 3X表達載體(Glutagene;Smith & Johnson，1988)中;使重組質(zhì)粒生長于大腸桿菌(TG-1菌株)中。向生長活躍的細(xì)胞中加IPTG(終濃度1mM)并在37℃繼續(xù)保溫3小時，以誘導(dǎo)HaEPVp50-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合產(chǎn)物的表達。離心收集細(xì)胞團塊，重新懸注在TEN(50mM Tris，pH7.5;2mM EDTA;100mM NaCl)中并加溶菌酶(終濃度0.2mg/ml)于37℃保溫30分鐘以溶解細(xì)胞，離心(10000g，5分鐘)溶胞產(chǎn)物并將沉淀餅重新溶解在PBS中。在30mM尿素和0.2%SDS存在下，于60℃將溶胞產(chǎn)物保溫30分鐘，以部分地純化高度可溶性融合蛋白質(zhì)。然后按上述條件離心溶胞產(chǎn)物混合物，將沉淀餅重新懸浮PBS中，在SDS-PAGE樣品緩沖液(Sambrook et al.，1989)中煮沸使之變性，并在SDS-PAGE凝膠(4%堆積膠;12.5%分離膠)上分離蛋白質(zhì)。從該聚丙烯酰胺膠中切下融合蛋白帶，再次上瓊脂糖凝膠(Pro Sieve，F(xiàn)MC)上電冰。然后從切下的瓊脂糖凝膠中洗脫蛋白質(zhì)并超濾濃縮之。
使純化的融合蛋白質(zhì)(約5μg)與弗氏佐劑混合并經(jīng)皮下注入體內(nèi)。用相似量的蛋白質(zhì)作加強注射，并在第一次注射后的14、28和35天給藥;末次加強免疫使用加在瓊脂糖凝膠基層中的融合蛋白質(zhì)，并與佐劑徹底混合。于第28天和40天從兔體內(nèi)得到抗血清。
為進行免疫螢光研究，將純化HaEPV球形體和紡錘體的懸液在PBS中清洗，用加有0.05% Tween 20的PBS洗兩次，然后在加有2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)的PBS室溫下保溫1小時。制劑在0.05%Tween 20中洗兩次以上，然后在使用PBS作1∶500稀釋的第一抗體(兔預(yù)免疫血清，或抗p50融合蛋白血清)中保溫2小時。洗3次后，向制劑中加入等體積在PBS中1∶64稀釋的第二抗體(FITC結(jié)合的羊和抗兔IgG;Sigma F-9262)，并保溫過夜。再次用PBS徹底洗制劑，然后在含1%鄰苯二胺的在PBS中的甘油50%溶液內(nèi)固定。用Wild Leitz若焦點激光掃描顯微鏡檢測熒光活性。
HaEPV制劑中的蛋白質(zhì)。在Laemmli凝膠上對含有HaEPV球形體和仿錘體的制劑的中解離的蛋白質(zhì)進行電泳分離，可產(chǎn)生多條有不同強度的帶。當(dāng)同樣的蛋白質(zhì)制劑在用20mM谷胱甘肽預(yù)處理的凝膠上電泳時，出現(xiàn)大致相同的電泳圖形，顯著的不同點是主帶的呈現(xiàn)50KDa的表現(xiàn)遷移率。在標(biāo)準(zhǔn)Laemmli條件下，可在凝膠的這個區(qū)域中觀察到一條寬的分散帶;用谷胱甘肽預(yù)處理者則出現(xiàn)明確限定的p50帶，而不是分散帶，且在這些條件下在我們的制劑中存在最豐富的蛋白質(zhì)。制劑中的其他主要帶已基于它們的表現(xiàn)分子量而定名為p120，p98，p87和p21。
對印跡轉(zhuǎn)移的p50進行N末端安基酸分析測知前11個殘基的序列為His-Gly-Tyr-Met-Thr-Phe-Pro-Ile-(Ile/Ala)-Ala-Gln。試圖用這些方法限定p120的N末端氨基酸組成，但沒有獲得成功，可能是因為蛋白質(zhì)在該位點上被封閉。
克隆和序列分析。根據(jù)先前已公開的Chloristoneura biennis EPV序列(Yuen et al.，1990)設(shè)計簡并寡核苷酸并在Pharinacia LKB Gene Assembler Plus上合成之;寡核苷酸序列為(5′)GAATATGC(A/T)GC(A/T)TTAGCAGG(A/T/C)CC和(5′)ACA(A/G)TT(A/G)TA(A/G)AA(T/A)CCTTC(T/A)CC(T/C)AC。按標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Sambrook et al.，1989)使用這些寡序列，從純化的HaEPA基因組DNA產(chǎn)生擴增子(amplicon)。該反應(yīng)共進行31次;初始模板變性為94℃下進行5分鐘，然后分別在42°，72°和94℃下進行前5次退火、延伸和變性，所有過程均為1.5分鐘。其余反應(yīng)周期條件基本相同，但退火溫度為50°，變性時間為1分鐘，并且最后一個周期中延伸步驟為5分鐘。用反應(yīng)得到的復(fù)制子作為模板，以合成隨機引導(dǎo)的32p標(biāo)記的DNA探針(Boehringer Mannheim)。用Southern吸印法(Sambrook et al.，1989)篩選限制酶消化的HaEPV基因組DNA中的有用片段，然后將鑒定的4.9kbBglⅡ片段克隆到pTZ19R(Pharmacia)中。
之后克隆該BglⅡ片段并進行序列檢測(圖1)。發(fā)現(xiàn)在該片段內(nèi)有一個含有p50之N末端氨基酸序列的開放讀碼。此開放讀碼由1056個堿基(包括終止密碼子)組成，并推測其編碼分子量為40132Da的351氨基酸蛋白質(zhì)，且其等電點為5.87。該氨基酸序鑒定為形成在預(yù)測蛋白質(zhì)之氨基酸21處開始的p50的N末端部分(參見上文)，并完全相同于預(yù)測的11個殘基中的第10個殘基處的序列(得自該基因的三個獨立基因組克隆的核苷酸基因數(shù)據(jù)清楚地表明成熟形式的p50中的第10個氨基酸是Arg)。這一發(fā)現(xiàn)證明p50是經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后修飾的;剪短的成熟形式的蛋白質(zhì)的預(yù)測分子量為37730Da，等電點為5.63，并含有9個半胱氨酸殘基。
在p50成熟期間顯然被切掉的20氨基酸肽的推測的分子量為2420，等電點為8.07，且具有一個疏水核心。這些特征與見于其他病毒的作為先導(dǎo)序列并且引導(dǎo)新生蛋白質(zhì)穿越細(xì)胞外膜的肽相一致。
將HaEPV p50氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中可得到的其他序列相比較，揭示它只與Choristoneura biennis EPV(CbEPV)50K蛋白質(zhì)(Yuen et al.，1990)和Autographa californica NPU的相關(guān)34.8K蛋白質(zhì)(Viallard et al.，1990)有大部分同源性。HaEPV p50與這些蛋白質(zhì)一一相對排列，使用Gap計算法顯示分別有63%和42%完全相同。圖2中顯示HaEPV p50與CbEPV 50K蛋白質(zhì)的推測的全長氨基酸序列的比較。
成熟形式的HaEPV p50中的9個半胱氨酸殘基，每一個都在CbEPV p50(Yuen et al.，1990)中有其相應(yīng)的Cys，并且該9個中的6個也保留于AcNPV p34.8中。His-Gly-Try作為成熟形式HaEPV p50之N末端的保守性，支持以前關(guān)于該序列(與直接上游的氨基酸結(jié)合存在)作為加工主體重要性的猜想，并進一步提示有可能在相似位置上加工AcNPV p34.8(Vialard et al.，1990)。
HaEPV p50基因和在先推測的開放讀碼間的5′非編碼核苷酸序列長度為80個堿基，其中68個(85%)是A或T殘基。
使用Gap計算法比較相應(yīng)的HaEPV和CbEPV非編碼區(qū)，顯示出低的(50%)核苷酸序列同源性(圖3)。
對存在于純化的HaEPV制劑中的蛋白質(zhì)(含有球形體和紡錘體)的Western印跡分析顯示，紡錘體蛋白質(zhì)，p50是所存在的最為豐富的蛋白質(zhì)。對被感染細(xì)胞中的病毒蛋白質(zhì)所作實驗提示，該環(huán)境中的紡錘體蛋白也是很豐富的。據(jù)此，假定每個EPV基因組只有一個紡錘體蛋白基因的拷貝(所有這些指征都使我們?nèi)绱送葡?，則p50基因的啟動子似乎應(yīng)是最活躍的HaEPV病毒啟動子。
HaEPV p50融合蛋白質(zhì)和血清學(xué)檢測法。
含有HaEPV p50和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)序列的融合蛋白質(zhì)具有預(yù)期的約64KDa的分子量。在SDS-PAGE條件下，GST以其特定表觀分子量泳動，而融合蛋白則以81KDa蛋白表觀分子量遷移。
在Western印跡上，預(yù)免疫血清并不識別轉(zhuǎn)印跡的HaEPV蛋白質(zhì)，但抗p50融合血清則顯示為復(fù)合的染色圖形。除了如所預(yù)略的識別p50外，該抗血清還與p98，以及幾個有更高分子量白蛋白帶發(fā)生強反應(yīng)。這些觀察結(jié)果有力地提示p98是p50的二聚體，而且表明由該抗血清識別的有更高分子量的帶很可能是p50的更高級數(shù)的多聚體。該抗血清不識別據(jù)信是HaEPV河豚精蛋白的P120。
當(dāng)與EaEPV制劑用于免疫熒光研究時，預(yù)免疫血清只顯示出很低的著染水平。相反，抗p50融合血清則可與HaEPV紡錘體特異地結(jié)合，但未顯示出與球形體的反應(yīng)性。如根據(jù)被標(biāo)記之第二抗體的熒光所顯示的一樣，用共焦點激光掃描顯微鏡可清楚地看到抗p50融合抗體相對于紡錘體的定位。
另外還發(fā)現(xiàn)一個與編碼HaEPV p50的基因同源的基因存在于澳大利西鰓角金龜蟲Sericesthis nigrolineata的EPV中。紡錘體是內(nèi)這種病毒產(chǎn)生的。
為制備SnEPV的基因組DNA，在硫代乙醇酸和碳酸鹽緩沖液中，加入1/10體積Tris緩沖液(10mM，PH8.0)，用蛋白酶K(1mg/ml)消化(37℃，4小時)，并用6體積蒸餾水稀釋。從而破壞球形體。使用前已詳述的程序和寡核苷酸，以4微升等分的該制劑作為模板進行PCR擴增。純化一個該反應(yīng)中產(chǎn)生的約500bp的擴增子并克隆到pTZ19U(Pharmacia)中。測定已克隆之?dāng)U增子的序列，分析所得結(jié)果可以看出在擴散子序列和HaEPV紡錘體蛋白基因的序列間存在同源性。
PCR方法已被用于檢測與桑燈蛾EPV和Choristoneura biennis EPV(CbEPV)河豚精蛋白基因有同源性的HaEPV基因的存在(Sensu Hall and Moyer，1991，1993)。按乙知方法合成寡核苷酸RM58和RM118(Hall and Moyer，1993)，并與前述的HaEPV基因組DNA制劑一起使用。在該反應(yīng)中產(chǎn)生一個約1.1kb的擴增子;該擴增子的大小很接近于已報導(dǎo)的當(dāng)使用帶有CbEPV DNA的同樣寡核苷酸作模板(Hall and Moyer，1993)，并利用PCR方法的已知特異性時所產(chǎn)生的復(fù)制子，這一事實有力地證實HaEPV衍生的擴增子代表了存在于HaEPV基因組中的河豚魚精蛋白基因同系物的一部分。
基于上述各實驗的結(jié)果證明的HaEPV基因組與其他昆蟲痘病毒基因組間的對應(yīng)關(guān)系，可見相似的PCR為基礎(chǔ)的方法學(xué)很可能用于鑒定HaEPV基因組中是否存在胸苷激酶(TK)基因。最近已證明了AmEPV、CbEPV和云杉卷葉蛾EPV的基因組中存在同源TK基因(Lytvyn et al.，1992)。
在BglⅡ片段內(nèi)，還鑒定出一個編碼推測的11.5KDa蛋白質(zhì)的開放讀碼。分析p11.5ORF上游的DNA序列，提示它很可能是適于表達異源序列的強啟動子。
實施例2制備重組HaEPV(ⅰ)G+F-(即GUS+紡錘體蛋白(fusolin)-)HAEPV按下述方法制備重組G+F-HaEPV用已克隆到pTZ19R中的4.9kb BglⅡ HaEPV基因組片段作為構(gòu)建EPV轉(zhuǎn)移載體的基礎(chǔ)。刪除該基因組片段中由5′BglⅡ位點和內(nèi)部EcoRI位點限定的長約700bp的部分，留下含有圖1所示序到的4.2kb HaEPV基因組DNA。使用位點特異性誘變方法在紡錘體蛋白基因的上游非編碼序列和編碼區(qū)之間引入BamHI位點。如此構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒稱為pEPAS3。
使用合成的寡核苷酸(GATCTTAAATAGATCTATTTAA)對pEPAS3作進一步的操作，使之自身退火得到帶有BamHI相容性末端的ds DNA片段。將該片段插入pEPAS3的BamHI位點，從而將合成接頭序列，牛痘病毒相符性晚期啟動子序列(TAAAT)，和一個新產(chǎn)生的BglⅡ位點摻入轉(zhuǎn)移載體中。在同一過程中破壞了pEPAS3的原存在的BamHI位點。將此被修飾的轉(zhuǎn)移載體稱為pEPAS3 linker1。
將編碼β-糖苷酸酶的細(xì)菌報導(dǎo)基因(GUS;Jefferson 1987)插入pEPAS3 linker1的BglⅡ位點以產(chǎn)生pEPAS3 linker1.GUS;該構(gòu)建體中，EcoRI位點被導(dǎo)入GUS的編碼序列和作為克隆制備物的紡錘體蛋白(fusolin)基因之間。在大腸桿菌中擴增此構(gòu)建體，然后用Magic Maxiprep程序(Promega)純化之。將純化的DNA轉(zhuǎn)移到已用野生型HaJEPV感染24小時的美洲棉鈴蟲細(xì)胞BCIRL＝HZ-MA1細(xì)胞株(McIntosh and Ignoffo，1981)。應(yīng)根據(jù)同源重組現(xiàn)象的發(fā)生而達到HaEPV在這些細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，從而使含報導(dǎo)基因(GUS)構(gòu)建體的一部分整合到病毒的基因組中?？梢灶A(yù)期經(jīng)修飾的紡錘體蛋白啟動子應(yīng)能驅(qū)動GUS基因的表達，而中GUS基因終止密碼子將防止與其直接下游融合的紡錘體蛋白基因的其表達。
從上述被感染/轉(zhuǎn)染的美洲棉鈴蟲細(xì)胞中收獲含有HaEPV的感染性顆粒的培養(yǎng)基，并用于進一步感染其他美洲棉鈴蟲細(xì)胞。對該培養(yǎng)基進行一系列稀釋，使之達到在給定體積的接種物中存在1個感染性顆粒，以便分離下文稱之為克隆H12的G+F-HaEPV重組體。按照J(rèn)efferson所述方法(1987b)，使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-GLU)底物估測重組HaEPV的GUS活性。圖4(A)顯示了使用野生型HaEPV(左側(cè))或G+F-克隆H12HaEPV(右側(cè))感染的全細(xì)胞所作這一檢測的結(jié)果。從中可以看出GUS活性只存在于H12HaJEPV感染的細(xì)胞中。圖5顯示用分光光度分析法檢測G+F-克隆H12HaEPV或野生型HaKEPV感染的或偽感染(即未加病毒)的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中GUS酶促活性的結(jié)果?？梢钥闯觯珿US基因在重組HaEPV感染的細(xì)胞中得到表達，但這種活性與野生型HaEPV或細(xì)胞本身無關(guān)。
按上述方法制備第二個重組體G+F-HaEPV，但不同的是將GUS報導(dǎo)基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pEPAS3的BamHI位點中以得到pEPAS3∶GUS。將該載體轉(zhuǎn)染到已被野生型HaEPV感染了24小時的美洲棉鈴蟲細(xì)胞中，可再次期望產(chǎn)生由野生型紡錘體蛋白啟動子驅(qū)動表達的帶有GUS基因的G+F-HaEPV重組體。
用標(biāo)準(zhǔn)酶促檢測法估測GUS活性，再次顯示特征性GUS催化的蘭色反應(yīng)產(chǎn)物存在于經(jīng)受EaEPV轉(zhuǎn)染/感染處理的細(xì)胞中(圖4(B)右側(cè))，但不存在于受野生型HaEPV感染的細(xì)胞中(圖4(B)，左側(cè))。
(ⅱ)G+iHaEPV按下述方法制備在p11.5ORF和紡錘體蛋白基因之間的基因間區(qū)域(ⅰ)具有GUS編碼序列之拷貝的重組HaEPV再次基于克陸的4.9kb BglⅡ HaEPV基因組片段制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。
使用位點特異性誘變技術(shù)，以保留紡錘體蛋白啟動子之完整活性的方式將BglⅡ位點導(dǎo)入p11.5ORF和紡錘體蛋白編碼序列之間的基因間區(qū)域中。在此誘變反應(yīng)中，將相對于紡錘體蛋白轉(zhuǎn)譯終止密碼子來說處于-71至-66堿基位置(見圖1)的序列ATATCT改變成AGATCT;所得轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體被定名為pEPAS4。
切掉pEPA3∶GUS構(gòu)建體中由49堿基野生型紡錘體蛋白啟動子序列和GUS編碼序列組成的DraI-EcoRI片段，用Klenow片段DNA聚合酶修成平頭，并克隆到pEPAS4的未端填充的基因間BglⅡ位點中。如此構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體被稱為pEPAS4∶GUS。
(ⅲ)抗神經(jīng)氨酸苷酶+F-HaEPV制備可表達小鼠抗流感病毒神經(jīng)氨酸苷酶蛋白質(zhì)之免疫球蛋白重和輕鏈可變區(qū)的融合部分的重組HaEPV。該表達產(chǎn)物有可能用于體外診斷流感。所謂的蛋白質(zhì)受到進一步的基因工程化修飾，以包含可由市售的單克隆抗體(抗FLAG MS2抗體;International Biotechnologies)識別的八肽序列。
將編碼上述蛋白質(zhì)的基因(Malby，R.L.et al.，1993)克隆到pEPAS3的BamHI位點中，得到轉(zhuǎn)移載體pEPAS3∶NC10。按上述方法共轉(zhuǎn)染H.zea細(xì)胞。使用抗FLAG MS2單克隆抗體，以Western印跡法檢測由重組HaEPV感染的細(xì)胞表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以證明經(jīng)重組后該基因得以表達(圖6)。
(ⅳ)est+F-HaEPV制備可表達已在201位發(fā)生突變而使絲氨酸殘基變?yōu)楦恃跛釟埢腍eLIOTHIS irescens保幼激素酯酶基因的重組HaEPV。當(dāng)此突變蛋白由重組核多菌體病毒表達時，即顯示出其很強的殺昆蟲作用，因此該重組HaEPV被看作是制備有用病毒殺昆劑的候選物。
將突變的est基因克隆到pEPAS3轉(zhuǎn)移載體(Prof.B.B.Hammock，University of Californis，Davis，USA)的BamHI位點中，然后按上述方法進行轉(zhuǎn)染/感染，以制得該重組體。
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Other aspects of the present invention, and modifications andvariations thereto, will become apparent to those skilled inthe art on reading this specification, and all such otheraspects and modifications and variations are to be consideredas included within the scope of the present invention.
在閱讀了該說明書基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他方面及其改進和變化對于本領(lǐng)域的專業(yè)人來說均是顯而易見的，并且所有的這些其他方面、改進和變化均被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種重組昆蟲痘病毒，特征在于其異源基因定位于選自下列一組之基因組的一個或多個區(qū)域中p11.5開放讀碼(ORF)區(qū)域；胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域；和紡錘體蛋白編碼基因基因間區(qū)域。
2.一種重組昆蟲痘病毒，特征在于其異源DNA位于該基因組的p11.5ORF區(qū)域中。
3.一種重組昆蟲痘病毒，特征在于其異源DNA位于該基因組的胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域中。
4.一種重組昆蟲痘病毒，特征在于其異源DNA位于該基因組的紡錘體蛋白編碼區(qū)域中。
5.一種重組昆蟲痘病毒，特征在于其異源DNA位于該基因組的基因間區(qū)域中。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5的重組昆蟲痘病毒，其中異源DNA位于p11.5ORF和紡錘體蛋白編碼區(qū)域間的基因間區(qū)域中。
7.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任何一項的重組昆蟲痘病毒，其中昆蟲痘病毒是Amsacta moorei EPV，Choristoneura biennis EPV，Heliothis armigera EPV，Choristoneura fumiferana EPV，Aphodius tasmaniae EPV，Dermolepida albohirtum EPV，Melolontha melolontha EPV或Servicesthis nigrolineata EPV。
8.一種重組棉鈴蟲(Heliothis armigera)昆蟲痘病毒(HaEPV)，特征在于其異源DNA位于該基因組的一個或多個非必需區(qū)域中。
9.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于選自下列一組的基因組的一個或多個區(qū)域中p11.5開放讀碼(ORF)區(qū)域;胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域;紡錘體蛋白編碼區(qū);河豚精蛋白編碼區(qū)域;以及基因間區(qū)域。
10.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于該基因組的p11.5ORF區(qū)域中。
11.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于該基因組的胸苷激酶(TK)編碼區(qū)域中。
12.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于該基因組的紡錘體蛋白編碼區(qū)域中。
13.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于基因組的河豚精蛋白編碼區(qū)域中。
14.一種重組HaEPV，特征在于其異源DNA位于基因組的基因間區(qū)域中。
15.一種根權(quán)利要求14的重組HaEPV，其中異源DNA位于p11.5ORF和紡錘體蛋白編碼區(qū)域間的基因間區(qū)域。
16.一種重核多菌體病毒(NPV)，特征在于其異源DNA位于基因組中實質(zhì)上與p11.5ORF昆蟲粢病毒區(qū)域的至少一部分同源的區(qū)域中。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的重組NPV，其中NPV是桿狀病毒。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的重組NPV，其中NPV是AcNPV或OpNPV。
19.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任何一項的重組病毒，其中異源DNA包括至少一個編碼能破壞昆蟲之物質(zhì)的基因。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19的重組病毒，其中異源DNA編碼選自下列一組的物質(zhì)蘇云金芽胞桿菌δ毒素，昆蟲神經(jīng)激毒、與昆蟲激毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)、黃峰、蝎毒或其他異源來源的殺昆蟲化合物，或針對昆蟲基本細(xì)胞功能的核糖酶。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求19的重組病毒，其中異源DNA編碼保幼激素酯酶。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求1-18中任何一項的重組病毒，其中異源DNA包括至少一個編碼所需生物學(xué)活性蛋白質(zhì)、多肽或肽的基因。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求22的重組病毒，其中異源DNA編碼選自下列一組的物質(zhì)IFN-α、IFN-β、IFN-δ、TPA、淋巴毒素、巨噬細(xì)胞激活因子、胰島素、表皮細(xì)胞生長因子、人生長激素、抗體和抗體片段。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求22的重組病毒，其中異源DNA編碼了抗流感病毒之神經(jīng)氨酸酶的小鼠重和輕鏈免疫球蛋白鏈之可變區(qū)的融合成分。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求19-24中任何一項的重組病毒，其中異源DNA的表達是由昆蟲痘病毒啟動子驅(qū)動的。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25的重組病毒，其中昆蟲痘病毒啟動子是棉鈴蟲EPV的紡錘體蛋白啟動子，河豚精蛋白啟動子或p11.5ORF啟動子。
27.一種控制有害昆蟲增殖的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求19-21、25或26中之任何一項的重組病毒，或其與農(nóng)業(yè)上可接受的載體的混合物施用于受感染的地區(qū)。
28.一種生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)，多肽或肽的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求22-26中任何一項的重組病毒感染敏感的宿主細(xì)胞。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求1-26中任何一項的重組病毒，其中通過同源重組使異源DNA定位于病毒基因組中。
30.一種分離的DNA分子，其包括編碼棉鈴蟲昆蟲痘病毒紡錘體蛋白或其部分的核苷酸序列。
31.一種分離的DNA分子，其包括基本上相當(dāng)于圖1中核苷酸443至核苷酸1498的核苷酸序列。
32.一種分離的DNA分子，其包括編碼p11.5ORF或其部分的核苷酸序列。
33.一種分離的DNA分子，其包括編碼棉鈴蟲p11.5ORF或其部分的核苷酸序列。
34.一種分離的DNA分子，其包括基本上相當(dāng)于圖1中核苷酸57至核苷酸362的核苷酸序列。
35.一種分離的DNA分子，其包括編碼昆蟲痘病毒基因組內(nèi)處于p11.5ORF和紡錘體蛋白編碼區(qū)之間的基因間區(qū)域或其部分的核苷酸序列。
36.一種分離的DNA分子，其包括棉鈴蟲編碼昆蟲痘病毒基因組內(nèi)處于p11.5ORF和紡錘體蛋白編碼區(qū)之間的基因間區(qū)域或其部分的核苷酸序列。
37.一種分離的DNA分子，其包括基本上相當(dāng)于圖1中核苷酸363至核苷酸442的核苷酸序列。
38.一種分離的DNA分子，其包括編碼昆蟲痘病毒啟動子或其功能性部分的核苷酸序列。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求38的分離的DNA分子，其中啟動子是紡錘體蛋白啟動子。
40.一種根據(jù)權(quán)利要求39的分離的DNA分子，其中紡錘體蛋白啟動子衍生于棉鈴蟲昆蟲痘病毒。
41.一種根據(jù)權(quán)利要求38的分離的DNA分子，其中啟動子是p11.5ORF啟動子。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求41的分離的DNA分子，其中p11.5ORF啟動子衍生于棉鈴蟲昆蟲痘病毒。
43.一種分離的DNA分子，其包括基本上相當(dāng)于圖1中核苷酸1至核苷酸56的核苷酸序列。
44.一種分離的DNA分子，其編碼包括昆蟲痘病毒紡錘體蛋白啟動子序列和牛痘病毒相符晚期啟動子序列的融合的啟動子成分。
45.一種基本上如本文實施例2所述的重組病毒。
全文摘要
描述了重組昆蟲病毒，特別是重組棉鈴蟲昆蟲痘病毒(HaPEV)，其中異源DNA位于病毒基因組的非必要區(qū)域中。這些重組病毒可用作生物殺昆蟲劑，并用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)所需生物學(xué)活性蛋白質(zhì)、多肽和肽。
文檔編號C12N15/863GK1083527SQ93109028
公開日1994年3月9日 申請日期1993年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1992年6月16日
發(fā)明者D·J·達爾, A·施里斯康塔, C·A·費爾農(nóng) 申請人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織