一種通過(guò)不同宿主交替繁殖快速獲得殺蟲(chóng)譜擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于害蟲(chóng)生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)在不同活體宿主中交替繁殖快速獲得殺蟲(chóng)譜擴(kuò)大重組病毒的方法。
二、技術(shù)背景
[0002]昆蟲(chóng)病毒殺蟲(chóng)劑因具有對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)致病性高和能在害蟲(chóng)種群中自然傳播并長(zhǎng)期流行，以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)于其它殺蟲(chóng)劑的特點(diǎn)，一直以來(lái)都受到人們關(guān)注。然而單一的病毒殺蟲(chóng)劑除存在殺蟲(chóng)速度慢的缺點(diǎn)，還有殺蟲(chóng)譜窄的不足，這些均束縛了昆蟲(chóng)病毒在生產(chǎn)上的應(yīng)用。如何通過(guò)有效的生物學(xué)途徑，擴(kuò)大病毒的宿主域，此對(duì)于創(chuàng)新和高效利用昆蟲(chóng)病毒防治重大害蟲(chóng)至關(guān)重要。
[0003]現(xiàn)已研究證實(shí)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞或活體內(nèi)，利用異源重組的方法可成功得到宿主域較親本病毒擴(kuò)大的重組病毒株系。如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和刺金翅夜蛾核型多角體病毒(RoNPV)共同感染大蠟螟幼蟲(chóng)時(shí)，可得到不同于兩個(gè)親本的重組病毒(Crozier等，1988);用AcNPV與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)共同感染Sf_21細(xì)胞(BmNPV的非受納細(xì)胞系)，獲得了能在Sf-21和家蠶細(xì)胞系中均可復(fù)制增殖的重組病毒，其宿主域得到擴(kuò)大(Kondo等，1991年)；將斜紋夜蛾核型多角體病毒(S1NPV)病毒粒子與甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)DNA的Bam HI酶切片段，以及SeNPV病毒粒子與S1NPV DNA的BamHI的酶切片段共轉(zhuǎn)染，均獲得了寄主范圍擴(kuò)大的重組病毒(劉彥文等，1996)。
[0004]空斑純化法和活體克隆法都可用于分離重組昆蟲(chóng)病毒，其中空斑純化法為通過(guò)在細(xì)胞中培養(yǎng)來(lái)分離病毒不同基因型，為常用分離方法，而活體克隆法則利用活體昆蟲(chóng)宿主來(lái)分離病毒不同基因型，應(yīng)用相對(duì)較少。雖然空斑純化法能較快速地分離出許多病毒基因型，但要明確各病毒基因型對(duì)活體宿主的致病力，篩選出目的重組病毒，還需要對(duì)分離的多個(gè)病毒基因型進(jìn)行大量生物測(cè)定，通過(guò)活性測(cè)定結(jié)果明確病毒活性和宿主域。傳統(tǒng)的活體克隆法利用一種活體宿主分離病毒基因型，其分離獲得的病毒基因型對(duì)克隆宿主有致病力，但對(duì)其他活體宿主是否有致病力，需要借助于生物測(cè)定來(lái)明確。因此，在不同病毒發(fā)生重組后，要分離宿主域擴(kuò)大的重組病毒，無(wú)論是現(xiàn)有的空斑純化法還是活體克隆法，均需要借助于大量生測(cè)才能篩選出目的重組病毒。要有效提升昆蟲(chóng)病毒作為病毒殺蟲(chóng)劑的潛力，需要建立一種快速獲得宿主域擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒的方法。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1、發(fā)明目的
[0006]提供一種快速的宿主域擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒獲得方法，能有效篩選宿主域擴(kuò)大病毒，提升病毒殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用潛力。
[0007]2、技術(shù)方案
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選用分別對(duì)兩種昆蟲(chóng)宿主專(zhuān)化的不同核型多角體病毒以高劑量共同侵染其中一種宿主群體，繁殖后再以極低劑量侵染另一種宿主，單頭收集染病害蟲(chóng)，所獲得的單頭病毒即為能夠同時(shí)感染兩種宿主的宿主域擴(kuò)大重組病毒。
[0009]本發(fā)明為一種宿主域擴(kuò)大的重組昆蟲(chóng)病毒的獲得方法，其特征在于利用不同活體宿主交替繁殖快速獲得殺蟲(chóng)譜擴(kuò)大的重組病毒，提升昆蟲(chóng)病毒的應(yīng)用潛力。
[0010]3、有益效果
[0011]本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)生以下有益效果:(1)與傳統(tǒng)的空斑純化法和活體克隆法相比，明顯提高了目的重組病毒篩選速度。(2)有效地?cái)U(kuò)大了病毒的宿主域范圍，從而擴(kuò)大了病毒應(yīng)用范圍。(3)顯著減少了施藥次數(shù)，降低了病毒的應(yīng)用成本。
四、【具體實(shí)施方式】
:
[0012]本發(fā)明的實(shí)施例是采用室內(nèi)生物測(cè)定方法。
[0013]供試材料
[0014]供試?yán)ハx(chóng):斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均為室內(nèi)長(zhǎng)期人工飼養(yǎng)，已連續(xù)飼養(yǎng)40多代。飼養(yǎng)溫度為27°C +1°C，光照為14h:10h(L:D)，蟲(chóng)卵用2 %甲醛消毒，幼蟲(chóng)3齡前群體飼養(yǎng)，3齡后單頭飼養(yǎng)。試驗(yàn)選用齡期一致的健康幼蟲(chóng)。
[0015]供試病毒:SlNPV、SeNPV和AcNPV均為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。病毒純化后適當(dāng)稀釋?zhuān)醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0016]試驗(yàn)方法
[0017]病毒侵染和分離:將不能經(jīng)口感染斜紋夜蛾的SeNPV或者AcNPV與不能經(jīng)口感染甜菜夜蛾的S1NPV按多角體濃度1: 1以高濃度(10sPIB/ml)混合感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，飼料添毒法，感染致死后收獲病蟲(chóng)，進(jìn)行病毒多角體純化。再將純化后的多角體以10PIB/頭的低劑量感染斜紋夜蛾4齡初期幼蟲(chóng)，共接種100-300頭斜紋夜蛾，放于6孔板中，每孔1頭，在病毒致死率在5%以下時(shí)，收集單頭病蟲(chóng)，并分別純化，測(cè)定其中病毒產(chǎn)量最高的單頭病毒的活性，同時(shí)以重組前的S1NPV作為對(duì)照。
[0018]病毒活性測(cè)定:采用飼料添毒法測(cè)定病毒對(duì)斜紋夜蛾和甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的活性，分別測(cè)定濃度為107PIB/ml、10sPIB/ml和109PIB/ml病毒的活性。將人工飼料切成相同小塊(確保24h內(nèi)吃完)，加入滅過(guò)菌的24孔板中，加10 μ 1病毒懸浮液。SeNPV和S1NPV復(fù)合侵染處理組分別接入大小一致甜菜夜蛾或斜紋夜蛾3齡中期幼蟲(chóng)，AcNPV和S1NPV復(fù)合侵染處理組分別接入大小一致甜菜夜蛾2齡中期幼蟲(chóng)或斜紋夜蛾3齡中期幼蟲(chóng)，每孔1頭，每個(gè)濃度處理4塊板，同時(shí)以清水作為空白對(duì)照。試驗(yàn)在29+1 °(:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日調(diào)查病死蟲(chóng)數(shù)，直到不再有病毒致死幼蟲(chóng)出現(xiàn)。
[0019]實(shí)施例1
[0020]將不能感染斜紋夜蛾的SeNPV和不能感染甜菜夜蛾的S1NPV按病毒多角體數(shù)量1:1混合以高濃度一同感染甜菜夜蛾后，獲得病毒再經(jīng)低劑量感染斜紋夜蛾，獲得了對(duì)斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重組病毒。毒力測(cè)定結(jié)果表明，在病毒濃度為10sPIB/ml和109PIB/ml時(shí)，較重組前的S1NPV而言，重組病毒對(duì)甜菜夜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死率由重組前的0%分別上升到20.5%和31.6%。同時(shí)，病毒對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死率分別為89.2%和98.5%與重組前的92.8%和99.6%無(wú)顯著差異。
[0021]實(shí)施例2
[0022]同樣，將不能感染斜紋夜蛾的AcNPV和不能感染甜菜夜蛾的S1NPV按病毒多角體數(shù)量1: 1混合以高濃度一同感染甜菜夜蛾后，獲得病毒再經(jīng)低劑量感染斜紋夜蛾，也獲得了對(duì)斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重組病毒?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，病毒濃度為107PIB/ml時(shí)，對(duì)甜菜夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致死率由重組前的0上升至22.8%。病毒濃度為10sPIB/ml和109PIB/ml時(shí)，對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死率沒(méi)有顯著變化，分別為87.4%和97.0%，與重組前的92.8%和99.6%無(wú)顯著差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種殺蟲(chóng)譜擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒的獲得方法，其特征在于通過(guò)在不同宿主中交替繁殖快速獲得殺蟲(chóng)譜擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速獲得宿主域擴(kuò)大重組昆蟲(chóng)病毒的方法?，F(xiàn)有空斑純化法和活體克隆法在篩選宿主域擴(kuò)大重組病毒時(shí)，需借助于大量生物測(cè)定才能篩選出目的重組病毒，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。針對(duì)這一問(wèn)題，用分別對(duì)兩種昆蟲(chóng)宿主專(zhuān)化的不同核型多角體病毒以高劑量共同侵染其中一種宿主群體，繁殖后再以極低劑量侵染另一種宿主，單頭收集染病害蟲(chóng)，所獲得的單頭病毒即為能夠同時(shí)感染兩種宿主的宿主域擴(kuò)大重組病毒。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法明顯提高了目的病毒的獲得速度，有效地?cái)U(kuò)大了病毒的宿主域范圍，從而擴(kuò)大了病毒的應(yīng)用范圍。
【IPC分類(lèi)】C12N7/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105420197
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510783220
【發(fā)明人】郭慧芳, 方繼朝, 劉寶生, 鐘萬(wàn)芳, 張志春, 牛洪濤
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日