mPRα介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及性激素及受體與肺腺癌關(guān)系研究領(lǐng)域，特別涉及mPRa介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺 腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，女性激素及其受體在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展與治療中的作用成為人們研究 的熱點。有學(xué)者認(rèn)為肺腺癌像乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等一樣也屬于性激素依賴性腫瘤。女性 激素包括雌激素(Estrogen)和孕激素(孕酮，Progesterone，P4)，雌激素的促癌作用已達(dá)成 廣泛共識，而孕激素對肺癌的作用與雌激素似乎不同。Ishibashi等在孕激素受體表達(dá)陽性 的小鼠肺癌模型中，發(fā)現(xiàn)用孕酮處理可以抑制腫瘤生長。與之相反的是，Check等的研究結(jié) 果卻表明米非司酮(孕激素核受體抑制劑)能延緩小鼠自發(fā)肺部腫瘤的進(jìn)展。此外，在孕酮 對乳腺癌影響的研究中也發(fā)現(xiàn)類似矛盾的腫瘤生物學(xué)現(xiàn)象?，F(xiàn)在認(rèn)為這種矛盾現(xiàn)象可能與 實驗對象的孕激素受體不同或其表達(dá)狀態(tài)不同有關(guān)，這激起研究者們對孕激素及其受體在 腫瘤中作用機(jī)制探索的興趣。
[0003] 孕激素可與孕激素受體(ProgesteroneReceptor，PR)結(jié)合激活下游的分子信號 通路而發(fā)揮作用。孕激素的經(jīng)典作用途徑由孕激素核受體（nuclearprogesterone receptor，nPR)介導(dǎo)，依賴于目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控革El基因的表達(dá)水平而對細(xì)胞的各 種功能產(chǎn)生調(diào)控作用，稱之為基因組作用。另外，孕酮還可對缺乏孕激素核受體的細(xì)胞和組 織發(fā)揮作用，如T淋巴細(xì)胞、血小板、大鼠黃體細(xì)胞等，這種作用并不依賴于孕激素核受體的 基因轉(zhuǎn)錄，故命名為非基因組作用。在這類細(xì)胞中，強(qiáng)有力的nPR激動劑（如R5020)或nPR拮 抗劑(如米非司酮)對孕酮的快速非基因組作用很少或根本沒有影響。這些證據(jù)均提示除了 孕激素核受體之外，還有可能存在其他類型的孕激素受體。
[0004] 2003年Zhu等首次從云紋犬牙石首魚卵巢組織中克隆出了孕激素膜受體 (MembraneProgesteroneReceptors，mPRs)的cDNA，認(rèn)為其編碼的蛋白質(zhì)滿足類固醇激素 受體的七條標(biāo)準(zhǔn)，即結(jié)構(gòu)合理性、亞細(xì)胞定位、組織分布具有特異性、可與孕激素特異性結(jié) 合、具有激素調(diào)節(jié)作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和生物學(xué)相關(guān)性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的mPRs亞型有 五種，即mPRa、mPR0、mPRy、mPR5、mPRe，其中mPRa(MembraneProgesteroneReceptora)是 新發(fā)現(xiàn)的，研究較多的，且作用最強(qiáng)的孕激素膜受體，因而受到廣泛關(guān)注。后來對其結(jié)構(gòu)研 究發(fā)現(xiàn)，mPRa基因編碼的mRNA長度為4.Okb，其表達(dá)的蛋白質(zhì)分子大小為40kDmPRa蛋白具 有7次跨膜區(qū)域，包含細(xì)胞內(nèi)的羧基端(C-端)和細(xì)胞外的氨基端(N-端），與G蛋白耦聯(lián)受體 (GproteinCoupledReceptor，GPCR)具有相似性，屬于一種獨特的受體家族，叫做孕激素 和脂聯(lián)素Q受體家族（ProgestinandadiponectinreceptorJAQlOJOO?年Dressing等利 用PCR和Western-blot技術(shù)在乳腺癌MCF-7和SKBR-3細(xì)胞中檢測到有mPRamRNA和蛋白質(zhì)表 達(dá)。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)mPRa在肺腺癌細(xì)胞和組織中均有表達(dá)，其可介導(dǎo)孕酮(P4)抑 制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖與侵襲。2010年Zuo等在乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)mPRa與小窩蛋 白-l(Cav-l)和表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)共同定位 于細(xì)胞膜表面的小窩囊泡結(jié)構(gòu)，并證明mPRa介導(dǎo)孕酮可經(jīng)PI3K/Akt和EGFR信號通路逆轉(zhuǎn)乳 腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。此外，多項研究表明，孕酮可通過非基因組作用快速啟動 多種細(xì)胞活動，其中一部分是通過EGFR信號通路完成，進(jìn)而對細(xì)胞的多種生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行 調(diào)控，包括激素分泌、小分子物質(zhì)攝入、離子通道激活以及胞質(zhì)內(nèi)酶的活化(如MAPK、PKA) 等。這些研究均提示孕激素膜受體信號通路與EGFR信號通路存在交聯(lián)。
[0005]EGFR信號通路是目前肺癌研究中最為廣泛的一個領(lǐng)域。人們發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變或 擴(kuò)增導(dǎo)致EGFR信號通路的持續(xù)活化與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。EGFR活化突變主要位 于酪氨酸激酶區(qū)域，常見的突變類型有18外顯子(如G719X)、19外顯子(如LREA缺失）、20外 顯子、21外顯子(如L858R)突變。在肺癌患者中，約20%的患者存在EGFR突變，而這一比例在 肺腺癌(40 % )、女性患者(42 % )、亞裔(30 % )和不吸煙(51 % )患者中明顯增加。EGFR基因突 變的發(fā)現(xiàn)使以EGFR為目標(biāo)分子的靶向治療成為晚期NSCLC治療的里程碑，其中EGFR酪氨酸 激酶抑制劑(EGFR-TKIs)是目前臨床應(yīng)用最普遍的一類靶向治療藥物，常用的藥物有吉非 替尼(Gefitinib)、厄洛替尼（特羅凱/0SI-774)、埃克替尼等。然而，肺癌對EGFR-TKIs的敏 感性主要取決于EGFR的突變狀態(tài)，EGFR野生型患者對EGFR-TKIs的敏感性較差，故指南推薦 對存在EGFR活化突變的肺癌患者優(yōu)先考慮使用EGFR-TKIs。
[0006] 在EGFR突變型患者中，EGFR-TKIs治療后RR(緩解率)可達(dá)到75%，這就意味著大約 25 %的患者不能從EGFR-TKIs治療中獲益即發(fā)生了耐藥。此外，人們發(fā)現(xiàn)，幾乎所有對EGFR-TKIs非常敏感的肺癌患者在治療8-16個月后不可避免的發(fā)生了耐藥。EGFR-TKIs耐藥分為 原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。目前研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性耐藥可能的機(jī)制有:20外顯子插入或復(fù)制 突變（如D770-N771、insNPG、insSVQ、insG、N771T突變）；罕見突變（如E709A突變）；與EGFR突 變并存的其他基因組突變(如PIK3CA突變、IGF1R突變）；EGFR野生型（如:ALK融合基因突變、 KRAS突變、BRAF突變）等。獲得性耐藥的可能機(jī)制有：二次突變（如T790M、L747S、D761Y、 T854A突變）;MET基因擴(kuò)增等。針對EGFR-TKIs的耐藥情況，各國科研工作者經(jīng)過不懈努力提 出了一些應(yīng)對之策，包括二、三代EGFR-TKIs的研發(fā)、多條信號通路阻斷劑的聯(lián)合應(yīng)用、其他 驅(qū)動突變基因阻斷劑（如克唑替尼）等。然而，對EGFR-TKIs耐藥的研究現(xiàn)在仍處于起步階 段，許多問題亟待解決，因此，改善EGFR-TKIs的敏感性、逆轉(zhuǎn)其耐藥性以及尋找新的針對 EGFR野生型肺腺癌的治療靶點成為肺癌治療的新興主題之一。
[0007]隨著對女性肺癌特點的深入研究，多項臨床研究發(fā)現(xiàn)亞裔女性肺腺癌患者更容易 發(fā)生EGFR基因突變，且對EGFR-TKIs治療的敏感性相對較高，推測女性激素及其受體可能與 EGFR突變及EGFR-TKIs靶向治療相關(guān)。最近有研究證明，SRC抑制劑通過介導(dǎo)ERK (ExtracellularRegulatedKinase)再活化可恢復(fù)肺腺癌耐藥株P(guān)C-9GR細(xì)胞對EGFR-TKIs 的敏感性。而之前已有研究證明在人子宮平滑肌細(xì)胞中，mPRa可介導(dǎo)孕酮抑制SRC的表達(dá)。 然而，目前mPRa介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs的敏感性本領(lǐng)域尚無相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供mPRa介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺腺 癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的方法，從女性激素的角度探討孕酮經(jīng)膜受體介導(dǎo)是否可以改 善不同EGFR突變表型的肺腺癌細(xì)胞(EGFR野生型A549細(xì)胞、EGFR突變型PC-9細(xì)胞、EGFR耐藥 突變型PC-9GR細(xì)胞)對EGFR-TKIs的敏感性，擬為未來研究肺腺癌靶向藥物增敏劑提供理論 基礎(chǔ)。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0010]mPRa介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的方法，通過比較mPRa對不同EGFR突變狀態(tài)的肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的影響，誘導(dǎo)肺腺癌敏感株P(guān)C-9細(xì)胞成為 耐藥株P(guān)C-9GR細(xì)胞，從而動態(tài)觀察耐藥過程與mPRa表達(dá)的關(guān)系。
[0011 ] 進(jìn)一步的，mPRa介導(dǎo)孕酮調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs敏感性的方法，包括如下步 驟：
[0012]步驟一:細(xì)胞培養(yǎng)
[0013] (1)凍存細(xì)胞復(fù)蘇
[0014]將凍存的細(xì)胞迅速放入提前調(diào)好溫度的37°C恒溫水浴箱，輕輕搖晃凍存管，使細(xì) 胞盡快融化;待細(xì)胞懸液完全融化后，噴灑75%的酒精消毒，放入已用紫外燈照射消毒好的 生物安全柜中，用巴氏吸管將凍存管內(nèi)細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至無菌的15ml離心管中；加入5ml提 前配制好的完全培養(yǎng)基，混勾，常溫離心機(jī)800rpm，離心5min;棄上清液，加入5ml完全培養(yǎng) 基混勻，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0015] (2)細(xì)胞換液
[0016]從細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)， 噴灑酒精消毒后放入生物安全柜中；倒掉培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)基，無菌PBS溶液輕輕沖洗3次， 加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0017] (3)細(xì)胞培養(yǎng)傳代
[0018]從細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)， 如果細(xì)胞生長密度達(dá)80-90%則可以傳代;噴灑酒精消毒后放入生物安全柜中，倒掉培養(yǎng)瓶 中舊的培養(yǎng)基，無菌PBS溶液輕輕沖洗3次，加入lml0.05%的胰蛋白酶液，置于恒溫培養(yǎng)箱 中消化3-5min，若熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)已收縮變圓形，可加入約3ml的完全培 養(yǎng)基終止細(xì)胞消化過程;巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成單個，將細(xì)胞懸液平均分配到2個 新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶加入完全培養(yǎng)基至5ml，標(biāo)記好細(xì)胞種類、傳代日期和細(xì)胞代數(shù)， 置于37°C，5 %C02的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0019] (4)細(xì)胞凍存
[0020]在細(xì)胞凍存前24h需換液一次，取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)期分裂細(xì)胞進(jìn)行凍存； 將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來;配制細(xì)胞凍存液，胎牛血清:DMS0 = 9:1;用凍存液重懸細(xì) 胞，并用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞使之混勻，轉(zhuǎn)移至凍存管中，進(jìn)行梯度降溫，-4°C冰箱放置 20min，-20°C冰箱放置20min，-80°C冰箱暫時保存，1周內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮罐中可長期保存，注意 標(biāo)記好細(xì)胞種類、凍存日期和細(xì)胞代數(shù)；
[0021 ] 步驟二:基因測序法檢測EGFR突變狀態(tài)
[0022] (1 )DNA提取:按照DNA提取試劑盒protocol進(jìn)行操作；
[0023] 1)準(zhǔn)備工作:①向裂解液RL-plus中加入一定量的β-巰基乙醇使其終濃度為1% ; ②按試劑瓶上標(biāo)注向漂洗液PW、緩沖液GD加入適量無水乙醇;③用RNase-FreeddH20配制 70%的無水乙醇；
[0024] 2)收集細(xì)胞，數(shù)量〈lx107個，PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸出roS溶液，向細(xì)胞中加入含有 0.05 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離瓶底時，加入完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移 至RNase-Free的離心管中，800rpm離心lOmin，收集管中細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸棄所有上清液；[0025]3)裂解處理:對于離心后得到的細(xì)胞沉淀，手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀變松 散，加入約600μ1裂解液RL-plus，渦旋震蕩3〇sec;
[0026] 4)將所有溶液轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱CB3,吸附柱CB3放在2mlRNase-Free的離心管中，12000rpm離心60sec;
[0027]5)向DNA吸附柱CB3中加入500μ1緩沖液⑶，12000rpm離心60sec，倒掉收集管中的 離心廢液，將吸附柱CB3再放回收集管中；
[0028]6)加入500μ1漂洗液PW于吸附柱CB3中，室溫下靜置約2min，12000rpm離心60sec， 倒掉收集管中的離心廢液，將吸附柱CB3再放回收集管中；
[0029] 7)重復(fù)步驟6);
[0030]8)12000rpm離心2min，倒掉收集管中的離心廢液，將吸附柱CB3在室溫下放置3-5min，使吸附材料中殘余的漂洗液徹底晾干；
[0031]9)將吸附柱CB3放入一個新的1.5mlRNase-Free的離心管中，加入100μΙ洗脫緩沖 液ΤΒ，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到DNA溶液；
[0032](2)引物設(shè)計，設(shè)計EGFR突變位點特異性引物序列；
[0033] (3)PCR反應(yīng)體系：
[0035] (4)PCR反應(yīng)條件；
[0037] (5)基因測序；
[0038]步驟三:CCK_8法檢測細(xì)胞增殖率(按照試劑盒protocol進(jìn)行操作）
[0039] (1)CCK_8操作方法：
[0040]收集腫瘤細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后按照5000cel ls/wel 1接種 于96孔板，邊緣孔用無菌PBS填充以防止過度蒸發(fā)影響實驗結(jié)果，每孔100μΙ，每組設(shè)置6個 復(fù)孔;在5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;給予無血清培養(yǎng)基饑餓處理4小時后，加入各組處 理藥物，置于5%C02、37°C分別培養(yǎng)24h、48h、72h;以不加藥物組為對照組，以僅含完全培養(yǎng) 基不含細(xì)胞組為本底;檢測時各組按ΙΟμΙ/well加入CCK-8試劑，37°C孵育lh測定0D 450;扣 除本底后，加藥組0D值除以對照組0D值的比值即為細(xì)胞生存率；
[0041] 計算公式:生存率=(加藥組0D-本底0D)/(對照組0D-本底0D)X100% ;
[0042] (2)CCK_8法測肺癌細(xì)胞對吉非替尼的IC50值
[0043]收集肺癌細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后按照5000〇6118/\^11接種 于96孔