專利名稱：T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的治療的制作方法
背景技術(shù)：
自身免疫疾病的特點是個體的免疫系統(tǒng)攻擊其自身的組織。自身免疫疾病通常是由個體免疫系統(tǒng)對自身抗原的耐受崩潰造成的。在各種自身免疫疾病中為個體免疫系統(tǒng)所識別的特異性抗原可能系統(tǒng)性出現(xiàn)或可能是器官特異性的。例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)的特征是存在對DNA、核糖核蛋白、組蛋白和其他非器官特異性分子的自身抗體。其他自身免疫疾病通常以一個器官的破壞為特征。這種自身免疫疾病包括I型糖尿病，在這種疾病中胰臟Langerhans胰島的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞受到破壞。
在某些自身免疫疾病中，組織破壞主要是由于產(chǎn)生高水平的自身抗體的結(jié)果。這類疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，特征是關(guān)節(jié)軟骨的破壞和滑膜炎癥?；碱愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人的關(guān)節(jié)中有免疫復(fù)合物累積，該復(fù)合物由抗IgG的Fc段和抗IgG分子的自身抗體結(jié)合造成。這種免疫復(fù)合物激活補體級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致組織損害。重癥肌無力是一種進(jìn)行性肌無力病，它是由于產(chǎn)生對神經(jīng)肌肉接點運動終板的乙酰膽堿受體有活性的自身抗體而引起的。
在其他自身免疫疾病中，組織破壞似乎并非主要由自身抗體所介導(dǎo)，而是由自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)。例如，實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是一種多發(fā)性硬化動物模型，其特征是在腦髓和脊髓發(fā)生脫髓鞘。這種疾病可通過將來自患病動物的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移給首次受試動物而誘導(dǎo)產(chǎn)生。因此，一般認(rèn)為EAE表現(xiàn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，而非B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病(Ben-Nun，A.et al.(1981)Eur.J.Immunol.11，195)。
多發(fā)性硬化(MS)是腦髓和脊髓的一種脫髓鞘病。它是一種進(jìn)行性疾病，其特征表現(xiàn)為影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的神經(jīng)機(jī)能障礙的緩解和加重。這種疾病的癥狀產(chǎn)生于炎性脫髓鞘的病灶，然后形成斑痕，在大腦白質(zhì)、腦干或脊髓中出現(xiàn)“斑”。目前，對MS沒有一定的診斷測試法，而以諸如神經(jīng)機(jī)能障礙開始加重時的病人的癥狀的程度和/或病人的年齡一類的因素為基礎(chǔ)的診斷和治療體制正處于制定之中。
對患有MS的病人一般用類固醇治療，目的是使病人的病情緩解或減慢患者的疾病進(jìn)程。其他藥物，例如肌肉松弛藥用于治療這種疾病的特殊癥狀?？捎糜贛S治療的新進(jìn)展包括施用β干擾素，看來β干擾素有望減緩疾病進(jìn)行，然而，仍然需要有效的MS治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，如多發(fā)性硬化的方法。該方法包括給接受治療者施用有效治療或預(yù)防劑量的T細(xì)胞表面受體拮抗劑，所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能(helper effectorfunction)。在優(yōu)選實施方案中，施用的拮抗劑是一種抗體或其片段，該抗體或其片段與此種T細(xì)胞受體gp39特異性結(jié)合。
附圖簡述

圖1是受注射小鼠的每日測量的DAS單位圖解，在第0日注射75微克PLP-肽(A部)或300微克PLP-肽(B部)并伴隨注射抗pg39抗體(黑色柱)或PBS(灰色柱)，該圖解說明施用抗pg39能防止實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎EAE的發(fā)生。
圖2是受注射小鼠中誘導(dǎo)的抑制EAE百分比圖解，在第0日注射PLP肽并在第0日、2日、和6日或在第4日、6日和8日或第7日、9日和11日進(jìn)一步注射抗pg39抗體(黑色柱)或PBS(灰色柱)，該圖解說明在誘導(dǎo)所述疾病后施用抗pg39能有效防止EAE。
圖3是移植了接受PLP肽和抗pg39抗體(黑色柱)注射的小鼠供體脾細(xì)胞或僅接受PLP肽注射(灰色柱)以及接受PLP肽注射的小鼠供體脾細(xì)胞之小鼠中每日測量的DAS單位圖解。
發(fā)明詳述本發(fā)明是關(guān)于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病如多發(fā)性硬化癥的治療。這種疾病通過施用T細(xì)胞表面受體拮抗劑來治療，所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型T細(xì)胞輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能。
如此處所定義的，“介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的分子或受體”是在Th細(xì)胞上表達(dá)并與效應(yīng)細(xì)胞(例如B細(xì)胞)上的配體相互作用的分子或受體，其中受體與配體的相互作用對效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生是必要的(例如B細(xì)胞活化)。除了涉及到效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)，已發(fā)現(xiàn)這種分子還涉及T細(xì)胞對抗原的反應(yīng)。
在優(yōu)選實施方案中，介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的T細(xì)胞表面上的受體是gp39。在此實施方案中，拮抗劑是一種分子，它抑制gp39與位于向T細(xì)胞遞呈抗原的細(xì)胞上的gp39配體的相互作用。一種特別優(yōu)選的gp39拮抗劑是抗gp39抗體。另外，該gp39拮抗劑是gp39配體(例如可溶性CD40)的一種可溶形式。
本發(fā)明的方法至少部分基于將抗gp39抗體施用于小鼠從而防止EAE的誘發(fā)并使患EAE動物的疾病發(fā)生逆轉(zhuǎn)的觀察。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在治療典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病時，抑制T細(xì)胞上的gp39與其他細(xì)胞上的gp39配體相互作用的藥劑在預(yù)防和治療上都是有效的。這個結(jié)果對先前的研究來說是出人意料的，那些研究已將gp39歸于在介導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)中起主要作用。抗gp39抗體在治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病中是有效的這個發(fā)現(xiàn)構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)。按照本發(fā)明，患有T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病如多發(fā)性硬化癥的被試者通過施用模擬抗gp39抗體的作用的試劑得到治療。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病用語“自身免疫病”意指包括一個被試者的免疫系統(tǒng)與自身抗原起作用以至使該被試者中發(fā)生顯著的組織或細(xì)胞破壞的疾病。術(shù)語“自身抗原”意指包括一個被試者的任何被該被試者的免疫系統(tǒng)識別的抗原。術(shù)語“自身抗原”(autoantigen)和自身抗原(Self-antigen)在此可互用，此處所用的術(shù)語“自身”意指一個被試者的任何成分并包括分子、細(xì)胞和器官。自身抗原可以是肽、核酸或其他生物物質(zhì)。用語“T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病”意指包括那些自身免疫病，在該類疾病中對自身的反應(yīng)主要涉及與體液免疫機(jī)制相對的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制。因此，本發(fā)明的方法適合于治療組織破壞主要是由活化B細(xì)胞和由不是B淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的那類自身免疫病。然而，即使本發(fā)明的方法是要治療對自身反應(yīng)主要通過活化B細(xì)胞和非B淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，該類自身免疫病可以是以自身抗體的存在為特征的。例如，一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病EAE可通過本發(fā)明的方法治療，該病常常伴隨抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成分如卵磷脂類蛋白質(zhì)的自身抗體的存在。可由本發(fā)明的方法治療的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的非限定性實施例包括多發(fā)性硬化癥、EAE、I型糖尿病、卵巢炎和甲狀腺炎。gp39拮抗劑按照本發(fā)明的方法，給被試者施用gp39拮抗劑以阻礙T細(xì)胞上的gp39與抗原遞呈細(xì)胞如B細(xì)胞上的gp39配體相互作用從而防止，減輕或改善病情。gp39拮抗劑被定義為一種阻礙這類相互作用的分子。如下面更詳細(xì)的介紹，gp39拮抗劑可以是抗gp39的抗體(例如，抗gp39單克隆抗體)、抗gp39抗體的一個片段或衍生物(例如，F(xiàn)ab或F(ab)′2段，嵌合抗體或人源化抗體)、一種gp39配體的可溶形式(例如，可溶性CD40)、一種gp39配體的融合蛋白的可溶形式(例如，可溶性CD40Ig)、或破壞或阻礙所述gp39-CD40相互反應(yīng)的藥劑。A.抗體為制備抗-gp39抗體，可用引起哺乳動物抗體反應(yīng)之免疫原性形式的gp39蛋白或蛋白質(zhì)片段(例如，肽片段)免疫哺乳動物(例如，小鼠、倉鼠、或兔)。在細(xì)胞表面上表達(dá)gp39的細(xì)胞也可用做免疫原。選擇的免疫原包括純化的gp39蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。gp39可通過標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)從表達(dá)gp39細(xì)胞純化，例如gp39 cDNA可在宿主細(xì)胞如細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)純化gp39蛋白質(zhì)(Armitage等，Nature，35780-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)Hollenbaugh等，EMBO J.，114313-4319(1992))。可以gp39的氨基酸序列為基礎(chǔ)用已知技術(shù)(例如F-moc或T-boc化學(xué)合成法)合成gp39肽(發(fā)表在Armitage等，Nature，35780-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等，EMBO J.，114314-4319(1992))。賦予蛋白質(zhì)以免疫原性的技術(shù)包括結(jié)合到載體技術(shù)或其他本行業(yè)所熟知的技術(shù)。例如，可在佐劑存在時施用所述蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)測免疫進(jìn)程。可使用標(biāo)準(zhǔn)的酶聯(lián)免疫法或其他免疫檢測法以免疫原作為抗原評估抗體水平。
按免疫方法操作可得到抗血清，若需要的話可從該血清中分離多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，可從免疫的動物收集產(chǎn)抗體細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)并通過標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合方法與骨髓瘤細(xì)胞融合從而使這些細(xì)胞無限增殖并產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這個技術(shù)是本行業(yè)所熟知的。例如，雜交瘤技術(shù)最初是由Kohler和Mistein(Nature(1975)256495-497)以及其他技術(shù)如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kazbar等。Immunol.Today(1983)472)、為生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等.Moleclonal Antibodies in CancerTherapy(1985)(Allen R.Bliss，Inc.，page 77-96)和篩選復(fù)合抗體庫(Huse等.，Science(1989)2461275)發(fā)展起來的。為生產(chǎn)與所述蛋白或肽起特異性反應(yīng)的抗體，可對雜交瘤進(jìn)行免疫化學(xué)篩選并分離單克隆抗體。
此處使用的術(shù)語抗體意指包括具有對gp39蛋白質(zhì)或其肽或gp39融合蛋白的反應(yīng)特異性之抗體片段?？捎贸Ｒ?guī)技術(shù)使抗體成為片段并根據(jù)實用目的以上述完整抗體的同樣的方式篩選所述片段。例如，通過用胃蛋白酶處理抗體生成F(ab′)2段?？商幚淼玫降腇(ab′)2段以還原二硫鍵從而生成Fab′段。本發(fā)明的抗體還意指包括有抗gp39部分的雙特異性分子和嵌合分子。
當(dāng)將非人受試者產(chǎn)生的抗體用于人類治療時，它們不同程度的被辨認(rèn)為外來物并可在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。比免疫抑制更優(yōu)選的一種減小或消除這個問題的方法是產(chǎn)生嵌合抗體衍生物例如將非人動物可變區(qū)和人類恒定區(qū)相結(jié)合的抗體分子。例如，嵌合抗體分子可包括例如帶有人類恒定區(qū)的源于小鼠、大鼠、或其他物種之抗體的抗原結(jié)合區(qū)。各種制備嵌合抗體的方法已有介紹并可將這些方法用于制備含識別gp39的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體。例如，見Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851(1985)；Takeda等，Nature 314452(1985)，Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567；Boss等，U.S.Patent No.4,817,397Tanaguchi等，European Patent Publication EP171496；Uuropean PatentPublication 01734594，United Kindom Patent GB2177096B。預(yù)期這類嵌合抗體在人體中的免疫原性比相應(yīng)的非嵌合抗體的免疫原性要低。
為人類治療目的的具有與gp39蛋白質(zhì)或肽的特異反應(yīng)性的單克隆抗體或嵌合抗體可通過產(chǎn)生人可變區(qū)嵌合體使其進(jìn)一步人源化，在所述嵌合體中可變區(qū)部分，特別是抗原結(jié)合區(qū)的保守框架區(qū)具有人類來源，而只有高變區(qū)是非人來源的。可通過本行業(yè)所知的幾個技術(shù)的任何一種制備這類改變了的免疫球蛋白分子，(例如，Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)Kozbor等.，Immunology Today，47279(1983)；Olsson等.，Meth.Enzymol.，923-16(1982))，并最好按照PCT Publication WO92/06193或EP0239400教程進(jìn)行制備。例如，Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain可生產(chǎn)供出售的人源化抗體。
生產(chǎn)對gp39蛋白質(zhì)或肽有反應(yīng)性的特異抗體或抗體片段的另一種方法是用gp39蛋白或肽篩選細(xì)菌中表達(dá)的編碼免疫球蛋白基因的表達(dá)文庫或其部分。例如，可用噬菌體表達(dá)文庫在細(xì)菌中表達(dá)完整的Fab段，VH區(qū)和FV區(qū)。例如，見Ward等，Nature，341544-546(1989)；Huse等，Science，2461275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature，348552-554(1990)。例如，用gp39肽篩選這類文庫可鑒定具有對gp39的反應(yīng)性的免疫球蛋白。另外，SCID-hu小鼠(從Genpharm得到)可用于生產(chǎn)抗體或其片段。
在PCT專利申請?zhí)朩O 95/06666中題為“抗gp39抗體及其應(yīng)用”(其中的教程為參考引用)描述了生產(chǎn)抗gp39，包括抗人gp39和抗小鼠gp39單克隆抗體的方法，以及單克隆抗體，適合本發(fā)明方法中使用。本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗人gp39抗體是mAbs24-31和89-76，它們分別由雜交瘤24-31和89-76產(chǎn)生。按照布達(dá)佩斯條約，產(chǎn)生89-76和24-31抗體的雜交瘤89-76和24-31于1994年9月2日分別儲存在American TypeCulture Collection，Parklawn Drive，Rochville，Md.。給雜交瘤89-76ATCC保藏號是HB11713，而雜交瘤24-31ATCC保藏號是HB11712。
按照標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)對編碼抗gp39抗體的核酸(例如DNA)進(jìn)行操作可生產(chǎn)重組型抗gp39抗體，如嵌合抗體和人源化抗體。因此，本發(fā)明的另一方面是關(guān)于可編碼與gp39，特別是人gp39有反應(yīng)性的免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其部分的分離的核酸分子。編碼免疫球蛋白的核酸可編碼免疫球蛋白輕鏈或重鏈的可變區(qū)，或有或無相連接的重鏈或輕鏈恒定區(qū)(或其部分)。例如，通過cDNA庫篩選，PCR擴(kuò)增或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可從24-31或89-76雜交瘤分離編碼24-31或89-76嵌合抗體的核酸。而且，繼分離和可能的進(jìn)一步操作之后，編碼抗人gp39嵌合抗體可整合到表達(dá)載體中并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以有利于表達(dá)和產(chǎn)生重組形式的抗人gp39抗體。B.gp39的可溶性配體其他可用于產(chǎn)生T細(xì)胞耐受的gp39拮抗劑是gp39配體的可溶形式。gp39的單價可溶配體如CD40可結(jié)合gp39，從而抑制gp39與B細(xì)胞上的CD40的相互作用。術(shù)語“可溶性”是指配體不與細(xì)胞膜永久結(jié)合?？扇苄詆p39配體可由化學(xué)合成法制備，或最好通過DNA重組技術(shù)例如通過只表達(dá)所述配體的細(xì)胞外域(沒有配體的跨膜域和胞質(zhì)域)制備。優(yōu)選的可溶性gp39配體是可溶性CD40。另外，可溶性gp39配體可以是融合蛋白的形式。這類融合蛋白至少包括附著到第二個分子上的gp39配體的一部分。例如，CD40可表達(dá)成帶有免疫球蛋白的融合蛋白(例如，CD40 Ig融合蛋白)。在一種實施方案中，所產(chǎn)生的融合蛋白包括CD40分子的細(xì)胞外域部分的氨基酸殘基連接著對應(yīng)于免疫球蛋白重鏈如Cγ1的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)序列的氨基酸殘基以形成CD40Ig融合蛋白(例如見Linsley等(1991)J.Exp.Med.1783721-730；Capon等(1989)Nature 337，525-531；和Capon U.S.5,115,964)?？赏ㄟ^化學(xué)合成法或最好通過以CD40的cDNA為基礎(chǔ)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)所述融合蛋白(Stamenkovic等，EMBO J.81403-1410(1989))。
將本發(fā)明的拮抗劑以適合體內(nèi)用藥的生物學(xué)相容形式施用于被試者?！斑m合體內(nèi)用藥的生物學(xué)相容形式”是指所述拮抗劑的一種給藥形式，在該形式中所述蛋白質(zhì)的治療作用超過任何毒副作用。術(shù)語被試者意指包括在其體內(nèi)可引發(fā)免疫反應(yīng)的所有活有機(jī)體，例如哺乳動物。被試者的實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉(zhuǎn)基因物種?？梢匀魏嗡幬镄问皆谌芜x的藥用載體中施用gp39拮抗劑，治療活性量的拮抗劑的施用被定義為以必要的劑量和時間間隔而達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有效量。例如，gp39的一種拮抗劑的治療活性量可根據(jù)諸如個體的病情、年齡、性別和體重以及該拮抗劑引起該個體體內(nèi)的所需反應(yīng)的能力而有不同?？蓪┝矿w制調(diào)整到能提供所述最佳治療反應(yīng)。例如，每天可給數(shù)份藥或根據(jù)治療情況的要求按比例減少每份藥量。
活性化合物(例如拮抗劑)可以方便的方式施用，如注射(皮下，靜脈內(nèi)等)、口服、吸入、經(jīng)皮施用、或直腸給藥。根據(jù)給藥途徑，可用一種物質(zhì)包被活性化合物以防止化合物受酶、酸和其他可使該化合物失活的天然成分的作用。
為了施用經(jīng)胃腸給藥的gp39拮抗劑，可能有必要將一種物質(zhì)包被該拮抗劑或與該拮抗劑的共給藥以防止拮抗劑失活。例如，一種拮抗劑可在適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑中給藥，伴隨酶抑制劑共同給藥或在載體如脂質(zhì)體中給藥。藥用稀釋劑包括生理鹽水和緩沖水溶液。酶抑制劑包括胰臟胰蛋白酶抑制劑、二異丙基-氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂質(zhì)體包括水包油包水乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等，(1984)J.Neuroimmunol727)活性化合物還可經(jīng)胃腸外或腹腔內(nèi)給藥。也可用甘油、液體聚乙烯甘醇及其混合物和油類制備分散劑。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑可含有一種防腐劑以防微生物生長。
適合注射使用的藥用組合物包括為臨時配制無菌注射液或分散劑用的無菌水溶液(水溶性溶液)或分散劑和無菌粉劑。在各種情況下，組合物必須是無菌的并必須是達(dá)到易于注射程度的流體。所述組合物在生產(chǎn)條件和儲存下必須是穩(wěn)定的并必須保存在抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染活動的條件下。所述載體可以是例如含水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙烯甘醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如通過使用一種包被如卵磷脂、通過依靠分散劑維持所需顆粒的大小和通過使用表面活性劑可保持適當(dāng)?shù)牧鲃有??？捎酶鞣N抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、asorbic acid、乙基汞硫代水楊酸鈉等防止微生物活性。在許多情況下，在組合物中最好包括等滲試劑，例如糖類、多醇類、如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。在組合物中包括延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠可產(chǎn)生注射用組合物的延長吸收作用。
通過將在適當(dāng)溶劑中之需要量的活性化合物根據(jù)需要與上述所列配料之一或一種組合相混合然后過濾除菌可制備無菌注射液。一般說，通過將所述活性化合物摻入到無菌載體中制備分散劑所述載體含有一種基本的分散介質(zhì)和上述所列的其他需要成分。就無菌粉劑來說，為制備無菌注射液，優(yōu)選的制備方法是產(chǎn)生活性成分(例如，拮抗劑)粉末的真空干燥和冷凍干燥加上來自前述相應(yīng)無菌過濾液的其他所需成分。
如上所述，當(dāng)活性化合物受到適當(dāng)保護(hù)時例如用一種惰性稀釋劑或一種可吸收的食用載體，就可以口服所述蛋白質(zhì)。如本文所用“藥用載體”包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑等。除了受到任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性化合物不相容的限制外，都要考慮在治療用組合物中使用上述成分。
將經(jīng)胃腸外給藥的組合物配制成劑量單位形式對方便給藥和劑量統(tǒng)一是有特殊優(yōu)越性的。此處所用的劑量單位形式指適合作為接受治療的哺乳動物被試者使用的單一劑量的物理上分立的劑量單位；每單位含有計算好的與需要的藥物載體結(jié)合使用時能產(chǎn)生理想治療效果之預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格受支配于并依賴于(a)活性化合物獨具的特點和所要達(dá)到的特殊的治療效果，和(b)合成用于個體敏感性治療的此類活性化合物之技術(shù)的內(nèi)在限制。
本發(fā)明由下述實施例做進(jìn)一步解釋，所述實施例不應(yīng)被看作是對本發(fā)明的限制。在全部所述應(yīng)用中引用的所有參考、專利和出版的專利應(yīng)用之內(nèi)容均結(jié)合于此作為參考引用。實施例1
通過施用抗gp39抗體防止EAE本實施例證明給小鼠施用抗gp39抗體能防止誘發(fā)實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，此處EAE是一種多發(fā)性硬化癥的動物模型。
EAE是一種頗具特點的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病模型并且對人類自身免疫病多發(fā)性硬化癥來說是一種指導(dǎo)性模型。通過用卵磷脂類蛋白質(zhì)(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PAP)、少突神經(jīng)細(xì)胞髓磷脂蛋白質(zhì)(MOG)、或以這些卵磷脂結(jié)合蛋白序列為基礎(chǔ)合成的肽類同時給與百日咳細(xì)菌佐劑免疫動物，可在易感動物如小鼠中誘發(fā)EAE。在免疫動物后一到二周，動物發(fā)生腦脊髓炎，其特征是外周血管滲潤有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并發(fā)生腦髓和脊髓脫髓鞘。動物表現(xiàn)出急性、慢性或慢性復(fù)發(fā)性癱瘓。在此實施例中，分析了在小鼠發(fā)生EAE時給予抗gp39抗體的效果。
在易感小鼠腹部兩側(cè)皮下注射(第0日)乳劑誘發(fā)EAE，在該乳劑中含70微克或300微克PLP肽的50微升PBS溶液并含25微克結(jié)核桿菌(H37RA，Difco)的50微升完全Freuds佐劑。在給所述肽的同時以及兩天后，靜脈給予200微升百日咳桿菌懸液(10.1010在1毫升PBS中)。給小鼠注射的PLP肽的氨基酸序列相應(yīng)于大鼠PLP的139到151氨基酸殘基(Daotigny等，F(xiàn)EBS Lett.18833，1985)。PLP肽是按照固相合成法用f-moc保護(hù)的氨基酸合成的(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149，1963)。用此肽免疫動物導(dǎo)致發(fā)生急性EAE，后者在臨床上和病理上等同于用完整中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)卵磷脂或用MBP致敏所誘發(fā)的EAE(Tuohy等，J.Immunol.1421523，1989；Sobel等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.49468，1990)。
為確定抗gp39在疾病進(jìn)程中的作用，在第0天用上述方法給小鼠注射PLP肽并在第0、2、4天追加靜脈注射125微克倉鼠抗gp39Mabs(Noelle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550，1992)的200微升PBS溶液或注射125微克正常倉鼠抗體(Serv Feinbiochemica)的200微升PBS溶液(對照組動物)。每日評估EAE臨床體征的嚴(yán)重性并按照平均病廢標(biāo)度(DAS)記分區(qū)分等級0級＝無臨床體征，1級＝尾部無力，2級＝后肢中度癱瘓和運動失調(diào)，3級＝后肢嚴(yán)重癱瘓或運動失調(diào)，4級＝瀕死狀態(tài)，5級＝EAE導(dǎo)致死亡。
圖1表示注射70微克PLP肽(A部)或300微克PLP肽(B部)并用抗gp39或?qū)φ湛贵w處理的小鼠疾病進(jìn)程。對照小鼠和用抗gp39處理之小鼠的DAS記分(此記分反映該病的嚴(yán)重程度)分別用灰色和黑色條塊表示。
結(jié)果表明接受對照抗體的動物發(fā)生了EAE，而接受了抗gp39抗體的動物受到保護(hù)沒有誘發(fā)該病。對于接受了對照抗體的動物，EAE的最初臨床體征在第11天明顯表現(xiàn)出來。在這些動物中，注射75微克PLP肽的動物的最高DAS記分是2.33，在第15-22天觀察到此分?jǐn)?shù)(圖1，A部黑色條塊)，注射300微克PLP肽的動物最高DAS記分是3.6，在第16-23天觀察到此分?jǐn)?shù)(圖1，B部灰色條塊)。相反，接受了抗gp39單克隆抗體的動物顯示經(jīng)75微克PLP肽誘導(dǎo)EAE后沒有臨床體征(圖1，A部，黑色條塊)，而經(jīng)300微克PLP肽誘導(dǎo)該病后僅有輕微臨床體征，該體征在第31天完全消失(圖1，B部，黑色條塊)。
因此，給小鼠施用抗gp39抗體完全抑制在這些小鼠中誘發(fā)EAE。
通過從卵磷脂成分免疫的動物分離到的或從卵磷脂成分體外活化后得到的卵磷脂反應(yīng)性T細(xì)胞的繼承性轉(zhuǎn)移誘發(fā)EAE表明特殊活化的T細(xì)胞與誘導(dǎo)期后的臨床特征的發(fā)生有關(guān)(Pettinelli和McFarlin，J.Immunol.1271420，1979；Mokgtarion等，Nature 309356，1984；Veen等，J.Neuroimmu-nol.21183，1989)。然而，本文描述的實驗顯示施用抗gp39單克隆抗體能防止EAE發(fā)生。在對照組，用低和高PLP肽誘發(fā)EAE的動物中分別在第14天(吸收系數(shù)1.92)和第21天(吸收系數(shù)2.15)觀察到有意義的抗PLP肽抗體反應(yīng)。相反，在經(jīng)gp39處理的動物中，接受低和高劑量PLP肽注射的動物分別在第14天最初觀察到有意義的抗PLP抗體反應(yīng)并在第31天達(dá)到穩(wěn)定水平(吸收系數(shù)0.928)和(吸收系數(shù)1.54)。在抗gp39單克隆抗體處理的小鼠中有意義的抗PLP抗體反應(yīng)的產(chǎn)生推遲了14天，這表明抗gp39單克隆抗體對抗體的產(chǎn)生有某些影響。
因此，所述實施例證明抗gp39能防止EAE發(fā)生并表明可將抗gp39抗體用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，如多發(fā)性硬化癥。實施例2通過施用抗gp39抗體逆轉(zhuǎn)EAE實施例1說明了抗gp39抗體對誘發(fā)EAE的抑制作用。因此，證明了在誘發(fā)該疾病時免疫小鼠能防止該病的發(fā)生。這個實施例表明在誘發(fā)該病后施用所述抗體導(dǎo)致該疾病的消退。
在本實施例中，通過注射含150微克PLP肽的乳劑在雌性SJL/j小鼠中誘發(fā)EAE，乳劑制備方法同上所述。為確定在誘發(fā)疾病后給小鼠施用抗gp39抗體時該抗體的作用，在第0、2和4日，在第4、6和8日或在第7、9和11日給小鼠腹腔內(nèi)注射125微克抗gp39單克隆抗體(Nocllc等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896550，1992)的200微升PBS溶液(抗gp39處理的小鼠)，或僅注射200微升PBS(對照小鼠)。其結(jié)果以抑制百分?jǐn)?shù)表示，并與抗gp39處理的動物及對照動物的每日DAS記分全部記分?jǐn)?shù)比較。
圖2顯示的結(jié)果表明在給小鼠注射PLP肽后最晚7天施用首副劑量的抗gp39抗體，導(dǎo)致對該病的抑制達(dá)60％以上。因此，抗gp39抗體能夠逆轉(zhuǎn)或抑制EAE。
該結(jié)果進(jìn)一步表明即使在誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后僅7天施用首副劑量的抗體導(dǎo)致對發(fā)病的抑制作用，當(dāng)首副劑量的抗體于誘發(fā)該病后越早施用gp39抗體則效果會更好些。
因此，給小鼠施用抗gp39抗體能防止小鼠在誘導(dǎo)EAE時發(fā)生該病并對患EAE小鼠的EAE起抑制作用。實施例3在gp39處理的小鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移后EAE的抑制已檢測了從EAE復(fù)康的Lewis大鼠調(diào)節(jié)抑制性T細(xì)胞(Pesoa等，J.Neuroimmunol.7131，1984)并檢測了口服卵磷脂成分后的抑制性T細(xì)胞(Lider等，J.Immunol.142748，1989；Hafler等，Ann.NY Acad.Sci.636251，1991)。據(jù)Karpus和Swanborg(J.Immunol.1433492，1989)的推斷，從EAE復(fù)康的大鼠分離的CD4+抑制性T細(xì)胞可通過對淋巴因子生成的差異抑制調(diào)減EAE T效應(yīng)細(xì)胞。相反，通過口服MBP來抑制Lewis大鼠的EAE是受CD8+T細(xì)胞調(diào)節(jié)的(Miller等，J.Exp.Med.174791，1991)。為確定是否通過施用抗gp39抗體而防止了EAE的小鼠的T細(xì)胞能夠防止新受試動物患EAE進(jìn)行了下述實施例。
在此實施例中，按照實施例1所述方案給第一組小鼠注射了150微克PLP并給第二組小鼠注射了150微克PLP和抗gp39抗體。四個月后，用二氧化碳安樂死法處死這些小鼠并取脾臟。用標(biāo)準(zhǔn)氯化銨處理除去紅細(xì)胞(Mishell和Shiigi，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Company，1980)。將來自個體脾臟的細(xì)胞(500微升)靜脈輸注給新受試的5Gy灌注的受體雌性SLJ/j小鼠(10-12周齡)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移兩天后，按照實施例1所述方法通過腹腔內(nèi)注射150微克PLP肽激發(fā)小鼠并確定DAS記分?jǐn)?shù)。
圖3顯示所述動物的DAS記分?jǐn)?shù)。此結(jié)果表明接受來自最初經(jīng)PLP肽和抗gp39抗體注射的動物的脾細(xì)胞移植的小鼠得到保護(hù)而免于發(fā)生所述疾病，而接受來自最初僅經(jīng)PLP肽注射的動物之脾細(xì)胞移植的小鼠則發(fā)生EAE。而且，考慮到估計的抗體半衰期是12天，認(rèn)為在所述小鼠中被轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞中沒有抗體存在。因此，不能通過抗gp39抗體的存在解釋來自受PLP肽和抗gp39抗體注射的動物供體脾細(xì)胞提供的防護(hù)作用。這些小鼠的DAS記分?jǐn)?shù)表明受體小鼠中的EAE的抑制最可能是由于在轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞懸液中存在的T抑制細(xì)胞群并且所述T抑制細(xì)胞群的作用有效壓倒T效應(yīng)細(xì)胞群。實施例4gp39陽性Th細(xì)胞的檢測本實施例證明在患多發(fā)性硬化癥的人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在gp39陽性細(xì)胞。
人尸體解剖中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)從荷蘭的阿姆斯特丹的荷蘭腦庫獲得。按照本行業(yè)所知的方法用CD40-Ig融合蛋白檢測gp39陽性細(xì)胞。用CD40-Ig對一例MS患者和一例Alzheimer患者的CNS組織切片染色。在此實施例中，僅使用事先對其中的抗MBP抗體形成細(xì)胞做過檢測的MS患者的CNS組織。染色結(jié)果顯示在MS患者的8微米冠狀大腦切片中存在gp39陽性細(xì)胞，但是在Alzheimer患者的冠狀大腦切片中沒有檢測到gp39陽性細(xì)胞。因此，僅在MS患者的CNS組織切片中檢測到gp39陽性細(xì)胞。在MS患者CNS組織中存在gp39陽性細(xì)胞以及僅在MS患者CNS組織中檢測到抗MBP抗體形成細(xì)胞而在對照的CNS組織中卻沒有檢測到該細(xì)胞表明此類細(xì)胞在MS患者的病理學(xué)上受累的CNS組織中起作用。
在此研究中，我們已經(jīng)表明施用抗gp39Mabs對激活B細(xì)胞的抑制可導(dǎo)致對EAE發(fā)生的徹底防護(hù)，而EAE的發(fā)生取決于誘導(dǎo)EAE的抗原劑量并取決于誘導(dǎo)EAE與施用抗gp39Mabs之間的時間間隔。雖然尚不清楚與EAE誘導(dǎo)和發(fā)生有關(guān)的確切機(jī)制，所述資料表明可將抗gp39抗體用于治療自身免疫病。等價物熟悉本行業(yè)的人員將知道，或能夠肯定僅僅使用常規(guī)實驗時，本文所描述的發(fā)明之具體實施方案有許多等價物。所述等價物是要包括在下述權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的方法，包括給被試者施用一種治療上或預(yù)防上有效量的T細(xì)胞表面受體的拮抗劑，所述受體介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病選自多發(fā)性硬化癥、EAE、I型糖尿病、卵巢炎和甲狀腺炎。
3.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病是多發(fā)性硬化癥。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的T細(xì)胞表面上的受體是gp39。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述拮抗劑是一種抗gp39抗體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗gp39抗體是單克隆抗體。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗gp39抗體是抗人gp39抗體。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體產(chǎn)生于89-76雜交瘤、其ATCC保藏號為HB11713或24-31雜交瘤、其ATCC保藏號為HB11712或一種具有其所述gp39結(jié)合特征的抗體。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體是一種嵌合的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體是一種人源化的單克隆抗體。
11.一種治療多發(fā)性硬化癥的方法，包括給被試者施用治療有效量的抗人gp39抗體。
全文摘要
描述多發(fā)性硬化癥和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的治療方法。該方法涉及給被試者施用有效治療劑量的T細(xì)胞表面受體拮抗劑,例如抗－gp39抗體,所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型輔助效應(yīng)功能。
文檔編號A61P37/06GK1192156SQ96195877
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者R·J·諾勒, E·克拉森 申請人:達(dá)特茅斯學(xué)院理事, 荷蘭應(yīng)用自然科學(xué)研究組織