專利名稱：：制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及保存和純化來自全*本的細(xì)胞的方法。具體而言，本發(fā)明涉及4絲和純化來自全*本的細(xì)胞的方法，以使得一群淋巴細(xì)#抗原呈遞細(xì)月^皮有效穩(wěn)定化和純化，以供用于體外測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)免C^答的分析中。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)應(yīng)答通常用于確定個(gè)體的免疫狀態(tài)。通常，在臨床免疫學(xué)領(lǐng)域，術(shù)語CMI應(yīng)答涵蓋體內(nèi)皮試、淋巴細(xì)自殖分析以#特異性抗原了用于，、^定化^^制備來自分離的全"本的細(xì)胞的改進(jìn)的方法,以:用、于測(cè)量一類CMI應(yīng)答的分析技術(shù)(下文稱作"CMI分析")，所述CMI應(yīng)答即針對(duì)特異性抗原的、基于細(xì)胞因子的體外CMI應(yīng)答。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞在受到抗原的刺激后能夠產(chǎn)生免疫效應(yīng)物分子，例如細(xì)胞因子。CMI分析包括將細(xì)M本與一種抗原""^溫育，并測(cè)量免疫效應(yīng)物^(例如細(xì)胞因子)是否存在或者存在的量，以提供個(gè)體針對(duì)所選抗原產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力的指征。在CMI分析中使用的細(xì)|^￡包括分離的淋巴細(xì)|^(特別是T細(xì)^)和抗原呈遞細(xì)胞(APC)群。APC參與抗原的加工，以使得該抗原可以被每個(gè)T細(xì)J^4面的T細(xì)胞受體識(shí)另，J?？乖T導(dǎo)的細(xì)胞因子可被員到分析介質(zhì)中，并通過例如ELISA的方法直接測(cè)定，或者對(duì)分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞的頻率佳月ELISP0T方法ii^f于定量。過濾免疫蝕斑分析也稱酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(ELISPOT)，在開發(fā)之初用于對(duì)個(gè)別的分泌抗體的B細(xì)Jf&i^ff^r測(cè)和定量。在該技7M皮開發(fā)出來時(shí)，它為常規(guī)的蝕斑形成細(xì)胞分析提供了快速的、多用途的替代方案。最近的改進(jìn)已經(jīng)提高了ELISP0T的靈M，以致可以^"測(cè)到每秒產(chǎn)生低至100個(gè)特異性蛋白質(zhì)分子的細(xì)胞。這些分析利用了在緊鄰分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞的環(huán)境中的較高深度的給定的蛋白質(zhì)性細(xì)胞產(chǎn)物(例如細(xì)胞因子)。這些細(xì)胞產(chǎn)物利用高親和性抗體進(jìn)行捕捉和檢測(cè)。ELISPOT分析的綜述可參考CurrentProtocolsinImmunology,Unit6.19pages6.19.1-8。ELISP0T分析通常包括六個(gè)步驟(1)在膜支持的微滴定;tUi包被純化的細(xì)胞因子特異性抗體；(2)封閉該板，以防止非特異性吸附^^T其他的蛋白質(zhì)；(3)將分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞與適當(dāng)?shù)脑噭?^溫育；(4)除去細(xì)#試劑；(5)加入標(biāo)記的第二抗細(xì)胞因子抗體；以及(6)枱r測(cè)膜上的抗體-細(xì)胞因子復(fù)合物。從全血樣本制備用于CMI分析的細(xì)胞的目前的方法包括使用聚糖體(Ficoll)梯度來分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。梠^據(jù)這些方法，為了有效進(jìn)行CMI分析，淋巴細(xì)胞和APC必須從全械本中盡快純化，糾地ill在從個(gè)體采集血液樣本后的8小時(shí)內(nèi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)明了保存和純化來自全jfc^本的細(xì)胞，以供在細(xì)胞介導(dǎo)免疫分析(CMI分析)，如ELISP0T分析中使用的方法。*明了在^之前處理全j6l^羊本的方法。這些方法可使全jfe^本在CMI分析，例如ELISP0T分析中使用之前^皮保存例如至少6小時(shí)，如多至48小時(shí)。本發(fā)明提供了一種M和純化來自全血樣本的細(xì)胞的方法，包括在純化細(xì)胞之前和/或^絲該樣本至少6小時(shí)，以及純化一群淋巴細(xì)胞和APC以供在細(xì)胞介導(dǎo)免疫分析(CMI分析)中^J^！,所述純^if過一種引AiL向或負(fù)向親和it擇步驟的方法^Mi^f亍。本發(fā)明在另一方面提[種處理和M全j6^本的方法，包括使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋所述全i^羊本；并且將處理過的全j&^羊本絲至少6小時(shí)，其中，在4錄之后，可獲得一群淋巴細(xì)胞和APC以供在CMI分析中使用。在M之后，可從稀釋的全*本中分離PBMC或者淋巴細(xì)胞和APC的適當(dāng)?shù)闹苿┮怨┰贑MI分析，如ELISP0T分析中^Jl。本發(fā)明在另一方面^^"種在ELISP0T分析中員來自全血的、分離的T細(xì)胞的肽特異性細(xì)胞因子應(yīng)答的方法，包括^f捐正向或負(fù)向親和選擇>^^斤述全jM羊本中分離一群包括T細(xì)#APC的細(xì)胞。本發(fā)明在另一方面"R供一種制備適用于ELISP0T分析的淋巴細(xì)胞和APC的方法，其中，所述方法包^it過iiy慮除去紅細(xì)胞。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種保存和純化來自全*本的細(xì)胞以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法。本發(fā)明還提供了一種通過^J^)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋來處理全jk^羊本、##存該處理的全*本的方法。該方法^f吏得來自所#液樣本的分離的淋巴細(xì)#APC的肽特異性細(xì)胞因子應(yīng)答足以在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，優(yōu)逸地用在i貪斷方法中。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)^^h導(dǎo)免疫^^斤(CMI分析)是指用于測(cè)量4十對(duì)特異性抗原的、基于細(xì)胞因子的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的體外分析。此類分析^^)從個(gè)體中獲得的樣本，其中所述樣本包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。該免疫系統(tǒng)的細(xì)胞在受到抗原刺激后能夠產(chǎn)生免疫效應(yīng)物M，如細(xì)胞因子。該分析包括將該樣本與一種抗原""^溫育，并測(cè)量免疫效應(yīng)物^(例如細(xì)胞因子)是否存在或者存在的量，以提供個(gè)體針對(duì)所選抗原產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力的指征。本發(fā)明中，CMI分析優(yōu)選為ELISPOT分析。在CMI分析，如ELISPOT分析中使用的細(xì)胞包括分離的淋巴細(xì)#APC群，例如一群T細(xì)#APC。根據(jù)本發(fā)明方法制備的分離的淋巴細(xì)胞和APC制劑、特別是T細(xì)胞和APC制劑可用于CMI分析，如ELISPOT分析，以用于診斷。該制劑產(chǎn)生足以進(jìn)4tit斷的應(yīng)答。該應(yīng)答可被P艮定為高于本底的50%?；蛘撸搼?yīng)答可被限定為佳月剛剛分離的全jk4羊本所能獲得的最;Ul答的至少50%。例如，在通常的分析中，在ELISP0T分析的每個(gè)孔中可使用2.5xl(f個(gè)存活的PBMC。在結(jié)核病的ELISPOT分析中，陰性對(duì)照通常少于5個(gè)斑點(diǎn)。在這種情況下，P曰性或M性樣本應(yīng)比陰性對(duì)照多6個(gè)或6個(gè)以上斑點(diǎn)。如果陰性對(duì)照有6個(gè)或6個(gè)以上斑點(diǎn)，則只有在斑點(diǎn)數(shù)量為陰性對(duì)照的兩倍以上時(shí)才表明^JI性樣本。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在*之前或之后，使用正向親和選擇步驟或負(fù)向親和選擇步驟來純化來自全*本的細(xì)胞。正向親和選擇步驟用于將所需細(xì)胞結(jié)合至固體支持物上，從而使結(jié)合的細(xì)胞與^合的細(xì)胞分離。純4匕的結(jié)合的細(xì)胞^t保留，未結(jié)合的細(xì)l&^:丟棄。另一方面，負(fù)向親和選擇步驟用于除去那些在用于CMI分析，如ELISP0T分析的細(xì)胞制劑中不需要或不想要的細(xì)胞。因而，結(jié)合至固體支持物的細(xì)胞被丟棄，純化的未結(jié)合的細(xì)g回收并床留。該方法使淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞)和APC都得到純化。該純化可包拾淋巴細(xì)胞和APC兩者的正向或負(fù)向親和選擇，在這種情況下，通常樣本中這兩種細(xì)胞類型都得到富集，即，作為實(shí)施本發(fā)明方法的結(jié)果，樣本中T細(xì)J^細(xì)胞總數(shù)的比例和APC對(duì)細(xì)胞總數(shù)的比例都升高。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在通過包括正向或負(fù)向親和選擇步驟的方法對(duì)來自全jMf本的細(xì)胞進(jìn)行純^iL前和/或之后，將該全jM羊^i行保存。例如，該全jM羊本可在分離所選細(xì)lfe^ML前進(jìn)行保存。在保存至少6小時(shí)、至少8小時(shí)、多達(dá)IO、12、18、24、36或48小時(shí)之后，處理(即進(jìn)行親和選擇)該全jfa^羊本以分離所選細(xì)胞群，然后可用于CMI分析，如ELISPOT分析。或者，該全血樣本在獲得之后不久即進(jìn)行處理(即進(jìn)行親和選擇)，例如在獲得之后1小時(shí)內(nèi)、多達(dá)6小時(shí)或者多達(dá)8小時(shí)時(shí)進(jìn)行處理以分離所選的細(xì)胞群。然后，在用于CMI分析，如ELISP0T分析^^前，將該細(xì)J!WM^。優(yōu)選地，該全J&^羊4^cg在-5X:和40lC之間，通常在2"和8。C之前或者18。C和25。C之間。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該全_16^羊4^皮*在室溫下，例如約18。C或20。C或者從18"C至25'C或者從201C至25匸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該樣^本文提及的任何方法的任何階段都不進(jìn)行冷凍。在一個(gè)實(shí)施方案中，該樣^^MS^^取的階^g和純化(通it^發(fā)明的方法)階段之間不4皮冷凍；并且/或者該樣本在保存和純化階段至在CMI分析中使用的階段之間不被冷凍。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，純化方法包括負(fù)向親和選擇步驟以除去全*本中的粒細(xì)#^^的紅細(xì)胞，以侵Jl得可在ELISPOT分析中使用的淋巴細(xì)#APC制劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所提供的方法在一個(gè)步驟中從全*本中同時(shí)除去粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。才艮據(jù)該方法，全jfiM^本與含有抗CD66b和血型糖蛋白A抗體的抗體制劑相接觸。這些抗體用于使紅細(xì)J^粒細(xì)M集。凝集的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞可通過例如離心從樣本中除去。該樣;^ii可在離心前進(jìn)行聚糖體梯度。在本發(fā)明的另一方面中，負(fù)向親和選擇包括使用結(jié)合有配體的固體支持物，所述配體結(jié)合存在于粒細(xì)J^面的細(xì)J!fe4面蛋白，而不結(jié)合在ELISPOT分析中^JI的淋巴細(xì)I^APC表面上存在的細(xì)g面蛋白。例如，提供的固體支持物可包括抗CD15配體以結(jié)冶^樣本中的CD15+細(xì)胞，和/或包括抗CD66b以除去樣本中的CD66b+細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，使全*本，或者經(jīng)過處理已除去紅細(xì)胞的血液樣本在可結(jié)合粒細(xì)胞的條件下與含有抗CD15配體或抗CD66b配體的固體支持物相接觸。已經(jīng)除去粒細(xì)胞的淋巴細(xì)胞或APC制劑可直接獲得，例如通過偉樣本與該固體支持物接觸，并收集^T未結(jié)合到該固體支持物的物質(zhì)?；蛘?，結(jié)合有粒細(xì)胞或者其他不想要的細(xì)胞的固體支持物可與樣本的剩余物分開。例如，該固體支持物可包括#^例如*。一旦,已與樣4^^觸并置于可使粒細(xì)胞與固體支持物結(jié)合的條件下，微珠即可與該樣本分離以使淋巴細(xì)胞和APC制劑中的粒細(xì)皿除去。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固體支持物包括可與樣本的剩余物分開的/^:，例如，可通過應(yīng)用磁場(chǎng)與樣本的剩余物分開。應(yīng)該理解，可與粒細(xì)胞表面的細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)合的M配體，特別是抗體，都可用于負(fù)向親和選擇。例如，下述抗體也可用于通it^方法除去粒細(xì)胞抗CD16b和/或抗CD88抗體。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，紅細(xì)胞<^^^全*本中除去。這可以在除去表達(dá)CD15+的細(xì)J!^者粒細(xì)fe前、之后或者同時(shí)實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^4沐適當(dāng)?shù)姆椒ǔ颖局械募t細(xì)胞。例如，樣本中的紅細(xì)胞可通過4吏紅細(xì)胞fj^來除去(Simonetal.,Immunol.Commun.1983，Vol.12，pp.301-314)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，紅細(xì)胞可通過it^、除去。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了一種制^^淋巴細(xì)胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法，包括過濾除去紅細(xì)胞。該方法可單獨(dú)使用，或者與本發(fā)明的一種或多種其他方法結(jié)^f^)，例如，與^^J抗CD15+配體的負(fù)向親和選^^^f^以除去粒細(xì)胞。本申請(qǐng)的過濾方法包括將全jMf本應(yīng)用至過濾器。選擇過濾器以使紅細(xì)胞穿過過濾器而淋巴細(xì)胞和APC留在過濾器上。才艮據(jù)該方法，帶有淋巴細(xì)胞和APC的過濾器可直接在CMI分析，如ELISPOT分析中使用?；蛘撸馨图?xì)胞和APC可通過例如下述方法收集沖洗過濾器或者反向沖洗過濾器，并收集回收的、淋巴細(xì)胞和APC。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，從全*本中純^*巴細(xì)#APC制劑是通過包括正向親和步驟的方法實(shí)現(xiàn)的，其中優(yōu)i^屯，該親和選擇步^i^擇所有類型的T細(xì)胞(例如，不管是CD4還是CD8，或者不管識(shí)別什么表位)。在一個(gè)方面，使全iMf本與附著有配體的固體支持物相接觸，所述B己體結(jié)合在淋巴細(xì)胞和APC表面存在的細(xì)胞表面蛋白。該配體可以是抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，該配體選自抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD45、抗CD45RC和抗CD14配體。例如，所提供的固體支持物可結(jié)合全jfa^羊本中的CD4+、CD8+CD14+和CD19+細(xì)胞，或者其子集，如CD4+、CD8+和CD19+細(xì)胞。這些細(xì)胞的分離可使淋巴細(xì)胞和APC制劑適于在ELISP0T分析中使用。該制劑可包括004+和008+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD4和/或抗CD8配體不用于純化步驟中，優(yōu)選地，抗CD4抗體和/或抗CD8抗不用于純化步驟中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇固體支持物上的配體，以使在最終制劑中不想要的細(xì)胞(如粒細(xì)胞)不保留在固體支持物上。例如，選擇g己體，以使它們對(duì)淋巴細(xì)胞和APC具有特異性，并且不結(jié)合粒細(xì)胞。固體支持物上可以大約相同的比率提供抗CD4、抗CD8和抗CD19配體或者其他適當(dāng)?shù)呐潴w?；蛘?，選擇每種S己體的比率，以例如反映出存在于全血中的每種細(xì)胞的比例?；蛘?，可以選擇配體的比率，例如CD4:CD8:CD19S己體，以便以期望的比率(例如特別適合在ELISP0T分析中使用的比率)結(jié)^^和分離淋巴細(xì)胞和APC。使用結(jié)合有配體的固體支持物結(jié)合所選蛋白質(zhì)的親和選擇方法為本領(lǐng)域所7^p。通常，使全j^羊本與含有所需配體的固體支持物相接觸，所述接觸發(fā)生在可使細(xì)l&iti^目關(guān)的細(xì)胞表面蛋白與該配體相結(jié)合的條件下。該固體支持物可與樣本的剩余物分開以便將結(jié)合的細(xì)胞與未結(jié)合的物質(zhì)分離?？砂_洗步驟，例如，從固體支持物上洗去未結(jié)合的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，固體支持物包括#。該^Mr容易地，例如通it應(yīng)用磁場(chǎng)，與樣本分離。若固體支持物以^Ml^^類型賴沐的形式提供，則每個(gè)#^上可具有一個(gè)酉己體，例如抗CD4S&體。每個(gè)只帶一個(gè)St體(如抗CD4、抗CD8、抗CD14或抗CD19)的微珠可結(jié)合在一^使用，以佳_形成的固體支持物可結(jié)合所需的細(xì)胞，如CD4+、CD8+、CD14+和CD19+細(xì)胞。或者，每個(gè)^K上可提供多于一個(gè)配體，如抗CD4和抗CD8兩種配體，或者抗CD4和CD19兩種配體，或者所有g(shù)己體的結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇配體的比率，如抗CD4:抗CD8:抗CD19，使其相關(guān)于在ELISP0T分析中^J]的最終制劑中所需的淋巴細(xì)J!^APC的比率。也可選擇一定數(shù)量的#,以便分離選定數(shù)量的細(xì)胞，以便有助于進(jìn)一步處理該制劑以供在ELISP0T分析中使用。結(jié)合在固體支持物上的所選細(xì)胞的制劑，特別是淋巴細(xì)胞和APC制劑可直接在分析中使用。特別是，結(jié)合有相關(guān)細(xì)胞的磁珠可直接在CMI分析，如ELISP0T分析中使用。優(yōu)選地，結(jié)合有細(xì)胞的微^被用于分析中之前被洗滌?；蛘撸坏┧x細(xì)胞與全*本的剩余物分離，結(jié)合在固體支持物上的細(xì)胞可以從該固體支持物上解離以在分析中使用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，全械本^JI細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋處理，并在用于CMI分析，如ELISPOT分析之前進(jìn)^f亍^M^。稀釋的全jfi^羊本在采集^可保存至少6小時(shí)，例如在從個(gè)體采集^##至少8小時(shí)，>^在采集^*長(zhǎng)達(dá)IO、12、18、24、36或48小時(shí)。才艮據(jù)本發(fā)明的這一方面，全iM^^M^之前被穩(wěn)定化或處理。例如，該方法包括^J^細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋全械本，以使當(dāng)^^斤述*的全械本獲得的全jM羊本或者分萬的t細(xì)胞和apc制劑在樣本采集后長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)時(shí)在ELISP0T分析中^J^1時(shí)，仍保持活性應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，全j^羊本可^^細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基以^^t適當(dāng)?shù)谋嚷氏♂?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，全jfa^羊本與細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的比率為1:1。另夕卜，全械本與細(xì)胞生缺養(yǎng)基的比率可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、高達(dá)10:1、20:1或30:1。另外，全械本與細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的比率可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10、低至1:15、1:20或1:30。在一個(gè)實(shí)施方案中，將稀#^養(yǎng)#入全_1&#本中，但不進(jìn)行振蕩或^攪拌。全j6Mf本優(yōu)選^"在標(biāo)準(zhǔn)的^:化試管中。優(yōu)iti也，全*^^^在暗處。本發(fā)明中使用的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基可為^f可適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。例如，該培養(yǎng)基可以是市場(chǎng)上購得的培養(yǎng)基，如AIM-V(InvitrogenPaisleyUK)或者RPMI1640(SigmaAldrichCorp,St.Louis,M0，USA)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基為無血清的培養(yǎng)基，如AIM-V。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所i^t理的全j6M^本用于CMI分析或者準(zhǔn)^^在保存后用于CMI分析。通常，在*后，^y^斤述處理的全jfa^本中純化PBMC制劑或者T淋巴細(xì)胞和APC制劑，以供用于CMI分析。任何適當(dāng)?shù)姆椒ň捎糜讷@得分離的細(xì)胞制劑，以供用于CMI分析，如ELISP0T分析。通常，可使用聚糖,度來分離PBMC。更M地，通過包括親和選擇步驟的方法，從處理過的全jMf本中除去紅細(xì)^粒細(xì)胞，以例如分離'淋巴細(xì)胞和APC制劑。稀釋處理還可用于本發(fā)明的另一方面，用以在CMI分析中佳月之前的M該制劑之前處理分離的淋巴細(xì)胞和APC制劑。在本發(fā)明的另一方面中，將稀釋或未稀釋的全血^M^幾個(gè)小時(shí)，優(yōu)選*至少6小時(shí)，或者長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)，或者12-48小時(shí)。可以在2-8。C或者室溫j呆存。保存后，可以通過上述的親和選擇來制備淋巴細(xì)胞和APC制劑，并JWii^地，該制劑中T細(xì)胞的肽特異性應(yīng)答可通過CMI分析測(cè)定。用這樣的方式，引入CMI分析的T細(xì)胞的體外活性被穩(wěn)定化和儲(chǔ)。因此，該過程減少或者絲了體外T細(xì)胞活性的顯著降低，而當(dāng)血液樣本在分離步驟前保存幾小時(shí)，再使用例如標(biāo)準(zhǔn)的聚糖*度從全*本中分離而得的淋巴細(xì)胞和APC制劑中，會(huì)觀察到體外T細(xì)胞活性的顯著I^f氐。本發(fā)明還提供了一種^4MfiM^本的試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)的g化試管和細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了一種在由本文所述的方g萍和純化的細(xì)l&Ji實(shí)施ELISPOT分析的試劑盒，其中所述試劑盒包括(i)一種細(xì)胞因子特異性抗體，任選地附著于微滴定板，和(ii)本文所述的可用于親和選擇中的一種或多種配體，^fiit地結(jié)合于一個(gè)固體支持物，和(iii)任選地，進(jìn)行ELISP0T分析和/或?qū)嵤?和純化細(xì)胞的方法的說明書。另外，本發(fā)明還提供了一種用于根據(jù)本發(fā)明來純化一群淋巴細(xì)胞和APC的試劑盒，其中所述試劑盒包括一種或多種本文提及的配體，所述配體<鏈地結(jié)合于固體支持物上。該試劑盒還包括用于實(shí)施本發(fā)明的方法的說明書。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，全jM羊本使用正向或負(fù)向親和選擇步驟處理，分離一群T細(xì)胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，而無需保存該樣本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，正向或負(fù)向親和選擇方法可用于分離細(xì)胞制劑以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，所述細(xì)胞來自于已經(jīng)過稀釋處理和^#的4^Jfe■#本。任何上述實(shí)施方案均可在來自于人的樣本上實(shí)施，例如被懷疑患有可由ELISP0T診斷的疾病的人。下文中，參照以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。實(shí)施例1使用培養(yǎng)^^^#釋處理對(duì)總共78個(gè)供體中的^個(gè)皿進(jìn)行靜脈穿刺，之后立即采集一管10mlLithiumHeparinVacutainer管(BDBiosciences,Oxford,UK)的全血，并<吏用T一SPOT.7^分才斤試劑盒(OxfordI咖unotec，Abingdon,UK)i^f亍6個(gè)月時(shí)間的處理。根據(jù)該試劑盒隨附的廠商說明書來實(shí)施該方法。該方法包括a)用于制備夕卜周血單核細(xì)胞(PBMC)的標(biāo)準(zhǔn)的Ficol1方法-參見SampleCollectionandPreparation,Procedure2"alternativebloodcollectionmethods"andNote2.;b)^JI臺(tái)盼藍(lán)染色排除法(TrypanBlueDyeExclusionmethod,Freshney,R.(1987)CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,p.117，AlanR.Liss,Inc.,NewYork)對(duì)存活細(xì)JJ&it^i十?dāng)?shù)；c)將細(xì)胞使用GIBC0AIM-V(Invitrogen，Paisley,UK)^^釋至250，000細(xì)胞/100pi;d)將250，000(100pi)Ficol1提取的細(xì)#入每個(gè)微滴定板中，所述滴定板已經(jīng)用抗y干擾素以及下述之一物質(zhì)很好地包被植物血細(xì)皿集素(pha)陽性對(duì)照；或者來自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的特異性測(cè)試抗原(A板；B板)；或者來自巨細(xì)胞病毒/EB病毒/流感病毒(CEF;Mabtech，Sweden),該抗原不在T-SP0T.M試劑盒中提供；e)將該板溫育16至20小時(shí)(37X:，5%C02)，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗四次，然后加A^性磷酸酶綴合的第二抗體，并在2-8。C溫育l小時(shí)；f)將孔沖洗四次，然后加入5-溴-4-氯-3，吲咮基磷酸酉旨/硝基藍(lán)四唑(NitroBlueTetrazoli咖，BCIP/NBT),溫育7^#。出現(xiàn)斑點(diǎn)后，使用蒸餾水終止反應(yīng)；g)在37X:干燥4小時(shí)之后，記錄每個(gè)孔中的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)it量，并i^f亍^^沖斤。將剩余的M體的血液使用AIM-V以1:1的比例稀釋，在室溫(18-25t:)、暗處it^^M^24小時(shí)。在第2天，對(duì)保存的血液進(jìn)行T-SPOT.7S分析，包括制備PBMC的標(biāo)準(zhǔn)的Ficol1方法。然后使用陽性對(duì)照(PHA)和空白對(duì)照(無抗原)，進(jìn)行T-SP0T.分析以確定SFC計(jì)數(shù)。從測(cè)"^原孔的SFC計(jì)數(shù)中減去空白對(duì)照。如果任何一個(gè)抗原孔含有6個(gè)或者更多斑點(diǎn)而空白對(duì)照含有零個(gè)斑點(diǎn)，則該樣樹于該測(cè)試抗原來iJW皮認(rèn)為是"反應(yīng)性的，，。下J^示新鮮的和稀釋的和保存的血液之間的關(guān)系。顯示了對(duì)于每個(gè)^H^血液樣本，在室溫(RT)下過夜^M^血液(在用AIM-V以1:1稀釋之后)，使用A板、B板和CEF孔的反應(yīng)性和非反應(yīng)性結(jié)果。同時(shí)顯示了供沐總數(shù)的百分比。CEF抗原溶解于AIMV，以5畔/ml的水平存在于該分析中。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果顯示86.1%的臨床一致性(敗比空白對(duì)照多6個(gè)斑點(diǎn)表示^性)。因此，^Ejk液樣本中加入培養(yǎng)基使得在保存24小時(shí)后在PBMC中可測(cè)得陽性SFC應(yīng)答，該應(yīng)答與在采M直接處理的血液中所測(cè)得的應(yīng)答類似。采集并保存24小時(shí)而不添加培養(yǎng)基的血液在可測(cè)得的CMI應(yīng)答中顯示顯著性減小(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例2正向親和選擇在第1天，并JL^靜脈穿刺的2小時(shí)之內(nèi)，對(duì)于九個(gè)皿中的每個(gè)皿，取兩管10mlLithiumH印arinVacutainer管的全j6a文置^^，一管在室溫(18-25°0下暗處，另一管在冰箱(2-8n)中。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)^^靜脈穿刺后的0-2小時(shí)(新鮮的)或者24小時(shí)(保存的)，取3ml全血使用沖洗緩沖液(PBS/0.1。/4BSA/2mMEDTA)以1:1稀釋，與80pl特異性Dynabead^l的濕/^混合，所M^的"^物即111.45(CD4);111.47(CD8);111.49(CD14);和111.43(CD19)以同等比例混合(Invitrogen)。這些"齡"基于是否存在特異性分化(CD)標(biāo)記物對(duì)細(xì)J!feii行正向選擇，所述特異性分化標(biāo)記物為CD4和CD8為T細(xì)胞亞群；CD14(單核細(xì)胞)和CD19(B細(xì)胞和APC)。將該樣^室溫下混合12min，通過將樣本試管置于磁性顆粒聚焦器(magneticparticleconcentrator,MPC:Invitrogen,Paisley,UK)2分鐘來將^分離。棄去上清液，將:用PBS沖洗兩次，然后再次在MPC中分離。然后將孩沐重新懸浮于lmlAIM-V，使用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法對(duì)細(xì)胞進(jìn)^S十?dāng)?shù)。將細(xì)胞佳月AIM-V稀釋至250，000細(xì)胞/100jil。作為平行，，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)^^靜脈穿刺后0-2小時(shí)(新鮮的)或者24小時(shí)WW的)，取5ml全血用實(shí)施例1中所述的標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法直接處理。然后將所有處理的樣本^J^T.SPOT.7S分析試劑盒(見實(shí)施例l)進(jìn)行分析，在分析孔中使用抗原CEF(5蹄/ml)，或者PPD(1pg/ml)，或者PPD/CEF(分別為1蹄/ml和5蹄/ml),它們均不在T-SPOT.TB試劑盒中提供；PPD(產(chǎn)品^R^馬RT23)從StatensSerumInstitut(Copenhagen,Denmark)|yf;對(duì)于CEF,參見實(shí)施例1。PPD和CEF分別用于識(shí)別CD4+和CD8+T細(xì)胞。下表#了所有供本的結(jié)果的平均值，顯示了由ELISPOT測(cè)得的選自新鮮的或者M(jìn)的血液的細(xì)胞的SFC計(jì)數(shù)，該分析佳月CD4、CD8、CD14和CD19綴合的*，并與僅使用Ficoll的分析相對(duì)照。在室溫*24小時(shí)并用M選擇的血液的結(jié)果與"新鮮M"樣本的結(jié)^目當(dāng)，并且比"只^吏用Ficoll"的樣本以及"只佳月Ficoll"和在4X:保存的結(jié)果^"好。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>假定只用Ficoll處理的"新鮮"樣本在ELISPOT分析中產(chǎn)生100%的SFC計(jì)數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。上面三4于顯示平均SFC計(jì)數(shù)，下面三行顯示標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例3負(fù)向親和選捧從4個(gè)供體中的每一個(gè)，在靜脈穿刺后立即采集兩個(gè)10mlLithiumHeparinVacutainer管全血，時(shí)間跨度1個(gè)月。對(duì)于每個(gè)供體的一個(gè)樣本，使用MACSi抗CD15/^(MiltenyiBiotech,BergischGladbach，Germany)進(jìn)行負(fù)向選擇步驟。^MM^)前完全重新懸浮，以確保均勻地*。將400nl^M^入15ml錐管中的4ml全血中。將該試管在室溫下佳月MACSimix(MiltenyiBiotech)試管旋轉(zhuǎn)器以中等ii^(8rpm)溫育15分鐘。將試管置于MACSiMag分離器(MiltenyiBiotech)中2分鐘，以使M粘附于試管壁。將試管留M場(chǎng)中，用移液管移去上清液，置于新試管中。含有上清液的試管重新置于MACSiMag分離器中2分鐘，以使所有殘留的微珠粘附于試管壁上。將試管留在磁場(chǎng)中，將上清液轉(zhuǎn)移至50ml錐管中。加入16ml新制備的1X紅細(xì)胞(RBC)自緩沖液(由10X自緩沖液稀釋而制備1.55MNH4C1，lOOmMKHC03，lOmMEDTA),將試管在室溫溫育5分鐘。將樣本在300xg離心10分鐘。將沉淀的細(xì)胞用^J^緩沖液(5ml)沖洗兩次，每次在300xg下離心5分鐘。將細(xì)胞用RPMI沖洗一次，在lmlAIM-V中稀釋，以供用于ELISP0T分析。作為本方法的平行#，^^I每個(gè)餘沐的第二個(gè)樣本，將5ml全血通過實(shí)施例1中所述的標(biāo)準(zhǔn)的Ficol1方法處理。然后將純化的PBMC樣本在如實(shí)施例1中所述的T.SPOT.7S分析中進(jìn)行分析，分析中將CEF(5叫/ml)用于供體l、2和4樣本作為抗原；A板和B板抗原(33畔/ml)用于*體3樣本。^J1負(fù)向選擇方^^J)MACSi抗CD15^i^制備的PBMC所獲得的SFC計(jì)數(shù)(如下表所示)顯示了與^^1聚糖>^#度制備的PBMC的高度的等價(jià)性。該基于抗體的PBMC分離方法被證實(shí)在技術(shù)上是可行的，在T-SPOT.M分析中產(chǎn)生高度可重現(xiàn)的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(N.B,為脅3和4，(-)孑L^示沒有^^;(+)孑A示存在PHA(5貼/ml)實(shí)施例4負(fù)向親和選擇ii-f亍兩項(xiàng)分開的實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)^^I從一組15或11個(gè)儉本匯集的全血。對(duì)于每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)a)在第l天，在靜脈穿刺之后立即將一個(gè)10mlLithiumH印arinVacutainer管的從每個(gè)供沐匯集的全jM艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法(見實(shí)施例l)進(jìn)行處理。^^l臺(tái)盼藍(lán)染色排除法對(duì)存活的PBMC進(jìn)^i十?dāng)?shù)。將細(xì)胞佳月細(xì)I^養(yǎng)基(AIM-V)稀釋至250，000細(xì)胞/100b)將剩余的血液以未稀釋的狀態(tài)、在暗處、在2-8。C的水箱中或者在室溫(18-25。C)保存24小時(shí)；c)在第2天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法對(duì)保存的血液樣4^ii行處理以制備PBMC，如上所述(見本實(shí)施例的第一勵(lì)對(duì)存活的細(xì)胞進(jìn)^i十?dāng)?shù)^l釋。在每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中處理的平行樣本中，對(duì)于每個(gè)餘沐，在第l天(新鮮的)和第2天(^#的)，將4.5ml全jkip入到15ml離心管中，然后將225jilRosetteSep(StemCell，Vancouver,BC，Canada)加入^爭(zhēng)個(gè)管中，以4吏用含有抗CD66b和血型糖蛋白A的四聚體復(fù)絲使RBC和粒細(xì)胞結(jié)合。將樣錄輕^^，置于室溫下溫育20M。然后將樣本^j^RPMI以1:1稀釋，標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法(見實(shí)施例1)將PBMC從除去粒細(xì)胞的細(xì)胞中分離，從而將RBC和粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞和APC分離。然后根據(jù)試劑盒隨附的廠商說明書，對(duì)淋巴細(xì)#APC進(jìn)行沖^fe^處理-見實(shí)施例1。結(jié)果在下面顯示。在進(jìn)行的兩項(xiàng)分開的實(shí)驗(yàn)中，在分析中一項(xiàng)使用CEF(5蹄/ml)作為抗原，另一項(xiàng)使用PPD(l畔/ml)。Ji^:在4t:和室溫以Ficoll和RosetteS印處理的CEF誘導(dǎo)的SFC計(jì)數(shù)(15個(gè)儉f^的平均值)。下表在4。C和室溫以Ficoll和RosetteS印處理的PPDi秀導(dǎo)的SFC計(jì)數(shù)(ll個(gè)儉沐的平均值)。結(jié)a明，在4匸保存、然后以抗粒細(xì)胞抗體處理、接著用Ficoll純化PBMC獲得的樣本與標(biāo)準(zhǔn)的"新鮮"樣本是等價(jià)的，同時(shí)其SFC計(jì)數(shù)高于在室溫下保存然后以抗粒細(xì)胞抗體處理的樣本。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n=ll個(gè)供體，32個(gè)重復(fù)實(shí)施例5-過濾在靜脈穿刺后T0和T24小時(shí)研究佳JI反向沖洗白細(xì)胞濾膜(PALLMedical)的可行性以絲該膜上捕獲的細(xì)胞的穩(wěn)定性。將捕獲的細(xì)絲該膜上絲，一個(gè)糾的併存在冰箱(2-81C)中，另一個(gè)儉沐的絲在室溫(18-251C)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和溫度,在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Ficol1PBMC分離方法的同時(shí)進(jìn)^S亥膜分離方法。該膜需要按照步驟1-3(見下幻進(jìn)行*,然后對(duì)其^適當(dāng)?shù)腲MNH^和期限。然后將膜^#裝置從保存區(qū)域移除，并^M目關(guān)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行4-7(見下文)。將Ficoll對(duì)照##樣本在室溫、暗處存放，用AIMV細(xì)l&^養(yǎng)基以1:1稀釋，直到需要通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll分離方法進(jìn)行處理。膜處理過程如下所述步驟1-3包括佳冗轉(zhuǎn)移注射器將10ml沖洗緩沖液1通過該膜過濾至廢物瓶中。將10ml全*本與50ml沖洗緩沖液1先混合，然后使用轉(zhuǎn)移注射器通過LK4膜過濾至廢物瓶中。使用#^多注射器，將50ml冷卻的沖洗緩沖液1通過LK4膜過濾至廢物瓶中。步驟4-7包括立即或者在24小時(shí)后(根據(jù)時(shí)間點(diǎn))將濾膜倒置。使用反向沖洗注射器，將50ml冷卻的移除緩沖液l反向通過該膜過濾到50mlFalcon管中。將細(xì)胞懸液以2000rpm在室溫下離心5min，然后重懸于10mlAIMV中。將細(xì)胞懸液再次以2000rpm在室溫下離心5min,然后重懸于lmlAIMV培養(yǎng)基中，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll分離方法計(jì)數(shù)。(沖洗緩沖液l:500mlAIMV培養(yǎng)基，以20mMHEPES和1%[w/v]DextranT40緩沖)(移除緩沖液1:500mlAIMV培養(yǎng)基，以20mMHEPES和0.1%[w/v]DextranT40緩沖)。然后，如實(shí)施例l所述，同時(shí)根據(jù)每個(gè)試劑盒附隨的廠商指導(dǎo)說明，進(jìn)行T-SPOT.7S分析。下表記載了該研究中進(jìn)行的T-SPOT.7S，結(jié)果的總結(jié)。顯示了與膜實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和溫^L有關(guān)的CEF斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的對(duì)比。這是針對(duì)膜性能與在同一天進(jìn)行的相關(guān)Ficoll對(duì)照的關(guān)系以及它們?cè)赥O的關(guān)系進(jìn)行的。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>^MJi^中可以看出，用于新鮮全血、在T0和T24^#在2-8匸和18-25。C(室溫)的膜所提供的PBMC在用于ELISPOT分析時(shí)可產(chǎn)生足夠的CEF信號(hào)。在ii^已經(jīng)證實(shí)了^^反向沖洗濾膜條的PBMC能夠在ELISPOT分析中誘導(dǎo)應(yīng)答。實(shí)施例6-負(fù)向親和選~^前的##時(shí)間使用來自15個(gè)儉體的^r—個(gè)的全i^羊本，進(jìn)行兩項(xiàng)M的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)a)在第1天，在靜脈穿刺后立即將一個(gè)10mlLithiumH印arinVacutainer瓶的來自每個(gè)供體的全i^艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法進(jìn)行處理("新鮮，，樣本)，以制備PBMC;b)將來自每個(gè)儉休的剩余血液以未稀釋的狀態(tài)保存在暗處，在2-8t:的水箱中(保存的樣本)保存不同時(shí)間(16到72小時(shí))；c)在第2天，#^存的樣本如實(shí)施例4所述用RosetteS印(StemCell，Vancouver,BC，Canada)溫育，然后才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll方法進(jìn)行處理，以制備PBMC。然后對(duì)PBMC進(jìn)^i十?dāng)?shù)和稀釋，將樣擬艮據(jù)實(shí)施例4進(jìn)行處理，除了在進(jìn)行的兩項(xiàng)分開的實(shí)驗(yàn)中，一項(xiàng)使用CEF(5pg/ml)作為抗原，另一項(xiàng)在分析中使用CEF/PPD(分別為5jig/ml和1蹄/ml)。下面給出的結(jié)果^^了，對(duì)于所有個(gè)體##:#本，在4捐CEF抗原(n=10)或者使用CEF和PPD兩種抗原(n-5)經(jīng)過不同的處理M后，所記錄的累積SFC計(jì)數(shù)，該計(jì)^bl^于^—處理樣本的三次單獨(dú)ELISP0T分析結(jié)果的平均值的總和。這些數(shù)據(jù)表明，在2-8"C保存了16至24小時(shí)之間的樣本可隨后在用Ficoll處理之前用抗4立細(xì)胞抗體"穩(wěn)定化"，而斜目同的純化^Ht^^^更長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致ELISP0T分析中的SFC計(jì)it逐漸減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>當(dāng)樣本在室溫下保存了長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)，然后被"穩(wěn)定化"并用Ficoll處理時(shí)，獲得了類似的結(jié)果。權(quán)利要求1.一種保存和純化來自全血樣本的細(xì)胞的方法，包括在純化細(xì)胞之前和/或之后保存該樣本至少6小時(shí)，以及純化一群淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞以供在細(xì)胞介導(dǎo)免疫分析(CMI分析)中使用，所述純化通過一種引入正向或負(fù)向親和選擇步驟的方法來進(jìn)行。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣^M^保存至少IO小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述樣^^皮M至少12小時(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述樣^^皮保存12至36小時(shí)之間、12至48小時(shí)或者24至48小時(shí)。5.根據(jù)上i^K利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣4^皮*在2-8。C。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣4^皮*在18-25"C。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述純化方法包括負(fù)向親和選擇步驟以除去粒細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中，所述方法包括使該樣本與包括抗CD66b和血型糖蛋白A抗體的抗體制劑相接觸，以使紅細(xì)^粒細(xì)胞疑集，并且通過離心>^^斤述制劑中除去所述紅細(xì)#粒細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述粒細(xì)胞的除去是通過使所述樣本與包括抗CD15配體的固體支持物相接觸以從該樣本中除去CD15+細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述固體支持物包括#,并且其中，該方法包括使該樣本與該^M目接觸以使CD15+細(xì)胞與該^K結(jié)合，以及從該樣本中分離結(jié)合有CD15+細(xì)胞的^K。11.根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，該樣本中的紅細(xì)Jf&it過裂解或過濾除去。12.根據(jù)上it^L利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述純化導(dǎo)致該樣本中T細(xì)胞對(duì)總細(xì)胞的比例和抗原呈遞細(xì)胞對(duì)總細(xì)胞的比例均升高；和/或其中，該樣^4保存或者純化或者在CMI分析中佳月之前的任何時(shí)間都不被冷凍。13.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，它包括對(duì)所述細(xì)胞的正向親和選擇步驟，其中任選地，該親和選擇步^it擇所有類型的T細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述方法包括將所述樣本與附著有配體的固體支持物接觸，從而分離淋巴細(xì)^抗原呈遞細(xì)胞制劑，其中所述配體可結(jié)合存在于所逸林巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的表面的細(xì)J!fe^面蛋白。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述固體支持物包括抗CD4、抗CD8、抗CD19和抗CD14配體中的一種或多種，以便將CD4+、CD8+、CD19+和/或CD14+細(xì)JJ&^全j6M^本中分離。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中，在用于分析之前，將所述淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞制劑從該固體支持物上分離。17.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中，所逸林巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞制劑被保留在所述固體支持物Ji^分析中^fM。18.根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述固體支持物包括19.才艮據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中，每個(gè)所述的^Ui結(jié)合有一個(gè)抗CD4、抗CD8和抗CD19g己體。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，每個(gè)>#^上結(jié)合有抗CD4、抗CD8或抗CD19中的一種或多種，并JL^斤ii^Ma^在"^，以4吏該固體支持物能夠結(jié)合CD4+、CD8+和CD19+細(xì)胞。21.—種處理和絲全械本的方法，包括使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋所述全jM羊本；并且將處理過的全jfi^羊本保存至少6小時(shí)，其中，在*之后，可獲得一群淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞以供在細(xì)胞介導(dǎo)免疫分析(CMI分析)中賴。22.才艮據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括在#之后，A^斤述全jk4f23.根據(jù)權(quán)利要求21或22;斤述的方法，其中，)斤述全JM^本使用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基以l:l的比例辨f釋。24.根據(jù)權(quán)利要求21、22或23所述的方法，其中，所述的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基為AIM-V。25.—種進(jìn)行ELISP0T分析的方法，包括##權(quán)利要求1至20或22中任一項(xiàng)所述的方法來^#4^62##純化一群淋巴細(xì)#抗原呈遞細(xì)胞，以;S^ELISP0T分析中^^1該淋巴細(xì)#抗原呈遞細(xì)胞制劑。26.—種在ELISP0T分析中,來自全血的、分離的T細(xì)胞的肽特異性細(xì)胞因子應(yīng)答的方法，包括^^正向或負(fù)向親和選擇A^斤述全J6^本中分離一群包括T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中-T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞群通it^利要求7至26中4壬一項(xiàng)限定的方法從全血中分離；和/或-其中，在進(jìn)行親和選擇之前，所述樣本保存至少10小時(shí)、至少12小時(shí)，或者在12至36小時(shí)之間、12至48小時(shí)之間或者24至48小時(shí)之間；和/或-其中，在進(jìn)行親和選擇之前，所述樣本M在2-8t:之間或者18-25'C之間。28.—種制備適用于ELISPOT分析的淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中，所述方法包^it過過濾除去紅細(xì)胞,其中所述方'^fii^包括使所述全血樣^it過一個(gè)過濾器，允許紅細(xì)胞穿過該過濾器，151^從該過濾器收集淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中反向沖J5^斤述it^慮器以回Jl^斤ii^巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞。30.根據(jù)上a利要求中任一項(xiàng)所述的方法，該方法在來自人體的樣本上進(jìn)行，任選地該樣本在CMI分析中使用以診斷疾病。31.—種用于實(shí);^K利要求25的方法的試劑盒，包括(i)一種細(xì)胞因子特異性抗體，^i^附著于微滴定板，和(ii)權(quán)利要求9和15中^—項(xiàng)限定的配體/抗體中的一種或多種，<鏈地結(jié)合于一個(gè)固體支持物，和(iii)任選地，實(shí)施M和純化細(xì)胞的方法和/或進(jìn)行ELISP0T分析的說明書。32.—種用于根據(jù)權(quán)利要求1至20、26和27中^~~項(xiàng)來純化一群淋巴細(xì)齡抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，其中，該試劑盒包括(i)權(quán)利要求9和15中P艮定的配體/M中的一種或多種，^i^結(jié)合于一個(gè)固體支持物，和(iiMii^地，用于實(shí)施該純化的說明書。全文摘要一種保存和純化來自全血樣本的細(xì)胞的方法，包括在純化細(xì)胞之前和/或之后保存該樣本至少6小時(shí)，以及純化一群淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞以供在細(xì)胞介導(dǎo)免疫分析(CMI分析)中使用，所述純化通過一種引入正向或負(fù)向親和選擇步驟的方法來進(jìn)行。文檔編號(hào)G01N1/34GK101529221SQ200780037140公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2007年10月5日優(yōu)先權(quán)日2006年10月6日發(fā)明者A·奧基夫,I·杜蘭特,M·班普頓,T·戴申請(qǐng)人:牛津免疫科技有限公司