專利名稱：Light-介導(dǎo)的抗細(xì)胞增殖組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及LTbeta受體激動劑(例如,LIGHT, p30多肽), 以及治療不良的或異4立的細(xì)月包增殖或高度增殖疾病(例如腫瘤、癌 癥、瘤形成(neoplasia)和惡性腫瘤)的方法。本發(fā)明還涉及LIGHT (p3(:)多肽)的形成，該LIGHT (p30多肽)相對天然野生型LIGHT (p30 多肽)改變了親和性，例如對LTbeta受體或HVEM具有增加的或更 大的親和,性或親和力，或?qū)ecoy受體3 (DcR3)具有減少的或更小的結(jié)合親和性或親和力。
技術(shù)背景月中瘤壞死因子超家族成員LIGHT (TNFSF-14)是針對淋巴毒素 -P受體(LTpR)、皰疹病毒侵入介體(HVEM)和decoy受體-3 (DcR3)(在人體內(nèi)由人癌癥細(xì)胞表達(dá)的分子)的配體。膜結(jié)合形式的LIGHT還可調(diào)節(jié)HVEM激活抑制性受體BTLA ( B和T淋巴細(xì)胞 衰)咸子)的肯fe力(Cheung,等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 13218 (2005); Compaan,等人J Biol Chem 280:39553 (2005); Gonzalez, 等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 1116 (2005);以及Sedy，等人， Nat. Immunol. 6:90 (2005))。 LIGHT最-近—皮揭示為介導(dǎo)4元月中瘤應(yīng)答的 細(xì)胞因子。LIGHT通過其結(jié)合LT卩R、 HVEM和DcR3的能力，成為一種 獨(dú)特的免疫治療分子。LT(3受體可調(diào)節(jié)多個能在發(fā)炎的組織和區(qū)域 幫J力纟且織、淋巴纟田月包的基因(Ware， CF, Annu Rev Immunol. 23:787 (2005))。例如，LTpR調(diào)節(jié)如CCL21等多種趨化因子的表達(dá)(Cyster, J. G. Annu Rev Immunol. 23: 127 (2005);和Dejardin,等人，Immunity 17:525 (2002))。CCL21和相關(guān)的趨化因子對于在造血、感染時將原態(tài)(naive)T 淋巴細(xì)胞運(yùn)輸進(jìn)入淋巴組織，或許運(yùn)輸進(jìn)入腫瘤環(huán)境 一 夂常重要。 LT卩R還可用作向T細(xì)胞呈現(xiàn)抗原的淋巴組織中樹突細(xì)胞的重要的 生長調(diào)節(jié)劑(Kabashima，等人，Immunity 22:439 (2005))。 LIGHT與 HVEM在T細(xì)胞上的相互作用提供了 T細(xì)胞激活、擴(kuò)增和分化成 為腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的共刺激信號。DcR3可有效地 免爭LIGHT與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體LT卩R或HVEM的結(jié)合。最近的研 究才艮導(dǎo)了膜結(jié)合的LIGHT抑制HVEM和BTLA之間的結(jié)合 (Cheung,等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 13218 (2005))。因此， LIGI IT的三重功能性使其成為獨(dú)特的增強(qiáng)免疫性的分子。發(fā)明相無述本發(fā)明提供了具有依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體 激動劑的細(xì)胞。在一個實施方式中，該LTbeta受體激動劑包括LIGHT (p30多肽)、LTalphal beta2 、 LTalpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受體杰t體。在另 一實施方式中，LTbeta受體激動劑包含了嵌合蛋白， 該嵌合蛋白的一部分包含與細(xì)胞膜(例如，膜上存在的分子)結(jié)合 的結(jié)合蛋白，例如配體、受體、抗體或抗體子序列。其膜可依附、結(jié)合或偶聯(lián)LTbeta受體激動劑的細(xì)胞包括不良 的、異常的或異位的細(xì)胞，例如高度增殖細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞、 癌癥細(xì)胞、惡性細(xì)胞、新生細(xì)月包和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞)和病原體感染的細(xì) 胞。其膜可依附、結(jié)合或偶聯(lián)LTbeta受體激動劑的細(xì)胞包括真核細(xì) 月包(例如，哺乳動物，如人的纟田胞)，該細(xì)胞可以是死細(xì)胞或活細(xì) 胞。其膜可依附、結(jié)合或偶聯(lián)LTbeta受體激動劑的細(xì)胞還包括表 達(dá)抗原的細(xì)胞。在特定的實施方式中，細(xì)胞表達(dá)選自如下的抗原 腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原，惡性細(xì)胞、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞抗原， 病毒4元原，細(xì)菌^t原，真菌4元原或寄生蟲抗原。在特定的實施方式中，可依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta 受體激動劑并非由細(xì)胞中編碼該LTbeta受體激動劑的核酸表達(dá)得 到。在另一實施方式中，當(dāng)LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式是 依附、結(jié)合或偶l笑至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑時，該LIGHT (p3() 多肽)變體或多形態(tài)形式可從編石馬該LIGHT (p30多肽)變體或多形 態(tài)形式的細(xì)胞核酸表達(dá)得到。在附加的實施方式中，LTbeta受體激動劑^農(nóng)附、結(jié)合或偶耳關(guān)至 存在于細(xì)胞膜上的分子(例如，多肽，如抗體，或者石灰水化合物)。 LTbeta受體激動劑與細(xì)胞膜的依附、結(jié)合或偶聯(lián)可由共價或非共價 鍵介導(dǎo)，例如，通過交耳關(guān)介導(dǎo)。LTbeta受體^L動劑通過如下方式^衣 附、纟吉合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜LTbeta受體激動劑與中間體分子共價或非共價結(jié)合，其中該中間體分子隨后共價或非共1"介結(jié)合至細(xì)月包膜上 的分子。在特定的方面，中間體分子包含第一部分和第二部分，例 如，第一部分為生物素或生物素A'f生物，第二部分為親和素、中性親和素或鏈霉親和素或其書1"生物或-氬基酸變體LTbeta受體漠丈動劑包才舌哺乳動物(例^。，人)形式。LTbeta 受體激動劑可以是全長天然序列，例如LIGHT (p30多肽)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受體抗體的全長序列，或 者其保留了至少部分LTbeta受體激動劑或結(jié)合活性的子序列。在特 定的實施方式中，子序列包含LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: l所示的LIGHT ),可溶形式的LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 2所示的LIGHT )或者包含LIGHTt66 (例如，SEQ ID NO: 2 所示的LIGHT t66 )的LIGHT (p30多肽)的胞外氨基酸序列。LTbeta受體激動劑包括變體和多形態(tài)形式，例如LIGHT (p30 多肽)、I」Todphal beta2 、 LTalpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受體抗體 的變體和多形態(tài)形式，或者其保留了至少部分LTbeta受體激動劑或 結(jié)合活性的變體或多形態(tài)形式的子序列。在特定的實施方式中， LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式相比天然的野生型LIGHT (p30 多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )對DcR3 (Decoy受體3)的親和性或 親和力減少或較低，LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式相比天然 的野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )對LT卩R或 HVEM的親和性或親和力更高或增加；且LIGHT (p30多肽)變體和 多形態(tài)形式相比天然的野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )對LT卩R或HVEM的親和性或親和力更高或增加并.對DcR3 (Decoy受體3)的親和性或親和力減少或4K氐。在更具體的實施方式 中，LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式包含了選自SEQIDNOs:3 至10任意 一 個的氨基酸序列。本發(fā)明還^是供了促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加針對高度增殖細(xì)胞、 月中瘤纟田胞、癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、或病原體感染細(xì)月包的免疫性的方 法。在一個實施方式中，該方法包括向?qū)ο笫┯靡欢康木哂幸栏?、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，其中該LTbeta 受體激動劑可有效促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加該對象4十對高度增殖細(xì) 胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的免疫性。本發(fā)明還提供了治療對象的不良的或是異常的高度增殖細(xì)胞、 腫瘤細(xì)月包、癌細(xì)胞、新生細(xì)月包或轉(zhuǎn)-移性細(xì)月包、或病原體感染的細(xì) 月包的方法。在一個實施方式中，該方法包4舌向?qū)ο笠欢康木哂衈f衣 附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，其中該 LTbeta受體激動劑可有效治療對象的不良的或是異常的高度增殖 細(xì)月包、月中瘤纟田月包、癌細(xì)月包、新生細(xì)月包或壽爭移性細(xì)月包、或病原體感 染的細(xì)月包。適用于該方法的細(xì)胞包括其中的受體激動劑為LIGHT (p30多 肽)、LIGHT (p30多肽)嵌合體、LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形 式、Ltalphalbeta2、 LTodpha2 betal 、 Ltbeta以及Ltbeta受體4元體或 抗體子序列的細(xì)胞。膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的 細(xì)胞包括LTbeta受體激動劑不由細(xì)月包內(nèi)核酸表達(dá)得到的細(xì)月包。對于 1」GHT (p3()多肽)變體或多形態(tài)形式是依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜 的細(xì)胞，該LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式可^人編碼該LIGHT (p3()多肽)變體或多形態(tài)形式的細(xì)胞核酸表達(dá)得到。細(xì)胞包括真核 細(xì)月包(例如，哺乳動物，例如人的細(xì)月包)，該細(xì)月包可以是死纟田月包或 活纟田月包。適用于該方法的I....Tbeta受體激動劑包括UGHT (p30多肽)、 LIGHT (p3()多肽)嵌合體、LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式、 Llalphalbeta2、 LTalpha2 betal 、 Ltbeta和Ltbeta受體抗體，保留至少部分LTbeta受體激動劑或結(jié)合活性的其全長和子序列、變體或 多形態(tài)形式(例如，全長天然LIGHT (p30多肽)，其變體和多形態(tài) 形式和子序列)。
適用于該方法的目標(biāo)對象包括需要該種治療的對象，例如具有 或容易具有能夠影響或牽涉任意區(qū)域、器官、組織或生物系統(tǒng)(例 如造血細(xì)胞、腦、皮膚、鼻咽、頭、頸、肺、曱狀腺、腎、肝、胰、 胃、腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、卵巢、子宮、乳腺、前列腺、骨、陰 道或陰莖)的不良或異常高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)/l包、惡性 細(xì)胞、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染性細(xì)胞的對象。
該方法包4舌減少或降^氐該高度增殖細(xì)/泡、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、 新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖或數(shù)量， 或者抑制或防止該高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)胞、 轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染的細(xì)胞的數(shù)量或轉(zhuǎn)移的增加，或者穩(wěn)定該 高度增殖細(xì)月包、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包或病原 體感染的細(xì)/泡的數(shù)量。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了相對天然野生型LIGHT(30多肽)(例如， SEQ ID NO: 1所示的LIGHT(30多肽)),對LTbeta受體或HVEM 具有增加的或更大的親和性或親和力，或?qū)ecoy受體3 (DcR3) 具有減少的或更'J、的結(jié)合親和性或親和力的分離和純化的LIGHT (p3(:)多肽)-氮基酸序列或其子序列。在特定的實施方式中，LIGHT (p30多肽)氨基酸序列包含SEQ ID NOs:3至10中任意一個，或其 子序歹。。
本發(fā)明進(jìn)一步4是供了編碼相對天然野生型LIGHT(30多肽)(例 如,SEQ ID NO: 1所示的LIGHT(30多肽)),對LTbeta受體或HVEM
具有-增加的或更大的親和性或親和力，或?qū)ecoy受體3 (DcR3)具有減少的或更小的結(jié)合親和性或親和力的LIGHT (p30多肽)氨基 酸序列或其子序列的分離和純化的LIGHT (p30多肽)核酸。在特定 的實施方式中，4亥酉臾編石馬選自SEQIDNOs:3至10中4壬意一個的序 列，或其子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了與選自SEQ ID NOs:3至10中任意一個的 LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列雜交或互補(bǔ)，Y旦不與天然 野生型L1GHT(30多肽)序列(例如，SEQ ID NO: 1 )雜交或互補(bǔ)
的斗亥酉臾。。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了包含表達(dá)LIGHT (p30多肽)氨基酸序 列，例i。變4本和多形態(tài)形式的宿主細(xì)月包(例如，豐^f匕細(xì)月包)的栽體 (例如，表達(dá)載體)。在特定的實施方式中，核酸編碼選自SEQ ID N(:)s:3至U)中任意一個的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序 列，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)選自SEQ ID NOs:3至10中任意一個的LIGHT (p3()多肽)-氮基酸序列。


圖1A-IB.通ii^w LIGHT抑制腫瘤生長。(A)向每個樣本4或 5只C57B1/6(B6)小鼠的組以7.5 x 105細(xì)胞/小鼠的量皮下注射以空
載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的EL4(EL4-LIGHT)。在細(xì)胞注射16天后以卡4甘測量同系 基因B6小鼠中的EL4和EL4-L1GHT腫瘤的生長。EL4-注射的小 鼠快速形成了明顯的腫瘤，而EL4-L1G1-1T注射組的腫瘤保持在很 小或不可測得的狀態(tài)。(B)同時向?qū)φ蘸蜏y試組皮下注射2.5 x
1()5纟田胞/小鼠的EL4-V纟田胞。向測試組的每只小鼠隨后注射 EL4-LIGHT細(xì)胞(2.5 x 105)。采用(A)中的方法測量腫瘤生長。 F丄4-LIGHT細(xì)胞強(qiáng)烈抑制親代EL4細(xì)胞的腫瘤生長。
EL4細(xì)胞和用編碼人LIGHT的逆4爭錄病毒圖2A-2B. LIGHT同工型對LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答的作
用。(A)對每組皮下注射2.5 x 105細(xì)胞/小鼠EL4-LIGHTATM的或 E;L4-LIGHTt66。在17天后測量腫瘤生長。(B)向每只小鼠注射、混 合的EL4-LIGHT (1.25 x 105細(xì)胞)和EL4-LIGHTt66 (1.25 x 105細(xì) 月包)。向一個單獨(dú)的組注射EL4-LIGHT (2.5 x 105細(xì)月包)作為對照。注 意到的EL4-LIGHT-t66存在強(qiáng)烈抑制表達(dá)膜LIGHT的細(xì)胞介導(dǎo)的 4元月中瘤應(yīng)答。
圖3A_3E.基于生物素的蛋白固定化系統(tǒng)。(A)天然LIGHT
(橫跨膜雙層)和可溶性LIGHT固定化的示意圖。代表性的細(xì)胞 表面分子(蛋白)以灰色陰影顯示。帶有接頭的生物素衍生物顯示 為義人該分子延伸的單才艮灰線。Neutravidin (中性親和素)四聚體顯 示為圓柱體。可溶性人LIGHT (LIGHTt66)顯示為三聚體。(B) LIGHT修飾細(xì)胞的組裝的示意圖。目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞表面采用生 物素衍生物進(jìn)行修飾，并用PBS洗滌去除游離的生物素。用1%福 爾馬林固定該細(xì)胞，以含于PBS的中性親和素(Neutmvidin) (10 !ig/ml)孵育30分鐘，隨后洗滌去除游離的中性親和素。然后將細(xì)胞 與生物素化的LIGHT (1昭/ml)孵育45分鐘，并洗滌去除未結(jié)合的 LIGHT。 (C)對LIGHT-修飾的EL4細(xì)胞上的細(xì)胞表面LIGHT的染 色。將EL4-NA-LIGHT (藍(lán)纟《)和EL4-NA (灰色陰影)纟田胞與人 抗hLfGHT重組體"Ornniclone"抗體(5 fig/ml)在結(jié)合緩沖液(PBS，帶 有2% FCS)中孵育60分鐘，洗滌并用PE結(jié)合的山羊抗人l:gG (Southern Bk)tech)染色，通過流式細(xì)/I包4義進(jìn)行熒光^全測。以表達(dá) El..4-LI(:]HT (綠線)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞和EL4-V細(xì)胞(灰色 陰影)被用作對照。(D)固定化效率。測定了(C)中的EL4-LIGHT 和EL4-NA-LIGHT之間表面LIGHT染色的比平均熒光強(qiáng)度(MF!)。 (E)小鼠HVEM與EL4-NA-LIGHT細(xì)胞的結(jié)合。將細(xì)胞與小鼠 HVEM-Fc (20嗎/ml)在結(jié)合緩沖液(PBS,帶有2% FCS)中孵育60分鐘，洗滌并用PE結(jié)合的山羊抗人IgG (Southern Biotech)染色，并 通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(線)。親代EL4-NA細(xì)胞被用作陰 性對照(灰色陰影)。
圖4A-4C.以LIGHT修^飾的癌癥細(xì)胞i^ft^先免疫對腫瘤生 長的抑制。(A)依賴型腫瘤疫苗4妾種的^:計示意圖。將福爾馬林固 定的中性親和素修飾的EL4 (EL4-NA)細(xì)胞(4 xl()6)或人LIGHT-中性 親和素^f奮飾的EL4 (EL4-:NA-UGHT)細(xì)胞皮下注射至B6小鼠(n=4 或5小鼠)。14天后，用活的EL4細(xì)胞(0.5 x 106/小鼠)攻擊這些 小鼠。在17天后測量腫瘤生長。(B)將福爾馬沖木固定的人 UGHT-中性親和素修飾的EL4 (EL4-NA-LIGHT)細(xì)胞(4 xl()6)或中 性親和素修飾的EL4 (EL4-NA)細(xì)胞(4 xlO"皮下(SC)注射至B6小鼠 (n-:5小鼠/l且)。14天后，Z人每《且的小鼠采集血清，并通過流式 細(xì)胞儀測定結(jié)合至未修飾EL4細(xì)胞的小鼠抗體活性。將未修飾的 EL4細(xì)胞與含于40 fil結(jié)合緩沖液的血清(1:5稀釋)孵育60分鐘， 洗滌，并以山羊抗-小鼠IgG-PE二級抗體染色，通過流式細(xì)胞儀檢 測熒光。預(yù)先注射EL4-NA細(xì)胞的小鼠不生成可測的抗-EL4抗體活 性。然而，在4只用EL4-NA-LIGHT細(xì)月包預(yù)先免疫的小鼠中的3 只測得了抗-EL4抗體應(yīng)答。(C)預(yù)先注射EL4-NA-L1GHT細(xì)胞對攻 擊的EL4腫瘤生長的作用。
圖5A-5B.以LIGHT 4務(wù)飾的癌癥細(xì)胞抑制原4戈腫瘤生長。(A)
研究設(shè)計示意圖。將活的EL4纟田胞(0.5 xl 06)皮下(SC)接種至B6 小鼠(n爿9)，然后使腫瘤生長至觀察到明顯增厚(通常為6天)。 在第6天將福爾馬林固定的LIGHT修飾EL4細(xì)胞(0.5 xl0"注射至 腫瘤體上。該福爾馬林固定的中性親和素修飾的EL4細(xì)胞,皮用作對 照,，(B)用EL4-NA-LIGHT細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種對于形成的EL4腫 瘤的作用。圖6A-6B.對LlGHT-介導(dǎo)的抗肺瘤應(yīng)答的受體的需求。將
EL4-LIGHT細(xì)胞皮下注射至缺乏(A) /n^w、(B)/^r的小鼠(2.5 x 105 細(xì)月包/小鼠)。缺乏LT卩R的小鼠不能排斥EL4-LIGHT腫瘤。
圖7A-7B.在腫瘤環(huán)境中用EL4-LIGHT細(xì)胞"i秀導(dǎo)CCL21。(A)
在腫瘤環(huán)境中進(jìn)行CCL21分析的研究設(shè)計的示意圖。將EL4-V 或EL4-LIGHT細(xì)胞皮下注射至B6小鼠》在10天后采集脾臟進(jìn)行 趨化因子CCL21的RT-PCR分析。(B) 相比用EL4-V對照注射 的d、鼠，在用EL4-LIGHT注射的小鼠中腫瘤滲透/l年臟中的CCL21 表達(dá)提高了 2.5倍。
圖8A-8D.對LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答的配體的需求。將
EL4-LIGHT細(xì)胞(2.5 x 105細(xì)胞/小鼠)皮下注射至(A)///2^和攀 (B)/〃w、 (C)"/ 或(D)/to遺傳缺陷型小鼠中。在16-39天后測量月中 瘤生長。LTP—A(C)缺陷小鼠不能排斥EL4-LIGHT腫瘤，顯示LTp 參與LJGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答。
圖9A-9B.在T和B細(xì)胞中的LTp表ii^寸于LIGHT-介導(dǎo)的抗
腫瘤應(yīng)答是必需的。將EL4-LIGHT纟田月包(2.5 x 10"皮下注射至在(A) T細(xì)胞(T-LTP——)或(B) B細(xì)胞(B-LTpl中條件性刪除/0的小鼠。在 2i-22天后測量腫瘤生長。在T或B細(xì)胞區(qū)域缺失LT卩的小鼠不能 夠排斥EL4-LIGHT腫瘤，顯示LT(3在T或B細(xì)胞區(qū)域的表達(dá)是必 需的，但對于LlGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答而言并不足夠。
圖10A-10E. LTpR-Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc對人LIGHT變
體形式的親和性。(A)將穩(wěn)定表達(dá)LIGHT (32S-214E)的主要形式的 t:L4細(xì)胞與舍于i00 pl結(jié)合緩沖液中的梯度數(shù)量的LT(3R-Fc (3 ng 至50 jLig/mi)孵育60分鐘，洗滌并以PE結(jié)合的山羊抗-人IgG染色，
通過流失細(xì)胞系檢測熒光。通過從實驗組減去親代EL4細(xì)胞(陰性對照)的背景熒光染色獲得比平均熒光強(qiáng)度(MFI)。平衡結(jié)合常數(shù)
可通過以Prism GmphPad (v4; San Diego, USA)(左圖)和雙倒凄t 圖(右圖)進(jìn)行非線性回歸分析計算得到。LIGHT變體32S-214K (B) 和32L-214E與LTPR-Fc的結(jié)合可參照(A)中方法沖企-驗。(D)參照 (A)中的方法采用流式細(xì)胞儀檢驗穩(wěn)定表達(dá)LIGHT各種多形態(tài)形式
(32S-214E, 32S-214K和32L-214E)的EL4纟田月包只于LT卩R陽Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc的結(jié)合親和力。(E) 參照(A)中的方法采用 流式細(xì)胞儀才僉驗穩(wěn)定表達(dá)LIGHT多形態(tài)形式的各種組合
(32S-214E/32S-214K、 32S-214E/32L-214E和32L-214E/32S-214K ) 的EL4纟田月包對LT(3R-Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc的結(jié)合親和力。
圖11A-UB.在DcR3存在下LTpR-Fc與表達(dá)LIGHT的EL4
細(xì)胞的竟?fàn)幮越Y(jié)合測定。(A)將梯度濃度的DcR3-Fc與表達(dá)各種 I,IGHT多形態(tài)形式(32S-214E, 32S-214K, 32L-214E/32S-214K)的
EL4細(xì)胞在恒定濃度的LTpR-Fc存在下進(jìn)行將育。采用抗-LT'pR單 克隆抗體(BD-A8)檢測與表達(dá)LIGHT的EL4細(xì)胞結(jié)合的特定 LTpR-Fc。 (B) 采用Prism GraphPad (v4; San Diego, USA)經(jīng)非線 性回歸分析計算值IC50。
圖12A-12B.基于生物素的蛋白固定化系統(tǒng)。(A)天然LIGIIT 和可溶性L1GHTL固定化的示意圖。天然LIGHT三聚體包含顯示 在左側(cè)的跨膜區(qū)?？扇苄訪IGHT的固定化顯示在右側(cè)。代表性的 細(xì)胞表面分子(蛋白)以灰色陰影顯示。帶有接頭的生物素衍生物 顯示為從該分子延伸的單沖艮灰線。NeutraviciinTM四聚體顯示為圓柱 體 可溶性人LIGHT (LIGHTt66)顯示為三聚體。(B) LIGHT修飾 細(xì)胞的組裝的示意圖。(B) LIGHT修飾細(xì)胞的組裝的示意圖。目 標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞表面采用生物素衍生物進(jìn)行修飾，并用PBS洗滌去除 游離的生物素。該細(xì)胞以1 %福爾馬林固定。然后將細(xì)胞與 Neiitravidin (10 pg/ml)在PBS中孵育30分鐘，并、;先滌細(xì)月包以去除游離NeutravidinTM。然后將細(xì)胞與生物素化的LIGHT (1 fig/ml)孵育 45分4f ，并洗滌細(xì)力包去除未結(jié)合的LIGHT。
發(fā)明詳述
本發(fā)明至少部分基于經(jīng)過LTbeta受體激動劑修飾的細(xì)胞。特 別地，具有依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑的細(xì)胞。 該種細(xì)胞可用于治療不良的或是異常的細(xì)胞增殖、高度增殖(例如， 高/復(fù)增殖'!"生疾病)、腫瘤、癌癥、4爭移'性和新生以及病原體感染細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，提供了以LTbeta受體激動劑修飾的細(xì)胞，包括 LTbeta受體激動劑被依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的細(xì)胞。LTbeta 受體激動劑包括，例如，LIGHT (p30多肽)、LIGHT (p30多肽)變體 或多形態(tài)形式、LIGHT (p30多肽)嵌合體、Ltalphalbeta2、 LTdpha2 beta:l、 Ltbeta和Ltbeta受體抗體。經(jīng)LTbeta受體激動劑修飾的細(xì) 胞包括不良細(xì)胞或高度增殖細(xì)胞、腫瘤纟田月包、癌癥細(xì)胞、新生細(xì)胞、 轉(zhuǎn)移性細(xì)胞和病原體感染細(xì)胞。以LTbeta受體激動劑《奮飾的細(xì)胞包 括真核細(xì)l包，例如哺乳動物(例如，靈長動物或人)纟田月包，該纟田月包 可以是活細(xì)胞、非活性細(xì)胞或死細(xì)胞。
本發(fā)明還部分基于護(hù)&顯示改變了對受體的親和性和/或親和力 的LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式。該種LIGHT (p30多肽)變 體或多形態(tài)形式相對于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，如SEQ II) NO: 1所示)對受體(例如LTbeta受體、HVEM或DcR3 (Decoy
受體3))具有不同的親和性和/或親和力。
根據(jù)本發(fā)明，提供了據(jù)顯示改變了對受體(例如LTbeta受體、 HVEM或DcR3 (Decoy受體3))的親和性和/或親和力的LIGHT (p3()多肽)變體。在一個實施方式中，LIGHT (p30多肽)變體與SEQ ID NO: 1所示的天然野生型LIGHT (p30多肽)相比顯示出對DcR3 (Decoy 受體3)下降的或是更少的親和性和/或親和力。在另 一 實施方式中， LIGHT (p30多肽)變體與SEQ ID NO: 1所示的天然野生型LIGHT (p30多肽)相比顯示出對LTbeta受體或HVEM增加的或是更高的親 和性和/或親和力。LIGHT (p30多肽)變體包括從天然環(huán)境中分離或 純化的，具有不同于SEQ ID NO: 1的序列的多形態(tài)形式。
在涉及LTbeta受體激動劑時，此處所用的術(shù)語"依附、結(jié)合或 偶聯(lián)"至細(xì)胞膜及其語法變化表示該激動劑結(jié)合至或物理依附至細(xì) 胞膜或細(xì)胞膜上存在的分子(例如，多肽、碳水化合物等)。因此， 例如，由于LTbeta受體激動劑從細(xì)月包中編碼LTbeta受體激動劑的 核酸的表達(dá)，依附或存在于細(xì)胞膜上的LTbeta受體激動劑并非在細(xì) 胞表面上。LTbeta受體激動劑可依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞(例如高 度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)月包、癌癥細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原 體感染細(xì)胞)的膜上存在的任意分子。LTbeta受體激動劑與細(xì)胞膜 上的分子的結(jié)合可通過共價(例如，交聯(lián))或非共價(例如，配體 -受體，抗體-抗原)鍵介導(dǎo)。結(jié)合LTbeta受體激動劑的細(xì)胞可以是 或表達(dá)選自如下的抗原月中瘤細(xì)胞或癌纟田月包抗原、新生細(xì)月包或轉(zhuǎn)移 性細(xì)月包抗原、病毒抗原、纟田菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。
LTbeta受體激動刑可通過非共價或共價鍵"依附、結(jié)合或偶聯(lián)" 至細(xì)胞膜或細(xì)胞膜上存在的分子。非共價鍵包括氫鍵、離子相互作
用、范德華相互作用以及疏水相互作用。非共價鍵的非限制性范例 為受體—配體、抗體-抗原和酶—底物。共價鍵通常包括電子的共享， 還被稱為化學(xué)鍵。共價鍵.的非限制性范例為酰胺鍵，非天然的和非 酰胺化學(xué)鍵，其它化學(xué)鍵或偶聯(lián)方式包括，例如，碳鏈，例如羧酸， 多碳鏈(例如，二狻酸，如戊二酸，琥礎(chǔ)酸.和己二酸)，戊二醛， N-羥基琥珀酰亞胺酯，雙功能馬來酰亞胺，N,N'-二環(huán)己基石炭二亞胺(DCC)或N，N'-二異丙基碳二亞胺(DCC)。替代酰胺鍵的基團(tuán)包括， 例如，酮亞曱基(例如，《(=0)《1"12-或-(^(=0)-^^),氨基亞甲基 (CH2-NH)，亞乙基,烯烴(CFNCH)，醚(CH2-0)，石危醚(CH2-S),四 哇(CN4-)， 口塞唑，反酰胺(retroamide),石克酰胺，或酉旨(例如，參見 Spatola ('1983)于 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids ， Peptides and Proteins. Vol. 7， pp 267-357， "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY )。
結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜或細(xì)胞膜上存在的分子.中間體分子可以是其 本身共價或非共價結(jié)合至細(xì)胞的膜或細(xì)胞膜上存在的分子。在一個 實施方式中，中間《本分子包含兩個或多個成分，例如第一部分和第 二部分。在特定的方面，第一和第二部分纟皮此結(jié)合或物理相互作用， 例如，第--部分包含生物素或生物素布f生物，而第二部分包含親和 素、中性親和素或《連霉親和素，或其彩f生物或氨基酸變體。LTbeta 受體激動劑結(jié)合至細(xì)胞膜或細(xì)胞膜上的分子，因此包括與可結(jié)合細(xì) 月包月菱上的分子的親和素、中性親和素或4連霉親和素的，或其彩于生物 或氨基酸變體的結(jié)合。該LTbeta受體激動劑或該激動劑依附、結(jié)合 或偶if關(guān)的分子可分別通過共價或非共價結(jié)合至生物素或生物素衍 生物，或親和素、中性親和素或《連霉親和素。
LTbeta受體激動劑包括哺乳動物形式，例如靈長動物和人 LTbeta受體激動劑。該種激動劑包括"氨基酸"、"蛋白"、"多肽"和 "肽"序列。術(shù)語"氨基酸"、"蛋白"、"多肽"和"肽"在此可互換使用， 并指通過酰胺4i共^介連4妻的兩個或多個凄l(xiāng)基酸或"殘.基"，或者同等 的氨基酸序列可通過非天然和非酰胺化學(xué)鍵(包括，例如，與戊二 醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯，雙功能馬來酰亞胺或N,N'-二環(huán)己基碳 二亞胺《DCC)形成的鍵)連接。非酰胺鍵包括，例如，酮亞曱基-氨基亞甲基、烯烴、醚、硫醚等(例如，參見Spatola in Chemistry andBiochemi.stry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Vol 7, pp 267-357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY')。
LTbeta受#^敫動劑、嵌合體和LIGHT (p30多肽)包才舌LTbeta 受體激動劑的全長天然野生型、變體和多形態(tài)形式，例如保留了至 少部分LTbeta受體激動劑或結(jié)合活性的LIGHT (p30多肽)、HVEM 和LIGHT (p30多肽)嵌合體。示范性的LTbeta受體激動劑變體和多 形態(tài)形式包括相對于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO:l )對DcR3 (Decoy受體3)具有降低的或減少的親和性的LIGHT (p30多肽)，相對于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO:l )對LT卩R或HVEM具有增加的或更高的親和性或親和力的 LIGHT (p30多肽)，以及相對于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例 如，SEQ ID NO: 1 )對LT卩R或HVEM具有增加的或更高的親和性 或親和力且對DcR3 (Decoy受體3)具有降低的或減少的親和性的 LIGHT (p30多肽)。LIGHT (p30多肽)的特定非限制性變體或多形態(tài) 形式包括選自SEQ ID NOs 3至10任意一個的氨基酸序列。
K表性的LIGi1T(p30多肽)序列如下所示
全長人LIGHT (氨基酸序列)(SEOIDNO: 1》
MEESWRPSVFWDGG'TDIPFTRLGRSHRRQSCSV,
護(hù)QLHWRIiGEMVTRI^DGPAGSWEQ:LI QERRSHEWPAAHLTGANS S LTGSGGPLLW
DGTRSYFGAFMV為^f潛種誠的扇差凝戎差以厲參i^。 L./C7//.r的/應(yīng)，錯^7試的桌差
發(fā)嫂差* T".好嫂i ^
LIGHT的可溶性形式(AKA: LIGHTt66,氨基酸序列)(SEQ ID NO:
lvsqqspcgratsssrvwwdssflggwhleageevwrvlderlvrlrdgtrsyfg afmv
人LIGHT E214K (氨基酸序列)(SEO ID NO : 3 )
MEESWRPSVFWDG(2TD工PFTR;LGRSHRR(2SCSVARVGLGLKLLLMGAGLAVQGWF
DGTRSYFGAFMV
5'￡'Q //〕 WO: J的位f 2/4丄的-教羞凝'殘'差被》p^^示。
乂、 LIGHT S32L ( -姜、基商臾/f歹l1 ) (SEQ ID NO: 4 )
meeswrpsvfwdg,ipftrlgrshrrqIcsvarvglglllllmgaglavqgwf llglhwrlgemvtrlpdgpagsweqliqerrshevnpaahltganssltgsggpllw
RYPEf
DGTRSYFGAFMV/D M9: 4的位f 32丄的-襲差^嫂差被》"荖貞示。
人LIGHT S9A(在氨基酸位置9上由S突變?yōu)锳,氨基酸序列)(SEQ ID NO:5)
MEESWRPIvFWDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGIjGIAI^LMGAGLAVQGWF IAQL服RLGEKVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPHW
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、S7 C 7" 5的^if 9 J:的桌基^嫂差被》。荖^ ^。
人LIGHT S27A (在氨基酸位置27上由S突變?yōu)锳，氨基酸序列) (SEO II) NO:6)
MEESWRPSVFWDGQTDIPFTOLGRfHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVQGWF ETGLGLAFLRGLSYHDGALWTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTP
DGTRSYFGAFMV
5'￡'( 〃〕yVO, 69丄的Jt羞^.殘'差被'》"^j至示。
人LIGHT S9A & S27A (在氨基酸位置9和27上由S突變?yōu)锳,氨 基g臾/，歹'j ) (SEO 1DNO:7)meeswrplvfvvdgqtdipftrlgrihrrqscsvarvglgii嵐lmgaglavqgwf l:lq:lhwrlgemvtrlpdgpagsweqliqerrshevnpaahltganssltgsggpi^w etqlglaflrglsyhdgalwtkagyyyiyskvqlggvgcplglastithgiiykrtp rypeelellvsqqspcgratsssrvwwdssfxggwhleageewvrvlderlvrlr
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W^/D^a 7的位置9 #口" J:的歲差礙減差被》^老^示。
人LIGHT S9A & S32L (在氨基酸位置9上由S突變?yōu)锳并在位置 32上由S突變?yōu)長，氨基酸序列)(SEQ ID NO:8)
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人LIGHT S27A & S32L (在氨.基酸位置27上由S突變?yōu)锳并在位 ,置32上由S突變?yōu)長,氨基酸序列)(SE0 1DNO:9)
dgtrsyfgafmv/D 9的位f 2/ #口 32丄的-歲羞^嫂差被》 S^示。
人LIGHT S9A & S27A & S32L (在氨基酸位置9和27上由S突變 為A并在位置32上由S突變?yōu)長，氨基酸序列)(SEO ID NO:IO)
MEESWRPgVFWDGQTDIPFTR:LGRgHRR霧SVARVGLG:LLIXLMGAGLAVQGWF
RYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGWHLEAGEEVWRVLDERLVRLR DGTRSYFGAFMV
ZD A^.' 〃9的位置9, 27和32 J:的扇差^戎差被^知荖i示。
LTbeta受體激動劑還包括LTbeta受體激動劑的全長天然野生 型、變體和多形態(tài)形式、LIGHT (p30多肽)、HVEM和LIGHT (p30 多肽)嵌合體。示范性的LTbeta受體激動劑、嵌合體和LIGHT (p30 多肽)的長度包括LTbeta受體激動劑的全長天然野生型、變體和多 形態(tài)形式、LIGHT (p3()多肽)嵌合體、LIGHT (p3(.)多肽)和HVEM, 以及保留了至少部分LTbeta受體激動劑或結(jié)合活性的LTbeta受體 激動劑-LIGHT (p30多肽)嵌合體、LIGHT (p30多肽)和HVEM的 子序列。示范性的LTbeta受體激動劑子序列包括從約5至15， 20 至25， 25至50, 50至100, 100至150, 150至200或200至300 個氨基酸殘基的長度。
在特定的實施方式中，LTbeta受體〖敫動劑、LIGHT (p30多肽) 嵌合體、LIGHT (p30多肽)和HVEM包含約1至10、 10至20、 15 至20、 20至30、 30至40、 40至50、 60至70、 70至80、 80至9(h 90至100或更多個殘基的氨基酸序列或由其組成。特定的非限制性 范例包括結(jié)合并保留至少部分LTbeta受體活性的SEQ ID NOs: 1-10任意一個所示的LTbeta受體激動劑的可溶形式，例如，缺失跨膜結(jié) 構(gòu)域(例如，LIGHT (p30多肽)的胞外氨基酸序列)的激動劑，或 者SEQ ID NO: 2 (UGHTt66)所示的LIGHT (p30多肽)的可溶形式。 其它的特定非限制性范例包4舌結(jié)合LTbeta受體或HVEM、顯示 LTbeta受體J敫動劑活性或與SEQ ID NO: 1相比具有與DcR3的結(jié)合 減少或更低的如SEQ ID NOs:3-10任意一個所示的LIGHT (p30多 肽)變體或多形體的可;容形式。
因此，LTbeta受體激動劑，如LIGHT (p30多肽)、LIGHT (p30 多肽)嵌合體、LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式以及HVEM可
包含一個或多個(2、 3、 4、 5等)保守和非保守替換。"保守替換" 是一個氨基酸被生物、化學(xué)或結(jié)構(gòu)類似的殘基所替換。生物類似表 示該替換與生物活性(例如，激動劑活性)相容。結(jié)構(gòu)類似表示該 氨基酸具有類似長度的側(cè)鏈，如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，或者具 有類似的大小，或者保留了第一、第二或附加結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。化學(xué) 類似.表示該殘基具有相同的電荷或均未親水或疏水。特定的范例包 括《f 4灸用 一個疏水殘基(例如異亮-氤酸、纈-氤酸、亮—氤酸或y蛋氨酸) 替換另 一個疏水殘基，或者用 一個極性殘基替換另 一個極性殘基， 例如用精氨酸替換賴氨酸，谷氨酸替換天冬氨酸，或者用谷氨酰胺 替換天冬酰胺，絲氨酸替蘇氨酸等,，常規(guī)測定可用于確定變體或多 形態(tài)形式是否具有活性，例如，激動劑活性或結(jié)合活性。
特定的范例包括受體激動劑(如LIGHT (p30多肽)變體和多形 態(tài)形式)中一個或多個(例如，1-3、 3-5、 5-10、 10-20或更多)氨
基酸殘基的替換或刪除。變體或多形態(tài)序列通常與參考序列具有 85%、 90%、 95%, 96%、 97%、 98%或更多的一致性。
術(shù)語"一致性"和"同源性"及其語法變化指兩個或多個所指的實 體相同。因此，當(dāng)兩個fl基酸序列為一致時，它們具有相同的氨基酸序列。"一致的范圍、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域"表示兩個或多個所指實體中 的部分相同。因此，當(dāng)一個或多個序列區(qū)域的兩個氨基酸序列一致 或同源時，它們在這些區(qū)域具有一致性。由于在結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)蛋 白之間序列保留數(shù)量的變化，保留功能或活性所需的序列 一致性的 數(shù)量依賴于該蛋白、區(qū)域和該區(qū)域的功能或活性。術(shù)語"互補(bǔ)性"在 指核酸序列時表示參考區(qū)i或具有1.00%互補(bǔ)性，即，顯示了沒有4昔 配的100°/"咸基配對。
兩個序列之間的 一致性程度可通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序 和數(shù)學(xué)算法得以確定。該種計算序列一致性(同源性)百分比的算
法通?？烧f明比較區(qū)域的序列間隙和錯配。例如，BLAST (例如， BLAST 2.0)檢索算法(例如,參見Altschul等人，J. Mol. Biol. 2i5:403 (l990),可乂人NCBI上々>開獲耳又)具有如下示范性;險索參#:: 4昔配2;間隙開口5;間隙延伸2。對于多肽序列比對，BLASTP算 法通常組合使用計分矩陣，例如PAMIOO、 PAM250、 BLOSUM 62 或BLOSUM 50。 FASTA(例如，F(xiàn)ASTA2和FASTA3 )和SSEARCH 序列比對程序同樣用于對一致性程度的定量(Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000); and Smith等人，J. Mol. Biol.47: 195 (1981))。采用基 于Delaunay的拓樸映射的蛋白結(jié)構(gòu)相似性定量程序已被開發(fā) (:Bostick等人，Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (:2003》。
LTbeta受體激動劑如LIGHT (p3()多肽)、LIGHT (p30多肽)嵌 合體、LGI..「r(p:30多肽)變體和多形態(tài)形式以及.i-.1VEM序列可完 全由天然氨基酸或者由合成的、非天然-氮基酸或fL基酸類似物或書亍 生形式所組成。非天然存在的氨基酸序列包括L-氨基酸序列、D-氨基S菱序列和具有I,氨基酸和D-氨基酸混合物的氨基酸序列。在 不同的實施方式中，LTbeta受體激動劑包括替換L-氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸混合物或完全由D-氨基酸殘基組成的序列的一個或
多個D-氨基酸。
氨基酸序列可以是線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其依附、結(jié)合或偶耳關(guān)至不 同的部分(例如，中間體)，形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，經(jīng)修飾 以包含，例如，糖或碳水化合物殘基、磷酸基團(tuán)、脂肪酸、脂質(zhì)， 還形成更高級的多聚體或具有相同或不同氨基酸序列的低聚體，例
如，不同的LTbeta受體激動劑，例如多聚體組合中的LIGHT (p30 多肽)的野生型和變體或多形體。
LTbeta受體激動劑的其它范例包括抗體和抗體片段。"抗體"指 任意單克隆或多克隆免疫J求蛋白分子，例如IgM、 IgG、 IgA、 IgE、 :gD及任意其小類。IgG的示范性小類為IgG,、 IgG2、 IgG3及IgG4。 LTbeta受體激動劑抗體的特定范例包括3C8和4H8(大鼠抗小鼠)， 山羊多克隆抗體和小鼠抗人BDA8抗體。LTbeta受體激動劑抗體的 其它特定范例包括全長人源抗體。
1....Tbeta受體激動劑包括嵌合蛋白，其中具有不同于LTbeta受 體激動劑的部分。換言之，嵌合LTbeta受體激動劑可包含不同于天 然野生型LTbeta受體的部分。特定的范例包括與細(xì)胞膜上存在的抗 體、受體、配體或抗原相結(jié)合的抗原、配體、受體或抗體。其它的 特定范例包括結(jié)合免疫3求蛋白的蛋白A結(jié)構(gòu)域。
月大禾口類月大(peptidomimetics)可采用本4頁i或已4口的方法生萬l和 分離。肽可通過本.領(lǐng)域已知的化學(xué)方法完全或部分合成(例如，參 見Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980) 以、7iBanga, A.K.., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation. Processing and Delivery Systems (.1995) Technomic Publishing Co.， Lancaster, PA),,月太'^成可通過多種固相4支術(shù)實施(例如，參見Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3(1997))，而自動合成可通過如ABI 431A肽合成4義(Perkin Elmer)
根椐生產(chǎn)商說明得以實現(xiàn)。肽和肽才莫擬物還可采用組合方法合成。 合成的殘基和多肽結(jié)合類似物可通過本領(lǐng)域已知的多種步驟和方 〉去-合成(侈寸"i口，.參少1 Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman， 等人(Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY)。修飾的肽可通過化學(xué)修 飾方法生成(例如，參見Belousov，Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Freiikel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995)以及Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994)。
本發(fā)明進(jìn)一步4是供了編碼不同于天然存在LIGHT (p30多肽) (例如，SEQ ID NO: 1 )的LIGHT (p30多月太)變體和多形體及其子 序列的核酸。核酸還提供編碼與天然存在的LIGHT (p30多肽)(例 如，SEQ ID NO: 1 )相比減少了或不顯示可測的與DcR3的結(jié)合， 但保留了至少部分與一種或多種LTbeta受體或HVEM的結(jié)合的 LIGHT (p30多肽)變體、多形態(tài)形式和子序列。核酸進(jìn)一步l是4共了 編.碼與天然存在的LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )相比 與LTbeta受體和HVEM的結(jié)合增加或更高的LIGHT (p30多肽)變 體、多形態(tài)形式和子序列.在部分實施方式中，核酸編碼SEQ ID N(::)s:3-10任意一個，或其子序列。在進(jìn)一步的實施方式中，核酸與 編碼SEQ II) NOs:3-10 ^壬意一個或其子序列的核酸序列互補(bǔ)。
核酸，在此也可稱為基因、多聚核苷酸、核苷酸序列、引物、 寡聚核苷酸或探針，表示天然或修飾的任意長度的汗嘌呤和嘧咬聚 合物，指多核糖核苷酸或多脫氧核糖核普酸或者混合的多核糖-多脫 氣核糖核香酸及其a-異構(gòu)形式。兩個或多個含噪呤和嘧啶聚合物通 常通過磷酸酯鍵或其類似物進(jìn)行連接。這些術(shù)語可互換使用以表示 所有形式的核酸，包4舌脫氣核3f磨核酸(DNA:)和核糖核酸(:RNA)。核 酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈，呈線性或環(huán)狀。核酸包括遺傳DNA、以是剪4妄或未剪4妾的m.RNA、 rRNA、 tRNA或反義。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸類似物和
作為遺傳密碼退化的結(jié)果，核酸包括針對編碼本發(fā)明的LIGHT (p30多肽:)變體和多形態(tài)形式的序列退化的序列。因此，本發(fā)明提 供了編碼不同于天然存在LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 ) 的LIGHT (p30多月太)變體和多形體及其子序列的核酸。
核酸可通過多種已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆和化學(xué)合成方法生成，并可通 過定點(diǎn)突變或本領(lǐng)域^支術(shù)人員已知的其它重組^支術(shù)-進(jìn)行有意的修 飾。多聚核苷酸的純度可通過測序、凝/]交電泳、UV光語測定進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的核酸可^皮4翁入核酸構(gòu)建體，其中該核s交的表達(dá)受到
"表達(dá)控制元件"(在此稱為"表達(dá)盒")的影響或調(diào)節(jié)。術(shù)語"表達(dá)控 制元件"指調(diào)節(jié)或影響與之可操作連接的核酸序列表達(dá)的 一種或多 種核酸序列元件。表達(dá)控制元件可在蛋白編碼基因前適當(dāng)?shù)匕▎?br> 動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、基因沉默、起始密碼子(例如，ATG)
寺..o
可操作地連接至核酸序列的表達(dá)控制元件控制核酸序列轉(zhuǎn)錄， 并適當(dāng)?shù)胤g核酸序列。術(shù)語"可4喿作地連接"指 一 種并置 (j uxtaposition)，其中涉及的成分所處的關(guān)系允許它們以其預(yù)期的方 式作用。通常表達(dá)控制元件并置在基因的5'或3'端，但也可以是內(nèi)插子。
表達(dá)控制元件包括可誘導(dǎo)(即，需要外部信號進(jìn)行激活)或可 脫阻抑(即，需要信號關(guān)閉激活；當(dāng)該信號不在存在時，轉(zhuǎn)錄被激活或"脫阻抑")的組成性激活轉(zhuǎn)錄的元件。本發(fā)明的表達(dá)盒中還包 含了足以賦予基因表達(dá)針對特定細(xì)胞類型或組織的可控性的控制 元件(即，組織特異性控制元件)。該種元件通常^立于編碼序列的 上游或下游(即，5'和3')。啟動子通常位于編石馬序列的5'。通過
重組DNA或合成技術(shù)生成的啟動子可用于提供本發(fā)明的多聚核苷 酸的轉(zhuǎn)錄。"啟動子"表示足以引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列元件。
核酸可被插入質(zhì)粒以增殖進(jìn)入宿主細(xì)胞和進(jìn)行所需的后續(xù)遺 傳才喿作。質(zhì)粒是能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定增殖的核酸；質(zhì)?？梢钥蛇x地 包含表達(dá)控制元4牛，以驅(qū)動該核酸的表達(dá)。ot匕處所用的載體與質(zhì)粒 同義，并可包含針對在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制元件。質(zhì)粒和載 體通常包含至少用以在細(xì)胞內(nèi)增殖的復(fù)制起始區(qū)和啟動子。因此質(zhì) 粒和載體可用于，例如，月太和杏t體編石馬核酸的遺傳才喿作，生成肽和 抗體或反義，以及在宿主細(xì)月包或有才幾體中表達(dá)該肽和抗體。
細(xì)菌系統(tǒng)啟動子包4舌T7和可i秀導(dǎo)啟動子，如p藍(lán)菌體X的pL、 plac、 ptrp、 ptac ( ptrp-lac雜交啟動子)以及四環(huán)素應(yīng)答啟動子。昆
蟲細(xì)月包系#充啟f力子包才舌纟且成的或是可i秀導(dǎo)的啟動子(例，蟲兌4匕
素)。哺乳動物細(xì)力包組成型啟動子包4舌SV40、 RSV、牛乳頭瘤病 毒(BPV)和其它病-謄啟動子，或者由哺乳動物細(xì)"包(例如，金屬硫 蛋白HA啟動子；熱休克啟動子)或哺乳動物病毒(例如，^l病毒 晚期啟動子；可誘導(dǎo)的小鼠乳房腫瘤病毒長末端重復(fù))的基因組獲 得的可誘導(dǎo)啟動子。替代性地，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可被遺傳修飾， 以導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)月包并引導(dǎo)蛋白或抗體的表達(dá)。
表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步包4舌經(jīng)"i殳計在體內(nèi)^吏用的載體。特定的非限制 性范例包括腺病毒載體(美國專利5,700,470和5,731,172 ),腺病 毒相關(guān)載體(美國專利5,604,090 )，單純皰滲病毒載體(美國專利 5,501,979 )，逆4爭錄病一爭載體(美國專利5,624,820, 5,693,508和5,674,703 ) , BPV栽體(美國專利5,719,054 )以及CMV載體(美 國專利5,561,063 )。
酵母載體包含組成型和可誘導(dǎo)啟動子(例如，參見Ausubel等 人,In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2， Ch. 13, ed.， Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience ， 1988; Grant 等人 Methods in Enzymologv, 153:516 (1987)， eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzvmology. 152:673 (1987)， eds. Berger & Kimniel, Acad. Press, N. Y.以及Strathera等人,The Molecular Biology of the Yeast Saccha:romyces (1982—) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I和II)。 可使用組成型酵母啟動子如ADHesive或LEU2,或使用可誘導(dǎo)啟 f力子嗦口 GAL ( R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.U, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash.， D.C., 1986 )。 通過同源性重組等方式促進(jìn)外源核酸序列整合進(jìn)入酵母染色體的 載體已為本領(lǐng)域所知。當(dāng)插入的多聚核苦酸對于常身見載體而言過大 時(例如，大于約12 Kb),?？墒褂媒湍溉斯と旧w(YAC)。
(例如，beta-半乳糖苦酶)的選4奪性標(biāo)記，從而允許細(xì)胞具有待選 擇、生長和擴(kuò)增的載體。替代性地，選擇性標(biāo)記可位于伴隨含有本 發(fā)明多聚核苷酸的第 一 載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的第二載體上。
i4沖奪系統(tǒng)包括^S不限于可分別應(yīng)用于tk-, hgp:rt-或aprt-細(xì)胞的 單純皰疹病毒胸芬激酶(Wigler等人，Cell 11:223 (1977)),次黃噤 i呤-鳥'嘌口令石奔酉炱杉Z.術(shù)魯對i^多酵(Szybalska并口 Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sd USA 48:2026 (1962)),以及腺。票呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人.， Cell 22:817 1980)基因。此外，抗代謝產(chǎn)物耐受可作為對可陚予對氨 甲喋呤的耐受性的dhfr( O'Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 1 527 (1981));可賦予對霉酚酸耐受性的gpt基因(Mulligan等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981));可貝武予對氨基沖唐苦 G—418的耐受性的新霉素基因(Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol. 150:1(1981));噤^令霉素；以及可f!武予對潮霉素耐受〗生的潮霉素基 因(Santerre等人，Gene 30: 147 (1984)選4奪性的基礎(chǔ)。其它的選擇 性基因包括trpB,其允許細(xì)胞取代色氨酸利用。引咮；hisD,其允許 細(xì)胞耳又代組氨酸利用histinol;以及ODC (鳥氨酸脫羧酶)，其賦 予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑，2-(二氟甲基)-DL-烏氨酸，DFMO的耐 受性(McConlogue (.1.987) In: Current Communications in Molecular ■Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)。
還提供了表達(dá)LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)氨基酸序列的宿 主細(xì);I包。該種導(dǎo)入了編碼LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)-氬基酸序 歹J的核酸的細(xì)胞被稱為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。宿主和轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括不表達(dá) LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)氨基酸序列，但用于增殖包含了編 碼LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)氨基酸序列或其子序列的核酸的 核酸或載體的細(xì)胞。示范性的宿主和轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)選自SEQ ID NOs: 3至10任意一個的-氮基酸序列。在一個實施方式中，宿主或轉(zhuǎn)化細(xì) 胞為原核細(xì)胞。在另一實施方式中，宿主或轉(zhuǎn)化細(xì)胞為真核細(xì)月包。 在不同的方面，該真^f亥細(xì)月包為酵母或哺乳動物(例如，靈長動物， 人等)纟田月包。
宿主和轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括但不限于微生物(如細(xì)菌和酵母)，以及 植.物、昆蟲和哺乳動物細(xì)/I包。例如，4^f共了以重組噬菌體核酸、質(zhì) 粒核酸或粘粒核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；以重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 的酵母；以重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV:煙 草花葉病毒，TMV )或以重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化 的植物細(xì)胞系統(tǒng)；以重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的 昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以重組病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒，月象病毒，牛痘病毒)感染的動物細(xì)/]包系統(tǒng)，或經(jīng)過工禾呈改造可瞬時或穩(wěn)、定增 殖或表達(dá)的轉(zhuǎn)化動物細(xì)月包系統(tǒng)。
具有依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜或細(xì)胞膜上的分子的LTbeta 受體激動劑(例如，LIGHT (p30多肽)，LIGHT (p30多肽)嵌合體， LT(ilphal beta2, LTodpha2 betal, LTbeta或LTbeta受體抗體，LIGHT (P30多肽)變體和多形體及其子序列，以及編碼LIGHT (p30多肽) 變體和多形體及其子序列的核酸)的細(xì)胞可包括分離或純化形式。
完全或至少部分從天然存在的體內(nèi)環(huán)境中分離。 一般而言，分離的 組合物基本不含一種或多種通常與之天然伴隨的物質(zhì)，例如， 一種 或多種蛋白、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、細(xì)月包膜。術(shù)語"分離的"不 排除該組合物的替代物理形式，例如多聚體/低聚體、變體、修飾或 衍生形式或由人工生成的宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式。術(shù)語"分離的"還 不排除其組合中的任意一個由人工制備的形式(例如，藥物制劑和 組'合物)。
當(dāng)不含部分、大量、基本所有通常與之天然相伴的物質(zhì)時，"分 離的"組合物也可以是"純化的"。因此，基本純的LIGHT (p30多肽) 變體或多形體不包含數(shù)百萬種其它序列的多肽或多聚核苦酸，例如 在7圣白庫中的蛋白或在基因組或cDNA庫中的核酸。"純化的"組合 物可結(jié)合一種或多種其它分子。
本發(fā)明提供了混合物或組合物,，在一個實施方式中，混合物包 含了兩種或多種細(xì)胞，其中依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑， 每種細(xì)月包可選地具有不同的與之相連的LTbeta受體激動劑。在另一 實施方式中，混合物包含兩種或多種LIGHT (p30多肽)序列，例如 變體或多形體以及野生型LIGHT (p30多肽)，或者第一LIGHT (p30 多肽)變體或多形體以及不同于該第一 LIGHT (p30多肽)變體或多形體的第二 LIGHT (p30多肽)變體或多形體。在進(jìn)一步的實施方式 中，混合物包含了藥物可接受的載體或賦形劑，即，藥物組合物或
藥物制劑。
例如以LTbeta受體激動劑和LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)氨 基酸序列修飾的細(xì)胞等組合物可用于耙向不良的、異常的細(xì)月包，高 度增殖細(xì)/包，如肺瘤、癌癥、新生和4爭移'性細(xì)"包，以.及病原體感染 的細(xì)胞，使之溶解、死亡或凋亡。因此，可根據(jù)本發(fā)明治療的基本 包括不良的、異常的細(xì)胞增殖和高度增殖細(xì)胞和疾病，例如，具有 或容易具有不良的、異常的高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌癥細(xì)胞、 新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的對象。
以LTbeta受體激動劑修飾的細(xì)月包可應(yīng)用于各種方法，該細(xì)胞 包括表達(dá)一種或多種針對不良的、異常的細(xì)胞或高度增殖細(xì)胞、腫 瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包和病原體感染細(xì)月包的抗原 的細(xì)月包。因此，為了耙向不良的、異常細(xì)胞、高度增殖細(xì)胞、月中瘤、 癌癥、新生和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，這些細(xì)胞可經(jīng)修飾具有依附、結(jié)合或偶 聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑，而該修飾后的細(xì)胞由此可用于靶 向不良的、異常的細(xì)胞、高度增殖細(xì)胞、腫瘤、癌癥、新生、轉(zhuǎn)移
修飾的細(xì)胞可用于fe向不良的、異常的細(xì)胞、高度增殖細(xì)胞、腫瘤、 癌癥、新生和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞以及病原體感染細(xì)月包。
本發(fā)明還提供了促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加針對高度增殖細(xì)胞、
月中瘤纟田月包、癌細(xì)月包、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)月包、或病原體感染細(xì)胞的 免疫性的方法。在 一 個實施方式中，該方法包括向?qū)ο笫┯没蚪佑| —定量的具有依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)月包膜的LTbeta受體激動劑的細(xì) 胞，其中該LTbeta受體激動劑足以促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加該對象
細(xì)月包4吏之〉容角年、死亡或凋亡。通過該方法，所針對高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或 病原體感染細(xì)^^的免疫性。
本發(fā)明還提供了治療對象的不良的或是異常的高度增殖細(xì)胞、 腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)月包、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包、或病原體感染的細(xì) 月包的方法。在一個實施方式中，該方法包4舌向^"象施用或角f卩余一定
量的具有依.附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑的細(xì)胞， 其中該LTbeta受體激動劑可有效治療X十象的不良的或是異常的高 度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)月包、新生細(xì)月包、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、或病
原體感染的細(xì)月包。
在不同的方面，該LTbeta受體激動劑包括LIGHT (p30多肽)、 LTalphal beta2、 LTodpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受體4元體。在對爭 定方面，該LTbeta受體激動劑包括LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài) 序歹'j,例如，對LTbeta受體或HVEM具有增高的或更大的結(jié)合親 和性的LIGHT (p30多肽)，或?qū)cR3具有減少的或更小的結(jié)合親 和性或親和力的LIGHT (p30多肽)，例如，SEQ ID NOs: 1， 2-10 中的任意一個或組合。在其它特定的方面，抗體為刺激或-提高 LTbeta受體活性的激動劑。
術(shù)語"高度增殖疾病"指任意不良的、異常的細(xì)胞存活(例如， 未進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡或凋亡)、生長和增殖。該種疾病包括增生、 非轉(zhuǎn)移性腫瘤和轉(zhuǎn)移性(新生)肺瘤和癌癥。不良的、異常細(xì)胞增 殖和高度增殖疾病可影響對象中的4壬意細(xì)月包、組織、器官、區(qū)i或或 系統(tǒng)。腫瘤可源自多個組織和器官，包括^旦不限于，乳腺、肺、鼻 咽、甲狀腺、頭部和頸部、腦、淋巴、胃腸道(口腔、食道、胃、 小腸、結(jié)腸、直腸)、泌尿生殖道(子宮、卵巢、子宮頸、膀胱、 陰道—、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝臟、骨骼 肌肉、皮 映，其可轉(zhuǎn)移或不轉(zhuǎn)移至第二位點(diǎn)。不良或異常細(xì)力包增殖和高度增殖疾病可影響4壬意細(xì)l包或i!L織類型，例々口，癌、肉瘤、黑色素瘤、 神經(jīng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮或造血新生細(xì)胞和疾病(如，骨髓瘤、'淋巴瘤或白 血病)。不良的或異常的細(xì)胞增殖和高度增殖疾病可局部、區(qū)域或 系統(tǒng);也存在于對象中。
術(shù)語"肺瘤"、"癌癥"和"新生瘤"可互換使用，并表示生長、增 殖或存活大于普通的對應(yīng)細(xì)胞的生長、增殖或存活的細(xì)月包或細(xì)月包群
體，例力口，細(xì)"包增殖或分4t疾病。一4S:而言，該種生長不受4空制。
術(shù)語"惡性"至對鄰近組織的侵襲。術(shù)語"轉(zhuǎn)移"指腫瘤、癌癥或新生 物對該對象體內(nèi)更遠(yuǎn)處的組織或位點(diǎn)的擴(kuò)散和卡丈才番。
術(shù)i吾"病原體感染的細(xì)月包"指受到病毒感染、或者經(jīng)-秀導(dǎo)(轉(zhuǎn)化) 表達(dá)病毒、細(xì)菌或寄生蟲(病原體)基因或當(dāng)細(xì)月包依附、結(jié)合或偶
聯(lián)了 LTbeta受體激動劑時刺激免疫性的基因的細(xì)胞，如自體人血細(xì) 胞。施用該種依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的病原體感染 細(xì)胞允許表達(dá)的病原體抗原誘導(dǎo)針對該抗原的免疫應(yīng)答(例如，保
護(hù)'1生.免^/￡寸生)。
術(shù)語"接觸"表示兩個或多個實體之間(例如，介于LTbeta受體 和激動劑之間，已在膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的 細(xì)胞與對象之間，等等)直接或間接結(jié)合或相互作用。此處所用的 接-觸包4舌在)容液中、固相中、體外、間4妄體內(nèi)、細(xì)月包中以及4機(jī)內(nèi)才妻 觸。體內(nèi)4妄觸可一皮稱為施用。
包含腫瘤的細(xì)胞可聚集在細(xì)胞團(tuán)中或可分散。"實體腫瘤"指通 常具體在 一 起并形成團(tuán)塊的新生瘤或轉(zhuǎn)移瘤。特定的非限制性范例 包括內(nèi)臟胂瘤，例如，黑色素瘤，乳腺、胰腺、子宮和卯巢癌、睪 丸癌，包括精原細(xì)胞瘤，胃癌或結(jié)腸癌，肝癌，腎上腺、腎和膀胱 癌，肺、頭和頸部癌癥以及腦腫瘤/癌癥表示上皮或內(nèi)分泌組織的惡性胂瘤的癌包括呼吸系統(tǒng)癌，胃腸 系統(tǒng)癌，生殖泌v^系統(tǒng)癌，睪丸癌，乳月泉癌，前列腺癌，內(nèi)分泌系 統(tǒng)癌和黑色素瘤。示范性的癌包^^由子宮、宮頸、肺、前列腺、乳 腺.頭頸、結(jié)腸、胰腺、睪丸、腎上腺、腎、食管、胃、肝和卵巢 形成的癌。該術(shù)i吾還包4舌癌肉瘤，例如，包4舌由癌瘤性和肉瘤性組 織組成的惡性腫瘤的癌肉瘤。^^癌包4舌a泉組織的癌，或者肺瘤形成 腺狀結(jié)構(gòu)的癌。
肉瘤指間質(zhì)細(xì)胞來源的惡性胂瘤。示范性的肉瘤包4舌，例如， 詳本巴肉瘤、脂牙i肉瘤、骨肉瘤、岸欠骨肉瘤、平滑月幾肉瘤、橫1丈月幾肉
瘤和纖維肉瘤。
神經(jīng)新生瘤包括腦膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì) 胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
"液態(tài)瘤"表示具有分-狀性質(zhì)的新生瘤，因為它們通常不形成固 體團(tuán)塊。特定的范例包括網(wǎng)狀內(nèi)皮組織或造血系統(tǒng)的新生瘤，如淋 巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病的非限制性范例包括急性和l曼性成 淋巴細(xì)胞、成髓細(xì)胞白血病以及多發(fā)性骨髓瘤。通常而言，該種疾
病源自于分化4交差的急性白血病，例如，成紅細(xì)月包白血病和急性成 巨核細(xì)胞白血病。特定的骨髓疾病包括，但不限于，急性早幼粒白 血病(APML),急性骨髓性白血病(AML)以； U隻性骨髓性白血病 (CML)。淋巴惡性肺瘤包括，但不限于，急性成淋巴細(xì)胞白血病 (ALL),其包括B系A(chǔ)LL和T系A(chǔ)LL，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)， 幼淋巴細(xì)胞白血病(PLL)，毛細(xì)胞白血病(HLL)以及特發(fā)性巨i求蛋白 血癥(WM)。特定的惡性淋巴瘤包括，非1--iodgkin淋巴瘤及變體， 周邊T細(xì)胞淋巴瘤，成年T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮膚T細(xì)胞 淋巴瘤(CTCL),大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(LGF)， Hodgkin疾病和 Reed-Sternberg疾病，，月中瘤、癌癥、惡性腫瘤或新生瘤可處于4壬意階4殳，例如，早期 或晚期，例如I、 II、 III、 IV或V階段肺瘤。該腫瘤可經(jīng)過預(yù)先處 理或被穩(wěn)定化(非進(jìn)展)或緩解。
膜上依.附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式以及本發(fā)明的方法包括抗增殖、抗腫 瘤、抗癌癥、抗新生瘤治療、方案以及療法，其包括任意其它的抑 制、減少、阻滯、減緩、降低或防止高度增殖疾病(例如體外或體 內(nèi)腫瘤、癌癥、惡性或新生生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、增殖或存活、或者 惡化)的組合物、治療或治療方案?？乖鲋承?例如，肺瘤或癌癥) 治療法特定的非限制性范例包括化學(xué)療法、免疫療法、放射療法(電 離或化學(xué))、局部熱能(高溫)療法和手術(shù)切除。任意具有抗細(xì)胞 增殖活性或作用的組合物、治療、計劃、療法或方案均可在本發(fā)明 的方法中與膜上依附了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，LIGHT (p30多 肽)變體和多形態(tài)形式聯(lián)用。
抗增殖或抗腫瘤組合物、療法、計劃、或治療包括能夠防止、 破壞、中斷、抑制或延緩細(xì)胞周期進(jìn)展或細(xì)胞增殖；刺激或增強(qiáng)凋 亡或細(xì)胞死亡，抑制核酸或蛋白合成或4汔謝，抑制細(xì)胞分化或減少、 降低或抑制細(xì)胞存活，或必要的細(xì)胞存活因子、生長因子或信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑(胞外或胞內(nèi))的生成和利用的組合物、療法、計劃或治療。 具有抗細(xì)胞增殖和抗腫瘤活性的化學(xué)劑種類的非限制性范例包括 烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、 核芬酸和核芬酸類似物。具有抗細(xì)胞增殖和抗腫瘤活性的藥物的特 定范例包括環(huán)磷酰胺，硫唑噪呤，環(huán)孢菌素A,潑尼松龍，美法蘭， 笨丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨曱蝶呤，6-巰基嘌呤，硫代鳥嘌呤， 5-氟尿嘧咬，阿糖胞苷，AZT, 5-氮胞苷(5-AZC)及5-氮胞苷相關(guān)的 化合物，如地西他濱(5-氮雜-2'脫氧胞苷)，阿糖胞苷，1-f3-D-阿 拉伯呋喃糖-5-氮胞嘧啶和二氫-5-氮雜胞苷，博萊霉素，放線菌素D,光神霉素，絲裂霉素C,卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，鏈唑霉 素，羥基脲，順鉑，米托坦，甲基千肼，達(dá)卡巴口秦，紫杉醇，長春 花石咸，長春新;咸，阿霉素和二溴甘露醇。
也可采用適用于該組合物和方法的其它藥劑。例如，結(jié)合腫瘤
細(xì)胞或癌基因產(chǎn)物的單克隆抗體，例如Rituxan⑧和Herceptin (曲妥 單抗)(抗-Her-2 neu抗體)，貝伐單抗(阿瓦斯汀)，澤瓦林，百克沙， Oncolym, 17-1A(依決可單抗)，3F8 (抗-成神經(jīng)細(xì)胞瘤抗體)， MDX-CTLA4， Campath , Mylotarg, IMC-C225 (西妥昔單抗)， cBR96 禾口 cAC10 的 aurinstatin 纟吉合4勿 (Doronina等人 Nat Biotechnol. 21:778 (2003))由其可與才艮據(jù)本發(fā)明的》務(wù)飾細(xì)胞或 LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式耳關(guān)用。
此處4是供了治療腫瘤、癌癥、新生惡性腫瘤或病原體感染的細(xì) 月包的方法，由于患有或易患有肺瘤、癌癥、新生瘤、惡性腫瘤或病 原體感染的細(xì)胞而有此需要的對象的治療發(fā)放，4是高效力或改進(jìn)抗 腫瘤、抗癌癥、抗新生瘤、抗惡性腫瘤或抗病原體感染的細(xì)月包的療 法的方法,.在各自的實施方式中，該方法包4舌向患有或易患有腫瘤、 癌癥、新生瘤、惡性肺瘤或病原體感染的細(xì)胞的對象施用一定量的 在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，或者一 定量的LIGHT (p3()多肽)變體和多形態(tài)形式，所施用的數(shù)量足以治 療該腫瘤、癌癥、新生瘤、惡性腫瘤或病原體感染的細(xì)力包；向該對 象施用一定量的在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶l關(guān)了 LTbeta受體激動劑 的細(xì)月包或LIGHT (p3()多肽)變體和多形態(tài)形式，所施用的凄史量足以 治療該對象；以及向正經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷腫瘤、癌癥、新生瘤、惡性 腫瘤治療或針對病原體感染細(xì)胞的治療的對象施用 一定量的在細(xì) 胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞或LIGHT (p3() 多肽)變體和多形態(tài)形式，所施用的數(shù)量足以提高該抗腫瘤、抗癌癥、 抗新生瘤、抗惡性腫瘤或4元病原體感染細(xì)月包的療法的效力,，本發(fā)明的方法可在不良、異位或異常細(xì)胞增殖或高度增殖疾病 或病原體感染的細(xì)月包的i正據(jù)(例如， 一種或多種癥狀)出現(xiàn)之前(即， 預(yù)防)、同時或之后進(jìn)纟亍施用。在不良、異^f立或異常細(xì)力包增殖、高 度增殖疾病或病原體感染細(xì)胞的癥狀形成之前、同時或之后緊^妄施
用在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，或者 LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式可減少該對象體內(nèi)一種或多種 癥狀的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限。此外，在一種或多種癥 狀形成之前、同時或之后緊接施用在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體;敫動劑的纟田月包，或者LIGHT (p30多月大)變體和多形態(tài)形 式可減少或防止高度增殖細(xì)月包(例如，腫瘤或癌癥轉(zhuǎn)移)或病原體 感染細(xì)胞向?qū)ο篌w內(nèi)其它區(qū)域、組織或器官的擴(kuò)fA。
在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞， LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式，以及本發(fā)明的方法(例如治 療方法)可提供可檢測的或可測量的對對象的治療效果或改進(jìn)。治 療效果或改進(jìn)是任意可測量或可檢測的、客劉L的或主觀的、瞬時的、 臨時的、或者更長期的對對象的效果或?qū)ο蟮慕M織、器官、細(xì)胞 或細(xì)胞群中任意程度的狀況、紊亂或疾病、有害癥狀、后果或基本 病因的改進(jìn)。治療效果和改進(jìn)包括，^旦不限于，減少或降j氐與紊亂、 疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的—發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性. 進(jìn)展或期限，或者減少或降低紊亂、疾病或病癥的發(fā)病原因或后續(xù) 作用。在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞， LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式，以及本發(fā)明的方法(例如治 療方法)因此包括向?qū)ο筇峁┲委熜Ч蚋倪M(jìn)。
需要的對象施用充分或有效量的在細(xì)i]包j]莫上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體;敫動劑的細(xì)月包，或LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式。
"充:^量"或"有效量"指以單獨(dú)或多重劑量、單用或與 一種或多種其它組合物(治療劑，例如化療或免疫刺激藥物)、治療、計劃或治 療方案4關(guān)用時，可向?qū)ο筇峁┤我鈺r間長度(長期或短期)的可測 應(yīng)答、任意可測量或可檢測程度的或是任意時間長度(例如，持續(xù) 小時、天、月、年或治愈)的預(yù)期結(jié)果或效果的數(shù)量。用于治療(例 如，提供治療效果或改進(jìn))的劑量或"充分量"或"有效量"通常能夠
以可測-量的斥呈度有效改善紊舌L、疾病或病癥，或者該紊3L、疾病或
病癥的一種、多種或所有的有害癥狀、后果或并發(fā)癥，盡管減少或
術(shù)i吾"改善"表示對于對象病癥的可4企測的主，見或.客"L改進(jìn)?？?br> 作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限的主乂見或客勸L上的減少，對疾病、 疾病或病癥的發(fā)病原因或后果的改進(jìn)，或者紊舌L、疾病或病癥的耳又消。
因此治療可導(dǎo)致紊亂、疾病或病癥，或者相關(guān)的癥狀或后果， 或者發(fā)病原因的4卬制、減少或防止；紊^L、疾病、病癥、癥4大或后 果的進(jìn)/良或惡化，或者該紊亂的一種或多種其它癥狀、疾病狀況或 癥狀的進(jìn)一步惡化或發(fā)作的抑制、減少或防止。因此，成功的治 療結(jié)果導(dǎo)致"治療作用"或"效萊"或者抑制、減少或防止對對象體內(nèi) 一種或多種癥狀的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)/良或期限，或者病癥、 紊^L、疾病或癥^1犬的發(fā)病原因或后果。因此，可影響該病癥、紊亂、 疾病或癥狀的一種或多種發(fā)病原因的治療方法被認(rèn)為是有益的。對 紊亂或病癥的進(jìn)展或惡化的穩(wěn)定或抑制同樣是成功的治療結(jié)果。
因此治療效果或改進(jìn)不需-要完全消除與病癥、紊亂或疾病相關(guān) 的任意一種、多數(shù)或所有癥狀、并發(fā)癥、后果或發(fā)病原因。因此， 當(dāng)對于對象的癥狀有了改進(jìn)，或者在較短或較長的時間期限內(nèi)(小 時、天、周、月等) 一種或多種相關(guān)有害癥狀或并發(fā)癥或后果或發(fā)病原因的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限有了部分減少，或者該 紊亂或疾病的 一種或多種生理、生4t或細(xì)月包表J見或特4正的惡4t或進(jìn) 展有了4p分減少(例力口，穩(wěn)、定該病癥、紊話L或疾病的一種或多種癥 狀或并發(fā)癥)時，便達(dá)到了令人滿意的終點(diǎn)。
充分量或有效量不需要在單次施用中提供，并且可以(但非必 須)單用或與另一組合物(例如，化療或免疫刺〗敫藥劑)、治療、 計劃或治療方案聯(lián)用。例如，該數(shù)量可才艮據(jù)該對象、紊亂的狀態(tài)、 所治療的疾病或病癥或者4寺治療的副作用的需求相應(yīng)增加。此外， 如果在沒有第二組合物(例如，化療或免疫刺激藥劑)、治療、計 劃或治療方案時以單劑量或多劑量給用時，充分量或有效量不需要
充分或有效，因為還可在該劑量之外采用附加的劑量、^:量或期限， 或者可包舍附加組合物(例如，化療或免疫刺激藥劑)、治療、計 劃或治療方案以達(dá)到對給定對象的充分和有效。認(rèn)為充分的數(shù)量還 包4舌導(dǎo)致另 一治療、治療方案或計劃的使用減少的^:量。
充分量或有效量無需對每一個治療《于象有予頁防或治療效果，或 對給定組或群內(nèi)大部分治療對象有效。在治療方法中常見的是，部 分對象對給定的治療、治療方案或計劃顯示出更大或更小的應(yīng)答。 充分量或有效量指對特定對象充分或有效，而非對組或一^:群充分 或有效。該種數(shù)量將部分依賴于待治療的病癥，例如不良的、異位 的或異常的細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂(例如，癌癥、腫瘤、新生瘤 或惡性腫瘤)或者病原體感染細(xì)/]包的類型和階,殳，預(yù)期的治療效果，
以及.個體對象(例如，該對象的生物利用度、對該對象的應(yīng)答、性
別、年齡等)，，
對于不良的、異位的或異常的細(xì)胞增殖，如高度增殖疾病(例 如,癌癥、腫瘤、新生瘤或惡性腫瘤)或病原體感染性病的治療效 果或改進(jìn)的特定非限制性范例包括對高度增殖細(xì)胞(例如，肺瘤細(xì)胞、癌癥細(xì)胞、新生瘤細(xì)胞、惡性腫瘤細(xì)胞)或病原體感染細(xì)胞的 大小、質(zhì)量或體積的減少，對大小、質(zhì)量和體積以及數(shù)量或轉(zhuǎn)移增 加的抑制或防止，對于惡化或進(jìn)展的減緩或抑制，刺激細(xì)胞溶解或 凋亡，減少、降低或抑制高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌癥細(xì)胞、新 生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染性病的增殖或數(shù)量，或者減少、 降低或抑制腫瘤或癌癥轉(zhuǎn)移，或者穩(wěn)定高度增殖細(xì)胞(例如，腫瘤 纟田月包、癌癥細(xì)胞、新生細(xì)胞、惡性肺瘤細(xì)月包)或病原體感染細(xì)月包的 數(shù)量，降低死亡率，以及延長對象的壽命。因此，盡管沒有形成對 癌癥、肺瘤、新生瘤、惡性腫瘤或病原體感染細(xì)胞的完全消除，但 抑制或減緩大小、質(zhì)量、體積或轉(zhuǎn)移的上升(穩(wěn)定化)可增加壽命
(減少死亡率)，即^f吏只有^t天、^:周或數(shù)月。
對不良的、異位的或異常的細(xì)胞增殖，例如高度增殖疾病(例 如，癌癥、腫瘤、新生瘤或惡性腫瘤)，或病原體感染的細(xì)胞的癥 狀的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限的減少，例如，對主管感受 的改進(jìn)(例如，精神、食名夂的改善，惡心的減少，活動能力或心理 健康的改善)均為治療效果或改進(jìn)。可以減少或降^氐的與高度增殖 疾病(例如，癌癥、腫瘤、新生瘤或惡性腫瘤)相關(guān)的癥狀或并發(fā) 癥包括，例如，疼痛、惡心、食欲不振、嗜睡和虛弱。
例如，如果充分或有效量的在月莫上依附、結(jié)合或偶耳關(guān)了 LTbeta 受體激動劑的細(xì)胞，或LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式的施用 可導(dǎo)致不良的、異位的或異常細(xì)胞增殖，例如高度增殖疾病(例如， 癌癥、腫瘤、新生瘤或惡性腫瘤)或病原體感染的細(xì)月包的治療所需 的化療藥物、方t射、免疫療法或病原體療法的施用減少，則其被.認(rèn) 為具有治療效果。
術(shù)i吾"對象，，指動物，通常為哺乳動物，例如人，非人靈長動物 (猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、獼猴)，馴養(yǎng)動物(狗和貓)，畜
53牧動物(馬、牛、山羊、綿羊、豬)，實驗動物(小鼠、大鼠、兔 子、豚鼠)。對象包括動物疾病模型，例如，用于分析或體內(nèi)研究 的不良的、或異位的細(xì)/I包增殖，例如高度增殖疾病(例如，癌癥、 腫瘤、新生瘤或惡性腫瘤)或病原體感染的細(xì)"包的動物4莫型。
適于治療的對象包括具有或者易具有不良的、異位的或異常細(xì) 胞(例如腫瘤、癌癥、新生瘤、惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞)或者病原 體感染細(xì)l包的對象，正經(jīng)歷或者曾經(jīng)歷抗腫瘤、抗癌癥、抗新生瘤、 抗惡性腫瘤或抗轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或者抗病原體感染細(xì)胞療法的對象，包 括緩解中的對象。因此本發(fā)明適于治療，例如，由于在一^殳時間的 靜止或減緩后的復(fù)發(fā)或再生長易患有不良的、異位的或異常細(xì)胞、 腫瘤、癌癥、新生瘤、惡性肺瘤或轉(zhuǎn)移性或者病原體感染細(xì)力包或者 相關(guān)并發(fā)癥的》于象
"易患"對象通常具有與不良或異位免疫應(yīng)答、免疫紊亂或免疫 疾病、增生的形成(例如，癌癥或腫瘤)相關(guān)的風(fēng)險因素，或者暴 露至病原體或與病原體4妄觸。風(fēng)險因素包括年步冷、生活習(xí)慣(々欠食， 吸煙)、職業(yè)(醫(yī)療和臨床人員，農(nóng)業(yè)和畜業(yè)工作者)、環(huán)境因素 (致癌物質(zhì)暴露)、家族史(自身免疫疾病，糖尿病等)、遺傳傾 向、暴露等。例如，易患黑色素瘤的對象的風(fēng)險因素包括過量曰光 照射(紫外輻射)、白皮膚、痣數(shù)量過多(發(fā)育不良痣)、患者顯 型、家方l史或之前的黑色素瘤史。因A匕，易患癌癥的對象可通過生 物習(xí)慣、職業(yè)、環(huán)境因素、家族史以及腫瘤相關(guān)基因、基因刪除或
基因突變的篩選得以鑒別。例如，易患乳腺癌的對象缺失Brc"/。
易患結(jié)腸癌的對象具有幼年或高頻率的鼻息肉形成，或者刪除或突
變的腫瘤抑制基因，例如腺瘤性結(jié)腸息肉病('APC)基因。易患對高 -IgM (H!M)的免疫缺陷的對象可在如染色體X的q26發(fā)現(xiàn)基因 TNFSF5的在失陷。易患免疫缺陷疾病常常與MHC遺傳型相關(guān)。例 如，糸t.尿病與HLA-DR3和HLA-DR4相關(guān)。包含在細(xì)胞膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì) 胞，或LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式的組合物可以單獨(dú)或多 重劑量以有效或充分量施用，以提供目標(biāo)作用。示范性的劑量可在 連續(xù)數(shù)天或者隔天或間歇地施用。單獨(dú)或多重劑量可在相同天內(nèi)或 連續(xù)數(shù)天、隔天或間歇地施用。
可通過全身、區(qū)域或局部施用等任何途徑施用該組合物和實施 該方法。例如，依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，或 LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式可全身、區(qū)域或局部、靜脈、 口月良(例如，攝取或吸入)、肌肉、腹膜、皮內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、顱 內(nèi)、透皮(局部)、腸胃外(例如經(jīng)粘膜或經(jīng)直腸)施用。本發(fā)明 的組合物和方法包括可通過(微)月交嚢化傳遞系統(tǒng)施用或裝填進(jìn)入 移植物進(jìn)行施用的藥物制劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含在藥物組合物和制劑中的在細(xì)胞膜 上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，或LIGHT (p30 多肽)變體和多形態(tài)形式，以及LIGHT (p30多肽:)嵌合體。藥物組合 物指"藥學(xué)可接受的"和"生理可接受"的載體、稀釋劑或賦形劑。此 處所用的術(shù)語"藥學(xué)可接受的"和"生理可接受的"在涉及栽體、稀釋 劑或賦形劑時包括與藥物施用以及與該制劑中其它成分相容的溶 劑(水性或非水性)、清潔劑、溶液、乳液、分"R介質(zhì)、涂層、等 張劑和吸收促進(jìn)或延緩劑。該種制劑可包含在片劑(包衣或未包 衣)、膠嚢(硬或軟)、微粒、乳劑、粉末、顆粒、晶體、懸浮齊'J、 糖.漿或酏劑。
藥物組合物可制成與特定施用途徑相容的劑型。用于腸胃外、 皮內(nèi)或皮下施用的組合物可包含無菌稀釋劑，例如水、鹽水溶液、 固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑。該制劑可包 含--種或多種防腐劑以防止微生物生長(例如，苯甲醇或羥笨曱酸曱酯等抗菌劑；抗壞血酸或重亞石克酸鈉等抗氧化劑；乙二4妄四醋酉臾 等螯合劑；醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽等緩沖液以及氯化鈉或右旋 糖等調(diào)節(jié)張力的試劑)。
適于注射的藥物組合物包4舌無菌水;容液(具有水;容性時)或分 散體以及用于臨時制備無菌水溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈 施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany， NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。該載體可以是一種;容劑或-> 散介質(zhì)，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，丙三醇、 丙二醇、以及聚乙二醇)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩？赏ㄟ^，例如，采用 卵磷脂等涂層或使用表面活性劑來保持流動性?？咕鷦┖涂拐婢鷦?包括，例如，對羥笨曱酸酯、氯丁醇、笨酚、抗壞血酸和石克柳汞。 包4舌延纟爰吸收的藥劑，例如，單硬脂酸鋁和明月交可延長可注射組合
對于透粘膜或透皮施用，可在制劑中采用針對待滲透屏障的適 當(dāng)滲透劑。該種滲、透劑已為本領(lǐng)域所知，并包4舌，例如，用于透粘 膜施用的清潔劑、膽汁酸鹽和夫西地酸衍生物；用于透皮施用的油
膏、軟膏、凝膠或霜劑。
其它藥物制劑和傳遞系統(tǒng)已為本領(lǐng)所知并適用于本發(fā)明的
:方、;去(如J^口， 參;L Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed. , Merck Publishing Group ， Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.， (1993)以及Poznansky ，等人，Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315)。根據(jù)本發(fā)明提供了生成在細(xì)胞膜上(例如，與該細(xì)胞膜上存在
的分子，例如多肽或碳水化合物)依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體 逸t動劑的細(xì)/I包的方法。在一個實施方式中，該方法包4舌在允許所述 細(xì)胞和所述LTbeta受體激動劑結(jié)合(例如，通過中間體分子結(jié)合) 的條件下將該細(xì)力包與該LTbeta受體〖敫動劑相4妻觸，,人而生成具有依 附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑的細(xì)胞。在特定的方 面，該LTbeta受體;敫動劑并非由細(xì)/泡中編石馬該LTbeta受體激動劑 的核酸表達(dá)得到，而是通過共價或非共價鍵依附、結(jié)合或偶聯(lián)至該 膜。在另一實施方式中，該方法包括在允許所述細(xì)胞和所述LIGHT (p3()多肽)變體和多形態(tài)形式結(jié)合的條件下將該細(xì)胞與該LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式相接觸，,人而生成具有依附、結(jié)合或 偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式的細(xì)胞。在該 實施方式的特定方面，該LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式可乂人 編碼該LIGHT (p30多肽)變體或多形態(tài)形式的細(xì)胞核酸表達(dá)得到。
在特定的方面，該LTbeta受體;敫動劑包4舌其中包含了與細(xì)月包 膜上存在的分子相結(jié)合的結(jié)合部分(例如配體、受體或抗體或抗體 子序列)的一種或多種LIGHT (p30多肽)、LTcxlphal beta2、 LTodpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受體抗體，或嵌合蛋白 在其它特定的方 面，LIGHT (p30多肽)包括全長氨基酸序列、LIGHT (例如，SEQ ID NO: 1所示)的胞外氨基酸序列或可溶形式的L1GHT(例如，SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66)。除了特定的方面之外，LIGHT (p30多 肽)包含相對于天然野生型LIGHT (p30多肽)對DcR3 (Decoy受體 3)具有降低的親和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列，相對于天然 野生型LIGHT (p30多肽'pt LT(3R或HVEM具有增加的親和性的 1」GHT(p30多肽)氨基酸序列，或者相對于天然野生型LIGHT (p30 多肽)對LTPR或HVEM具有增加的親和性且對DcR3 (Decoy受體3)具有降低的親和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列，例如，選自 SEQ ID NOs 3至10任意一個的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
在進(jìn)一步特定的方面，該細(xì)胞為高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌 癥.細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)J包或病原體感染細(xì)胞、或表達(dá)選自腫 瘤細(xì)胞或癌癥細(xì)胞抗原、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞抗原、病毒抗原、 細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原的分子的細(xì)胞。細(xì)胞可以是死的 或者活的、真核的、哺乳動物(例如，人)細(xì)胞。
除了特定的方面以外，該細(xì)胞與第一部分(例如，生物素或生 物素衍生物)接觸后于第二部分(例如，親和素、中性親和素或《連 霉親和素，或其衍生物或氨基酸變體)接觸，從而生成了包含于細(xì) 胞結(jié)合的第 一部分以及與該第 一部分結(jié)合的第二部分的分子，所述 部分包4舌中間體分子。
在另一特定的方面，該LTbeta受體激動劑通過結(jié)合細(xì)胞膜上 存在的抗體與該細(xì)月包膜結(jié)合，該LTbeta受體;敫動劑通過LTbeta受 體激動劑與細(xì)胞膜上存在的分子(例如，蛋白或石灰水化合物)的交
聯(lián)與該細(xì)胞膜結(jié)合。
本發(fā)明提供了包含了裝填在適當(dāng)包裝材料中的在細(xì)胞膜上依 附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，LIGHT (p30多肽)變 體和多形態(tài)形式或其組合物和藥物制劑的試劑盒。試劑盒可選^^性 包含帶有成分描述或者對其中成分的體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)的使用 的說明的標(biāo)簽或包裝插頁。示范性的說明包括對減少或抑制細(xì)胞增 殖，減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖，減少或抑制新生、腫瘤或癌 癥細(xì)力包、惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性、或病原體感染細(xì)/泡的增殖，治療具有 高度增殖疾病的對象，治療具有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性新生瘤、腫瘤、 癌癥或惡性胂瘤或病原體感染細(xì)胞的對象的說明。術(shù)語"包裝材料"指包容該試劑盒的成分的物理結(jié)構(gòu)。該包裝材 料可維4爭該成分無菌，并可用常用于該種目的的材料(例如，紙， 波紋纖維，玻璃，塑料，箔，安瓿，小瓶，管等)制作。
本發(fā)明的試劑盒可包含標(biāo)簽或插頁。標(biāo)簽或插頁包括"印刷 品"，例如，單獨(dú)或粘帖至成分，試劑盒或包裝材料(例如，箱子)， 或貼在包含試劑盒成分的安吾瓦，管子或小瓶的紙張或紙寺反。標(biāo)簽或 插頁可進(jìn)一步包括計算機(jī)可讀介質(zhì)，例如磁碟(例如，軟盤，硬盤，
ZIP盤)，如CD-或DVD畫ROM/RAM, DVD, MP3等光石茱，》茲帶， 或RAM和ROM等電子存〗諸介質(zhì)或其復(fù)合體，如》茲/光.存4諸介質(zhì)， FLASH介質(zhì)或記憶類型卡。
標(biāo)簽或插頁還可包括其中 一種或多種成分的鑒別信息，劑量， 活性成分的臨床藥理學(xué)(包4舌作用沖幾制，藥^動力學(xué)和藥效學(xué))。 標(biāo)簽或插頁可包括生產(chǎn)商信息，批次，生產(chǎn)商地址以及日期的識別信息。
標(biāo)簽和插頁可包含有關(guān)試劑盒成分可能針對的病癥、紊亂或疾 病或癥狀的信息。標(biāo)簽和插頁可包含針對臨床醫(yī)師或?qū)ο笤诜椒ā?治療計劃或治療方案中使用 一種或多種試劑盒成分的i兌明。說明可 包括劑量、頻率或期限，以及實施此處所述的任意方法、治療計劃 或治療方案的說明。示范性的說明包括對治療不良的、異位的或異 常細(xì)胞、高度增殖細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的說明。因此本發(fā)明的試 劑盒可進(jìn)一步包括針對實施本發(fā)明所述的任意方法(包括治療、檢 測、監(jiān)測或診斷方法)的標(biāo)簽或說明。
標(biāo)簽或插頁可包括試劑盒成分可能提供的任意效果(例如，預(yù) 防性或治療性效果)的信息。標(biāo)簽或插頁可包括有關(guān)潛在有害副作 用的信息，例如對臨床醫(yī)生或?qū)ο笥嘘P(guān)不適于使用特定組合物的情
59形的警示。不良副作用還可能在該對象曾經(jīng)，將要或正在采用一種 或多種可能與該組合物不相容的其它藥物時出現(xiàn)，或在該對象曾
經(jīng)，將要或正在4姿受與該組合物不相容的其它治療方案時出現(xiàn)，因 此，該說明可包括有關(guān)該種不相容性的信息。
本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含其它成分。該試劑盒的各個成分 可封入單獨(dú)的容器中，且所有不同的容器包含在單個包裝中。本發(fā) 明的試劑盒可冷凍保存。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步設(shè)計為包含表達(dá) 本發(fā)明的肽或抗體或包含編碼核酸的宿主細(xì)胞。該試劑盒中的該細(xì) 胞可保存在適當(dāng)?shù)馁A存條件下，直至該細(xì)胞即將被使用。例如，含 有一種或多種細(xì)胞的試劑盒可包含適當(dāng)?shù)募?xì)胞貯存培養(yǎng)^^,從而<吏 該細(xì)月包可 一皮融解和生長。
除非另行說明，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義等同于本發(fā)
明所屬領(lǐng):t或普通4支術(shù)人員的普遍理解。盡管其它與此處所述類似或 等同的方法和材料也可用于對本發(fā)明的實施或測試，此處描述了適 用的方法和材津+。
此處引用的所有應(yīng)用，出版物，專利及其它參考文獻(xiàn)，GenBank 引文以及ATCC引文均在此全文引用作為參考。在產(chǎn)生沖突的情況
下，將受本說明書包4舌定義所支配。
除非上下文另行明確指出，此處所用的單數(shù)形式的"一種"和 "該"包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，在提及"膜上依附、結(jié)合或偶聯(lián)了 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞"或"LIGHT (p30多肽)變體和多形態(tài)形式" 時包括了多個該種細(xì)胞、變體或多形態(tài)形式，等等。
除非上下文另行明確指出，此處所用的所有數(shù)值或數(shù)值范圍包 括該范圍內(nèi)的整數(shù)以及該值或該范圍內(nèi)整數(shù)的分?jǐn)?shù)。因此，例如，90-100%的范圍包括91%, 92%， 93%， 94%, 95%, 95%, 97%等， 以及91.1 %, 91.2%, 91.3%， 91.4%， 91.5%等，92.1%, 92.2%， 92.3%, 92.4%, 92.5%等，并依次類4f至。
此處一4殳4皮露的本發(fā)明采用肯定性的語言描述多個實施方式。 本發(fā)明還特別包括了完全或部分排除特定對象(例如，物質(zhì)或材料、 方法步驟和條件、計劃、步驟、測定或分析)的實施方式。因此， 盡管本發(fā)明 一般不以本發(fā)明包括什么來進(jìn)行表示，本發(fā)明未明確排 除的方面仍然在AW皮露。
本發(fā)明的一系列實施方式已得到描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解可在 不脫離本發(fā)明的精神和范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行各種改動。相應(yīng)地，下列 實施例目的在于闡述，而非限值權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明的范圍。
實施例
實施例1
本實施例包括了對各種村料和方法的描述。
LIGHT基于生物素在肺瘤細(xì)月包上的固定4匕:LIGHT》爹飾的癌 細(xì)胞的組裝的示意圖(圖12)顯示了包括三個連續(xù)步鄰l的過程(:i) 癌細(xì)胞的生物素化，(ii)可溶性LIGHT的生物素化以及(iii)可溶性 LIGHT在該生物素化癌細(xì)胞上的固定化。在該整個過程中需要采用
無菌一支術(shù)。
癌細(xì)胞的生物素化: 癌細(xì)胞可從多種肺瘤切除后的惡性組 織中純化得到(Greiner,等人，J Lab Clin Med 109:244 (1987)和 O'Brien，等人，Cytometry 28:81 (1997)。在該制備中，我們采用了EL4纟田月包。將50 x 106的EL4細(xì)月包以冰凍的pH8.0的Dulbecco磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗滌3次(Invi加gen Corporation, USA; Cat. # 14190-144)以從組織培養(yǎng)基中去除任意的污染〃蛋白。4奪該細(xì)胞等夕)、 至兩個管子(25 x 106細(xì)胞/管)，并用1 ml PBS (pH 8.0)懸浮。采 用市售的生物素化試劑NHS-PE04-生物素(Pierce, IL， USA; Cat. # 21329)進(jìn)行該標(biāo)記反應(yīng)。在即將使用前，將200 pi的超純蒸餾水 (Invitrogen Corporation, cat. # 10977-01 5);忝力口至2 mg的NHS—PE04-生物素，并將50 pl的該NHS-PE04-生物素i容液添加至含25 x 106 EL4細(xì)胞的每個管中。將該樣本在室溫下孵育30分鐘，每5分4中 進(jìn)行間歇的混合。以ml冷的PBS (pH 8.0)洗滌該細(xì)月包3次以去除 未反應(yīng)的生物素化試劑。所制備的EL4細(xì)月包采用1%福爾馬才木 (ProtocolTM， USA; Cat. # 245-684)在水上固定30分4中，用1.2ml 的冰凍PBS (pH 7.4)洗滌4次，并貝±存在4。C下。
可溶性LIGIIT的生物素化:將純化的可溶性人LIGHT (LIGHTt66,濃度=0.262 mg/ml，含于PBS, pH 8.0)用于該生物素標(biāo) 記反應(yīng)(Rooney,等人J. Biol. Chem. 275: 14307 (2000))。在即^4吏 用前將200〖il的超純蒸餾水(Invitrogen)添加至2 mg的NHS-PE04-生物素，并將3.7 mi的該NHS-PE04-生物素溶液添加至1」GHTt66。 小午該才羊本在;水上孵育2小時。之后，添加42 pl的1 M Tris (pH 8,0) (Fisher Scientific, USA; Cat.弁BP1 54-1 )以終止該反應(yīng)。將該才羊本 對1L的PBS透析，并—進(jìn)4亍3次纟爰沖液殺#才奐。經(jīng)過0.22 mm Millex-GV 過濾器(Mmipore， Ireland, Cat. # SLGV004SL)的過濾只寸生物素4匕的 LIGHTt66滅菌，將其分成小的等分，并貯存在-8(TC下。
可溶性LIGHT在生物素化的癌細(xì)胞上的固定化: 在本制備 中使用了生物素化并福爾馬林固定的EL4細(xì)月包(30 x 106)。將該細(xì)月包 重懸浮于1 ml PBS (pH 7.4)中，然后與10 fig/ml的NeutravidinTM (Pierce; Cat. # 3 IOOO)孵育30分鐘。用1 ml冰凍PBS (pH 7.4)洗滌該細(xì)胞4次以去除游離的Neutravidin 。然后將該細(xì)月包與生物素4匕 的LIGHTt66 (1 i!g/ml)孵育45分鐘，并用1 ml的冰凍PBS (pH 7.4) 洗滌3次以去除未結(jié)合的LIGHT。將制備的細(xì)胞重懸浮于無菌PBS (40 x 106細(xì)月包/ml)中，并貯存在4°C下以供體內(nèi)抗腫瘤石開究。
本實施例顯示了 i正實腫瘤生長,皮腫瘤細(xì)月包表面上表達(dá)的 LIGHT所抑制的ft據(jù)。
為了分析LIGHT介導(dǎo)的腫瘤排斥的效力，采用了 EL4肺瘤細(xì) 胞模型。EL4是來自于C57/BL6 (B6)小鼠的小鼠胸腺瘤癌細(xì)胞系。 當(dāng)EL4細(xì)胞被皮下注射至同系基因B6小鼠時，在5至7天內(nèi)形成 實體腫瘤，并通常在15-20天中發(fā)展為致命的腫瘤。采用人LIGHT 怍為潛在的免疫治療劑。采用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備穩(wěn)定表達(dá)LIGHT 的EL4細(xì)月包系,.，將表達(dá)人LIGHT的EL4細(xì)胞(EL4-LIGHT)皮下注 射進(jìn)入同系基因B6小鼠，然后監(jiān)測腫瘤的生長。對照(7.5cn )和測 試組在15-20天后得到的平均腫瘤大小明顯不同(p〈0.05)(圖l.A)。 在注射了用對照空載體誘導(dǎo)的EL4細(xì)胞(EL4-V)的小鼠中長出了巨 大的種瘤。相反i也，在注射EL4-LIGHT細(xì)月包的小鼠中，肺瘤并未 生長，因此被排斥了。該結(jié)果證實了人LIGHT在小鼠紳瘤細(xì)胞中 表達(dá)時誘導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答。
為了確定未修飾的EL4細(xì)月包是否會在表達(dá)LIGHT的EL4細(xì)月包 的存在下生長，將等量的EL4-V和EL4-LIGHT纟田月包分另'j注入相同 的小鼠。EL4-V細(xì)胞一皮用作對照(圖1B)。在以EL4-V細(xì)胞注射 的小鼠中，該腫瘤迅速生長。對于共注射組，表達(dá)LIGHT的EL4
顯示了腫瘤排斥的全身作用。該結(jié)果從兩個方面來看非常重要。首
實施例2
端位置不表達(dá)LIGHT的EL4腫瘤的排斥，先，它顯示了腫瘤排斥不是由于人蛋白的存在，因為不具有LIGHT 的EL4-V細(xì)胞同樣被排斥了 。其次，該結(jié)果證實了表達(dá)LIGHT的 EL4細(xì)胞能夠介導(dǎo)針對EL4肺瘤的全身應(yīng)答。
實施例3
本實施例顯示了 LIGHT同工型在刺激抗肺瘤應(yīng)答中的作用。
在人和小鼠中，LIGHT存在至少三種主要的同工型(膜LIGHT、 可溶性LIGHT和LIGHTATM ) (Granger,等人，J Immunol 167:5122 (2001)。膜LIGHT代表了具有5爭膜錨(transmembrane anchor)的 LIGHT的全長形式。膜LIGHT可脫落(在細(xì)胞外測蛋白酶解裂解) 成為可;容性形式，而LIGHT的第三種同工型可通過交^務(wù)剪4秦，導(dǎo) 致跨膜結(jié)構(gòu)域的刪除后形成(LIGHTATM)。 UGHTATM缺失跨膜結(jié) 構(gòu)域并位于胞質(zhì)溶膠中。
為了確定其它的LIGHT同工型是否能夠誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答，采 用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備穩(wěn)定表達(dá)可溶性LIGHT (EL4-UGHTt66)和 Ll(i〖ITATM (EL4-LIGHTATM)的EL4細(xì)胞系。將這些細(xì)胞系注射 進(jìn)入兩組小鼠并監(jiān)測腫瘤的生長。結(jié)果(圖2A)證實表達(dá)可溶性 UGHT或L1GHTATM的細(xì)月包均不能i秀導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答。
為了確定可溶性LIGHT是否會損害EL4-L1GHT介導(dǎo)的腫瘤排 斥，將EL4-LIGHT和EL4-LIGHTt66的混合物注射—進(jìn)入B6小鼠， 并監(jiān)測腫瘤的生長(圖2B)。注射了 EL4-LIGHT的小鼠顯示出腫 瘤完全不生長。相反地，注射了 EL4-LIGHT和EL4-可溶性LIGHT 的小鼠中的腫瘤迅速生長。因此，可溶性LIGHT會削弱LIGHT-依賴性抗腫瘤應(yīng)答。這些結(jié)果顯示膜結(jié)合的LIGHT是LIGHT-介導(dǎo) 的4元腫瘤活性所必須的。實施例4
本實施例包含了對基于生物素的蛋白固定化系統(tǒng)的描述。
基于病毒和細(xì)菌的載體傳遞系統(tǒng)在人體內(nèi)具有先天的安全問 題。為了規(guī)避這一基于載體的傳遞系統(tǒng)的固有問題，開發(fā)了不依賴
于載體的生物化學(xué)方法，用以將功能性LIGHT連接至腫瘤細(xì)胞的 表面。該方法是一種固定化系統(tǒng)，其通過化學(xué)(生物素)連接以穩(wěn)、 定的方式將可溶性蛋白顯示在基本任意細(xì)胞的表面上。該方法(如 圖3A和B所述)采用了純化的重組表達(dá)的可溶性LIGHT (LIGHTt66) (Rooney，等人，J. Biol. Chem. 275: 14307 (2000))牙口 EL4月中瘤纟田月包 以得到增強(qiáng)的免疫性。首先，將EL4細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白生物素化。 然后，將可溶性LIGHT (LIGHTT66)同樣生物素化。通過添加四聚 體中性親和素將生物素化的可溶性LIGHT固定化至生物素化的 EL4細(xì)胞膜蛋白上。由于生物素和中性親和素之間的結(jié)合非常強(qiáng)， 這種生物素-中性親和素-生物素復(fù)合物在體內(nèi)才及為穩(wěn)定。
為了確定固定化的效力，以流式細(xì)胞儀檢測LIGHTt66,并與 EL4-LIGHT細(xì)胞進(jìn)行比較。在EL4細(xì)胞表面上固定化的可溶性 LIGHT可通過抗體染色或以HVEM-Fc進(jìn)行檢測(圖3C, E)。根 據(jù)(Rooney,等人，Methods Enzymol 322:345 (2000))的描述制備 LIGHT/LT(3R-Fc和HVEM-Fc的替代受體。
LIGHT-修飾的EL4細(xì)胞(EL4-NA-LIGHTt66)的熒光強(qiáng)度為逆 轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的EL4細(xì)胞(EL4-I」GHT)表達(dá)水平的27% (圖3D ), 顯示該方法可向細(xì)J包力莫傳遞與逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)腖IGHT。該結(jié) 果證實了該基于生物素的固定化系統(tǒng)是將純化的LIGHT連接至細(xì) 胞(例如腫瘤細(xì)胞)表面的有效途徑。因此，該基于生物素的固定 化系統(tǒng)可作為生物活性LTbeta受體激動劑(例如LIGHT)可依.附或偶聯(lián)至腫瘤細(xì)胞表面的范例。該種基于生物素的細(xì)胞膜固定化系
統(tǒng)是一種可變的無載體—^代系統(tǒng)，其可用于以LTbeta受體激動劑 (例如LIGHT)修飾腫瘤細(xì)胞，從而在該細(xì)胞被施用至動物時增強(qiáng)
對月中瘤細(xì)力包的免疫應(yīng)答。
實施例5
本實施例包含了證實腫瘤生長被在細(xì)胞膜上依附、偶聯(lián)或結(jié)合 了 LIGHT的F丄4纟田月包戶斤4中制的凄t才居。
為了確定LIGHT修飾的細(xì)胞作為癌癥疫苗的能力，設(shè)計了計 劃以評估LIGHT結(jié)合的EL4細(xì)月包作為癌癥疫苗的效力(圖4A )。 以結(jié)合LIGHTt66 (EL4-NA-LIGHTt66)或結(jié)合中性親和素(EL4-NA)
的福爾馬林固定的EL4細(xì)胞注射兩組小鼠。如同典型的疫苗策略， 在注射有活力的 EL4腫瘤細(xì)月包的 14天前向小鼠注射 F丄4-NA-UGHTt66或EL4-NA纟田月包，從而生成免疫應(yīng)。為了才t驗 LIGHT-修飾的EL4細(xì)胞對體液免疫性的誘導(dǎo)，從每個小鼠組采集 免疫前和免疫后的血清，并采用未》務(wù)飾的EL4細(xì)月包通過流式細(xì)胞4義 測試#元-EL4抗體活性(圖4B)。以EL4-NA細(xì)月包接種的小鼠未生 成可測的抗-F丄4活性。相反地，在注射了 EL4-NA-LIGHT的5只 小鼠中的3只的血清中檢測到了抗-EL4抗體活性，證實了以LIGHT-修飾的EL4細(xì)胞進(jìn)行的免疫引發(fā)了對EL4抗原的抗體應(yīng)答。
為了確定LIGHT〗奮飾的EL4細(xì)"包作為免疫增強(qiáng)疫苗的效力， 在每組中注射EL4細(xì)胞并監(jiān)測腫瘤生長。以進(jìn)行LIGHTt66-修飾的 EL4細(xì)胞免疫的小鼠顯示了腫瘤生長速率的明顯下降(圖4C)。這 些數(shù)據(jù)證實了以LIGHTt66-修飾的EL4纟田胞進(jìn)行免疫可針對EL4 腫瘤生成抑制腫瘤進(jìn)展的免疫應(yīng)答。實施例6
本實施例包含了證實原代腫瘤生長被在細(xì)胞膜上依附、偶聯(lián)或
結(jié)合了 LIGHT的EL4細(xì)胞所抑制的數(shù)據(jù)。
為了評估LIGHT-修飾的EL4細(xì)胞抑制原代腫瘤生長的能力， 向小鼠皮下注射EL4細(xì)胞，并允許細(xì)胞增殖，從而形成預(yù)先建立的 腫瘤。然后，向腫瘤區(qū)域注射福爾馬林固定的EL4-NA-L.1GHT細(xì)胞， 并對腫瘤生長監(jiān)測16天(圖5A)。將福爾馬林固定的EL4-NA作
為對照。
注射了 EL4-NA-LIGHT纟田月包的小鼠中的腫瘤生長相對EL4-NA 對照有所下降。這些結(jié)果i正實了 LIGHT"奮飾的EL4細(xì)月包在抑制已 建立的腫瘤生長中的效力。因此，依附、偶聯(lián)或結(jié)合了 LTbeta受體 激動劑如LIGHT的腫瘤細(xì)胞可用于已建立的腫瘤的治療(圖5B )。
本實施例包含了證實對LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答的受體要求
的數(shù)據(jù)。
為了從分子角度認(rèn)識LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答，對LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤活性的受體要求進(jìn)行了評估。LIGHT可與2種信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)受體HVEM和LT[3R相互作用。為了確定LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤 應(yīng)答需要兩種受體中的哪一種，對LT卩R和HVEM敲除(KO)小鼠
在HVEM KO小鼠中，EL4-LIGHT細(xì)胞被排斥(圖6A )，提 示HVEM并非LlGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答所必需。當(dāng)隨后以親代 EL4細(xì)胞攻擊這些小鼠時，沒有腫瘤形成。相反地，在LT(3R KO
實施例7小鼠中，EL4腫瘤被排斥，提示通過LTpR的LIGHT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與 了 LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤活性(圖6B)。
實施例8
本實施例包含了證實LIGHT刺激腫瘤環(huán)境中CCL21生成的彰:
據(jù)<>
將EL4-LIGHT細(xì)胞通過靜脈途徑注射進(jìn)入缺失T和B細(xì)胞的 重組酶激活基因-2 (RAG2-"小鼠，并在脾臟、肝臟和肺中被測得。 為了檢驗LIGHT在腫瘤環(huán)境中刺激趨化因子的能力，將 EL4-LIGHT纟田胞注入進(jìn)入RAG2:小鼠，并采集脾臟以通過實時 RTPCR檢測CCL21 (圖7A )。注射EL4-LIGHT的小鼠的CCL21 表達(dá)相對于注射了作為對照的EL4細(xì)胞的小鼠沖是高了 2.5倍(圖 7B )。該結(jié)果證實了 LIGHT在T和B細(xì)胞缺失時在胂瘤環(huán)境中提 高了 CCL21生成。
實施例9
本實施例包含了對顯示了 LiGHT-介導(dǎo)的抗.腫瘤活性機(jī)制的數(shù)
據(jù)的討論。
LT(3R與LIGHT、 LT(3和LTal(32相互作用。為了檢驗內(nèi)源性 LIGHT 、 LT(3和LTa對LIGHT-介導(dǎo)的抗胂瘤活性的貢獻(xiàn)，將 〖::L4-LIGHT細(xì)胞皮下注射至遺傳缺陷LT卩R的一種或多種細(xì)胞配體 的小鼠(LIGHT—LTp—— 、 LIGHT々—、LT(3々—以及LToT )。
在同時缺失LIGHT"'-和LT(T'-的小鼠中，EL4-LIGHT腫瘤未被 排斥，，提示內(nèi)源性LIGHT和/或LTp參與LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤活 性(圖8A)。然而，當(dāng)EL4-LIGHT纟田月包被注射進(jìn)入LIGHT"'—小鼠時，該胂瘤被排斥，顯示該腫瘤控制不要求內(nèi)源性LIGHT。當(dāng)隨后
以親代EL4細(xì)胞攻擊這些小鼠時，該腫瘤仍一皮排斥(圖8B)。
為了確定淋巴毒素是否參與腫瘤排斥，將EL4-LIGHT細(xì)胞注 射入LT(T'—和LTof"-小鼠(圖8C和D) 。 LT(3缺陷小鼠不能排斥 EL4-LIGHT胂瘤，顯示LT卩參與LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤控制。相反 地，該EL4-LIGHT肺瘤在LTor'-小鼠中排斥，盡管它需要更長的排 斥過程，提示LTa可提供幫助，但非LI:G.HT-介導(dǎo)的抗腫瘤控制所必需。
EL4-LIGHT細(xì)胞能夠于LToT7—小鼠中沒有的次級淋巴器官的缺 失下誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答。此外，LToT 、鼠可用作其它缺失刺激淋巴器 官的突變小鼠如LTPR-7-(圖6B )和LTP;(圖8C )的表型對照。 排斥EL4-LIGHT腫瘤的缺失LIGHT々-和LTa,的小鼠在隨后以未修 飾的EL4細(xì)胞進(jìn)行攻擊時，未顯示腫瘤形成(圖8B和D),且這 些小鼠在5個月以上仍保持無腫瘤，顯示通過該處理誘導(dǎo)了對EL4
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月t溜的w 買1。'r乙，合。 實.施例10
本實施例包含了顯示T和B淋巴細(xì)月包中LT(3的表達(dá)可導(dǎo)致 LI GHT-介導(dǎo)的抗腫瘤活性的數(shù)據(jù)。
為了進(jìn)一步考察LIGHT-介導(dǎo)的腫瘤排斥對LT(3表達(dá)的細(xì)胞需 求，將T(T-LT(3—7—)纟田月包或B細(xì)胞(B-LTp勺的條件性敲除LT卩的小鼠 作為宿主，以檢驗EL4-LIGHT的免疫刺激作用。將EL4-LIGHT細(xì) 胞皮下注射進(jìn)入T-LT(3—'-和B-LT(T-小鼠，并監(jiān)測腫瘤生長22天。 在T或B細(xì)胞中缺失/《i的小鼠不能排斥EL4-LIGHT腫瘤。該數(shù)據(jù)顯示LTf3在T和B細(xì)胞的表達(dá)均參與LIGHT-介導(dǎo)的腫瘤排斥(圖9)。
實》包例11
本實施例包含了對可增強(qiáng)免疫療法的LIGHT的變體形式的描
LIGHT在人的癌癥免疫療法中的效力受到人腫瘤所表達(dá)的 DcR3的潛在不利影響。人LIGHT的變體形式的特定組合改變了其 對人LT(3R和DcR3的結(jié)合親和性。LIGHT亞基的組合(32L-214E
的高結(jié)合親和性，4旦對人DcR3具有降低的親和性(圖10和表1 )。 此夕卜，對DcR3存在下該LIGHT 32L-214E/32S-214K的雜三聚體形 式和LT(3R之間的相互作用進(jìn)行了評估。
竟?fàn)幮越Y(jié)合測定證實了 DcR3-Fc對與LIGHT-E214K (在氨基 酸位置214由E突變?yōu)镵 )和LIGHT-S32L (在氨基酸位置32由S 突變?yōu)長)的組合的50"/。結(jié)合抑制濃度(IC50)約比LIGHT的主要形 式(圖32S和214E，圖1 , SEQ ID NO: 1 )高2.5 # 。具體i也，沖目 對LIGHT的主J^形式(SEQ ID NO: l)需要高2.5 4咅的DcR3-Fc濃度 來抑制LT(3R-Fc與LIGHT-E214K和LIGHT-S32L組合的結(jié)合。因 此，LIGHT-E214K和LIGHT-S32L可成為激活LTpR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 的潛在藥劑。
因此，LIGHT變體32L-214E/32S-214K分子可能是增強(qiáng)免疫應(yīng) 答(特別但不限于對癌癥細(xì)胞)的更有效的形式。增強(qiáng)的效力源于 對LT|3R的高結(jié)合親和力和對DcR3的^^結(jié)合親和力。據(jù)發(fā)現(xiàn)DcR3 可在多種癌細(xì)胞中高度表達(dá)，LIGHT變體32L-214E/32S-214K將使得DcR3對LIGHT及其受體HVEM和LT(3R之間的相互作用的抑 制作用最小化。此外，由于上文數(shù)據(jù)證實了 LT(3R可導(dǎo)致LIGHT-增強(qiáng)介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答，LIGHT 32L-214E/32S-214K對LT卩R的高 結(jié)合親和力也可增強(qiáng)LIGHT-介導(dǎo)的抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞，所述細(xì)胞具有依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的LTbeta受體激動劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑包括 LIGHT (p30多/汰)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受體抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)月包，
4. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)月包, 新生細(xì)力包或轉(zhuǎn)移性細(xì)月包。
5. 如權(quán)利^:務(wù)求1所述的細(xì)月包,其中該細(xì)胞為高度增殖細(xì)胞。 其中該細(xì)月包為腫瘤細(xì)^>、癌細(xì)月包、其中該細(xì)月包為病原體感染的細(xì)月包。
6. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)月包，其中該細(xì)月包表達(dá)選自如下的抗原 月中瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原、新生細(xì)月包或轉(zhuǎn)移性細(xì)月包抗原、病毒抗 原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。
7. 如斥又利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑不是由 編碼該LTbeta受體激動劑的細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)的。
8. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑依附、 結(jié)合或偶if關(guān)至該細(xì)胞的膜上的分子。
9. 如權(quán)利-務(wù)求5所述.的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑經(jīng)共價 或非共價鍵介導(dǎo)結(jié)合至細(xì)胞膜上的分子。
10. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該分子包括多肽或碳水化合物。
11. 如一又利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑通過如 下方式依附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜LTbeta受體激動劑與中 間體分子共價或非共價結(jié)合，所述中間體分子共1"介或非共價結(jié) 合至細(xì)胞膜上的分子。
12. 如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中該中間體分子包含第一部分 和第二部分。
13. 如片又利要求12所述的細(xì)胞，其中所述的第一部分包含生物素 或生物素布于生物。
14. 如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中所述的第二部分包含親和素、中,[生親和素或鏈霉親和素，或其衍生物或氨基酸變體。
15.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中LTbeta受體激動劑通過與親和素、中性親和素或鏈霉親和素或其衍生物或氨基酸變體的結(jié) 合而結(jié)合至該細(xì)月包膜，其中所述的親和素、中性親和素、鏈霉 親和素、其衍生物或氨基酸變體結(jié)合至細(xì)胞膜上的分子。
16,如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中通過將該LTbeta受體激動劑 與該細(xì)胞月莫上的分子交聯(lián)，從而發(fā)生LTbeta受體激動劑與細(xì)月包月莫的結(jié)合。
17.如權(quán)利4^求1所述的細(xì)胞，其中LTbeta受體激動劑通過與細(xì) 胞膜上的抗體結(jié)合而結(jié)合至該細(xì)胞膜。
18.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中通過將該LTbeta受體激動劑 與該細(xì)胞膜上的分子交聯(lián)使得LTbeta受體激動劑結(jié)合至細(xì)胞膜。
19. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑包括嵌 合蛋白，該嵌合蛋白包含結(jié)合部分。
20. 如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中該Ltbeta受體激動劑嵌合蛋 白結(jié)合部分包含結(jié)合至細(xì)胞膜上的分子的配體、受體或抗體或抗體子序列。
21. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑為哺乳 動物的LTbeta受體;敫動劑。
22. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑為人的 LTbeta受體;敫動劑。
23. 如權(quán)利要求2所述的纟田胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含全長氨基酸序列。
24. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽:)包含 LIGHT的胞外氨基酸序列。
25. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: I所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
26. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p3()多肽)包含 LIGHT的可i容'性形式。
27. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可;容性形式。
28. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含 UGHTt66。
29. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
30. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含與天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比對DcR3 (Decoy受體3)的親和 性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
31. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含與天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比乂于LT卩R或HVEM具有更高 親和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
32. 如權(quán)利:齊求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含與天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比對LTpR或HVEM具有更高 親和性并對DcR3 (Decoy受體3)的親和性下降的LIGHT (p30多肽)-氨基酸序列。
33. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中該LIGHT (p30多肽)包含選自 SEQ ID NO: 3至10任意一個的-氮基酸序列。
34. 如權(quán)壽i]要—求1所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑具有與 之連接-的生物素或生物素衍生物。
35. 如權(quán)壽'J要-求i所述的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑不是由 編碼該LTbeta受體激.動劑的細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)的。
36. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)/泡，其中該細(xì)月包為真核細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
38. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為人細(xì)胞。
39. 如片又利要求1所述的細(xì)^0其中該細(xì)月包為死細(xì)月包。
40. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為活細(xì)月包。
41. 包含權(quán)利要求1至40任意一項所述細(xì)胞的藥物組合物D
42. 促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加針對高度增殖細(xì)胞、肺瘤細(xì)胞、癌細(xì) 月包或轉(zhuǎn)移性細(xì)力包、或病原體感染的細(xì)力包的免疫性的方法，其包 括向?qū)ο笫┯?一 定量的具有依附、結(jié)合或偶l關(guān)至細(xì)力包膜的 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑可有效 促進(jìn)、刺激、誘導(dǎo)或增加該對象針對高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、 癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包或病原體感染細(xì)^>的免疫性。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑包括n， (p30多肽)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受體抗體。
44. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中該對象具有不良的或是異常 的高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌纟田l包、新生細(xì)月包或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、或病原體感染的細(xì)月包。
45. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中該高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)月包、 癌細(xì)胞、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、或病原體感染的細(xì)胞包括造j&纟田月包。
46. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中該高度增殖細(xì)月包、肺瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞是選自如下組織或器官的細(xì)胞腦、皮膚、鼻咽、頭、頸、肺、曱狀腺、腎、肝、胰、胃、 腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、卵巢、子宮、乳腺、前列腺、骨、陰 道或陰莖。
47. 治療對象的不良的或是異常的高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì) 胞、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)J包、或病原體感染的細(xì)胞的方法，其 包括像.該對象施用 一定量的具有依.附、結(jié)合或偶聯(lián)至細(xì)胞膜的 LTbeta受體激動劑的細(xì)胞，其中該LTbeta受體激動劑可有效 治療該對象的不良的或是異常的高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌 細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞。
48. 如4又利要求47所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑包括 LIGHT (p30多肽)、LTcdphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受體抗體。
49. 如4又利要求47所述的方法，其中該治療減少或降j氐該高度增 殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌纟田胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體 感染的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖或數(shù)量，或者抑制或防止該高度增殖 細(xì)月包、腫瘤細(xì)胞、癌纟w胞、新生細(xì)月包、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染的細(xì)胞的數(shù)量或轉(zhuǎn)移的增力o,或者穩(wěn)定該高度增殖細(xì)胞，腫 瘤纟田月包、癌纟田月包、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞或病原體感染的細(xì)胞的數(shù)量。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中該高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、 癌細(xì)胞、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包或病原體感染的細(xì)月包包括造血 纟田月包。
51. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中該高度增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、 癌細(xì)月包、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞包括腦、皮月夫、鼻咽、頭、頸、 月巿、曱狀腺、腎、肝、胰、胃、腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、卵巢、 子宮、乳腺、前列腺、骨、陰道或陰莖的細(xì)胞。
52. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中該腫瘤或癌癥包括肉瘤、癌、 黑色素瘤、林巴瘤、白血病或骨髓瘤。
53. 權(quán)利要求42至52任意一項所述的方法，其中該對象為哺乳動物。
54. 權(quán)利要求42至52任意一項所述的方法，其中該對象為人。
55. 如斥又利要求47所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑為哺乳 動物的LTbeta受體i敫動劑。
56. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑為人的 LTbeta受體激動劑》
57. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含全長氨.基酸序列。
58. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的胞外氨基酸序列。
59. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 1所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
60. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的可i容性形式。
61. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可::容性形式。
62. 如外又利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含 LIGHTt66。
63. 如4又利要求48所述的方法，其中該UGHT(p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
64. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比對DcR3 (Decoy受體3)的親 和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
65. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比乂于LT(3R或HVEM具有更 高親和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
66. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然里于生型LIGHT (p30多肽)相比對LT(3R或HVEM具有更 高親和性并對DcR3 (Decoy受體3)的親和性下降的LIGHT (p30多肽)—氮基酸序列。
67. 如權(quán)利-務(wù)求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包4、選 自SEQ ID NO: 3至10任意一個的氨基酸序列。
68. 如權(quán)利-要求48所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)具有與 之連接的生物素或生物素衍生物。
69. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中該細(xì)/]包表達(dá)選自如下的抗原 腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞抗原、病毒抗 原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。
70. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑不是由 編碼該LTbeta受體激動劑的細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)的。
71. 如權(quán)利-務(wù)求47所述的方法，其中該細(xì)胞為真核細(xì)胞。
72. 如^l利要求47所述的方法，其中該細(xì)"包為哺乳動物細(xì)J!包。
73. 如權(quán)利-務(wù)求47所述的方法，其中該細(xì)力包為人細(xì)胞。
74. 如4又利要求47所ii的方法，其中該細(xì)月包為死細(xì)月包。
75. 如4又利凌-求47所述的方法，其中該細(xì)月包為活細(xì)月包。
76. 具有依附、結(jié)合或偶耳關(guān)至細(xì)/]包力莫的LTbeta受體激動劑的細(xì)月包 的生成方法，其包4舌a) 在允許細(xì)胞與中間體分子結(jié)合的條件下將所述細(xì)胞與所述中 間#&-—f^目對姿角蟲；一ob) 在允許所述中間體分子和LTbeta受體激動劑結(jié)合的條件下將 該細(xì)胞與所述LTbeta受體激動劑相4妻觸，從而生成具有依附、 結(jié)合或偶l關(guān)至細(xì)胞膜的I.Tbeta受體激動劑的細(xì)胞。
77. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑包括 LK;HT (p3()多肽)、LTodphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受體抗體。
78. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)選自如下的抗原 肺瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原、新生細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞抗原、病毒抗 原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。
79. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑不是由 編碼該LTbeta受體激動劑的細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)的。
80. 如權(quán)利-務(wù)求76所述的方法，其中該細(xì)月包為高度增殖細(xì)胞、腫 瘤纟田胞、癌細(xì)月包、新生細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)月包或病原體感染的細(xì)月包。
81. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑依附、 結(jié)合或偶聯(lián)至該細(xì)胞的膜上的分子。
82. 如權(quán)利要求81所述的方法，其中該分子包括多肽或碳水化合物。
83 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑通過共 價或非共價鍵依附、結(jié)合或偶聯(lián)至該細(xì)胞膜。
84. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中步驟a)包括將該細(xì)/l包與第一 部分豐l觸，然后與第二部分對妄觸，從而生成包含了結(jié)合該細(xì)月包 的第 一部分和結(jié)合該第 一部分的第二部分的分子。
85. 如權(quán)利-齊求84所述的方法，其中所述的第一部分包含生物素或生4勿素形亍生4勿。
86. 如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述的第二部分包含親和素、 中性親和素或鏈霉親和素，或其衍生物或氨基酸變體。
87. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)選自如下的抗原 月中瘤細(xì)月包或癌細(xì)月包抗原、#斤生細(xì)月包或轉(zhuǎn)移寸生細(xì)月包4元原、病毒抗 原、細(xì)菌4元原、真菌4元原或寄生蟲才元原。
88. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑不是由 編碼該LTbeta受體激動劑的細(xì)胞內(nèi)核酸表達(dá)的。
89. 如4又利-要求76所述的方法，其中LTbeta受體激動劑通過與親 和素、中性親和素或鏈霉親和素或其衍生物或氨基酸變體的結(jié) 合而結(jié)合至該細(xì)胞膜，其中所述的親和素、中性親和素、鏈霉 親和素、其衍生物或氨基酸變體結(jié)合至細(xì)胞膜上的分子蛋白。
90. 如4又利要求76所述的方法，其中通過將該LTbeta受體激動劑 與該細(xì)胞膜上的分子交聯(lián)，從而發(fā)生LTbeta受體激動劑與細(xì)胞膜的結(jié)合。
91. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑通過與 細(xì)胞膜上的抗體結(jié)合而結(jié)合至該細(xì)胞膜。
92. 如一又利要求76所述的方法，其中通過+務(wù)該LTbeta受體纟敫動劑 與該細(xì)胞膜上的分子交Jf關(guān)〗吏得LTbeta受體激動劑結(jié)合至細(xì)胞膜。
93. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑包括嵌 合蛋白，該嵌合蛋白包含結(jié)合部分。
94. 如權(quán)利-務(wù)求76所述的方法，其中該Ltbeta受體激動劑嵌合蛋 白結(jié)合部分包含結(jié)合至細(xì)胞膜上的分子的配體、受體或抗體或抗體子序列。
95. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑為哺乳 動物的LTbeta受體激動劑。
96. 如4又利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑為人的 LTbeta受體;敫動劑。
97. 如4又利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多月太)包含全長-氤基酸序列。
98. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包舍 LIGHT的胞外氨基酸序列。
99. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ 1DNO: 1所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
100.如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的可溶性形式。
101.如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可;容性形式。
102.如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含 LlGHTt66。
103.如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
104.如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然野生型LIGHT (p3()多肽)相比對DcR3 (Decoy受體3)的親 和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
105. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比只于LT卩R或HVEM具有更 高親和性的LIGHT (p30多肽)氨基臥乏序列。
106. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含與 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比對LT(3R或HVEM具有更 高親和性并對DcR3 (Decoy受體3)的親和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
107. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中該LIGHT (p30多肽)包含選 自SEQ ID NO: 3至10 ^壬意一個的氨基酸序列。
108. 如權(quán)利要求76所述的方法，其中該LTbeta受體激動劑具有與 之連4妾的生物素或生物素書于生物。
109.如4又利凌-求76所i€的方法，其中該細(xì)月包為真核細(xì)月包。
110.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
111.如4又利要求76所ii的方法，其中該細(xì)月包為人細(xì)月包。
112.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該細(xì)胞為死細(xì)胞。
113.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該細(xì)胞為活細(xì)胞。
114.選自SEQIDNOs: 3至10中任意一個的分離或純化的LIGHT (p3(0多肽)氨基酸序列或其子序列。
115.如權(quán)利要求1 14所述的分離或純化的LIGHT (p30多肽)氨基酸 序列，其中該LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列對 LTbeta受體或HVEM具有增加的或更大的親和性或親和力，或?qū)ecoy受體3 (DcR3)具有減少的或更小的結(jié)合親和性或 親和力。
116.編碼選自SEQ ID NOs: 3至10中4壬意一個的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列的核酸。
117.可與編碼選自SEQ ID NOs: 3至10中Y壬意一個的LIGHT (p30 多肽》氤基酸序列或其子序列的核酸雜交或互補(bǔ)， <旦不與？予生 型天然LIGHT序列雜交或互補(bǔ)的核酸。
118.如權(quán)利要求.17所述的核酸，其中該野生型天然LIGHT序列 包含SEQ ID NO: 1 。
119. 包含選自SEQ ID NOs: 3至10中任意一個的LIGHT (p30多肽)湊、基酸序列或其子序列的編碼核酸的載體。
120. 如權(quán)利要求119所述的載體，其包含表達(dá)載體。
121. 表達(dá)選自SE:Q ID NOs: 3至10中任意一個的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列的轉(zhuǎn)化纟田月包。
全文摘要
腫瘤壞死因子超家族成員LIGHT(p30；TNFSF-14)是誘導(dǎo)針對腫瘤的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。新型的生物化學(xué)方法被用于以LIGHT修飾腫瘤細(xì)胞的表面。LIGHT修飾的細(xì)胞可被用于疫苗接種，并誘導(dǎo)針對表達(dá)neo或病原體相關(guān)抗原的細(xì)胞的有效、持續(xù)的免疫。LIGHT的變體被描述為可以增強(qiáng)與細(xì)胞受體(例如，LT beta受體)的結(jié)合并減少被抑制劑(例如，Decoy受體3)的調(diào)節(jié)，提高刺激免疫的能力。
文檔編號A61K39/00GK101616686SQ200780048119
公開日2009年12月30日 申請日期2007年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月25日
發(fā)明者卡爾·F·韋爾, 泰勒莎·A·班克斯, 蒂莫西·C·張 申請人:拉·約拉過敏反應(yīng)及免疫醫(yī)學(xué)研究所